CN111235129A

CN111235129A - 一种PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用

Info

Publication number: CN111235129A
Application number: CN202010072551.4A
Authority: CN
Inventors: 闫东科; 宫艳超; 许凤霞; 李陇梅; 吕平; 李冬
Original assignee: Tianjin Vocational Institute
Current assignee: Tianjin Vocational Institute
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2020-06-05

Abstract

本发明公开了一种PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用，本发明利用NdeΙ和HindⅢ将ppk2基因插入到原核表达载体pET30a中，重组表达载体通过物理法转入大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中，利用IPTG诱导目的蛋白PPK2在37℃、25℃和16℃下试表达，并通过SDS‑PAGE电泳和Western Blotting鉴定分析表达产物；最后，利用3.2L表达菌液进行放大培养，表达产物先后经Ni‑IDA亲和色谱柱、阳离子交换色谱柱和凝胶过滤色谱柱分离纯化。结果显示：大肠原核表达系统可在16℃、终浓度为0.2mM·L^‑1的IPTG诱导下稳定高效表达，PPK2蛋白带电性质专一，在溶液中以单体形式存在，性质稳定，不易发生降解，半衰期长，具有用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品的应用前景。

Description

一种PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用。

背景技术

蛋白标准品的主要作用是用来指示蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳泳道上蛋白条带所对应的分子量大小，是阳性对照，只有标准品准确无误，实验结果才有说服力。除此之外，蛋白标准品还有表示Western Blotting时转膜成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等作用，所以选择正确的蛋白标准品是分子生物学实验取得成功的必要条件之一。

多聚磷酸激酶2(Polyphosphate kinase 2,PPK2)在众多病原菌的致病性中发挥重要作用，而人等后生动物体内未发现ppk2基因，因而PPK2是新型抗生素开发的靶点。但以PPK2蛋白作为聚丙烯酰胺凝胶电泳的标准品的相关研究未见报道。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种PPK2蛋白，所述PPK2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明还提出一种如上所述的PPK2蛋白的编码基因。

可选地，所述PPK2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：

本发明还进一步提出一种包含如上所述PPK2蛋白的编码基因的表达载体或表达工程菌。

可选地，所述PPK2蛋白表达载体是将上述PPK2蛋白的编码基因插入到原核细胞表达质粒的NdeΙ和HindⅢ酶切位点之间得到。

可选地，所述原核细胞表达质粒选用pET30a作为亲本表达载体。

本发明还提出如上所述的PPK2蛋白在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用。

本发明还提出如上所述的PPK2蛋白的制备方法，如下所述：

重组表达质粒PPK2/pET30a通过物理法转入大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中，利用0.2mM·L^-1终浓度的IPTG诱导3.2L表达菌株(液)中的目的蛋白PPK2在16℃下表达，经系列色谱法纯化后浓度可达10mg·mL^-1，纯度为95％。

本发明的优点和有益效果为：

1、将PPK2蛋白与Western Blotting电泳标准品14～100kd(100、70、50、40、30、25、14)一同进行SDS-PAGE电泳分析，发现PPK2蛋白条带清晰，泳道上无其它条带，且位于30kd处。

2、将PPK2蛋白与常用SDS-PAGE电泳标准品12～80kd(12、20、30、40、60、80)一同进行SDS-PAGE电泳分析，发现PPK2蛋白条带染色完全，条带清晰，所在泳道无其它条带，且正好位于30kd处。

3、阳离子交换色谱和凝胶过滤色谱分析表明，PPK2蛋白带电性质专一，在溶液中以单体形式存在，性质稳定，不易发生降解，半衰期长。这与部分已商用的单条带蛋白标准品相比具有明显优势，有些商用的标准品在使用过程中会发生降解，导致电泳结束后凝胶上没有标准品条带。

4、如前所述利用3.2L表达菌液即可纯化出浓度为10mg·mL^-1，纯度为95％的PPK2蛋白，可见采用大肠杆菌原核表达系统表达PPK2蛋白的效率很高，适合利用该系统制备PPK2蛋白标准品。

附图说明

图1：PPK2/pET30a重组表达载体图谱。

图2：PPK2/pET30a重组表达质粒双酶切鉴定。C：对照(重组表达质粒)；PD：重组质粒的NdeΙ和HindⅢ双酶切；M：DNA标志物。

图3：SDS-PAGE分析PPK2蛋白试表达情况。M：蛋白分子质量标准；C：对照(未加IPTG)；T1：16℃诱导16h；T2：25℃诱导16h；T3：37℃诱导16h。

图4：Western Blotting鉴定PPK2蛋白16℃下表达情况。WM：Western Blotting蛋白分子质量标准；T1：16℃诱导16h。

图5：PPK2过Ni-IDA亲和柱纯化结果。s：全菌破菌离心后上清；ie：上清同Ni-IDA孵育后流出液；M：蛋白分子质量标准；A1：50mM·L^-1咪唑洗脱组分；A2-A3：100mM·L^-1咪唑洗脱组分；A4-A8：300mM·L^-1咪唑洗脱组分。

图6：PPK2蛋白的阳离子交换色谱纯化。

图7：阳离子交换色谱纯化PPK2蛋白的SDS-PAGE分析。S22-S26：蛋白收集管；M：蛋白分子质量标准。

图8：PPK2蛋白的凝胶色谱纯化。

图9：凝胶色谱纯化PPK2蛋白的SDS-PAGE分析。D24-D30：24-30蛋白收集管；M：蛋白分子质量标准。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

目的基因与质粒：以质粒pET30a作为表达载体(卡那霉素抗性，PPK2蛋白N端仅含有6×His标签，纯化过程中未切除)，PPK2目的基因由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

主要试剂：限制性核酸内切酶(NdeΙ、HindⅢ)和DNA Marker购自美国Thermo公司；SDS-PAGE Marker、Western Blotting Marker均购自全式金(北京)生物技术有限公司；DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术(上海)有限公司；AKTA蛋白纯化仪、Ni-IDA亲和柱、阳离子交换柱HitrapSP以及凝胶过滤色谱柱Superdex200 Increase10/300GL均购自美国GE公司。

实施例1：生物信息学预测

从NCBI数据库获得PPK2蛋白的氨基酸序列后(WP_AGG33389.1)，利用PSIPRED网站(http://web.expasy.org/protparam)预测PPK2蛋白的二级结构；利用ExPASy网站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测PPK2基本理化性质。

实施例2：全质粒酶切和测序

利用限制性核酸内切酶NdeΙ和HindⅢ酶切由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成的重组表达质粒PPK2/pET30a以进行质粒双酶切鉴定，在DNA琼脂糖凝胶电泳实验的结果中应有一个5250bp的条带和1个798bp的条带；同时，将PPK2/pET30a重组表达质粒交由金维智生物科技有限公司完成目的基因PPK2测序工作。最终，确认重组表达载体的准确性。

实施例3：PPK2蛋白试表达与鉴定

将上述构建正确的重组表达质粒PPK2/pET30a转化到大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上(含50μg·mL^-1的卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4ml的LB培养基中(含50μg·mL^-1的卡那霉素)，于37℃、220r/min恒温摇床中培养，待培养至OD₆₀₀值为0.5-0.8时，向试管培养液中加入IPTG使其终浓度为0.2mM·L^-1，之后分别置于16℃、25℃、37℃条件下诱导表达。将诱导后的培养液经12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清进行SDS-PAGE电泳。基于电泳结果，通过Western Blotting实验进一步分析鉴定PPK2蛋白的表达情况。

实施例4：PPK2蛋白的放大培养

根据上述试表达结果确定出最优诱导表达PPK2蛋白的温度为16℃，采用培养3.2L的表达菌液进行放大培养。当菌液OD₆₀₀值为0.8时，使菌液温度由37℃降低至16℃，并加入IPTG使终浓度为0.2mM·L^-1，16℃诱导PPK2表达16～18h后收集菌体。

实施例5：Ni-IDA亲和层析纯化

全菌采用50mM·L^-1Tris-HCl(pH8.0)、300mM·L^-1NaCl、20mM·L^-1咪唑含1％TritonX-100、1mM·L^-1DTT、1mM·L^-1PMSF超声裂解，同时以该Tris-HCl(pH8.0)缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑缓冲液洗脱目的蛋白PPK2，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE电泳分析检测。

实施例6：阳离子交换色谱和凝胶过滤色谱纯化

将PPK2蛋白洗脱液使用超滤管浓缩后，利用AKTA蛋白纯化仪进行后续纯化。首先使用阳离子交换柱(HitrapSP)进行分离纯化，根据目的蛋白PPK2的出峰位置，对收集的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。取蛋白纯度较高的收集液浓缩至体积500μl，利用凝胶过滤色谱柱(Superdex200)进一步纯化，并根据凝胶色谱图中的出峰位置，对收集的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。将浓度和纯度较高的PPK2蛋白洗脱液混合浓缩后分装，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定浓度后置于-80℃冰箱内保存。

结果

1、PPK2蛋白生物信息学预测

利用网站ExPASy(http://web.expasy.org/protparam)统计、分析β变形菌PPK2蛋白的基本理化性质(如表1)。根据表1中PPK2等电点(pI)为9.3可知：目的蛋白PPK2在后续的分离纯化过程中可选用pH8.0，50mM·L^-1Tris-HCl缓冲液以进行阳离子交换色谱柱分离纯化。

表1 PPK2基本理化性质

利用PSIPRED网站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测β变形菌PPK2蛋白的二级结构，PPK2不存在跨膜结构域和信号肽，因而应为胞内可溶性蛋白，且PPK2中的α螺旋和β折叠片层分布较为均匀。

2、PPK2/pET30a重组表达质粒双酶切鉴定

PPK2/pET30a重组表达载体(如图1)全长6048bp，利用限制性核酸内切酶NdeΙ和HindⅢ进行重组表达质粒双酶切鉴定，经1％琼脂糖凝胶电泳分析，在同一泳道上应有一个5250bp的条带和一个798bp的条带。如图2与上述预期相符。

3、PPK2蛋白试表达与鉴定

试表达产生的PPK2蛋白N端仅含有6×His标签，根据上述表1中PPK2蛋白分子量预测结果，16℃、25℃、37℃下诱导的试表达产物在SDS-PAGE电泳上的条带分子量应约为30kd。如图3与预期大小相一致，且16℃下诱导表达的PPK2蛋白表达量与状态更为理想，后续放大培养阶段选择在16℃下进行。为进一步确定上述实验结果，对16℃下的试表达菌液进行Western Blotting分析，结果显示，抗PPK2蛋白N端6×His标签的抗体曝光位置同样位于30kd(如图4)。

4、Ni-IDA亲和层析分离PPK2蛋白

将3.2L用于放大培养的表达菌液经IPTG诱导、超声破碎、离心后过Ni-IDA亲和色谱柱，SDS-PAGE电泳分析不同浓度咪唑洗脱PPK2蛋白情况。如图5，PPK2蛋白存在于全菌破菌离心后上清，蛋白可溶性良好，300mM·L^-1咪唑可充分洗脱PPK2蛋白，且蛋白纯度较高。

5、PPK2蛋白的纯化

Ni-IDA亲和色谱柱洗脱下来的PPK2蛋白首先使用HitrapSP阳离子交换柱进行纯化，PPK2蛋白的阳离子交换色谱图呈现较对称的单峰(如图6)，说明该蛋白带电性质较为均一。吸取S22-S26管洗脱液10μl进行SDS-PAGE电泳分析(如图7)。PPK2蛋白在凝胶过滤色谱柱上的色谱图呈现对称单峰(如图8)，洗脱峰值出现在14.71ml，说明PPK2蛋白在溶液中以单体形式存在。吸取D24-D30管洗脱液10μl进行SDS-PAGE电泳分析(如图9)，PPK2蛋白纯度较高，无其他杂质蛋白。将D24-D30管洗脱液混匀浓缩至80μl后，测定蛋白浓度为10mg/ml，纯度为95％。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市职业大学

<120> 一种PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> Betaproteobacterium

<400> 1

Met Gly Lys Ser Leu Ile Ser Glu Asp Thr Tyr Glu Ala Asp Leu Arg

1 5 10 15

Leu Leu Gln Ile Glu Leu Val Lys Leu Gln Arg His Ile Ile Gln Thr

20 25 30

Gly Lys Arg Leu Leu Val Ile Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys

35 40 45

Asp Gly Ser Ile Lys Ser Leu Thr Glu Asn Leu Ser Pro Arg Asp Thr

50 55 60

Lys Val Val Ala Leu Ala Ala Pro Thr Ser Leu Glu Glu His Glu Trp

65 70 75 80

Tyr Phe Gln Arg Tyr Val Ala Gln Leu Pro Ser Ala Gly Glu Thr Val

85 90 95

Leu Phe Asn Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Lys Val Met

100 105 110

Gly Phe Cys Thr Asp Glu Gln Tyr Lys Leu Phe Met Ala Thr Val Asn

115 120 125

Asp Phe Glu Ser Leu Leu Val Arg Ser Asn Ile Gln Ile Ile Lys Tyr

130 135 140

Tyr Leu Asp Ile Ser Lys Glu Glu Gln Ala Lys Arg Leu Lys Asp Arg

145 150 155 160

Glu Lys Asp Pro Leu Lys Gln Trp Lys Ile Ser Pro Ile Asp Gln Lys

165 170 175

Ala Gln Lys Met Trp Asn Ala Tyr Ser Ala Ala Arg Asp Glu Met Leu

180 185 190

Lys Lys Thr Ser Ser Leu Asp Ala Pro Trp Thr Val Ile Ser Ala Asn

195 200 205

Asp Lys Lys Leu Ala His Leu Asn Leu Ile Ser Asp Leu Leu Ser Arg

210 215 220

Val Asn Tyr Pro Asp Lys Asp Lys Lys Ile Leu Lys Ile Asp Pro Met

225 230 235 240

Ile Val Leu Ser Trp Pro Ala Asn Ser Lys Lys Leu Pro Lys Leu Ser

245 250 255

Lys

<210> 2

<211> 774

<212> DNA

<213> Betaproteobacterium

<400> 2

ttatttggat agtttcggta gctttttaga attcgctggc cagcttagaa caatcatagg 60

gtcaattttt aagatcttct tatctttgtc cggataattg actcgggata ataaatcaga 120

gatcaaattc agatgcgcaa gctttttatc atttgcgctg atgacggtcc atggtgcatc 180

taatgagcta gttttcttga gcatttcgtc tctggccgca gagtacgcat tccacatctt 240

ctgagctttc tgatcaatag ggctgatctt ccactgcttt agtggatctt tttctcggtc 300

tttaagtctt tttgcttgct cttctttaga gatatccaag tagtacttga ttatttgaat 360

attggatctt acgagcaggg attcaaaatc atttactgtt gccatgaata atttgtattg 420

ctcatcagtg caaaagccca ttactttttc tacgccagca cggttgtacc aacttcgatt 480

aaagagtacg gtttcaccag cagatgggag ctgcgcaacg tatctctgaa agtaccactc 540

atgttcctca agagaggtgg gggcggccag ggcaactact ttcgtatctc tagggcttaa 600

attttcagta aggcttttaa tgctgccatc tttgcctgca gcatcgcgtc cttcaaaaat 660

aaccaaaaga cgtttgcctg tttgaataat gtgacgctgt agtttgacta attcaatttg 720

aagtagccgt aagtctgcct cgtaagtatc ttcagaaatc agtgatttac ccac 774

Claims

1.一种PPK2蛋白，其特征在于：所述PPK2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种如权利要求1所述的PPK2蛋白的编码基因，其特征在于：所述PPK2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种包含如权利要求2所述的PPK2蛋白的编码基因的表达载体或表达工程菌。

4.一种如权利要求1所述的PPK2蛋白的制备方法，其特征在于：

将重组表达质粒PPK2/pET30a通过物理法转入大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中，利用0.2mM·L^-1终浓度的IPTG诱导目的蛋白PPK2在16℃下表达，经系列色谱法纯化后浓度达10mg·mL^-1，纯度为95％。

5.一种如权利要求1所述的PPK2蛋白在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用。