CN115927141A - 一种合成nmn的双酶共表达菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成NMN的双酶共表达菌株及其构建方法和应用，双酶共表达菌株同时携带烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶；其中，烟酰胺核糖激酶为NCBI基因序列库中的编号为AJT11364.1的氨基酸序列或由上述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列；多聚磷酸盐激酶为NCBI基因序列库中的编号为WP_096454974.1的氨基酸序列或由上述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但多聚磷酸盐激酶活性不变的氨基酸序列。该菌株能高效发酵，培养此重组菌株得到的粗酶溶液中两个酶的活力相匹配，可直接用于催化合成NMN和ATP的再生，减少了酶的发酵生产量。
Description
技术领域
本发明涉及生物酶工程技术领域，具体涉及一种合成NMN的双酶共表达菌株及其构建方法和应用。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononuclotide，NMN)，是自然界中天然存在的核苷酸，具有很强的生物活性，已有研究报道表明NMN有2种构型，α异构体和β异构体。其中，β异构体的NMN具有生物活性，分子量为334.221g/mol，是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+，又称辅酶I)合成途径中的重要前体。NMN在生物体内经过腺苷转移酶催化生成NAD+，而NAD+及NADP+等系列化合物是生物体内重要的辅酶，参与人体细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动，其作用主要体现在为细胞提供能量，提高细胞活力，加速细胞更新，从而使人体保持健康状态，延缓机体衰老。目前，Science、Nature等权威学术报道表明，补充NMN可有效地增加和恢复体内辅酶NAD的水平，大幅延缓衰老和防止老年痴呆症等多种神经元退化疾病，并由此从根本上调理和改善衰老的各种症状。因此以NMN为活性成分的功能性保健食品有着很大的开发潜力和市场前景。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成分开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor、日本MIRAI LAB等。
目前，NMN主要有三种合成方法：首先是化学合成法，主要由烟酰胺和核糖为底物合成烟酰胺核糖，再经过磷酸化得到NMN；此方法工艺简单，但是产品收率低，成本高，产物中易残留化学试剂，所得产品在保健品应用行业受到限制，同时工艺中所用有机溶剂环境不友好。第二种方法是微生物发酵生产，利用微生物自身代谢途径中辅酶循环再生系统，对辅因子代谢分支路径进行敲除，并过量表达NMN合成途径限速酶蛋白，提高微生物合成NMN能力，通过高密度发酵工艺提高细胞浓度，分离提取发酵液中的NMN，得到产品，此工艺中所得NMN中无有机试剂或者有毒杂质，工艺简单，但是目前的基因工程改造还没突破微生物自身的代谢限制，发酵所得NMN产量较低，不适合于大规模生产。最后一种方法是体外酶法多步合成，是目前市售NMN的主要生产工艺。
NMN体外酶法催化生产有两条工艺：
工艺1是以腺苷和烟酰胺为底物，以ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)或其盐作为磷酸根供体，在多聚磷酸盐激酶、嘌呤核苷磷酸化酶和烟酰胺核糖激酶的酶催化作用下合成β-烟酰胺单核苷酸(公开号为CN 112795606 B的专利文件中已有记载)；此工艺中使用了多聚磷酸盐激酶对ATP进行再生，极大的降低了ATP用量，但是还是需要同时发酵生产三种酶，离心发酵液得到三种酶后分步催化得到NMN，酶的发酵生产强度高，工艺复杂，发酵废水多，产品生产成本高。
工艺2是以烟酰胺核糖(nicotinamide riboside，NR)为起始原料，在烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NRK)和ATP的作用下，一步催化反应得到NMN，在此反应过程中底物NR和ATP经过烟酰胺核糖激酶作用，将ATP上的磷酸根转移至烟酰胺核糖上，得到NMN；此工艺路线清晰，反应步骤少，产业化前景较好；在此工艺基础上一些公司和研究机构进行了一些改进，例如公开号为CN112553178 A的专利和公开号为CN112608910 A的专利中，分别报道对烟酰胺核糖激酶进行发掘或者氨基酸序列定点突变，提高酶的热稳定性，提高酶的催化效率，简化产物提取工艺等；公开号为CN112522232A的专利中报道对此工艺所用烟酰胺核糖激酶发酵工艺进行优化，分阶段将OUR、发酵液中ORP和乙酸浓度中的至少一者控制在预定范围内，提高发酵液中烟酰胺核糖激酶酶活。
目前生物体外酶法多步催化工艺为相对高效的NMN生产工艺，但是，分析总结目前已有研究和专利报道，发现无论以哪一种体外酶法催化合成NMN，都必须由ATP提供磷酸根，其中NMN和ATP的摩尔比要大于1:1，由于ATP价格高，必须对其进行循环利用。而现有报道中并没有关于ATP再生所用多聚磷酸盐激酶、烟酰胺核糖激酶或者嘌呤核苷磷酸化酶进行共质粒表达的载体构建研究及应用报道；也没有对共表达载体筛选和两个酶的连接方式进行设计研究，以满足催化生产NMN中两种酶的酶活比例；现在主要还是以单个酶蛋白发酵生产后混合催化为主，酶的生产周期延长，设备投资加大，并且大量发酵导致废水量显著增加，污染环境。
发明内容
为了解决上述背景技术中存在的问题，本发明提供一种合成NMN的双酶共表达菌株，该菌株能高效发酵，同时生产烟酰胺核糖激酶(NRK)和多聚磷酸盐激酶(PPK)，培养此重组菌株得到的粗酶溶液中两个酶的活力相匹配，无需分离纯化两种酶，可同时用于催化合成NMN和ATP的再生，减少了酶的发酵生产量，简化了催化工艺，使得NMN生产成本显著降低。为此，本发明还提供一种上述合成NMN的双酶共表达菌株的构建方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种合成NMN的双酶共表达菌株，所述双酶共表达菌株同时携带烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶；
其中，所述烟酰胺核糖激酶为NCBI基因序列库中的编号为AJT11364.1的氨基酸序列或由上述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸、但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列；
所述多聚磷酸盐激酶为NCBI基因序列库中的编号为WP_096454974.1的氨基酸序列或由上述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸、但多聚磷酸盐激酶活性不变的氨基酸序列。
具体地，所述共表达菌株以pRSF-Duet、pETDue-1、pET28a、pCW、pUC或pPIC9k为表达载体。
具体地，所述共表达菌株以pRSF-Duet或pET系列为表达载体。表达载体上，可以包含一个启动子，也可以包含2个启动子，不同表达载体和不同RBS序列长度决定了不同的启动子数量。
具体地，烟酰胺核糖激酶基因片段和多聚磷酸盐激酶基因片段前端各有1个T7启动子，相同载体上两个基因片段之间用1-3个RBS序列连接，确定最优连接序列，使得两个酶的表达量适合于对底物的催化，多聚磷酸盐激酶对ATP的再生循环满足烟酰胺核糖激酶对磷酸根的需要；其中，烟酰胺核糖激酶基因片段为编码上述烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；多聚磷酸盐激酶基因片段为编码上述多聚磷酸盐激酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
具体地，相同载体上两个基因片段之间用1个RBS序列连接。
具体地，所述共表达菌株所采用的宿主细胞包括且不限制于大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的的蛋白的真核或原核细胞。
本发明的第二方面，提供一种上述合成NMN的双酶共表达菌株的构建方法，包括如下步骤：
S1、将烟酰胺核糖激酶基因片段和多聚磷酸盐激酶基因片段分别扩增回收，并经酶切连接至表达载体上得到重组载体，每个基因片段前端都有T7启动子，两个基因片段中间用1-3个RBS序列连接；
S2、将重组载体转入宿主细胞中得到双酶共表达菌株。
本发明的第三方面，提供一种上述合成NMN的双酶共表达菌株的应用，所述双酶共表达菌株经培养基培养、诱导表达、离心、细胞破碎处理得到同时含有烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶的粗酶液，该粗酶液直接用于催化NR合成NMN和ATP的再生。
具体地，所述粗酶液用于催化合成NMN时，底物NR的浓度为5-10％。
具体地，所述粗酶液用于催化合成NMN时，体系中还加入有多聚磷酸盐和ATP的钠盐，催化反应温度为30-40℃，催化反应时间为5-10h。
上述合成NMN的双酶共表达菌株的应用具体如下：培养上述构建的共表达菌株，获得培养物，从培养物中分离出含有烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸激酶的细胞，离心分离出烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶的细胞后，通过超声破碎，对细胞进行破碎，离心收集上清液得到两种酶的粗酶液；然后将在NR作为底物，在底物浓度达到5-10％的条件下，加入多聚磷酸盐和ATP的钠盐，在30-40℃之间，催化5-10h，底物完全催化。在一些实施例中，反应温度为30℃，底物浓度为5％，粗酶量为5％；在另外一些实施例中，反应温度为40℃，底物浓度为10％，反应时间为6h。根据本发明的一些实施例，烟酰胺核糖激酶为酶溶液或酶冻干粉。根据本申请的一些实施例，将反应得到的NMN溶液，经过结晶提取得到纯度高的NMN产品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)与现有的烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶单独表达菌株相比，本申请提供了一种烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶共表达菌株的有效构建策略，只需要进行一个菌株的发酵，就能得到含有两个酶的细胞，所得细胞直接催化NR生产NMN，酶的使用成本降低50％，适用于大规模工业化生产；
(2)本发明提供了高活力的编码上述烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列和编码多聚磷酸盐激酶的核苷酸序列，所表达酶活力高，催化条件温和，能催化高浓度的底物，催化时间5-10h，底物转化率大于85％；
(3)本发明还对烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶表达载体进行筛选和优化调整，筛选单启动子和双启动子表达效果，同时对载体上两个酶蛋白的编码序列间距进行优化，将优化好的表达载体转入宿主细胞，最终得到同时高效表达两个酶的一株重组菌；
(4)培养上述构建的双酶共表达菌株得到的粗酶溶液中两个酶的活力相匹配，满足高浓度NR催化生成NMN的要求和ATP的再生，减少了酶的发酵生产量，简化了催化工艺，使得NMN生产成本显著降低。
附图说明
图1为实施例1中产物的核磁共振图谱；
图2为实施例1中产物的液相色谱谱图。
具体实施方式
下面，结合附图和具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
S1、将来自于NCBI基因序列库中的编号为AJT11364.1的NRK(烟酰胺核糖激酶)的氨基酸编码序列和编号为WP_096454974.1的PPK(多聚磷酸盐激酶)的氨基酸编码序列进行密码子优化，交由苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成，得到核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示的NRK基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的PPK基因片段；
S2、选择具有双启动子的表达载体pRSF-Duet，根据载体序列和基因序列进行酶切位点分析，确定好酶切位点并设计引物，以合成的NRK和PPK基因序列为模板进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，酶切连接至载体pRSF-Duet的两个启动子下游，载体构建好外送测序，验证序列正确后，得到共表达载体pRSF-Duet-nrk-ppk；
S3、将共表达载体pRSF-Duet-nrk-ppk转入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，得到共表达菌株BL21-pRSF-Duet-nrk-ppk；
S4、采用LB培养基培养此共表达菌株BL21-pRSF-Duet-nrk-ppk，在35℃下培养7h后，加入0.1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达24h，结束培养，离心收集细胞，将细胞以10％的湿菌体浓度进行超声破碎，得到粗酶液；
S5、在100mL的玻璃反应器中加入底物NR至终浓度为5％，然后加入ATP二钠盐至浓度为10g/L，再加入多聚磷酸盐至浓度为5％，将此反应体系混合均匀，最后加入粗酶液至细胞终浓度5％，在30℃催化反应6h，底物完全催化，无残留。
对实施例1中制得的产物进行测试得到核磁共振图谱，如图1所示，可知，实施例1中经催化反应生成的产物为NMN(烟酰胺单核苷酸)。
采用LC-02型高效液相色谱仪进行液相色谱分析检测，得到色谱图如图2所示，经换算，底物转化率为85％。
实施例2
S1、将来自于NCBI基因序列库中的编号为AJT11364.1的NRK(烟酰胺核糖激酶)的氨基酸编码序列和编号为WP_096454974.1的PPK(多聚磷酸盐激酶)的氨基酸编码序列进行密码子优化，交由苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成，得到核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示的NRK基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的PPK基因片段；
S2、分析合成的NRK基因序列、PPK基因片段和载体pET28a的序列，确定适合于序列和载体的酶切位点，设计引物，以合成的NRK基因序列、PPK基因片段为模板进行PCR扩增，分离回收得到带有酶切位点的NRK和PPK序列，将此片段和pET28a酶切连接，在两个序列中加入一段RBS序列，序列在线性化的载体pET28a上的连接顺序为T7-nrk-rbs-ppk，构建好的载体测序验证连接正确，序列无突变后，将载体命名为pET-nrk-ppk；
S3、将得到的载体pET-nrk-ppk转入宿主BL21(DE3)中，得到共表达菌株BL21-nrk-ppk；
S4、采用LB培养基培养此共表达菌株BL21-nrk-ppk，在35℃下培养7h后，加入0.1mM的IPTG诱导表达24h，结束培养，离心收集细胞，将细胞以10％的湿菌体浓度进行超声破碎，得到粗酶液；
S5、在100mL的玻璃反应器中加入底物NR至终浓度为5％，然后加入ATP二钠盐至浓度为10g/L，再加入多聚磷酸盐至浓度为5％，将此反应体系混合均匀，最后加入粗酶液至细胞终浓度5％，在35℃催化反应6h，经检测底物转化率为72％，实施例2中催化反应效率显著低于实施例1。
实施例3
S1、将来自于NCBI基因序列库中的编号为AJT11364.1的NRK(烟酰胺核糖激酶)的氨基酸编码序列和编号为WP_096454974.1的PPK(多聚磷酸盐激酶)的氨基酸编码序列进行密码子优化，交由苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成，得到核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示的NRK基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的PPK基因片段；
S2、分析合成的NRK基因序列、PPK基因片段和载体pET28a的序列，确定适合于序列和载体的酶切位点，设计引物，以合成的NRK基因序列、PPK基因片段为模板进行PCR扩增，分离回收得到带有酶切位点的NRK和PPK序列，将此片段和pET28a酶切连接，在两个序列中加入两段RBS序列，序列在线性化的载体pET28a上的连接顺序为T7-nrk-rbs-rbs-ppk，构建好的载体测序验证连接正确，序列无突变后，将载体命名为pET-nrk-rbs-rbs-ppk；
S3、将得到的载体pET-nrk-rbs-rbs-ppk转入宿主BL21(DE3)中，得到共表达菌株BL21-nrk-ppk；
S4、采用LB培养基培养此菌株，35℃下培养7h后，加入0.1mM的IPTG诱导表达24h，结束培养，离心收集细胞，将细胞以10％的湿菌体浓度进行超声破碎，得到粗酶液；
S5、在100mL玻璃反应器中加入底物NR至终浓度为5％，然后加入ATP二钠盐至浓度10g/L，再加入多聚磷酸盐至浓度5％，将此反应体系混合均匀，最后加入粗酶液至细胞终浓度5％，在35℃条件下催化反应6h，经检测底物转化率为30％，实施例3中催化反应效率显著低于实施例1和2。
实施例4
S1、将来自于NCBI基因序列库中的编号为AJT11364.1的NRK(烟酰胺核糖激酶)的氨基酸编码序列和编号为WP_096454974.1的PPK(多聚磷酸盐激酶)的氨基酸编码序列进行密码子优化，交由苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成，得到核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示的NRK基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的PPK基因片段；
S2、分析合成的NRK基因序列、PPK基因片段和载体pET28a的序列，确定适合于序列和载体的酶切位点，设计引物，以合成的NRK基因序列、PPK基因片段为模板进行PCR，分离回收得到带有酶切位点的NRK和PPK序列，将此片段和pET28a酶切连接，序列在线性化的载体pET28a上的连接顺序为T7-nrk-ppk，构建好的载体测序验证连接正确，序列无突变后，将载体命名为pET-nrk-ppk；
S3、将得到的载体pET-nrk-ppk转入宿主BL21(DE3)中，得到共表达菌株BL21-nrk-ppk；
S4、采用LB培养基培养此菌株，35℃下培养7h后，加入0.1mM的IPTG诱导表达24h，结束培养，离心收集细胞，将细胞以10％的湿菌体浓度进行超声破碎，得到粗酶液；
S5、在100mL玻璃反应器中加入底物NR至终浓度为5％，然后加入ATP二钠盐至浓度10g/L，再加入多聚磷酸盐至浓度5％，将此反应体系混合均匀，最后加入粗酶液至细胞终浓度5％，在35℃催化6h，经检测，底物转化率65％，实施例4的催化反应效率低于实施例1，但是显著高于实施例2和实施例3。
对照实施例1
S1、将来自于NCBI基因序列库中的编号为AJT11364.1的NRK(烟酰胺核糖激酶)的氨基酸编码序列和编号为WP_096454974.1的PPK(多聚磷酸盐激酶)的氨基酸编码序列进行密码子优化，交由苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成，得到核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示的NRK基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的PPK基因片段；
S2、分析合成的NRK基因序列、PPK基因片段和载体pET28a的序列，确定适合于序列和载体的酶切位点，设计引物，以合成的NRK基因序列、PPK基因片段为模板进行PCR、凝胶电泳回收和酶切连接，分别将NRK和PPK酶切连接于载体pER28a上，得到表达载体pET28a-nrk和pET28a-ppk；
S3、将这两个载体分别转入宿主BL21(DE3)中，得到菌株BL21-nrk和BL21-ppk；
S4、采用LB培养基分别培养这两个菌株，35℃下培养7h后，加入0.1mM的IPTG诱导表达24h，结束培养，分别离心收集细胞，将细胞以10％的湿菌体浓度进行超声破碎，得到粗酶液；
S5、在100mL玻璃反应器中加入底物NR至终浓度为5％，然后加入ATP二钠盐至浓度10g/L，再加入多聚磷酸盐至浓度5％，分别加入粗酶液至细胞终浓度为5％，将此反应体系混合均匀，在35℃下催化6h，经检测，底物转化率75％，该实施例中的催化反应效率较实施例1显著降低约10％，但是显著高于其余实施例。说明表达载体pRSF-Duet较pET28a更高效表达这两个酶，另外实施例1中的pRSF-Duet-nrk-ppk共表达载体能更好的提高酶的活力。
对照实施例2
S1、将空载体pRSF-Duet直接转入宿主BL21(DE3)中，得到菌株BL21-pRSF-Duet；
S2、采用LB培养基培养菌株，35℃下培养7h后，加入0.1mM的IPTG诱导表达24h，结束培养，离心收集细胞，将细胞以10％的湿菌体浓度进行超声破碎，得到粗酶液；
S3、在100ml玻璃反应器中加入底物NR至终浓度为5％，然后加入ATP二钠盐至浓度10g/L，再加入多聚磷酸盐至浓度5％，分别加入粗酶液至细胞终浓度为5％，将此反应体系混合均匀，在35℃催化6h，经检测，底物转化率0％。说明不连接基因序列的空载体转入宿主细胞，其不具有NRK和PPK酶活，确定了以质粒pRSF-Duet或者pET28a共表达烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶的编码基因时，能得到高酶活的烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶，将NR催化生成NMN。
表1、不同构建策略的催化效果
表2、不同构建策略的NRK和PPK酶活测定结果
综上，本申请提供了一种烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶共表达菌株的有效构建策略，只需要进行一个菌株的发酵，就能得到含有两个酶的细胞，所表达酶活力高，能直接用于催化NR生产NMN，并可促进ATP的再生，酶的使用成本降低50％，适用于大规模工业化生产。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
Claims (10)
1.一种合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，所述双酶共表达菌株同时携带烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶；
其中，所述烟酰胺核糖激酶为NCBI基因序列库中的编号为AJT11364.1的氨基酸序列或由上述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列；
所述多聚磷酸盐激酶为NCBI基因序列库中的编号为WP_096454974.1的氨基酸序列或由上述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但多聚磷酸盐激酶活性不变的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，所述共表达菌株以pRSF-Duet、pETDue-1、pET28a、pCW、pUC或pPIC9k为表达载体。
3.根据权利要求2所述的合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，所述共表达菌株以pRSF-Duet或pET系列为表达载体。
4.根据权利要求1所述的合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，烟酰胺核糖激酶基因片段和多聚磷酸盐激酶基因片段前端各有1个T7启动子，相同载体上两个基因片段之间用1-3个RBS序列连接；其中，烟酰胺核糖激酶基因片段为编码上述烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列，多聚磷酸盐激酶基因片段为编码上述多聚磷酸盐激酶的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，相同载体上两个基因片段之间用1个RBS序列连接。
6.根据权利要求1所述的合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，所述共表达菌株以大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、链霉菌或枯草芽孢杆菌为宿主细胞。
7.一种如权利要求1所述的合成NMN的双酶共表达菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将烟酰胺核糖激酶基因片段和多聚磷酸盐激酶基因片段分别扩增回收，并经酶切连接至表达载体上得到重组载体，每个基因片段前端都有T7启动子，两个基因片段中间用1-3个RBS序列连接；
S2、将重组载体转入宿主细胞中得到双酶共表达菌株。
8.一种如权利要求1所述的合成NMN的双酶共表达菌株的应用，其特征在于，所述双酶共表达菌株经培养基培养、诱导表达、离心、细胞破碎处理得到同时含有烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶的粗酶液，该粗酶液直接用于催化NR合成NMN和ATP的再生。
9.根据权利要求8所述的合成NMN的双酶共表达菌株的应用，其特征在于，所述粗酶液用于催化合成NMN时，底物NR的浓度为5-10％。
10.根据权利要求8或9所述的合成NMN的双酶共表达菌株的应用，其特征在于，所述粗酶液用于催化合成NMN时，体系中还加入有多聚磷酸盐和ATP的钠盐，催化反应温度为30-40℃，催化反应时间为5-10h。
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