CN112410310A - 一种猪链球菌疫苗重组蛋白gse及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用作猪链球菌疫苗的重组蛋白GSE，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。针对猪链球菌病的灭活苗和弱毒苗型间交叉保护效果并不好，且存在一定的生物安全性问题，本发明基于猪链球菌保护性抗原表位的筛选，设计而成的重组蛋白能够用于猪链球菌病疫苗的制备中，本发明提供的这种重组蛋白可在安全的条件下高效制备，具有良好的实用性。

Description

一种猪链球菌疫苗重组蛋白GSE及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种猪链球菌疫苗重组蛋白GSE及其制备方法和应用。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis)对养猪业来说是一个非常值得重视的细菌性传染病病原，如果发生疫情可能造成巨大的经济损失，猪链球菌可引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎、脑炎、流产、多发性浆膜炎和支气管肺炎等疾病，发病致死率高达80％。1990年和2005年我国发生了大规模暴发，再一次提醒人们要增强对该病的重视程度。
由于猪链球菌血清型众多，使得在这种病的预防阶段灭活苗的型间交叉保护效果并不好。目前的疫苗研究更倾向于亚单位疫苗的开发，有研究者发现2个及以上的毒力因子或免疫原性蛋白串联构建的亚单位疫苗可以很好地增强免疫保护效果，使针对这种细菌病的亚单位疫苗的研究进入了新阶段。
本发明中涉及的三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶(Enolase)、DNA核酸酶(SsnA)是3种重要的猪链球菌保护性抗原。已有研究证实这些保护性抗原具有良好的免疫保护作用，但目前还没有研究者将这3种抗原结合，从中选取抗原表位，设计重组蛋白用于猪链球菌病的疫苗。
通过检索，尚未发现如下与本发明申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种猪链球菌疫苗重组蛋白GSE及其制备方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用作猪链球菌疫苗的重组蛋白GSE，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。
编码如上所述的重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
如上所述的重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
⑴B细胞和辅助T细胞抗原表位筛选；
⑵B细胞和辅助T细胞抗原表位串联基因设计及质粒构建；
⑶重组蛋白的原核表达和纯化，即得猪链球菌疫苗重组蛋白GSE。
而且，所述步骤⑴的具体方法为：根据猪链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶(Enolase)、DNA核酸酶(SsnA)的氨基酸序列，应用生物信息学软件，分析蛋白质一级结构，在抗原表位筛选时排除跨膜区域和信号肽区域，而后预测B细胞和辅助T细胞抗原表位，最后分析蛋白质的二级结构以进一步验证筛选出的抗原表位是否处于抗原性和亲水性的区域。
而且，所述分析蛋白质一级结构所用方法为TMHMM工具和SignalP工具，预测B细胞抗原表位采用ABCpred和BepiPred方法，预测辅助T细胞抗原表位采用在线工具RANKPEP和SYFPEITHI，分析蛋白质的二级结构则使用SOPMA和DNASTAR软件。
而且，所述步骤⑵的具体方法为：将步骤⑴获得的所述B细胞和辅助T细胞表位的片段，按GAPDH-SsnA-Enolase的顺序依次进行拼接，完成后在重组多肽的N端添加树突状细胞靶向肽序列，各片段间用4个甘氨酸(GGGG)短肽进行分割，完成重组蛋白氨基酸序列的设计；最后在序列两端添加酶切位点，获得编码所述重组蛋白GSE的核苷酸序列，进而构建包含目的基因的重组原核表达载体。
而且，添加的树突状细胞靶向肽序列为SEQ ID NO.3：FYPSYHSTPQRP；
或者，所述序列两端添加的酶切位点分别为BamH1和XhoI；
或者，所述重组原核表达载体为pET-28a-GSE。
而且，所述步骤⑶的具体方法为：
将步骤⑵获得的所述原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中，经鉴定后用IPTG作为诱导剂在最适的表达条件下表达，并采用His镍柱纯化的方法纯化重组蛋白；
其中，所述最适的表达条件为：诱导剂IPTG终浓度1mmol/L，37℃下诱导，设置转速180rpm，诱导时间6h。
而且，所述猪链球菌疫苗重组蛋白GSE还经过如下处理：
重组蛋白的细胞毒性检验；
具体方法为：
将细胞悬液接种到96孔板，预培养24h，再将步骤⑶获得的纯化后的重组蛋白梯度稀释，加到96孔板中，按蛋白浓度设置7个实验组，终浓度分别为500μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml，并设置对照组，继续培养24h，加入CCK8溶液计算细胞存活率。
较优地，所述细胞分别为RAW246.7(小鼠单核巨噬细胞)、PK15(猪肾细胞)、MARC145(非洲绿猴胚胎肾细胞)。
如上所述的重组蛋白GSE在制备用于预防猪链球菌病的疫苗方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、针对猪链球菌病的灭活苗和弱毒苗型间交叉保护效果并不好，且存在一定的生物安全性问题，本发明基于猪链球菌保护性抗原表位的筛选，设计而成的重组蛋白能够用于猪链球菌病疫苗的制备中，本发明提供的这种重组蛋白可在安全的条件下高效制备，具有良好的实用性。
2、本发明应用生物信息学软件将猪链球菌的3个保护性抗原：三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶(Enolase)、DNA核酸酶(SsnA)的B细胞和辅助T细胞表位串联，并在序列的N端添加了树突状细胞靶向肽，设计了重组蛋白GSE的氨基酸序列，构建了原核表达载体pET-28a-GSE，并通过大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行表达，表达出的蛋白经纯化后进行了细胞毒性实验，进一步验证了本发明重组蛋白的安全性。
附图说明
图1为本发明中使用TMHMM工具分析三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)跨膜区域结果图；
图2本发明中使用TMHMM工具分析DNA核酸酶(SsnA)跨膜区域结果图；
图3本发明中使用TMHMM工具分析烯醇化酶(Enolase)跨膜区域结果图；
图4本发明中使用SignalP工具分析三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)信号肽区域结果图；
图5本发明中使用SignalP工具分析DNA核酸酶(SsnA)信号肽区域结果图；
图6本发明中使用SignalP工具分析烯醇化酶(Enolase)信号肽区域结果图；
图7本发明中使用SOPMA软件分析三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)二级结构结果图；
图8本发明中使用SOPMA软件分析DNA核酸酶(SsnA)二级结构结果图；
图9本发明中使用SOPMA软件分析醇化酶(Enolase)二级结构结果图；
图10本发明中使用DNASTAR软件分析三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)亲水性和抗原性结果图；
图11本发明中使用DNASTAR软件分析DNA核酸酶(SsnA)亲水性和抗原性结果图；
图12本发明中使用DNASTAR软件分析醇化酶(Enolase)亲水性和抗原性结果图；
图13本发明中重组质粒双酶切鉴定结果图；其中，泳道M为DNA核苷酸大小标准(DNA Maker)；泳道1和2为质粒pET-28a-GSE酶切结果，酶切后质粒为5369bp，目的基因片段为1131bp；
图14本发明中表达菌株PCR鉴定结果图；其中，泳道M为DNA核苷酸大小标准(DNAMaker)；泳道1和2为扩增的基因片段，大小为1131bp；
图15本发明中蛋白表达诱导时间优化结果图；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Maker)；泳道1为表达菌株诱导2h后结果；泳道2为表达菌株诱导4h后结果；泳道3为表达菌株诱导6h后结果；泳道4为空载体诱导6h后结果；重组蛋白分子量为45.3kD；
图16本发明中蛋白表达诱导剂浓度优化结果图；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Maker)；泳道1为IPTG终浓度0.5mmol/L时的诱导结果；泳道2为IPTG终浓度1mmol/L时的诱导结果；泳道3为IPTG终浓度1.5mmol/L时的诱导结果；泳道4为空载体在IPTG终浓度1mmol/L时的诱导结果；
图17本发明中蛋白可溶性检测结果图；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Maker)；泳道1为超声破碎后上清；泳道2为超声破碎后沉淀；
图18本发明中蛋白纯化结果图；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Maker)；泳道1为过滤后上清；泳道2为上样后流出液；泳道3为平衡缓冲液洗涤流出液；泳道4为100mmol/L咪唑洗脱流出液；泳道5为200mmol/L咪唑洗脱流出液；泳道6为300mmol/L咪唑洗脱流出液；泳道7为400mmol/L咪唑洗脱流出液；
图19本发明中重组蛋白对PK15(猪肾细胞)、RAW246.7(小鼠单核巨噬细胞)、MARC145(非洲绿猴胚胎肾细胞)的毒性检验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量；本发明中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一种用作猪链球菌疫苗的重组蛋白GSE，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。
编码如上所述的重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
如上所述的重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
⑴B细胞和辅助T细胞抗原表位筛选；
⑵B细胞和辅助T细胞抗原表位串联基因设计及质粒构建；
⑶重组蛋白的原核表达和纯化，即得猪链球菌疫苗重组蛋白GSE。
较优地，所述步骤⑴的具体方法为：根据猪链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶(Enolase)、DNA核酸酶(SsnA)的氨基酸序列，应用生物信息学软件，分析蛋白质一级结构，在抗原表位筛选时排除跨膜区域和信号肽区域，而后预测B细胞和辅助T细胞抗原表位，最后分析蛋白质的二级结构以进一步验证筛选出的抗原表位是否处于抗原性和亲水性的区域。
较优地，所述分析蛋白质一级结构所用方法为TMHMM工具和SignalP工具，预测B细胞抗原表位采用ABCpred和BepiPred方法，预测辅助T细胞抗原表位采用在线工具RANKPEP和SYFPEITHI，分析蛋白质的二级结构则使用SOPMA和DNASTAR软件。
较优地，所述步骤⑵的具体方法为：将步骤⑴获得的所述B细胞和辅助T细胞表位的片段，按GAPDH-SsnA-Enolase的顺序依次进行拼接，完成后在重组多肽的N端添加树突状细胞靶向肽序列，各片段间用4个甘氨酸(GGGG)短肽进行分割，完成重组蛋白氨基酸序列的设计；最后在序列两端添加酶切位点，获得编码所述重组蛋白GSE的核苷酸序列，进而构建包含目的基因的重组原核表达载体。
较优地，添加的树突状细胞靶向肽序列为SEQ ID NO.3：FYPSYHSTPQRP；
或者，所述序列两端添加的酶切位点分别为BamH1和XhoI；
或者，所述重组原核表达载体为pET-28a-GSE。
较优地，所述步骤⑶的具体方法为：
将步骤⑵获得的所述原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中，经鉴定后用IPTG作为诱导剂在最适的表达条件下表达，并采用His镍柱纯化的方法纯化重组蛋白；
其中，所述最适的表达条件为：诱导剂IPTG终浓度1mmol/L，37℃下诱导，设置转速180rpm，诱导时间6h。
较优地，所述猪链球菌疫苗重组蛋白GSE还经过如下处理：
重组蛋白的细胞毒性检验；
具体方法为：
将细胞悬液接种到96孔板，预培养24h，再将步骤⑶获得的纯化后的重组蛋白梯度稀释，加到96孔板中，按蛋白浓度设置7个实验组，终浓度分别为500μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml，并设置对照组，继续培养24h，加入CCK8溶液计算细胞存活率。
较优地，所述细胞分别为RAW246.7(小鼠单核巨噬细胞)、PK15(猪肾细胞)、MARC145(非洲绿猴胚胎肾细胞)。
如上所述的重组蛋白GSE在制备用于预防猪链球菌病的疫苗方面中的应用。
本发明的相关制备及检测实施例如下：
实施例1
抗原表位筛选：
1、蛋白质一级结构分析
NCBI公布的猪链球菌GAPDH、SsnA、Enolase的蛋白质氨基酸序列，登录号分别为AKG39592.1、ABP90934.1、ACS66679.1，序列长度分别为336aa、1059aa、435aa。根据GAPDH、SsnA、enolase的蛋白质氨基酸序列，应用TMHMM工具分析蛋白质跨膜区域。应用SignalP工具分析蛋白质信号肽区域。
应用TMHMM工具分析结果显示，GAPDH蛋白不存在跨膜区域，其336个氨基酸均为胞外片段(如图1所示)。SsnA蛋白存在2个跨膜区域，N端1-27位的氨基酸为胞内片段，28-50位为跨膜片段，C端1054-1059位的氨基酸为胞内片段，1036-1053位为跨膜片段(如图2所示)。Enolase蛋白其435个氨基酸均为胞外片段，同GAPDH蛋白一样不存在跨膜区域(如图3所示)。
应用SignalP工具分析结果显示，GAPDH蛋白和Enolase蛋白不存在信号肽(如图4和图6所示)，而SsnA蛋白的1-56位氨基酸很有可能是信号肽片段(如图5所示)。重组表位疫苗的设计应避开胞内、跨膜区域及信号肽段。
2、B细胞抗原表位预测
B细胞表位预测采用ABCpred方法(人工神经网络算法)，以及基于氨基酸的亲水性、柔韧性、可及性、极性、暴露表面、转角和隐形马尔可夫模型的BepiPred方法。然后选取两种方法的重叠部分，获得蛋白的B细胞抗原表位。
采用ABCpred方法，预测获得的GAPDH、SsnA、Enolase蛋白的B细胞表位，如表1所示。采用BepiPred方法，预测获得的GAPDH、SsnA、Enolase蛋白的B细胞表位，如表2所示。综合这2种方法的预测结果，得到GAPDH蛋白的B细胞表位为(以在氨基酸序列中的位置表示)：57-66、76-88、189-198、266-278的肽段；得到SsnA蛋白的B细胞表位为：172-185、189-200、394-403、520-530、971-986的肽段；得到Enolase蛋白的B细胞表位为：13-21、98-106、204-219、293-303、372-379的肽段。
表1 ABCpred方案预测的猪链球菌蛋白B细胞表位肽段位置
Figure BDA0002747027850000071
表2 BepiPred方案预测的猪链球菌蛋白B细胞表位肽段位置
Figure BDA0002747027850000072
3、辅助T细胞(Th)抗原表位预测
辅助T细胞表位采用在线工具RANKPEP和在线工具SYFPEITHI进行预测，预测类型为HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1101及HLA-DRB1*1501结合肽，得到9个或15个氨基酸长度的辅助T细胞表位，表3列出由2种方法预测的分值较高且有候选意义的辅助T细胞表位数目情况。综合这2种方法的预测结果，最终选择的GAPDH蛋白Th表位为(以在氨基酸序列中的位置表示)：7-15、300-308、320-328的肽段；SsnA蛋白Th表位为：441-449、643-651、785-793、792-799的肽段；Enolase蛋白Th表位为：59-67、80-88、189-197、366-374的肽段。
表3在线工具RANKPEP和SYFPEITHI预测的辅助T细胞表位综合分析
Figure BDA0002747027850000081
4、蛋白质二级结构分析
蛋白的二级结构是计算机预测抗原表位的重要参数之一，无规卷曲区域和β转角区域，多出现在蛋白分子表面，有利于与抗体结合，较可能成为抗原表位。而α螺旋和β折叠区域则不易变形，较难结合抗体，一般不作为抗原表位，因此，利用SOPMA软件对GAPDH、SsnA、Enolase蛋白的二级结构进行分析，并使用DNASTAR软件预测这3种蛋白亲水性和抗原性较强的区域，进一步验证筛选出的抗原表位。
SOPMA软件分析结果如图7、图8、图9所示。分析结果显示这3种蛋白的B/Th表位基本均处于无规卷曲与β转角区域，表明预测的结果比较准确。再使用DNASTAR软件预测这3种蛋白的亲水性和抗原性，结果如图10、图11、图12所示。预测结果显示这3种蛋白的B/Th表位也基本处于亲水性和抗原性较好的区段，同样说明前期预测的结果较为合理。
实施例2
重组蛋白设计及质粒构建：
将预测获得的B细胞和辅助T细胞表位，按GAPDH-SsnA-Enolase的顺序依次进行拼接，并在重组多肽的N端添加树突状细胞靶向肽序列(序列为FYPSYHSTPQRP)，各肽段间用4个甘氨酸(GGGG)短肽进行连接。串联完成后得到重组蛋白的氨基酸序列，共373个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。
将氨基酸序列翻译为核苷酸序列，随后根据大肠杆菌密码子偏好性对得到的序列进行优化，并在序列N端添加酶切位点BamH1，序列C端添加酶切位点XhoI，最终获得重组蛋白GSE的核苷酸序列，共1131个核苷酸，如SEQ ID NO.2所示。将序列送至上海捷瑞生物工程有限公司合成，并构建载体，以pET-28a(+)作为原核表达载体，得到GAPDH-SsnA-Enolase表位串联蛋白重组质粒pET-28a-GSE。
实施例3
重组蛋白的原核表达和纯化：
1、重组质粒转化
1)制备卡那霉素浓度为50μg/ml的LB/Kan平板。
2)取100μL冰浴上融化的BL21(DE3)感受态细胞。
3)在超净台内，取20ng重组质粒与感受态细胞混合，混匀后，保持冰浴30min。
4)冰浴结束，迅速放置于42℃水浴中，热激45s，立即转移至冰浴2min。
5)完成后在反应管中加入不含抗生素的500μLLB培养液，置于37℃，200rpm培养1h，使细菌复苏。
6)吸取已转化的感受态细胞，用涂布棒均匀涂布于LB/Kan平板，让其自然干燥5～10min，37℃倒置培养过夜。观察菌落生长情况，待菌落长到适当大小即可用于下游试验。
2、重组质粒双酶切鉴定
挑取LB/Kan平板上的单克隆菌落，接种到LB/Kan液体培养基，37℃过夜培养，取5ml菌液，按说明书所述方法，使用质粒小提试剂盒提取质粒。将重组质粒用BamH1和XhoI进行双酶切，酶切体系为：10×FlyCut Buffer 5μL，BamH1和XhoI酶各1μL，质粒10μL，ddH2O33μL，体系共50μL。37℃酶切15min，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果可见5369bp的载体条带和1131bp的目的条带(如图13所示)，与预期大小一致。
3.重组质粒PCR鉴定
GSE蛋白上游引物：5’-TTTTATCCGTCATATCATAGTACCCCGC-3’，GSE蛋白下游引物：5’-ACCGCGTGCACGCAGAATT-3’，由上海生工生物公司合成。利用菌落PCR的方法进行鉴定，扩增体系：DNA模板5μL，10×PCRbuffer2.5μL，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，上、下游引物各1μL，Taq酶0.5μL，ddH2O 13μL，体系共25μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃10min。以1％琼脂糖核酸凝胶电泳检测PCR产物。结果显示，扩增产物与预期的目的片段大小一致(如图14所示)，测序结果显示与设计的重组蛋白(GSE蛋白)的核苷酸序列一致。
4、重组蛋白诱导表达
1)IPTG诱导时间的确定
挑单克隆接种于5mL的LB/Kan液体培养基中，在37℃下振荡培养过夜，取过夜培养的菌液按1:50的比例接种于10mLLB/Kan液体培养基中，继续振荡培养3～4h，当OD600值约为0.5时，向菌液中加入诱导剂IPTG使其终浓度为1mmol/L，37℃下诱导，设置转速为180rpm，分别诱导2h、4h、和6h，另外用空载体1mmol/LIPTG诱导6h做阴性对照。诱导完成后，将菌液12000rpm离心1min，弃上清，用80μL无菌PBS重悬菌体，并加入20μL的5×蛋白上样缓冲液，100℃水浴加热10min，制备蛋白质样品进行SDS-PAGE检测，结果显示在诱导6h后蛋白表达量最大(如图15所示)。
2)IPTG诱导浓度的确定
根据1)确定的最佳诱导时间，分别设定不同的IPTG终浓度：0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L，诱导至最佳时间时停止诱导，另外用空载体1mmol/LIPTG诱导6h做阴性对照。按1)所述方法制备蛋白质样品进行SDS-PAGE检测，结果显示诱导剂浓度对蛋白表达量影响不明显(如图16所示)。
3)蛋白可溶性检测
取200μL过夜培养的菌液加到10mL的LB/Kan液体培养基中，按照得到的最佳诱导条件进行诱导表达，将诱导后的菌液12000rpm离心1min，弃上清，用无菌PBS洗涤菌体并重悬，置冰浴中进行超声破碎，待菌液清亮时，4℃，12,000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，并用无菌PBS重悬沉淀，按1)所述方法制备蛋白质样品。以小鼠抗6×His单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，进行WesternBlot分析，确定表达产物是可溶性的(存在于上清中)还是以包涵体形式存在的(存在于沉淀中)。结果显示表达的重组蛋白主要存在于上清中(如图17所示)。
5、重组蛋白的纯化
1)将诱导后的菌液离心，弃上清，用无菌PBS洗涤菌体并重悬，置冰浴中进行超声破碎，离心后收集上清，用0.45um滤膜过滤，收集滤液，标记为1号。
2)将Ni-NTA Resin加入层析柱，用平衡缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mMimidazole，10mM Tris base，pH8.0)平衡层析柱。
3)将过滤后的上清加到层析柱中，收集流出液，标记为2号。
4)用平衡缓冲液洗涤层析柱，收集流出液，标记为3号。
5)用平衡缓冲液配置100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L的咪唑溶液以梯度洗脱目的蛋白。
将100mmol/L咪唑溶液加到层析柱中，收集流出液，标记为4号。
将200mmol/L咪唑溶液加到层析柱中，收集流出液，标记为5号。
将300mmol/L咪唑溶液加到层析柱中，收集流出液，标记为6号。
将400mmol/L咪唑溶液加到层析柱中，收集流出液，标记为7号。
用平衡缓冲液洗涤层析柱，完成后用20％的乙醇封存层析柱，4℃保存。
分别取80μL标记为1、2、3、4、5、6、7号的流出液，加入20μL的5×蛋白上样缓冲液，100℃水浴加热10min，制备蛋白质样品进行SDS-PAGE检测，结果显示，以200mmol/L咪唑溶液洗脱可以得到纯化的重组蛋白(如图18所示)。
6、蛋白浓度测定
1)蛋白超滤浓缩：将纯化后的蛋白液加到截留分子量为10kDa超滤管中，按说明书所述方法浓缩蛋白液。
2)BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度：取浓缩后的蛋白液，按说明书所述方法检测蛋白浓度，结果显示蛋白浓度为5.38mg/ml。将重组蛋白保存于PBS溶液中，-80℃储存。
实施例4
重组蛋白细胞毒性检验：
将RAW246.7(小鼠单核巨噬细胞)、PK15(猪肾细胞)、MARC145(非洲绿猴胚胎肾细胞)正常传代，当细胞汇合率到90％左右时用胰酶消化细胞，并进行细胞计数，以1×105/ml的细胞密度接种到96孔板，每孔加100μL，在细胞培养箱中预培养24h。
将重组蛋白梯度稀释加到96孔板中，按蛋白浓度设置7个实验组，终浓度分别为500μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml，并设置对照组，每组设置5个复孔。重组蛋白作用于细胞24h后，向每孔中加入10μL的CCK8溶液，置于培养箱中孵育1h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度并记录数据，计算细胞相对增值率(RGR)。RGR＝(实验组OD450平均值/对照组OD450平均值)×100％(平均值为弃掉最高值与最低值后余下3个孔的均值)。结果显示不同浓度的重组蛋白作用于RAW246.7、PK15、MARC145这三种细胞24h后，最高浓度的实验组细胞相对增值率也在92％以上，实验组的细胞存活率与对照组相比并无明显差异(如图19所示)，说明重组蛋白对细胞无毒性。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
相关序列可以如下：
Figure BDA0002747027850000121
Figure BDA0002747027850000131
Figure BDA0002747027850000141
序列表
<110> 天津农学院
<120> 一种猪链球菌疫苗重组蛋白GSE及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 373
<212> PRT
<213> 串联完成后得到重组蛋白GSE的氨基酸序列(Unknown)
<400> 1
Phe Tyr Pro Ser Tyr His Ser Thr Pro Gln Arg Pro Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ala Glu Arg Glu Pro Gly Asn Ile Asp Trp Ala Thr Asp Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Asp Gly Pro His Arg Gly Gly Asp Leu Arg Gly Gly Gly Gly Thr
35 40 45
Val Glu Val Lys Asp Gly Gly Phe Glu Gly Gly Gly Gly Ala Ala Thr
50 55 60
Glu Ser Phe Gly Tyr Thr Glu Asp Gln Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr
65 70 75 80
Ala Gln Leu Val Arg Thr Leu Gly Gly Gly Gly Ile Glu Val Asp Gly
85 90 95
Glu Gln Leu Val Gly Gly Gly Gly Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Leu Ala Gln Phe Asp Pro Glu Gln Asp Ala Leu
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ile Gln Gly Ala Ser His Gln Ser Pro Leu Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Thr Ser Glu Asn Thr Ala Thr Lys Pro Ser Asp Leu Val Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ala Thr Val Arg Ser Gly Ala Gln Gly Thr Glu Tyr
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Asp Asp Ser Gly Thr Val Asn Asn Ser Asp Asp Asn
180 185 190
Gly Thr Thr Asn Gly Gly Gly Gly Trp Ala Ala Val Arg Lys Thr Leu
195 200 205
Ala Gly Gly Gly Gly Ile Pro Asn Asp Asp Lys Leu Thr Ile Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ile Asp Pro Thr Asn Pro Ala Trp Ala Gly Gly Gly Gly Ile
225 230 235 240
Asn Ile Phe Thr Asp Lys Leu Lys Gly Gly Gly Gly Leu Asp Ser Arg
245 250 255
Gly Asn Pro Thr Leu Gly Gly Gly Gly Asp Gly Met Asp Glu Asn Asp
260 265 270
Trp Asp Gly Trp Gly Gly Gly Gly Asp Gly Thr Pro Asn Lys Gly Lys
275 280 285
Leu Gly Gly Gly Gly His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Lys Phe Glu Gly Thr Glu Asp Gly
305 310 315 320
Val Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Ala Val Val Ser His Arg Ser Gly Gly
325 330 335
Gly Gly Tyr Leu Gly Leu Gly Thr Gln Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ile
340 345 350
Gly Phe Asp Val Arg Asp Gln Gln Gly Gly Gly Gly Leu Lys Lys Ile
355 360 365
Leu Arg Ala Arg Gly
370
<210> 2
<211> 1131
<212> DNA/RNA
<213> 获得重组蛋白GSE的核苷酸序列(Unknown)
<400> 2
ggatcctttt atccgtcata tcatagtacc ccgcagcgtc cgggcggcgg tggtgcagaa 60
cgtgaaccgg gtaatattga ttgggccacc gatggtggtg gcggtgatgg cccgcatcgt 120
ggcggcgatc tgcgcggcgg cggtggcacc gttgaagtta aagatggtgg ttttgaaggt 180
ggtggcggcg ccgcaaccga atcttttggt tataccgaag atcagctggg cggtggtggt 240
tataccgccc agttagtgcg taccctgggt ggcggtggca ttgaagttga tggtgaacag 300
ttagttggtg gtggcggcat taatggcttt ggtcgtattg gtcgtggcgg tggtggcctc 360
gcccagtttg atccggaaca ggatgcctta ggcggtggtg gcattcaggg tgcaagccat 420
cagagtccgc tgggtggcgg cggtacctca gaaaataccg ccaccaaacc gtctgattta 480
gtgtcaggtg gcggcggcgc aaccgttcgc tcaggtgcac agggcaccga atatggtggc 540
ggtggcgatg attcaggcac cgttaataat agcgatgata atggtaccac caatggcggt 600
ggcggctggg ccgcagtgcg taaaacctta gcaggtggcg gcggtattcc gaatgatgat 660
aaactgacca ttggtggtgg tggcattgat ccgaccaatc cggcctgggc aggcggcggc 720
ggtattaata tttttaccga taaactgaaa ggtggcggcg gtctggattc tcgcggcaat 780
ccgaccttag gcggtggcgg cgatggtatg gatgaaaatg attgggatgg ctggggcggc 840
ggtggcgatg gtaccccgaa taaaggcaaa ttaggtggtg gcggtcatcg ctcaggtgaa 900
accgaagatg gcggtggtgg tgatgaaggc ggctttgccc cgaaatttga aggcaccgaa 960
gatggtgttg gcggtggtgg ctataccgcc gttgtgtcac atcgctcagg cggtggcggc 1020
tatctgggtt taggtaccca gaaagcaggc ggcggcggta ttggttttga tgttcgcgat 1080
cagcagggcg gcggtggcct gaaaaaaatt ctgcgtgcac gcggtctcga g 1131
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 树突状细胞靶向肽序列(Unknown)
<400> 3
Phe Tyr Pro Ser Tyr His Ser Thr Pro Gln Arg Pro
1 5 10

Claims (10)

1.一种用作猪链球菌疫苗的重组蛋白GSE，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.编码如权利要求1所述的重组蛋白GSE的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
3.如权利要求1所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
⑴B细胞和辅助T细胞抗原表位筛选；
⑵B细胞和辅助T细胞抗原表位串联基因设计及质粒构建；
⑶重组蛋白的原核表达和纯化，即得猪链球菌疫苗重组蛋白GSE。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴的具体方法为：根据猪链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶、烯醇化酶、DNA核酸酶的氨基酸序列，应用生物信息学软件，分析蛋白质一级结构，在抗原表位筛选时排除跨膜区域和信号肽区域，而后预测B细胞和辅助T细胞抗原表位，最后分析蛋白质的二级结构以进一步验证筛选出的抗原表位是否处于抗原性和亲水性的区域。
5.根据权利要求4所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：所述分析蛋白质一级结构所用方法为TMHMM工具和SignalP工具，预测B细胞抗原表位采用ABCpred和BepiPred方法，预测辅助T细胞抗原表位采用在线工具RANKPEP和SYFPEITHI，分析蛋白质的二级结构则使用SOPMA和DNASTAR软件。
6.根据权利要求3所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵的具体方法为：将步骤⑴获得的所述B细胞和辅助T细胞表位的片段，按GAPDH-SsnA-Enolase的顺序依次进行拼接，完成后在重组多肽的N端添加树突状细胞靶向肽序列，各片段间用4个甘氨酸短肽进行分割，完成重组蛋白氨基酸序列的设计；最后在序列两端添加酶切位点，获得编码所述重组蛋白的核苷酸序列，进而构建包含目的基因的重组原核表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：添加的树突状细胞靶向肽序列为SEQ ID NO.3；
或者，所述序列两端添加的酶切位点分别为BamH1和XhoI；
或者，所述重组原核表达载体为pET-28a-GSE。
8.根据权利要求3所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：所述步骤⑶的具体方法为：
将步骤⑵获得的所述原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中，经鉴定后用IPTG作为诱导剂在最适的表达条件下表达，并采用His镍柱纯化的方法纯化重组蛋白；
其中，所述最适的表达条件为：诱导剂IPTG终浓度1mmol/L，37℃下诱导，设置转速180rpm，诱导时间6h。
9.根据权利要求3至8任一项所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：所述猪链球菌疫苗重组蛋白GSE还经过如下处理：
重组蛋白GSE的细胞毒性检验；
具体方法为：
将细胞悬液接种到96孔板，预培养24h，再将步骤⑶获得的纯化后的重组蛋白梯度稀释，加到96孔板中，按蛋白浓度设置7个实验组，终浓度分别为500μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml，并设置对照组，继续培养24h，加入CCK8溶液计算细胞存活率。
10.如权利要求1所述的重组蛋白GSE在制备用于预防猪链球菌病的疫苗方面中的应用。
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