CN115216457A - 嗜极多聚磷酸激酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供嗜极多聚磷酸激酶及其应用，编码所述嗜极多聚磷酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示。通过建立极端嗜酸微生物进化树，从不同分支点上筛选了多个多聚磷酸激酶，在pH4.0‑10.0，温度30‑60℃内均可实现ATP的高效再生。嗜极多聚磷酸激酶可以与嗜极核苷激酶进行双酶级联反应，可在极端环境下催化多种核苷或其衍生物，聚磷酸盐，ADP或ATP反应生成相应核苷酸。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及嗜极多聚磷酸激酶及其应用。
背景技术
ATP依赖的酶催化反应在自然界中广泛存在，许多体外催化合成反应都需要ATP作为能量供体或磷酸供体，如6-磷酸葡萄糖、1,6-二磷酸果糖的生产，谷胱甘肽的合成(许可等.无细胞的合成生物技术—多酶催化与生物合成.中国科学：化学，2015)。但是直接添加大量的ATP会使成本剧增，并且产生的ADP和AMP会导致后续分离纯化困难，酶法生产往往因此而难以发展。多聚磷酸激酶可以通过从无机聚磷酸盐中转移磷酸基团催化ADP生成ATP，被广泛的应用于ATP再生和多酶偶联生产。Motomura等根据系统发育分析和催化特性，将多聚磷酸激酶分为三个亚家族(Motomura et al.A new subfamily of polyphosphatekinase 2(class III PPK2)catalyzes both nucleoside monophosphatephosphorylation and nucleoside diphosphate phosphorylation.2014)。至今为止，对不同多聚磷酸激酶的研究和应用取得了一定成功，但是仍然面临一些问题，最突出的是大多数多聚磷酸激酶热稳定性较差，并且工作pH较窄，无法忍受工业极端环境对酶的破坏(Liu et al.Enzymatic production of l-theanine byγ-glutamylmethylamidesynthetase coupling with an ATP regeneration system based on polyphosphatekinase.2016)。因此筛选在极端环境下仍具有高活性的多聚磷酸激酶十分重要。
核苷酸由一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物，作为生物生长发育过程中的重要中间体，发挥着不可替代的作用。目前，酶法制备核苷酸及其衍生物的生产方法取得一定成功(Li et al.Efficient One-Pot Synthesis ofCytidine 5’-Monophosphate Using an Extremophilic Enzyme Cascade System.2020)。但是由于使用的多聚磷酸激酶热稳定性较差，导致总产量不高。因此，筛选能耐受极端环境的高效嗜极多聚磷酸激酶具有非常大的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种嗜极多聚磷酸激酶，以解决多聚磷酸激酶不能耐受工业极端条件的技术问题。
本发明的第二个目的在于，提供嗜极多聚磷酸激酶在合成核苷酸中的应用。
本发明的第三个目的在于，提供利用嗜极核苷激酶和本发明嗜极多聚磷酸激酶耦联合成核苷酸的方法。
为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种嗜极多聚磷酸激酶，编码所述嗜极多聚磷酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示，或者与SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.4限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
为了实现上述第二个目的，本发明提供了所述的嗜极多聚磷酸激酶在合成核苷酸中的应用。
为了实现本发明第三个目的，本发明提供了一种嗜极酶耦联合成核苷酸的方法，将嗜极核苷激酶和本发明嗜极多聚磷酸激酶耦联，以核苷、聚磷酸盐、ADP或ATP为原料，在酶的催化作用下发生反应，制得多种核苷酸。
作为一个优选方案，反应pH4.0-10.0，反应温度30-60℃。
作为一个优选方案，所述嗜极酶通过以下方法制备，制备高表达多聚磷酸激酶、核苷激酶菌株，经发酵完成后离心收集菌体，Tris-HCl缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清，通过金属螯合层析获得纯酶。
本发明的嗜极酶耦联体系，反应在温度为30-60℃，pH为4.0-10.0的条件下进行。作为一个优选方案，所述核苷的浓度为50-600mM，所述聚磷酸盐的浓度为30-150mM，所述ADP或ATP的浓度为1-10mM。
本发明中所使用的各种酶的具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及各种固定化酶和固定化酶细胞，可以是未经纯化的粗酶形式、也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。
本发明多种核苷是指嘌呤核苷或嘧啶核苷，包含胞苷，尿苷，鸟苷，肌苷。本发明聚磷酸盐是指磷酸的聚合物，包括二聚、三聚等不同链长的缩聚磷酸盐，常用聚磷酸盐是六偏磷酸钠和三聚磷酸钠。
本发明嗜极核苷激酶来自Phorcysia thermohydrogeniphila。本发明筛选到了具有较高转化率和催化活性以及耐受极端条件的四种嗜极来源多聚磷酸激酶，分别来自Desulfurella amilsii(SEQ ID NO.1)，Sulfurovum lithotrophicum(SEQ ID NO.2)，Acidovorax sp.BoFeN1(SEQ ID NO.3)，和Acidithiobacillus caldus(SEQ ID NO.4)。其中来源于Acidovorax sp.BoFeN1的多聚磷酸激酶在pH 4.0-5.0环境下酶活超过30U/mg；来源于Desulfurella amilsii的多聚磷酸激酶在60℃半衰期超过1600min。
本发明所需多聚磷酸激酶的一个实施例中制备方法如下：
(1)将SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列连接质粒中，得到重组质粒，然后转化至BL21(DE3)，得到重组菌；
(2)培养重组菌，诱导表达重组蛋白，利用高压匀浆机破碎收集菌体，通过镍离子亲和层析柱纯化蛋白。
本发明的一种实施方式中，重组菌以pET-28a(+)为表达载体。
本发明的一种实施方式中，重组菌以BL21或Rosetta为宿主菌。
本发明的优点在于，本发明筛选到了四种耐受极端环境的多聚磷酸激酶，在pH4.0-10.0，温度30-60℃内均可实现ATP的高效再生，可以与核苷激酶进行双酶级联反应。将嗜极多聚磷酸激酶与嗜极核苷激酶耦联，可在极端环境下催化多种核苷或其衍生物，聚磷酸盐，ADP或ATP反应生成相应核苷酸。
附图说明
图1为极端嗜酸微生物进化树。
图2为酶的表达纯化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
以下实施例中所用的嗜极核苷激酶来自Phorcysia thermohydrogeniphila，多聚磷酸激酶分别来自Desulfurella amilsii，Sulfurovum lithotrophicum，Acidovoraxsp.BoFeN1，和Acidithiobacillus caldus。将各自的基因分别连接至pET28a表达载体上，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到的阳性克隆培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，30-37℃，220rpm诱导培养16h。
实施例1：体外合成相关酶的纯化
分别接重组菌至50ml含有50mg/L卡那霉素的LB中，37℃，220rpm培养6-8h，随后按2％接种量接入100ml的LB中于37℃培养，待OD600达0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，30℃，220rpm诱导16-18h。离心收集菌体，弃去上清，加入适量的含有10mM咪唑，500mMNaCl的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬菌体。对于核苷激酶的纯化，使用热裂解法。将重悬后的菌体在70℃孵育30分钟，离心收集上清液，直接用于反应。对于多聚磷酸激酶的纯化，将重悬后的菌体加入压力破碎机进行破碎，压力为600-700bar，直至菌液变澄清。收集破碎后的菌体，离心得到上清，将上清倒入镍柱中，使用含有不同浓度咪唑的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集150mM咪唑浓度下的洗脱液。将洗脱液超滤浓缩，直至剩余体积达0.5ml左右，按体积比1:1加入50％的分子级甘油，混匀后分装，置于-80℃保存备用。对纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示。其中1号泳道为protein maker；2号泳道为Acidovoraxsp.BoFeN1来源多聚磷酸激酶(PPKAb)；3号泳道为Acidithiobacillus caldus来源多聚磷酸激酶(PPKAc)；4号泳道为Desulfurella amilsii来源多聚磷酸激酶(PPKDa)；5号泳道为Sulfurovum lithotrophicum来源多聚磷酸激酶(PPKSl)。
实施例2：嗜极多聚磷酸激酶活性和热稳定性的测定
反应体系中含有50mM的PB缓冲液，分别加入10mM ADP，10mM六偏磷酸钠，20mM氯化镁，加入适量的纯酶，用水补足体系到1mL，得到反应液。
将反应液于30-60℃反应2min，取样，按照体积比1:1加入1M的盐酸终止反应，将样品在冰上静置10min，随后12000转离心10分钟，收集上清液，使用高效液相色谱检测ATP的含量。
根据测定得到的ATP浓度计算酶活，并将酶活力单位(U)定义为：一定温度和pH条件下，1分钟内催化生成1μmol产物所需的酶量为1U。按照定义的酶活单位计算结果如下：
半衰期的测定通过将四种嗜极多聚磷酸激酶在60℃孵育不同时刻后测定酶活变化确定。具体结果如下：
| 菌株 | PPKDa | PPKSl | PPKAb | PPKAc |
| 半衰期 | 1685min | 396min | 422min | 648min |
实施例3：嗜极酶耦联生产胞苷酸验证
反应体系包括2mM ADP,40mM MgCl2,30mM polyP,100mM胞苷,50mM PB缓冲液，任意一种嗜极多聚磷酸激酶和核苷激酶，浓度均为0.2-0.5g/L，总体积1mL，45-60℃，pH 4.5-5.5反应时间为1h，得到产物胞苷酸。
按实施例3的体外合成体系，用高效液相色谱检测胞苷酸的含量，具体如下：
| 酶 | 生产速率(mM/min) | 产量(mM) |
| PPKAb | 1.33 | 80.2 |
| PPKAc | 0.17 | 10.6 |
| PPKDa | 0.88 | 53.1 |
| PPKSl | 0.48 | 29.3 |
四种嗜极多聚磷酸激酶均可与核苷激酶耦联生产胞苷酸。
实施例4：嗜极酶耦联生产胞苷酸
反应体系包括5mM ATP,40mM MgCl2,50mM polyP,200mM胞苷,50mM PB缓冲液，PPKDa和核苷激酶，浓度均为0.2-0.5g/L，总体积1mL，45-60℃，pH 4.5-5.5反应时间为3h，得到产物胞苷酸。
按实施例4的体外合成体系，用高效液相色谱检测胞苷酸的含量，结果为197.2mM，转化率为98.6％。
实施例5：嗜极酶耦联生产多种核苷酸
使用PPKAb和核苷激酶耦联生产多种核苷酸。反应体系及反应条件，具体如下表：
| 主要底物 | 温度、pH | 单次反应时间 | 产量 |
| 100mM肌苷 | 45-60℃、8.0-10.0 | 3h | 70.6mM |
| 100mM尿苷 | 45-60℃、8.0-10.0 | 3h | 76.3mM |
| 50mM腺苷 | 45-60℃、8.0-10.0 | 3h | 19.6mM |
| 50mM鸟苷 | 45-60℃、8.0-10.0 | 3h | 27.6mM |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 嗜极多聚磷酸激酶及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> Desulfurella amilsii
<400> 1
atgagcaaag aaaaagaaaa cgaaaaacag gaactgtgca aactgtggat cgaactggtt 60
aaattccaga acaccctgat caaaaaagaa gaaaaagttc tgctgatcct ggaaggccgt 120
gatagcgcgg gtaaagacgg catgatccgt accatcaccc gccacctgag cccgcgtgaa 180
acccgcgtgt tcgcggtgag caaaccgacc gacaaagaag cgaaagaatg gtacttccag 240
cgtttcgttc cgcacctgcc ggcgccgtgc gaattcgtgc tgttcaaccg cagctggtac 300
aaccgtgcgg gtgttgaacg tgtgatgggc ttctgcacca aaaaagaata cgaacagttc 360
tacgaagatg ttatctactt cgaaaacctg ctgctgaacg cgggtatcaa aatgttcaaa 420
ttctatctgg atatcgataa aaaagaacag gaaaaacgtc tggaatcccg taaaaaagat 480
ccgctgaaac agtggaaaga aagcccggtt gatgatgcag cgatcaaaca cttcgatgat 540
tacacccagt cccgtaacga aatgttcgaa cgtacccaca ccccgcagag cccgtgggtt 600
atcgttaacg cgaacgacaa acacaaagcg cgtctgaacc tgatcaaata cttcctgctg 660
aacgtggact acaaagaaaa gaacgaaaaa atcctgaacg tggacccgaa catcgttgtt 720
gtttacaaca aaaacttctt catcaaataa 750
<210> 2
<211> 759
<212> DNA
<213> Sulfurovum lithotrophicum
<400> 2
atgaagaaaa acatctacaa aaaagaactg tacaaactgc aggttgaact ggttaaattc 60
cagaaatacg ttatcgaaga aaacgttgcg gtttgcctgg ttctggaagg ccgtgatacc 120
gcgggtaaag atggcaccat caaacgtttc accgaacacc tgagcccgcg tgaagcgcgt 180
accgttgcgc tgggcgttcc gagcgataaa gaaaagaaat cttggtactt ccagcgttac 240
gttccgcacc tgccgtctgc gggcgaaatc gttttcttca accgtagctg gtacaaccgc 300
gcgggcgttg aaaaagttat gggcttctgc accaaaaaac agtacaaagc gttcatggaa 360
gaagttggtt ccttcgaaca gatgctgacc cacagcaaca tccgtttctt caaatactac 420
ctggatatca ccaaaaaaga acagaaaaaa cgcctggaag cgcgtaaaac cgatccgctg 480
aaacagtgga aactgtcccc gatcgatgcg aaagcgcaga aaatgtggga tgcgtacagc 540
aaagcgcgtg atgatatgtt caacaaaacc agcttcatct acgcgccgtg gtacgttgtt 600
cacaccgatg ataaaaaaga agcgcgtatc aacatcatga aacacttcct gagcctgaac 660
gactacccgg ataaagataa agcgctgctg gtttacgatc acgatgttat ctgcaaattc 720
gacccggttt gctacgaaaa agaaatgatc gcgccgtaa 759
<210> 3
<211> 864
<212> DNA
<213> Acidovorax sp. BoFeN1
<400> 3
atggcgaaaa acaaaaaagc ggcgaccggc gcgaccaaaa aagcgcacgc agacgtgacc 60
gatgttgcgc acaacccgag ccgtgatgaa gcgaccgaac gtagcatcgg ccgtgaagat 120
tacgaagcgc agctgcacat gctgcagatc gaactggtga aactgcagcg tcacttcatc 180
aaatgctctg accgtatcct gatcctgctg gaaggccgtg acagcgcggg caaagatggt 240
agcatcaaac gtctggttga acacctgtct ccgcgtgaaa ctcgtgttgt tgcgctgtct 300
aaaccgtctg atcgtgatcg taccagctgg tacttccagc gttacgttcc gcacctgccg 360
gttggtgaag aactggttgt tttcaaccgt tcctggtaca accgtgcggg tgttgaaccg 420
gttatgggtt tctgcaccgc ggaacagcac gaagaattca tgaactctgt tccgaaattc 480
gaagaaatgc tggttaactc tggcatcaaa ctgctgaaat actatctgga tatcggtaaa 540
aaagaacaga cccgtcgtct gtctgaacgt cgtcgtgatc cgctgaaaca gtggaaatct 600
agcccggttg acgcggttgc tctgaaacac tgggatggtt acacccgtgc gcgtgatgaa 660
atgttcatcc gtacccacac cgcggcggcg ccgtggagcg ttgttctggc tgataacaaa 720
cgtgttgcgc gtctgaacct gatccgtgat gttctgagcc gtctgcacta cgcgggtaaa 780
aaacacaaac tgatcgcgcc ggatcgtgaa atcgttttcg aattcagcca ggattgcctg 840
gatagcggtc gtctggcgcg ttaa 864
<210> 4
<211> 777
<212> DNA
<213> Acidithiobacillus caldus
<400> 4
atgaaccaca gcgttgataa agcgcagaac cagtacaaag cgaccctgca cctgctgcag 60
atcgaactgg ttaaactgca gcgtcacatc atcaaacgtg gtgaacgtat cctgctgatc 120
ctggaaggcc gtgatggcgc aggtaaagat agcaccatca aacgtatcat cgcgcacctg 180
agcccgcgtg aaacccgtgt tgttgcgctg ccgaaaccgt ctgatcgtga acagaccgaa 240
tggtacttcc agcgttacgt tgcgcacctg ccggcggcgg cggaattcgt tatcttcaac 300
cgtagctggt acaaccgtgc gggtgttgaa aaagttatgg gcttctgctc tgatcgtgat 360
tacgaagaat tcttcgcgga agttaacgat ttcgaaagca tgctgacccg tagcggcatc 420
ctgctgcgta aatactatct ggatatcacc aaaaaagaac agaaagcgcg tctggcggcg 480
cgtcgtgatg atccgctgaa acagtggaaa atcagcccga tcgatgaaca ggcgctgaaa 540
cactggaaag attactctga agctcgtaac gttatgttcg cgcgttctca cacccacctg 600
tgcccgtgga ccatcgttca cagcgatgaa aagaaaaccg cacgtatcca gctgatcaaa 660
gatttcctgt ctcgtctgga atacgcggat aaagatatcg atctgctggc gccggatcgt 720
gaagttgttt tcgattacga tccggcgtac ctgaaaaacg atatgatcgc gccgtaa 777
Claims (4)
1.一种嗜极多聚磷酸激酶，其特征在于，编码所述嗜极多聚磷酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示，或者与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
2.权利要求1所述的嗜极多聚磷酸激酶在合成核苷酸中的应用。
3.一种嗜极酶耦联合成核苷酸的方法，其特征在于，将嗜极核苷激酶和权利要求1所述的嗜极多聚磷酸激酶耦联，以核苷，聚磷酸盐，ADP或ATP为原料，在酶的催化作用下发生反应，制得多种核苷酸。
4.根据权利要求3所述的一种嗜极酶耦联合成核苷酸的方法，其特征在于，反应pH4.0-10.0，反应温度30-60℃。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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