CN110468114A

CN110468114A - 一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110468114A
Application number: CN201910775531.0A
Authority: CN
Inventors: 李建军; 杜昱光; 胥华; 孙明; 王倬; 焦思明; 任立世
Original assignee: Zhongke Rongxin (suzhou) Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Zhongke Rongxin (suzhou) Biological Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2019-11-19

Abstract

本发明公开了一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用。所述聚磷酸激酶RmPPK的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有60％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。本发明将聚磷酸激酶基因RmPPK导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达获得聚磷酸激酶RmPPK。获得的聚磷酸激酶RmPPK是一种新型聚磷酸激酶PPK，为CTP、CMP‑唾液酸、UTP、UDP‑Glc/UDP‑GlcA/UDP‑GlcNAc/UDP‑Gal/UDP‑GalNAc/UDP‑Xyl、GTP或GDP‑Fuc/GDP‑Man等的再生提供了一种新型工具酶。

Description

一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用。

背景技术

多聚磷酸(Polyphosphate，PolyP)是一种线型高分子，由三到几百甚至上千个单体组成。PolyP不仅存在于细菌中，也存在于哺乳动物的肾脏、心脏、大脑等器官中(Kampinga HH,Molecular Cell.2014,53,685-687)。在没有ATP提供能量的最原始生物体内，PolyP充当磷酸和能量的储存库，是ATP相似的高能磷酸酐，对生物起源起到了重要作用(Rao NN,et al.,Annual Review of Biochemistry,2009,78,605-647)。

多聚磷酸激酶(Polyphosphate kinase，PPK)可以催化ATP转化为PolyP，且该反应为可逆反应，因此它也可以以PolyP作为磷酸供体催化ADP转化为ATP，以实现能量的循环(Andexer JN,and Richter M,ChemBioChem 2015,16,380-386)。根据PPK的结构和分子量大小，PPK主要被分为两类：催化合成PolyP的PPK1和催化分解PolyP的PPK2(Andexer JN,and Richter M,ChemBioChem 2015,16,380-386)。PPK1存在于多种病原体微生物中，通常由600到700个氨基酸组成，更倾向于以ATP为底物，大肠杆菌来源的PPK1合成与利用PolyP的速率比为4:1。另一种被研究较多的PPK为PPK2。PPK2与PPK1几乎没有氨基酸序列同源性，比PPK1短很多(由230个左右氨基酸组成)，倾向于以PolyP和ADP/GDP为底物催化合成ATP/GTP。

由于ATP/GTP/UTP/CTP等三磷酸核苷的价格相对昂贵，若能建立一个循环反应系统：由ATP/GTP/UTP/CTP降解而来的ADP/GDP/UDP/CDP(或AMP/GMP/UMP/CMP)通过其它途径再合成ATP/GTP/UTP/CTP，使ATP/GTP/UTP/CTP能够循环使用，这样就有可能采用能够再生ATP/GTP/UTP/CTP的廉价原料来替代ATP/GTP/UTP/CTP，从而提高有用物质生产过程的经济性。

目前关于NTP再生系统的研究报道大部分集中在ADP转化为ATP上，而针对GTP/UTP/CTP再生(把GDP/UDP/CDP转化为GTP/UTP/CTP)的研究还非常少(Andexer JN,andRichter M,ChemBioChem 2015,16,380-386)。因此，开发一类新型多功能多聚磷酸激酶，对能够利用廉价PolyP原料进行ATP/GTP/UTP/CTP的再生(即把ADP/GDP/UDP/CDP催化转化为ATP/GTP/UTP/CTP)具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是，提供一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用。本发明的另一目的是，提供包含所述聚磷酸激酶RmPPK编码基因的重组载体以及高效表达该RmPPK的重组菌株。本发明旨在提供一种新型的聚磷酸激酶。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种聚磷酸激酶RmPPK，所述聚磷酸激酶的氨基酸序列选自以下其中一种：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；

(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有60％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。

本发明还提供一种聚磷酸激酶基因RmPPK，所述基因编码上述聚磷酸激酶RmPPK。

优选地，所述聚磷酸激酶基因RmPPK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种重组表达载体，该重组表达载体包含所述聚磷酸激酶基因RmPPK。优选地，所述重组表达载体为pET28a-RmPPK。

本发明还提供包含上述重组表达载体的重组菌。优选地，所述重组菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供所述聚磷酸激酶RmPPK的制备方法，包括以下步骤：

1)构建包含聚磷酸激酶RmPPK的重组表达载体，将重组表达载体转化至宿主细胞，得到重组菌；

2)培养重组菌株使其发酵，诱导聚磷酸激酶RmPPK表达；

3)收集菌体，破碎菌体细胞，离心收集上清液；

4)对收集的上清液的进行纯化，获得聚磷酸激酶RmPPK。

优选地，所述步骤4)中上清液的的纯化方式为镍柱纯化，洗脱液为缓冲溶液+120-180mM咪唑。优选地，所述缓冲溶液为50mM Tris/HCl,pH 8.0,0.5M NaCl。

本发明还提供了上述聚磷酸激酶RmPPK在CTP、CMP-唾液酸、UTP、UDP-Glc/UDP-GlcA/UDP-GlcNAc/UDP-Gal/UDP-GalNAc/UDP-Xyl、GTP或GDP-Fuc/GDP-Man再生过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的聚磷酸激酶RmPPK是一种新型聚磷酸激酶PPK，该聚磷酸激酶为CTP、CMP-唾液酸、UTP、UDP-Glc/UDP-GlcA/UDP-GlcNAc/UDP-Gal/UDP-GalNAc/UDP-Xyl、GTP或GDP-Fuc/GDP-Man等的再生提供了一种新型工具酶，对于利用廉价PolyP原料进行ATP/GTP/UTP/CTP的再生具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例中表达质粒pET28a-RmPPK的图谱示意图。

图2为本发明实施例2中RmPPK镍柱纯化的SDS-PAGE电泳图。

图3为本发明实施例3中表达的多聚磷酸激酶RmPPK的活性分析HPLC检测结果。

图4为本发明实施例4中CTP或CMP-唾液酸再生的路线图。

图5为本发明实施例4中RmPPK参与CTP或CMP-唾液酸再生的产物的HPLC分析图。

图6为本发明实施例4中产物6’-SL的¹H-NMR谱图。

图7为本发明实施例4中产物6’-SL的¹³C-NMR谱图。

图8为本发明实施例4中产物6’-SL的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

本发明中的载体(vector)是指能够将DNA片段转移到受体细胞中的一种能自我复制的环状DNA分子。

“同源性”或“同源性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源性百分比，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同源性百分比是这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，同源性百分比＝相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)×100)。例如，“同源性百分比”通过下列方式来计算：在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即，窗的大小)，并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行：例如，Smith和Waterman(Smith,T.F.and Waterman,M.S.,Comparison of biosequences,Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(Needleman S.B.and Wunsch C.D.,Ageneral method applicable to the search for similarities in the amino acidsequence of two proteins,J.Mol.Biol.,1970,48,443-453.)的同源性比对算法；Pearson和Lipman(Pearson W.R.,Lipman D.J.,Improved tools for biologicalsequence comparison,Proc.Natl.Acad.Sci.,1988,85,2444-2452.)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(例如，Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLASTN和TFASTA)；或手工比对和目测检查(参见，例如Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology(1995增刊)。

实施例1多聚磷酸激酶RmPPK表达菌株的构建

对来源于Silicibacter pomeroyi的一类PPK(简称为SpPPK)进行氨基酸序列分析，分析结果发现：SpPPK中77.2％的序列同源性来源于Ruegeria marina的PPK(简称为RmPPK)。

本发明参照编码多聚磷酸激酶RmPPK的基因序列(GenBank:SDC15090.1)作为目的基因，为了保证目的基因能在大肠杆菌中高效表达，对目的基因进行密码子优化，委托华大基因有限公司有限公司合成了编码多聚磷酸酶RmPPK的基因，共有870个碱基，核甘酸序列如SEQ ID NO.2所示，克隆载体为pET28a，克隆位点NdeI和XhoI，载体抗性为卡那霉素(Kan)，优化物种为E.coli。参见图1，为表达质粒pET28a-RmPPK的图谱示意图。对携带表达质粒pET28a-RmPPK的大肠杆菌DH5进行培养，使用Plasmid Mini Kit I试剂盒提取质粒，然后将表达质粒导入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组菌株。氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，含有289个氨基酸，预测蛋白分子量为33.1kDa。

本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942-01)，DNA片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-01)，凝胶回收是采用OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01)。

实施例2多聚磷酸激酶RmPPK的表达、纯化与检测

一、配制含有Kan抗性的LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，120℃灭菌20min，冷却到室温加入Kan使其终浓度50g/mL。

二、将实施例1得到的重组菌株，接种到含有Kan抗性的固体LB培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种到5mL含有Kan抗性的液体LB培养基中，37℃，200rmp摇床培养24小时后，将上述菌液接种到500ml含有Kan抗性的液体LB培养中，37℃、200rmp床培养至OD600nm＝0.6时，加入0.5mM IPTG，16℃、200rmp诱导表达24小时，5000rmp离心，收集菌体。

三、将收集到的菌体悬浮到缓冲溶液A(50mM Tri-HCl，pH 7.9，500mM NaCl)中进行超声破碎，12000rmp离心收集上清液。

四、使用镍柱对上述收集的上清液进行纯化，获得目标蛋白多聚磷酸激酶RmPPK。镍柱纯化过程如下：

1.缓冲溶液A(50mM Tris/HCl,pH 8.0,0.5M NaCl)平衡柱子，流速1mL/min。

2.上样，流速1mL/min，收集穿透液。

3.缓冲溶液A洗涤柱子，流速1mL/min，洗涤30mL，

4.缓冲溶液A+20mM咪唑洗脱，流速1mL/min，洗涤30ml，每5min收集一管。

5.G250检测收集样品，确认最后一管是否还有蛋白被洗脱下来，若没有蛋白，则进行下一浓度咪唑洗脱

6.缓冲溶液A+60mM咪唑洗脱，流速1mL/min，洗涤30mL，每5min收集一管。

7.G250检测收集样品，确认最后一管是否还有蛋白被洗脱下来，若没有蛋白则进行下一浓度咪唑洗脱。

8.缓冲溶液A+160mM咪唑洗脱，流速1mL/min，洗涤30mL，每5min收集一管。

9.G250检测收集样品，确认最后一管是否还有蛋白被洗脱下来，若没有蛋白，则进行下一浓度咪唑洗脱。

10.缓冲溶液A+200mM咪唑洗脱，流速1mL/min，洗涤30mL，每5min收集一管。

11.G250检测收集样品，确认最后一管是否还有蛋白被洗脱下来，若没有蛋白，则进行下一浓度咪唑洗脱。

12.缓冲溶液A+500mM咪唑洗脱，流速1mL/min，洗涤30mL，每5min收集一管。

13.选取每组咪唑浓度洗脱中收集的蛋白含量最高的一管，对该管的收集液进行SDS-PAGE分析；同时还对破碎后未离心的原样液、离心后的原样液、上样流穿液、缓冲溶液A的洗脱液进行SDS-PAGE分析。参见图2，为RmPPK镍柱纯化的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M：蛋白标准物；泳道1：破碎原样液(未离心)；泳道2：原样液(离心后)；泳道3：上样流穿液；泳道4：缓冲溶液A(50mM Tris-HCl,pH 8.0,0.5M NaCl)的洗脱液；泳道5：缓冲溶液A+20mM咪唑的洗脱液；泳道6：缓冲溶液A+60mM咪唑的洗脱液；泳道7：缓冲溶液A+160mM咪唑的洗脱液；泳道8：缓冲溶液A+200mM咪唑的洗脱液；泳道9：缓冲溶液A+500mM咪唑的洗脱液。经分析，泳道7的黑框内为纯化的RmPPK蛋白，预测蛋白分子量为33.1kDa。

从图2的SDS-PAGE电泳图可看出：仅有泳道7的洗脱液能够洗脱出目标蛋白，因此可以判断咪唑浓度对能否洗脱出目标蛋白至关重要。进一步研究分析咪唑浓度对洗脱蛋白的影响，发现：当缓冲溶液A中加入的咪唑浓度在120-180mM时，均能够洗脱出目标蛋白。

14.合并比较纯的目标蛋白RmPPK的收集液，用14,000Da的透析袋进行透析。

实施例3多聚磷酸激酶RmPPK的酶活分析

酶活分析：反应体系组成及反应条件：20mM六偏磷酸钠，10mM ADP/CDP/UDP/GDP，30mM MgCl₂，Tris-HCl(50mM，pH 7.8)，1μM RmPPK，30℃，140rpm反应。反应12小时后用HPLC检测，具体条件：C18柱子，UV 270nm。流动相：A为pH 5.3的25mM磷酸盐缓冲液(含有2mM四丁基硫酸氢铵)，B为甲醇。洗脱条件：100％A，0-10min；100％-70％A，0-30％B，10-25min；70％A，30％B，25-45min。流速：1mL/min(Ryll T,Wagner R,Journal of Chromatography,1991,570,77-88)。参见图3，为表达制备的多聚磷酸激酶RmPPK的活性分析HPLC检测结果，其中，A)把ADP催化转化为ATP；B)把GDP催化转化为GTP；C)把CDP催化转化为CTP；D)把UDP催化转化为UTP。从图3可以看出：制备的多聚磷酸激酶RmPPK能够将ADP/GDP/CDP/UDP转化为ATP/GTP/CTP/UTP，经计算，转化率分别为76.3％、74.4％、75.6％、69.1％。

实施例4多聚磷酸激酶RmPPK在CTP或CMP-唾液酸再生过程中的应用

参见图4为CTP或CMP-唾液酸再生的路线图。反应体系组成与条件：10ml反应体系，3.6mM唾液酸，3mM乳糖，0.66mM CTP，0.33mM ATP，15mM六偏磷酸钠，Tris-HCl(pH 8.5，100mM)，20mM MgCl2，NmCSS(CMP-唾液酸合成酶，Yu H,et al.,Bioorganic&MedicinalChemistry,2004,12,6427–6435)、Pd26ST(α-2,6-唾液酸转移酶，Sun M,et al.,Biotechnol Lett.2008,30,671–676)、CMK(胞苷单磷酸激酶，Lee S-G and Kim B-G,J.Ind.Eng.Chem.,2006,12,757-761)、RmPPK、PPA(焦磷酸酶，Li L,et al.,Org.Lett.,2013,15,5528-5530)的浓度均为2μM，37℃140rpm反应48hr。反应后加入等体积的无水乙醇，浓缩后首先在Sepahadex G15上纯化，然后通过HPLC进一步分离纯化。参见图5，为RmPPK参与CTP或CMP-唾液酸再生的产物HPLC分析图，其中，Sia：唾液酸；Lac：乳糖；control：对照组，为不包括5个酶的反应。图中箭头指向的峰为反应生成的产物6’-SL，转化率接近100％。最后对纯化产物6’-唾液酸乳糖(6’-sialyllactose,简称6’-SL)进行NMR和质谱表征。

对纯化的产物6’-SL，通过¹H-NMR和¹³C-NMR和质谱进行表征。

参见图6，为产物6’-SL的¹H-NMR谱图。¹H-NMR(600MHz,D₂O)δ5.14(d,J＝6.0Hz,H-1α),4.59(d,J＝12.0Hz,H-1β),4.35(d,J＝12.0Hz,1H),3.89-3.48(m,18H),3.23(t,J＝6.0Hz,1H),2.63(dd,J＝6.0,12.0Hz,1H),1.95(s,3H),1.65(t,J＝12.0Hz,1H)。

参见图7，为产物6’-SL的¹³C-NMR谱图。13C-NMR(600MHz,D₂O)δ175.7,174.9,103.4,100.4,95.6,91.8,79.6,74.6,73.8,72.5,72.4,71.8,70.8,68.5,68.4 63.6,62.7,61.4,60.3,60.1,51.8,40.1,22.1。

参见图8，为产物6’-SL的质谱图。MALDI-TOF，计算分子量633.55(6’-SL的分子式：C₂₃H₃₉NO₁₉)，实际分子量632.234。

上述图谱表征结果表明得到的产物为6’-唾液酸乳糖结构。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中科荣信（苏州）生物科技有限公司

<120> 一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> Ruegeria marina

<400> 1

Met Thr Lys Thr Gln Ala Gly Gln Ile Thr Arg Tyr Phe Gln Asp Arg

1 5 10 15

Ala Pro Lys Ser Ile Arg Glu Ala Ile Glu Ala Ala Gly Lys Asp Asp

20 25 30

Ile Leu Ser Asp Thr Tyr Pro Tyr Asp Glu Gln Met Ser Ser Lys Asp

35 40 45

Tyr Asp Lys Ala Met Glu Ala Leu Gln Ile Glu Leu Val Lys Met Gln

50 55 60

Ala Trp Val Lys Glu Ser Gly Ala Arg Ile Ala Ile Val Phe Glu Gly

65 70 75 80

Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Ser Arg Phe Arg Gln Asn

85 90 95

Leu Asn Pro Arg Gly Ala Arg Val Val Ala Leu Gly Lys Pro Thr Glu

100 105 110

Ala Glu Arg Thr Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Ile Gln His Leu Pro

115 120 125

Ala Ala Gly Glu Ile Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Gly

130 135 140

Val Val Glu His Val Phe Gly Trp Cys Thr Pro Gln Glu Arg Glu His

145 150 155 160

Phe Phe Arg Gln Ala Leu Pro Phe Glu His Ala Leu Ile Glu Asp Gly

165 170 175

Ile His Leu Phe Lys Phe Trp Leu Asn Val Gly Arg Ala Glu Gln Leu

180 185 190

His Arg Phe Leu Ala Arg Glu Asn Asp Pro Leu Lys Ser Trp Lys Leu

195 200 205

Ser Pro Val Asp Val Ala Gly Leu Asp Lys Trp Asp Glu Tyr Thr Gly

210 215 220

Ala Ile Ser Glu Thr Leu Thr Arg Ser His Ser Lys Arg Ser Pro Trp

225 230 235 240

Thr Val Val Arg Ser Asp Asp Lys Lys Arg Ala Arg Ile Ala Ala Ile

245 250 255

Gln Thr Val Leu Ser Thr Ile Asp Tyr Asp Asp Lys Asp Thr Lys Ala

260 265 270

Leu Gly Arg Ile Asp Ser Ala Ile Cys Gly Gly Pro Asp Ile Trp Asp

275 280 285

Ala

<210> 2

<211> 870

<212> DNA

<213> Ruegeria marina

<400> 2

atgaccaaaa cccaggccgg ccagattacc cgctattttc aggatcgcgc cccgaaaagc 60

attcgcgaag caattgaagc agcaggtaaa gatgatattc tgagtgatac ctatccgtat 120

gatgaacaga tgagcagcaa agattatgat aaagccatgg aagccctgca gattgaactg 180

gtgaaaatgc aggcatgggt gaaagaaagc ggtgcacgta ttgcaattgt ttttgaaggc 240

cgtgatgcag ccggtaaagg tggtaccatt agccgttttc gccagaatct gaatccgcgc 300

ggtgcacgtg tggttgcact gggtaaaccg accgaagccg aacgcaccca gtggtatttt 360

cagcgctata ttcagcatct gccggcagcc ggtgaaattg ttttctttga tcgcagttgg 420

tataatcgcg gcgtggtgga acatgtgttt ggttggtgta ccccgcagga acgtgaacat 480

ttctttcgtc aggcactgcc gtttgaacat gccctgattg aagatggcat tcatctgttt 540

aaattctggc tgaatgttgg tcgtgccgaa cagctgcatc gctttctggc ccgcgaaaat 600

gatccgctga aaagttggaa actgagtccg gttgatgtgg ccggcctgga taaatgggat 660

gaatataccg gcgcaattag tgaaaccctg acccgcagtc atagtaaacg tagcccgtgg 720

accgtggttc gcagcgatga taaaaaacgt gcccgtattg cagccattca gaccgtgctg 780

agcaccattg attatgatga taaagatacc aaggcactgg gtcgtattga tagtgcaatt 840

tgcggcggcc cggatatttg ggatgcataa 870

Claims

1.一种聚磷酸激酶RmPPK，其特征在于，所述聚磷酸激酶的氨基酸序列选自以下其中一种：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

2.一种聚磷酸激酶基因RmPPK，其特征在于：所述基因编码权利要求1所述的聚磷酸激酶RmPPK。

3.如权利要求2所述的一种聚磷酸激酶基因RmPPK，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述聚磷酸激酶基因RmPPK的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pET28a-RmPPK。

6.包含权利要求4或5所述重组表达载体的重组菌。

7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.权利要求1所述聚磷酸激酶RmPPK的制备方法，包括以下步骤：

2)培养重组菌株使其发酵，诱导聚磷酸激酶RmPPK表达；

3)收集菌体，破碎菌体细胞，离心收集上清液；

4)对收集的上清液的进行纯化，获得聚磷酸激酶RmPPK。

9.如权利要求8所述的聚磷酸激酶RmPPK的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中上清液的纯化方式为镍柱纯化，洗脱液为：Tris/HCl缓冲溶液+120-180mM咪唑。

10.权利要求1所述的聚磷酸激酶RmPPK在CTP、CMP-唾液酸、UTP、UDP-Glc/UDP-GlcA/UDP-GlcNAc/UDP-Gal/UDP-GalNAc/UDP-Xyl、GTP或GDP-Fuc/GDP-Man再生中的应用。