CN115010793A

CN115010793A - 玫瑰叶畸形病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备方法及应用

Info

Publication number: CN115010793A
Application number: CN202210688871.1A
Authority: CN
Inventors: 王颖; 张秀琪; 聂张尧; 李梦林; 韩成贵; 张宗英
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2022-09-06

Abstract

本申请提供了一种玫瑰叶畸形病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备方法及应用；所述制备方法中使用针对RrLDV cp基因设计的引物CP‑F‑NdeI：SEQ ID NO.3、引物CP‑R‑XhoI：SEQ ID NO.4进行扩增，并将其连接至pDB‑His‑MBP载体上进行原核表达，纯化外壳蛋白制备抗血清。

Description

玫瑰叶畸形病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地，本申请提供了一种玫瑰叶畸形病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备方法及应用。

背景技术

月季(Rosa chinensis Jacq.)属于蔷薇科蔷薇属(Rosaceae)，原产于中国，有“花中皇后”的美称，极具观赏价值，是世界三大切花之一。1987年月季被选为北京市市花，具有重要的观赏价值与精神内涵。近年来北京的月季产业逐渐规模化和专业化，占据了北京都市农业的重要地位，随着种植推广面积不断扩大，月季病毒病的发生日趋频繁。

玫瑰叶畸形病毒(rosa rugosa leaf distortion virus，RrLDV)，异名月季黄叶病毒(rose yellow leaf virus，RYLV)，是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)的一个种，为单分体正义链RNA病毒，全长3.9kb，编码7个ORFs，ORF6编码外壳蛋白，通过嫁接传播，能造成月季叶片黄化、提前衰老。

目前对于RrLDV的检测，主要依靠RT-PCR技术，但由于月季叶片多糖多酚，提取RNA的步骤比较繁琐，RT-PCR检测就比较费时费力。

发明内容

为解决上述问题，申请人纯化了玫瑰叶畸形病毒外壳蛋白(RrLDV-CP)并以此制备了多克隆抗体。

一方面，本申请提供了一种RrLDV-CP蛋白的表达纯化方法，包括：RrLDV-CP基因的调取及扩增；RrLDV-CP基因原核表达载体构建；His-MBP-tag-(RrLDV-CP)融合蛋白的原核表达；His-MBP-tag-(RrLDV-CP)融合蛋白的纯化。

进一步地，所述RrLDV-CP基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3；所述RrLDV-CP蛋白氨基酸序列为：SEQ ID NO.6。

进一步地，RrLDV-CP基因的调取及扩增时使用序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物。

进一步地，原核表达载体以pDB.His.MBP构建。

进一步地，使用大肠杆菌进行表达。

进一步地，Ni亲和层析柱纯化RrLDV-CP。

另一方面，本申请提供了RrLDV-CP多克隆抗体的制备方法，包括前述的RrLDV-CP蛋白的表达纯化方法以及配置融合蛋白溶液、免疫动物和取血清步骤。

进一步地，所述动物为兔。

进一步地，免疫动物共进行4-5次。

进一步地，免疫动物时将含500μg融合蛋白的1体积份融合蛋白溶液和1体积份弗氏不完全佐剂混合，经背部皮下多点注射。

另一方面，本申请提供了由上述方法制备的RrLDV-CP多克隆抗体。

另一方面，本申请提供了由上述方法或多克隆抗体在制备RrLDV检测试剂盒中的应用。

另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含上述多克隆抗体。

另一方面，本申请提供了检测RrLDV的方法，所述方法中使用上述多克隆抗体。

有益效果

本申请抗体效价高，可以克服现有检测技术的缺陷，用于病毒外壳蛋白的研究和病毒检测，具有良好的应用价值和市场前景。

附图说明

图1为SDS-PAGE分析RrLDV CP融合蛋白结果图；

图2为SDS-PAGE检测瞬时pMDC32-RrLDV-CP-3Flag烟草叶片结果图；

图3为月季叶片RT-PCR检测结果图；

图4为CP^RrLDV多克隆抗体应用于病毒检测的结果图；

图5为SDS-PAGE分析CP^RrLDV抗血清效价结果图。

图6为SDS-PAGE分析CP^RrLDV灵敏度结果图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步举例描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实验材料及试剂

大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21和本生烟(Nicotiana benthamiana)由分子植物病毒学实验室保存，农杆菌GV3101由英国University of Cambridge的David Baulcombe教授惠赠，公众可从中国农业大学(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

克隆载体pMD19-T为TaKaRa公司的产品。Ni亲和层析柱购自QIAGEN公司。载体pDB.His.MBP(环形)购自DNASU质粒库。下述实施例中的TBST缓冲液均为含0.05％(v/v)Tween-20、150mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH7.5)的缓冲液；咪唑洗脱液：含150mM NaCl和相应浓度咪唑的pH 8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液；2×SDS蛋白上样缓冲液：含4％(w/v)SDS、20％(v/v)甘油、0.2％(w/v)溴酚蓝、100mM Tris-HCl(pH6.8)的缓冲液。

pMD19-T-RrLDV-CP的构建

(1)根据RYLV-CP(MN447653)设计特异性引物CP-F 5′-ATGGCAGCGGCTGATAGTCC-3′(SEQ ID NO.1),CP-R5′-TCACATTCTTGTAACATACGCGTG-3′(SEQ ID NO.2)检测疑似感病叶片，扩增到特异性条带，大小约为1020bp，回收并纯化PCR产物。

(2)将纯化产物根据说明书构建到pMD19-T，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性菌落，送擎科公司测序得到质粒pMD19-T-RrLDV-CP。

实施例1重组质粒pDB.His.MBP-RrLDV-CP的构建

(1)含有RrLDV cp基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.6)的pMD 19-T-RrLDV-CP质粒为模板，以5′-TTCCAGGGCCATATGATGGCAGCGGCTGAT-3′(SEQ IDNO.4，下划线为同源臂)和5′-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCACATTCTTGTAACAT-3′(SEQ IDNO.5，下划线为同源臂)为引物进行PCR扩增，得到大小约为1020bp的扩增产物，回收并纯化PCR产物。

(2)取载体pDB.His.MBP，用限制性内切酶Nde I和Xho I进行酶切，回收约6.5kb的载体骨架。

(3)利用2×Assembly Mix将步骤1和步骤2回收产物进行同源重组，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆送擎科公司测序得到重组质粒pDB.His.MBP-RrLDV-CP。

实施例2融合蛋白的表达和纯化

(1)将重组质粒pDB.His.MBP-RrLDV-CP导入大肠杆菌BL21(与材料中菌株一致)，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21-RrLDV-CP。

(2)完成步骤(1)后，取BL21-RrLDV-CP单克隆，接种至5mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、220rpm振荡培养12hrs，得到培养菌液。

(3)完成步骤(2)后，取培养菌液，按体积比为1:1 000接种至LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、220rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.6～0.8。取2mL菌液作为对照，其余菌液加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃、180rpm振荡诱导培养16hrs，4℃、6000rpm离心10min，收集菌体沉淀。

(4)完成步骤(3)后，取菌体沉淀，加入60mL高盐Buffer(20mM/L Tris-HCl,500mMNaCl,pH＝8.15)重新悬浮，重悬后超声破碎(超声波功率600W，循环程序为：破碎2s，停4s，2min 30s一次，共2次)。4℃、16 000rpm离心30min，收集上清液。将上清液加入Ni亲和层析柱，再用不同浓度(20mM、40mM、60mM、100mM、200mM、500mM)的咪唑洗脱液洗脱蛋白，收集洗脱液。将每个纯化过程的洗脱液进行SDS-PAGE检测，如图1所示。结果表明，上清液中存在融合蛋白浓缩合适的蛋白洗脱液，获得pDB.His.MBP-RrLDV-CP融合蛋白。

(5)完成步骤(4)后，取过柱后溶液，用超滤离心管浓缩至1.5mL，得到浓缩蛋白液。经检测，加入IPTG诱导获得的RrLDV-CP浓缩蛋白液中融合蛋白浓度约为8mg/mL。以下均采用加入IPTG诱导获得的浓缩蛋白液(以下简称浓缩蛋白液)进行实验。

实施例3多克隆抗体的制备

(1)取浓缩蛋白液，加入生理盐水稀释至200-500μL，得到融合蛋白溶液。

(2)将1体积份融合蛋白溶液(含500μg融合蛋白)和1体积份弗氏完全佐剂混合，取体重为1.5kg左右的新西兰白兔1只，经背部皮下多点注射。

(3)完成步骤(2)后，将1体积份融合蛋白溶液(含500μg融合蛋白)和1体积份弗氏不完全佐剂混合，经背部皮下多点注射。

(4)完成步骤(3)后，将1体积份融合蛋白溶液(含500μg融合蛋白)和1体积份弗氏不完全佐剂混合，经背部皮下多点注射。

(5)完成步骤(4)后，对新西兰白兔的颈动脉采血1mL，检测ELISA效价。

(6)完成步骤(5)后，将1体积份融合蛋白溶液(含500μg融合蛋白)和1体积份弗氏不完全佐剂混合，经背部皮下多点注射。

(6)采取全部血清，同时检测ELISA效价

上述步骤由北京博奥森有限公司操作。

实施例4多克隆抗体检测瞬时表达pMDC32-RrLDV-CP-3Flag的烟草叶片

提取瞬时表达pMDC32-RrLDV-CP-3Flag的烟草叶片进行SDS-PAGE和Western blot检测采用实施例2中制备的多克隆抗体和Flag抗体作为一抗检测RrLDV。

Western blot结果见图2。结果表明，实施例3中制备的多克隆抗体可以成功检测RrLDV。

实施例5多克隆抗体在病毒检测上的应用

待测叶片为RT-PCR阳性和阴性的月季叶片，RT-PCR结果见图3。

(1)参考朱丽娟提取茉莉蛋白的方法，(朱丽娟，茉莉H病毒的分子致病机理[D].福建农林大学,2019)提取月季叶片总蛋白。

(2)取前面实施例制备的RrLDV多克隆抗体，加入TBST缓冲液进行稀释，得到稀释液。稀释液的稀释倍数为128 000。

(3)将步骤1)获得的总蛋白进行SDS-PAGE和Western blot，采用步骤2)得到的稀释液作为一抗检测RrLDV。Western blot结果见图4，结果表明RrLDV-CP多克隆抗血清能够特异性检测到月季叶片中的RrLDV，并且与RT-PCR的检测结果一致。说明RrLDV-CP抗血清适用于月季中RrLDV的检测，具有较高的应用价值。

实施例6多克隆抗体的效价测定

(1)提取RT-PCR阳性的月季叶片的总蛋白。

(2)取前面实施例中制备的RrLDV-CP多克隆抗体，加入TBST缓冲液进行稀释，得到稀释液。稀释液的稀释倍数分别为1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128000、256 000、512 000、1 024 000。

(3)将步骤(1)提取的总蛋白进行SDS-PAGE和Western blot，采用步骤2)得到的稀释液作为一抗检测RrLDV。

Western blot结果见图5。结果表明，用RT-PCR阳性月季叶片检测多克隆抗体效价时，多克隆抗体稀释倍数达到2 048 000时仍可以检测到微弱的蛋白条带，因此，实施例中制备的RrLDV-CP多克隆抗体的效价约为1：2 048 000。

用RT-PCR阳性月季叶片检测多克隆抗体的最佳适用范围，在1：1 000-1:256 000的范围内显色效果都较为明显。当稀释倍数达到32 000时，从显色效果和经济角度，对RrLDV侵染的月季检测较理想。

实施例7多克隆抗体的灵敏度分析

(1)提取0.1g RT-PCR阳性月季叶片蛋白。

(2)完成步骤1)后，取蛋白样品倍比稀释，得到稀释倍数分别为2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 048和4 096的蛋白样品。

(3)取前面实施例中制备的RrLDV-CP多克隆抗体，加入TBST缓冲液进行稀释，得到稀释液。稀释液的稀释倍数为1 000和10 000。

(4)将步骤(2)得到的蛋白样品进行SDS-PAGE和Western blot，采用步骤3得到的稀释液作为一抗检测RrLDV。

RrLDV-CP的Western blot结果见图6。结果表明，0.1g RT-PCR阳性月季叶片的总蛋白在1:1 000浓度条件下蛋白稀释1 024倍后反应呈阳性，在1:10 000条件下蛋白稀释128倍呈阳性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 玫瑰叶畸形病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备方法及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<400> 1

atggcagcgg ctgatagtcc 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<400> 2

tcacattctt gtaacatacg cgtg 24

<210> 3

<211> 1020

<212> DNA

<213> artificial

<400> 3

atggcagcgg ctgatagtcc tcaggtcatc caagcagctt ccgctggcgc acaatgggcc 60

gtcaaactca gagccaaagg ctggaggagt ttaaccaagc tccagaaggc ccaggctcgc 120

tcacatgggg tgggtcctgt caccccggca acaattgtcc cgaaggtcac taggttgatc 180

aacggaaatc ctggaaatgt gaggcggcgt aacggtgagc cagggaatgc tatgaagagc 240

atgactatca ccaagcaaga atacctcgga accgtctctg gtgggagcgg tgtccgaact 300

ttcatcctcg atccgcgcaa cgtgaggagc ttccctcagt tgagcgcatt ttgcctgggg 360

tacaacaagt acaagttcac caagcttgct ttcaggtaca gtcctcgagt caacgaaacg 420

aatgcaggca tcatctgtgc ctacactagt gactcttctg atgaggcacc taagagcaag 480

taccagatgt acagcatcac ccccaggtac gaagccgtgg cgagcaaacc tctcatcgtc 540

tccatccctc cgactaagga accgaagttt cttcgggaca agtcttctga tgacgccaaa 600

cttgtcgaca gcggttccat ccactgtttg attgacggcg atcatgatgg gaaacttgga 660

gaaatctttc tcgatctgac cgtcgtgctc tctgagccaa cgttcaacca gtgtgcgatg 720

caagaggtta ccaagacgag gcacatcaag ggacctgggt acgtagtgcc ctcattccaa 780

gacggagttg tgaccctgac ctttcaagcg tcaggttcgt acctctgcac ttactcctgt 840

gcccccattt caagtctcag ccaaacaggc atggaagaag ctgcccgagt cacgaccacg 900

tcgacagagg agagtagtgg gtttgttgag gtggtgacag aagaacccct cagttgtgtt 960

aagtttacct ttgtgaaccc tgcttccggg aagtttcacg cgtatgttac aagaatgtga 1020

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<400> 4

ttccagggcc atatgatggc agcggctgat 30

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<400> 5

tggtggtggt ggtgctcgag tcacattctt gtaacat 37

<210> 6

<211> 339

<212> PRT

<213> artificial

<400> 6

Met Ala Ala Ala Asp Ser Pro Gln Val Ile Gln Ala Ala Ser Ala Gly

1 5 10 15

Ala Gln Trp Ala Val Lys Leu Arg Ala Lys Gly Trp Arg Ser Leu Thr

20 25 30

Lys Leu Gln Lys Ala Gln Ala Arg Ser His Gly Val Gly Pro Val Thr

35 40 45

Pro Ala Thr Ile Val Pro Lys Val Thr Arg Leu Ile Asn Gly Asn Pro

50 55 60

Gly Asn Val Arg Arg Arg Asn Gly Glu Pro Gly Asn Ala Met Lys Ser

65 70 75 80

Met Thr Ile Thr Lys Gln Glu Tyr Leu Gly Thr Val Ser Gly Gly Ser

85 90 95

Gly Val Arg Thr Phe Ile Leu Asp Pro Arg Asn Val Arg Ser Phe Pro

100 105 110

Gln Leu Ser Ala Phe Cys Leu Gly Tyr Asn Lys Tyr Lys Phe Thr Lys

115 120 125

Leu Ala Phe Arg Tyr Ser Pro Arg Val Asn Glu Thr Asn Ala Gly Ile

130 135 140

Ile Cys Ala Tyr Thr Ser Asp Ser Ser Asp Glu Ala Pro Lys Ser Lys

145 150 155 160

Tyr Gln Met Tyr Ser Ile Thr Pro Arg Tyr Glu Ala Val Ala Ser Lys

165 170 175

Pro Leu Ile Val Ser Ile Pro Pro Thr Lys Glu Pro Lys Phe Leu Arg

180 185 190

Asp Lys Ser Ser Asp Asp Ala Lys Leu Val Asp Ser Gly Ser Ile His

195 200 205

Cys Leu Ile Asp Gly Asp His Asp Gly Lys Leu Gly Glu Ile Phe Leu

210 215 220

Asp Leu Thr Val Val Leu Ser Glu Pro Thr Phe Asn Gln Cys Ala Met

225 230 235 240

Gln Glu Val Thr Lys Thr Arg His Ile Lys Gly Pro Gly Tyr Val Val

245 250 255

Pro Ser Phe Gln Asp Gly Val Val Thr Leu Thr Phe Gln Ala Ser Gly

260 265 270

Ser Tyr Leu Cys Thr Tyr Ser Cys Ala Pro Ile Ser Ser Leu Ser Gln

275 280 285

Thr Gly Met Glu Glu Ala Ala Arg Val Thr Thr Thr Ser Thr Glu Glu

290 295 300

Ser Ser Gly Phe Val Glu Val Val Thr Glu Glu Pro Leu Ser Cys Val

305 310 315 320

Lys Phe Thr Phe Val Asn Pro Ala Ser Gly Lys Phe His Ala Tyr Val

325 330 335

Thr Arg Met

Claims

1.一种RrLDV-CP蛋白的表达纯化方法，其特征在于，所述方法包括：RrLDV-CP基因的调取及扩增；RrLDV-CP基因原核表达载体构建；His-MBP-tag-(RrLDV-CP)融合蛋白的原核表达；His-MBP-tag-(RrLDV-CP)融合蛋白的纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RrLDV-CP基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3；所述RrLDV-CP蛋白氨基酸序列为：SEQ ID NO.6；优选地，其中RrLDV-CP基因的调取及扩增时使用序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中原核表达载体以pDB.His.MBP构建；使用大肠杆菌进行表达；Ni亲和层析柱纯化RrLDV-CP。

4.RrLDV-CP多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括根据权利要求1-3任一项所述的方法以及配置融合蛋白溶液、免疫动物和取血清步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述动物为兔；免疫动物共进行4-5次。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中免疫动物时将含500μg融合蛋白的1体积份融合蛋白溶液和1体积份弗氏不完全佐剂混合，经背部皮下多点注射。

7.使用根据权利要求4-6任一项所述的方法制备的RrLDV-CP多克隆抗体。

8.根据权利要求4-7任一项所述的方法或多克隆抗体在制备RrLDV检测试剂盒中的应用。

9.RrLDV检测试剂盒，其特征在于，其包含根据权利要求7所述的多克隆抗体。

10.检测RrLDV的方法，其特征在于，所述方法中使用根据权利要求7所述的多克隆抗体。