CN112795606A - 一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种β‑烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法。本发明以腺苷和磷酸盐为起始，在PNP酶和NRK酶的酶组合物的酶催化下生成D‑核糖‑1‑磷酸和烟酰胺核糖中间体，最后通过不可逆反应获得NMN，可大幅提高底物转化率；整个反应体系仅需要2种酶的参与，副产物腺嘌呤可回收再利用；同时，生成1分子的NMN的同时只需要消耗1分子的ATP，且加入多聚磷酸激酶实现ADP再生为ATP，整个工艺大幅降低了成本。

Description

一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide, 缩写成 NMN )是生物体内存在的一种物质，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成生物细胞所赖以生存的重要 物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+,又称辅酶I ) 。2017年3月David Scinclair研究团队发表在《science》上的一项研究表明，NAD+在小鼠体内的增加，使得大龄小鼠的组织和肌肉衰老迹象被逆转，这表明人类返老还童不再是梦想。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD+前体小分子物质NMN的研究发现，食用β-NMN可以有效提升体内NAD+的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得β-NMN成为了“ 不老神药”。截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具 有诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多医疗保健用途。
目前合成NMN的主要方法包括：化学合成、生物催化法。其中化学法成本高，同时造成严重的环境污染，已逐渐被生物催化法取代。相比较而言，生物酶法催化生产NMN更加高效、成本更低、节能环保。目前，有三种生物催化方法生产NMN，第一种是以烟酰胺核糖为原料，通过烟酰胺核糖激酶（Ribosylnicotinamide kinase，EC 2.7.1.22）在ATP供应下生成NMN。第二种是以烟酰胺、核糖和ATP为底物，经D-核糖激酶（Ribokinase，EC2.7.1.15）、核酸磷酸焦磷酸激酶（ribose phosphate pyrophosphokinase，EC2.7.6.1）、和烟酰胺核糖磷酸转移酶（Nicotinamide phosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12 ）催化反应生成NMN。第三种是以腺苷或AMP、ATP、烟酰胺为原料，经腺苷激酶（EC 2.7.1.20）（以AMP为原料时不需要此酶）、腺嘌呤磷酸核糖转移酶（EC 2.4.2.7）、烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamidephosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12 ）催化生成NMN。
上述第一种方法直接以烟酰胺核糖为原料，底物转化率高，但烟酰胺核糖价格昂贵，成本不具有优势。第二种、第三种方法最后均以PRPP和烟酰胺通过烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamide phosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12 ）制备NMN。因烟酰胺磷酸核糖转移酶催化可逆反应，合成NMN的同时也能水解NMN，反应转化率较低。同时，中间体PRPP化合物不稳定，不利于反应进行。再次，上述两种方法多步反应均需要ATP参与反应，整条工艺路线需要消耗大量的ATP，导致该生物催化法的生产成本仍较高。有必要开发一种更为高效、低成本的生物催化制备NMN的新方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种β-烟酰胺单核苷酸（NMN）的酶催化合成方法，使其以腺苷、ATP、烟酰胺为原料合成β-烟酰胺单核苷酸时，能够在生成1分子的NMN的同时只需要消耗1分子的ATP，并且反应中最后一步合成NMN的反应不可逆，可大幅提高底物转化率，反应过程生成的ADP在多聚磷酸激酶的作用下实现ATP循环再生，降低生产成本。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法，以腺苷，烟酰胺，ATP或其盐，多聚磷酸激酶，Mg离子或锰离子，多聚磷酸盐，磷酸盐为原料，在EC编号为EC 2.4.2.1的嘌呤核苷磷酸化酶（purine-nucleoside phosphorylase，简写PNP酶）和EC编号为EC 2.7.1.22 烟酰胺核糖激酶（ribosylnicotinamide kinase，简写NRK酶）的酶催化作用下合成β-烟酰胺单核苷酸。
本发明针对目前的酶催化法的诸多缺陷，利用酶促反应技术提供了另外一种从腺苷、烟酰胺、ATP开始合成β-烟酰胺单核苷酸的工艺，反应过程如下式：
Figure 404156DEST_PATH_IMAGE001
腺苷和磷酸盐在PNP酶的作用下先合成D-核糖-1-磷酸，然后继续在该酶催化下和烟酰胺合成烟酰胺核糖，然后消耗一分子ATP在NRK酶的催化下不可逆反应生成NMN。
在上述反应过程中，PNP酶包含来源于calf spleen，Bos taurus，Escherichiacoli，Salmonella typhimurium，Bacillus cereus，Bacillus clausii，Aeromonashydrophila，Bovine Salmonella enterica， Bacteroides fragilis ，Mycobacteriumtuberculosis ，Aeromonas hydrophila中的一种或两种以上的嘌呤核苷磷酸化酶。更优选地，所述PNP酶包含来源于calf spleen ，Bos taurus (Bovine)，Escherichia coli K12,Salmonella typhimurium (strainATCC 700720)，Bacillus cereus (strain ATCC14579)，Bacillus clausii (strain KSM-K16)，Aeromonas hydrophila，BovineSalmonella enterica ， Bacteroides fragilis (strain ATCC 25285)， Mycobacteriumtuberculosis (strain ATCC 25618)，Aeromonas hydrophila一种或一种以上的嘌呤核苷磷酸化酶。
本发明生成D-核糖-1-磷酸以及烟酰胺核糖都需要PNP酶参与，其中生成D-核糖-1-磷酸的过程不对PNP酶的来源限定，只要属于EC 2.4.2.1的PNP酶即可，而生成烟酰胺核糖的过程需要特定PNP才能够完成，在本发明中提供的PNP酶均可以完成两步反应。
NRK酶来源于B. pseudomallei，Ashbya gossypii，Haemophilus influenzae，Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces pombe，Salmonella typhimurium，Cupriavidus metallidurans，Xanthomonas campestris pv. Campestris，Agrobacteriumvitis ， Pseudarthrobacter chlorophenolicus，Actinobacillus succinogenes ，Homosapiens ，Saccharomyces cerevisiae ，Ashbya gossypii中的一种或两种以上。更优选地，所述NRK酶来源于B. pseudomallei K96243，Ashbya gossypii ATCC 10895，Haemophilus influenzae ATCC 51907，Saccharomyces cerevisiae ATCC 204508，Schizosaccharomyces pombe ATCC 24843，Salmonella typhimurium (strain ATCC700720)，Cupriavidus metallidurans (strain ATCC 43123，Deinococcus radiodurans（strain ATCC 13939），Xanthomonas campestris pv. campestris（strain ATCC 33913），Agrobacterium vitis (strain ATCC BAA-846) (Rhizobium vitis (strain S4))，Pseudarthrobacter chlorophenolicus，Actinobacillus succinogenes (strain ATCC55618)，Homo sapiens (Human)，Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508)(Baker's yeast)，Ashbya gossypii (strain ATCC 10895)中的一种或两种以上。
在本发明反应过程中，原料磷酸盐在最后生成NMN时会再次生成，可循环利用到下一反应过程中。反应一般可在缓冲液中进行，如Tris或PBS缓冲液，为了方便高效的进行反应，采用PBS缓冲液既可以充当反应介质，也可以作为反应中的磷酸盐启动反应。
在本发明中，ATP在多聚磷酸激酶和多聚磷酸盐存在下，可以实现其循环利用，大大降低其使用量。所述多聚磷酸盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾、六偏磷酸钠、六偏磷酸钾、四偏磷酸钾、四偏磷酸钠中的一种或多种。
作为优选，作为辅酶因子的镁离子或锰离子可由氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁、硝酸镁、氯化锰、硫酸锰、硝酸锰中的一种或多种提供。
作为优选，所述酶组合物以表达各酶的宿主细胞、各酶的酶液或各酶的固定化酶形式参与酶催化反应。在本发明具体实施方式中，所述表达各酶的宿主细胞为含有表达各酶的载体的大肠杆菌，所述载体可以是单独表达其中一种酶，也可以是共表达两种酶。其具体的制备过程如下：
提取菌株DNA，以其为模板，通过PCR扩增出目标PNP酶或NRK酶的DNA片段（可按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化），本发明表1列举了具体实施例中所使用的PNP酶或NRK酶的序列。利用酶切位点对扩增后的基因进行相应的酶切，并连接到相同酶切的载体质粒上；通过基因测序验证正确的质粒进而转入E. coli BL21(DE3)菌株中,于 LB培养液中进行培养，然后IPTG条件下诱导表达, 收集各酶的湿细胞；所述载体质粒为市售的pET28a质粒，各酶扩增引物可根据各酶编码序列进行设计。
在本发明具体实施方式中，所述各酶的酶液为从表达各酶的宿主细胞中提取的酶液；方法为将所收集的湿细胞经过高压破碎、高速离心收集含粗蛋白的上清液，即为含酶的酶液，也可以对上清液进一步纯化。
作为优选，本发明还包括β-烟酰胺单核苷酸的纯化步骤：
经过滤、层析分析，浓缩结晶干燥后获得β-烟酰胺单核苷酸的纯品。
按照本发明所述方法生成NMN，底物转化率（以腺苷、烟酰胺计算）为90-99%，获得的NMN成品纯度达99%以上。
由以上技术方案可知，本发明以腺苷、烟酰胺、磷酸盐、ATP为起始，在PNP酶和NRK酶的酶组合物的酶催化下生成D-核糖-1-磷酸和烟酰胺核糖中间体，最后通过不可逆反应获得NMN，可大幅提高底物转化率；整个反应体系仅需要2种酶的参与，副产物腺嘌呤可回收再利用；同时，生成1分子的NMN的同时只需要消耗1分子的ATP，且加入多聚磷酸激酶实现ADP再生为ATP，整个工艺大幅降低了成本。
具体实施方式
本发明公开了一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文方法及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述合成方法及其反应原理示意图旨在清楚的描述核心的反应路线，并不限制整个反应采用一步法还是多步法进行。
本发明所采用的各酶可以根据序列进行人工合成，也可按照本发明提供的方法通过质粒载体搭载各酶表达基因，借助宿主细胞诱导表达。
在进行固定化时，可参照本领域常规的固定化酶制备方式，在本发明具体实施方式中，本发明利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)进行一次性混合固定，其固定方法如下: 在1L磷酸钾缓冲液（1M pH7.5）中加入上述PNP纯酶液100ml，NRK纯酶液10ml混均，加入80克LX-1000EP环氧树脂，室温搅拌8小时后过滤出树脂,用25mM pH 8.0磷酸钾缓冲液洗涤三次，抽滤后得固定化酶，测定该固定化酶PNP酶活力为800U/g，NRK酶活力为80U/g。
依照本发明工艺的反应路线，各反应物质的用量可以根据实际情况调整，为了最大效率化，本发明提供了如下各反应物质的浓度和用量：
PNP酶与NRK酶的比例以酶活计，PNP：NRK的酶活比例为1：（0.01~100），优选的为1：（0.1~10）。腺苷的底物浓度为1-250mM，烟酰胺的底物浓度为1-250mM，ATP的底物浓度为0.5mM-20mM，锰离子或镁离子的浓度为5mM-250mM，磷酸盐或Tris的浓度为0.1-200mM，多聚磷酸盐浓度为1-250mM（以磷酸根计）。
反应过程维持反应液的pH在6.5-9.5之间，优选7.0-8.5；反应温度在25-50℃之间，优选35-45℃；
本发明具体实施例中所使用的酶的相关信息参见表1和表2：
表1
Figure 524559DEST_PATH_IMAGE002
Figure 835454DEST_PATH_IMAGE004
Figure 371609DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：
PNP酶来源Bos taurus (Bovine)；
NRK酶的制备来源Haemophilus influenzae （ATCC 51907)；
PNP/NRK酶比例1:10，38℃，50mM Tris（pH8.0） ，pH7.0 腺苷的底物浓度为250mM，烟酰胺的底物浓度为250mM，250mM多聚磷酸钠，ATP的底物浓度为10mM，镁离子的浓度为50mM，底物转化率90%；
PNP酶的制备：来源于Bos taurus的PNP酶蛋白质序列见附表1，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，利用Nde I/Xho I进行相应的酶切（NEB公司），并连接到相同酶切的pET28a质粒上(购于Addgene)。将构建好的质粒转入E .coli BL（DE3)菌株中(上海唯地生物)，确认正确的菌落接种至到含100uM卡那霉素的LB培养液中，LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸二氢钾以及5%的甘油；当细胞增长至对数中后期，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷( IPTG)在30℃诱导蛋白表达5小时，离心收集湿菌体。
NRK酶的制备：提取Haemophilus influenzae ATCC 51907菌株DNA，以其为模板，通过PCR扩增出NadR基因片段（genbank: NZ_CP009610.1)，（NadR正义引物：F: 5’-catatgcgagctaagtataacgcaaaat-3’，NadR反义引物：R:5’-ctcgagtcattgagatgtcccttttataggaaaggt-3’，由金唯智公司合成），该基因片段对应的蛋白质序列如附表1所示。利用NEB公司购买的Nde I/Xho I对扩增后的基因进行相应的酶切，并连接到相同酶切的pET28a质粒上(购于Addgene),将构建好的质粒转入E .coli BL21（DE3)菌株中(上海唯地生物)，确认正确的菌落培养到含100uM卡那霉素的LB培养液中，LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸二氢钾以及5%的甘油；当细胞增长至对数中后期，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷( IPTG )在30℃诱导蛋白表达5小时，离心收集湿细胞。
多聚磷酸激酶制备：来源于Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692)多聚磷酸激酶蛋白序列如SEQ ID NO.14所示，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，然后按实施例1的方法进行基因重组菌构建及菌体培养，离心收集湿菌体。
分别称取上述PNP酶、NRK酶、多聚磷酸激酶各100g湿细胞，分别用 20mM Tris pH7.5 1000ml水溶液重悬后经高压破碎得PNP酶、NRK酶、多聚磷酸激酶的粗酶液。使用现有技术记载的公知的测定PNP酶及NRK酶活性的方法，以在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)。本发明PNP酶的酶活定义为：1分钟转化1微摩尔腺苷生成D-核糖-1-磷酸所需的酶量为一个活力单位（U）。本发明NRK酶的酶活定义为：1分钟转化1微摩尔烟酰胺核糖生成β-烟酰胺核糖单核苷酸所需的酶量为一个活力单位（U）。测定上述PNP粗酶液酶活力为75U/ml，NRK酶活力为600U/ml。
在1L反应罐中配制250 mM 腺苷，250mM 烟酰胺，50 mM MgCl2，10mM ATP，250mM多聚磷酸钠，50mM pH8.0 tris缓冲液，调节pH值为7.0，加入上述PNP粗酶液为32ml（加酶量3U/ml），加入上述NRK粗酶液为40ml（30U/ml），加入上述制备的多聚磷酸激酶粗酶液50g/L，反应液总体积为0.8L。在38℃搅拌下反应15h维持反应液pH7.0，生成NMN 225mM（75.15g/L)，底物转化率为90%。反应液经过滤、层析分离，浓缩结晶干燥后获得NMN纯品43.28g，NMN产品纯度99.2%，NMN产品核磁谱结果为：1H NMR (400 MHz, D2O)δ：9 .43(s ,1H)，9 .27(d,1H ,J＝5 .9Hz ,)， 8 .95(d ,1H ,J＝7.8Hz)，8 .28-8 .23(m ,1H)，6 .15(d ,1H ,J＝5 .2)，4 .58 (q ,1H ,J＝2 .6Hz)，4.55-4.51(m ,1H)，4.41-4 .37(m,1H )，4 .28-4 .24(m ,1H)，4 .10-4 .07(m ,1H )。回收获得腺嘌呤纯品21.9g，腺嘌呤产品纯度99%。
实施例2：
PNP酶1来源Escherichia coli (strain K12)；
PNP酶2来源Bacillus clausii (strain KSM-K16)；
NRK酶来源Salmonella typhimurium（ATCC 700720）；
PNP/NRK酶比例100：1，35℃，20mM PBS pH8.5 ，腺苷的底物浓度为135mM，烟酰胺的底物浓度为135mM，ATP的底物浓度为20mM，多聚磷酸盐浓度为135mM，镁离子的浓度为200mM，底物转化率95%；
PNP酶1的制备：来源于Escherichia coli (strain K12)PNP酶蛋白序列见附表1，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，然后按实施例1的方法进行基因重组菌构建及菌体培养，离心收集湿菌体。
PNP酶2的制备：来源于acillus clausii (strain KSM-K16)的PNP酶蛋白序列见附表1，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，然后按实施例1的方法进行基因重组菌构建及菌体培养，离心收集湿菌体。
NRK酶的制备：来源于Salmonella typhimurium（ATCC 700720）的NRK酶蛋白序列见附表1，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，然后按实施例1的方法进行基因重组菌构建及菌体培养，离心收集湿菌体。
分别称取上述PNP酶1、PNP酶2、NRK酶各100g湿细胞，分别用 20mM Tris pH 7.51000ml水溶液重悬后经高压破碎得PNP酶1、PNP酶2及NRK酶的粗酶液。测定上述PNP酶1粗酶液酶活力为200U/ml、PNP酶2粗酶液酶活力为500U/ml，NRK酶活力为50U/ml。
在1L反应罐中配制135 mM 腺苷，135mM 烟酰胺，200mM MgCl2，20mM ATP，135mM多聚磷酸钠，20mM pH8.5 PBS缓冲液，调节pH值为8.5，反应液总体积为0.8L，加入上述PNP酶1粗酶液为50ml，PNP酶2粗酶液为30ml，加入上述NRK粗酶液为5ml，加入实施例1多聚磷酸激酶粗酶液50g/L，35℃搅拌下反应24h维持pH8.5，生成NMN 128.2mM（42.8g/L),底物转化率95%，反应液经过滤、层析分离，浓缩结晶干燥后获得NMN纯品26.71g，NMN产品纯度99.3%,回收获得腺嘌呤纯品11.8g，腺嘌呤产品纯度99%。
实施例3
PNP酶来源Bacteroides fragilis (strain ATCC 25285 )；
NRK酶来源B. pseudomallei K96243；
固定化酶形式；
PNP/NRK酶比例10:1，40℃，固定化酶，腺苷的底物浓度为50mM，烟酰胺的底物浓度为50mM，ATP的底物浓度为5mM，锰离子的浓度为5mM，六偏磷酸钠80mM，PBS浓度200mMpH7.0、底物转化率90%；
PNP酶的制备：来源于Bacteroides fragilis (strain ATCC 25285 )PNP酶蛋白序列见附表1，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，然后按实施例1的方法进行基因重组菌构建及菌体培养，离心收集湿菌体。
NRK酶的制备：来源于B. pseudomallei K96243的NRK酶蛋白序列见附表1，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，然后按实施例1的方法进行基因重组菌构建及菌体培养，离心收集湿菌体。
上述收集的含PNP酶，NRK酶菌体细胞混合后，分别经过高压破碎、离心收集含粗蛋白的上清液。上清液分别用镍离子螯合亲和柱（翊圣生物）纯化获得PNP纯酶液及NRK纯酶液，其中PNP纯酶液活力为6800U/ml，NRK纯酶液活力6400U/ml。
将获得的纯酶液，利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)进行一次固定，其方法如下：在1L磷酸钾缓冲液（1M pH7.5）中加入上述PNP纯酶液100ml，NRK纯酶液10ml混均，加入80克LX-1000EP环氧树脂，室温搅拌8小时后过滤出树脂,用25mM pH 8.0磷酸钾缓冲液洗涤三次，抽滤后得固定化酶，测定该固定化酶PNP酶活力为800U/g，NRK酶活力为80U/g。
在1L反应罐中配制50 mM 腺苷，50mM 烟酰胺，5 mM MnCl2，5mM ATP，六偏磷酸盐80mM（以磷酸根计），200mM pH7.0 PBS缓冲液，调节pH值为7.0，反应液总体积为0.8L，加入上述固定化酶20g，加入实施例1制备的多聚磷酸激酶50g/L，40℃搅拌下反应13h维持pH7.0，生成NMN 45mM（15.03g/L)，底物转化率为90%，反应液经过滤、层析分离，浓缩结晶干燥后获得NMN纯品9.26g，NMN产品纯度99.2%，回收获得腺嘌呤纯品4.1g，腺嘌呤产品纯度99.2%。
实施例4：
PNP酶来源：Salmonella typhimurium (ATCC 700720)；
NRK酶来源B. pseudomallei K96243纯化酶；
PNP/NRK酶比例1：100，35℃，腺苷的底物浓度为100mM，烟酰胺的底物浓度为100mM，ATP的底物浓度为2mM，镁离子的浓度为20mM，四偏磷酸钠200mM，0.5mM pH7.5 PBS缓冲液，底物转化率94%；
PNP酶的制备：来源于Salmonella typhimurium (ATCC 700720)的PNP酶蛋白序列见附表1，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，然后按实施例1的方法进行基因重组菌构建及菌体培养，离心收集湿菌体。按实施例3的方法制备获得PNP纯酶液，PNP纯酶液活力为6200U/ml
在1000ml三角瓶中配制100 mM 腺苷，100mM 烟酰胺，20 mM MgCl2，2mM ATP，四偏磷酸钠200mM，0.5mM pH7.5 PBS缓冲液，调节pH值为7.5，反应液总体积为500ml，加入上述的PNP纯酶液4.8ml，加入来源B. pseudomallei K96243的NRK纯酶液46ml，加入实施例1制备的多聚磷酸激酶粗酶液50g/L，35℃搅拌下反应20h维持pH8.0，生成NMN 94mM（31.4g/L)，底物转化率94%，反应液经过滤、层析分离，浓缩结晶干燥后获得NMN纯品12.2g，NMN产品纯度99.4%，回收获得腺嘌呤纯品4.9g，腺嘌呤产品纯度99.3%。
实施例5：
PNP酶来源Aeromonas hydrophila；
NRK酶来源Saccharomyces cerevisiae ATCC 204508；
NRK PNP共表达+全细胞催化形式；
PNP/NRK酶比例1：1，37℃，腺苷的底物浓度为135mM，烟酰胺的底物浓度为135mM，ATP的底物浓度为10mM，镁离子的浓度为20mM，多聚磷酸盐浓度135mM，20mM pH6.5 PBS缓冲液，底物转化率90%；
全细胞制备：来源于Aeromonas hydrophila的PNP酶蛋白序列如表1所示，将对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，利用BamH I/Not I进行相应的酶切（NEB公司）。来源于Saccharomyces cerevisiae ATCC 204508的NRK酶蛋白序列如表1所示，将对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，利用BamH I/Not I进行相应的酶切（NEB公司）。将酶切后的基因上述两端基因同时连接在相同酶切的pRSFDuet-1质粒上（购于生物风）。将构建好的质粒转入E .coli BL21（DE3)菌株中(上海唯地生物)，确认正确的菌落培养到含100uM卡那霉素的LB培养液中，LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸二氢钾以及5%的甘油；当细胞增长至对数中后期，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷( IPTG )在30℃诱导蛋白表达5小时，离心收集湿细胞。
取上述离心后的湿细胞用20mM pH7.0 PBS缓冲液洗涤二遍后重悬，加入0.15%Triton X-100低速搅拌处理30min，离心收集湿细胞。测定通透后的湿细胞PNP酶活力为750U/g，NRK酶活力为750U /g。
在1L反应罐中配制135 mM 腺苷，135mM 烟酰胺，20 mM MgCl2，10mM ATP，多聚磷酸钠135mM，20mM pH6.5 PBS缓冲液，调节pH值为6.5，反应液总体积为0.8L，加入上述湿细胞32g，加入实施例1制备的多聚磷酸激酶粗酶液50g/L，37℃搅拌下反应18h维持pH8.0，生成NMN121.5mM（40.58g/L)，底物转化率为90%，反应液经过滤、层析分离，浓缩结晶干燥后获得NMN纯品22.5g，NMN产品纯度99.1%，回收获得腺嘌呤纯品11.3g，腺嘌呤产品纯度99.3%。
实施例6：
PNP酶1来源：Deinococcus radiodurans (strain ATCC 13939)；
PNP酶2来源：Homo sapiens (Human)；
NRK酶来源：Ashbya gossypii (strain ATCC 10895)；
该实施例比较了相同酶活下（PNP/NRK酶比例1：0.518），不同形式粗酶、纯酶、固定化酶的效果；
PNP酶1的制备：来源于Deinococcus radiodurans (strain ATCC 13939)的PNP酶蛋白序列见附表1，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，然后按实施例1的方法进行基因重组菌构建及菌体培养，离心收集湿菌体。
PNP酶2的制备：来源于Homo sapiens (Human)的PNP酶蛋白序列见附表1，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，然后按实施例1的方法进行基因重组菌构建及菌体培养，离心收集湿菌体。
NRK酶的制备：来源于Ashbya gossypii (strain ATCC 10895)的NRK酶蛋白序列见附表1，对应的DNA基因序列经密码子优化后由安徽通用生物体外合成，然后按实施例1的方法进行基因重组菌构建及菌体培养，离心收集湿菌体。
分别称取上述PNP酶1湿细胞、PNP酶2湿细胞、NRK酶湿细胞100g，分别用20mM TrispH 7.5 1000ml水溶液重悬后经高压破碎获得PNP酶的粗酶液及NRK酶的粗酶液。测定上述PNP酶1的粗酶液酶活力为450U/ml，PNP酶2 粗酶液酶活力为 550U/ml，NRK粗酶液酶活力为760U/ml。
按上述方法制备的PNP酶1、NRK粗酶液经离心收集上清液，上清液分别用镍离子螯合亲和柱（翊圣生物）纯化获得PNP酶1纯酶液及NRK纯酶液，其中PNP酶1纯酶液活力为4800U/ml，NRK纯酶液活力6700U/ml。
将上述获得的纯酶液，利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)进行一次固定，其方法如下：在2L磷酸钾缓冲液（1M pH7.5）中加入上述PNP酶1纯酶液50ml，NRK纯酶液40ml混均，加入160克LX-1000EP环氧树脂，室温搅拌8小时后过滤出树脂,用25mM pH 8.0磷酸钾缓冲液洗涤三次，抽滤后得固定化酶，测定该固定化酶PNP酶1酶活力为98.4U/g，NRK酶活力为190U/g。
粗酶形式（PNP酶1）：在1L反应罐中配制100mM 腺苷，100mM 烟酰胺，20 mM MgCl2，10mM ATP，150mM六偏磷酸钠，20mM pH8.0 PBS缓冲液，调节pH值为8.0，反应液总体积为0.8L。加入上述制备的PNP酶2粗酶液35.2ml 、NRK粗酶液40ml，加入实施例1制备的多聚磷酸激酶粗酶液50g/L，在37℃搅拌下反应6h维持pH8.0，生成NMN 95mM（31.73g/L)，底物转化率为95%，反应液经过滤、层析分离，浓缩结晶干燥后获得NMN纯品20.0g，NMN产品纯度99.4%，回收获得腺嘌呤纯品7.7g，腺嘌呤产品纯度99.3%。
粗酶形式（PNP酶2）：在1L反应罐中配制100mM 腺苷，100mM 烟酰胺，20 mM MgCl2，10mM ATP，150mM六偏磷酸钠，20mM pH8.0 PBS缓冲液，调节pH值为8.0，反应液总体积为0.8L。加入上述制备的PNP酶2粗酶液28.8ml 、NRK粗酶液40ml，加入实施例1制备的多聚磷酸激酶粗酶液50g/L，在37℃搅拌下反应6h维持pH8.0，生成NMN 1mM（0.33g/L)，底物转化率为1%，底物转化率过低，无法纯化获得纯品。
采用只能完成第一步反应无法完成第二步反应的PNP酶2，通过结果数据说明确实反应只能进行到第一步无法继续，或者效率极其低下，这也说明了生成烟酰胺核糖的过程需要特定PNP酶才能够完成。
纯酶形式（PNP酶1）：在1L反应罐中配制100mM 腺苷，100mM 烟酰胺，20 mM MgCl2，10mM ATP，150mM六偏磷酸钠，20mM pH8.0 PBS缓冲液，调节pH值为8.0，反应液总体积为0.8L。加入上述制备的PNP酶1纯酶液3.28ml 、NRK纯酶液4.53ml，加入实施例1制备的多聚磷酸激酶粗酶液50g/L，在37℃搅拌下反应5h维持pH8.0，生成NMN 96mM（32g/L) ，底物转化率为95%。反应液经过滤、层析分离，浓缩结晶干燥后获得NMN纯品20.0g，NMN产品纯度99.4%，回收获得腺嘌呤纯品7.9g，腺嘌呤产品纯度99.3%。
固定化酶形式（PNP酶1）：在1L反应罐中配制100mM 腺苷，100mM 烟酰胺，20 mMMgCl2，10mM ATP，150mM六偏磷酸钠，20mM pH8.0 PBS缓冲液，调节pH值为8.0，反应液总体积为0.8L。加入上述制备PNP酶1、NRK固定化酶160g，加入实施例1制备的多聚磷酸激酶粗酶液50g/L，在37℃搅拌下反应7.5h维持pH8.0，生成NMN 94mM（31.39g/L)，底物转化率为94%。反应液经过滤、层析分离，浓缩结晶干燥后获得NMN纯品19.8g，NMN产品纯度99.4%，回收获得腺嘌呤纯品7.6g，腺嘌呤产品纯度99.3%。
固定化酶形式（PNP酶1）：在1L反应罐中配制1mM 腺苷，1mM 烟酰胺，5 mM MgCl2，0.5mM ATP，1mM六偏磷酸钠，5mM pH8.0 PBS缓冲液，调节pH值为9.5，反应液总体积为0.8L。加入上述制备PNP酶1、NRK固定化酶160g，加入实施例1制备的多聚磷酸激酶粗酶液50g/L，在25℃搅拌下反应5.5h维持pH9.5，生成NMN 0.99mM（0.33g/L)，底物转化率为99%。反应液经过滤、层析分离，浓缩结晶干燥后获得NMN纯品0.13g，NMN产品纯度99.4%。
固定化酶形式（PNP酶1）：在1L反应罐中配制1mM 腺苷，1mM 烟酰胺，5 mM MgCl2，1mM ATP，1mM六偏磷酸钠，5mM pH8.0 PBS缓冲液，调节pH值为9.5，反应液总体积为0.8L。加入上述制备PNP酶1、NRK固定化酶160g，加入实施例1制备的多聚磷酸激酶粗酶液50g/L，在45℃搅拌下反应0.5h维持pH9.5，生成NMN 0.99mM（0.33g/L)，底物转化率为99%。反应液经过滤、层析分离，浓缩结晶干燥后获得NMN纯品0.13g，NMN产品纯度99.4%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳瑞德林生物技术有限公司
<120> 一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法
<130> MP21007395
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Asn Gly Tyr Thr Tyr Glu Asp Tyr Gln Asp Thr Ala Lys Trp
1 5 10 15
Leu Leu Ser His Thr Glu Gln Arg Pro Gln Val Ala Val Ile Cys Gly
20 25 30
Ser Gly Leu Gly Gly Leu Val Asn Lys Leu Thr Gln Ala Gln Thr Phe
35 40 45
Asp Tyr Ser Glu Ile Pro Asn Phe Pro Glu Ser Thr Val Pro Gly His
50 55 60
Ala Gly Arg Leu Val Phe Gly Ile Leu Asn Gly Arg Ala Cys Val Met
65 70 75 80
Met Gln Gly Arg Phe His Met Tyr Glu Gly Tyr Pro Phe Trp Lys Val
85 90 95
Thr Phe Pro Val Arg Val Phe Arg Leu Leu Gly Val Glu Thr Leu Val
100 105 110
Val Thr Asn Ala Ala Gly Gly Leu Asn Pro Asn Phe Glu Val Gly Asp
115 120 125
Ile Met Leu Ile Arg Asp His Ile Asn Leu Pro Gly Phe Ser Gly Glu
130 135 140
Asn Pro Leu Arg Gly Pro Asn Glu Glu Arg Phe Gly Val Arg Phe Pro
145 150 155 160
Ala Met Ser Asp Ala Tyr Asp Arg Asp Met Arg Gln Lys Ala His Ser
165 170 175
Thr Trp Lys Gln Met Gly Glu Gln Arg Glu Leu Gln Glu Gly Thr Tyr
180 185 190
Val Met Leu Gly Gly Pro Asn Phe Glu Thr Val Ala Glu Cys Arg Leu
195 200 205
Leu Arg Asn Leu Gly Ala Asp Ala Glu Gly Met Ser Thr Val Pro Glu
210 215 220
Val Ile Val Ala Arg His Cys Gly Leu Arg Val Phe Gly Phe Ser Leu
225 230 235 240
Ile Thr Asn Lys Val Ile Met Asp Tyr Glu Ser Gln Gly Lys Ala Asn
245 250 255
His Glu Glu Val Leu Glu Ala Gly Lys Gln Ala Ala Gln Lys Leu Glu
260 265 270
Gln Phe Val Ser Leu Leu Met Ala Ser Ile Pro Val Ser Gly His Thr
275 280 285
Gly
<210> 2
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Gln Val Gln Phe Ser His Asn Pro Leu Phe Cys Ile Asp Ile
1 5 10 15
Ile Lys Thr Tyr Lys Pro Asp Phe Thr Pro Arg Val Ala Phe Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Leu Gly Ala Leu Ala Asp Gln Ile Glu Asn Ala Val Ala
35 40 45
Ile Ser Tyr Glu Lys Leu Pro Gly Phe Pro Val Ser Thr Val His Gly
50 55 60
His Ala Gly Glu Leu Val Leu Gly His Leu Gln Gly Val Pro Val Val
65 70 75 80
Cys Met Lys Gly Arg Gly His Phe Tyr Glu Gly Arg Gly Met Thr Ile
85 90 95
Met Thr Asp Ala Ile Arg Thr Phe Lys Leu Leu Gly Cys Glu Leu Leu
100 105 110
Phe Cys Thr Asn Ala Ala Gly Ser Leu Arg Pro Glu Val Gly Ala Gly
115 120 125
Ser Leu Val Ala Leu Lys Asp His Ile Asn Thr Met Pro Gly Thr Pro
130 135 140
Met Val Gly Leu Asn Asp Asp Arg Phe Gly Glu Arg Phe Phe Ser Leu
145 150 155 160
Ala Asn Ala Tyr Asp Ala Glu Tyr Arg Ala Leu Leu Gln Lys Val Ala
165 170 175
Lys Glu Glu Gly Phe Pro Leu Thr Glu Gly Val Phe Val Ser Tyr Pro
180 185 190
Gly Pro Asn Phe Glu Thr Ala Ala Glu Ile Arg Met Met Gln Ile Ile
195 200 205
Gly Gly Asp Val Val Gly Met Ser Val Val Pro Glu Val Ile Ser Ala
210 215 220
Arg His Cys Asp Leu Lys Val Val Ala Val Ser Ala Ile Thr Asn Met
225 230 235 240
Ala Glu Gly Leu Ser Asp Val Lys Leu Ser His Ala Gln Thr Leu Ala
245 250 255
Ala Ala Glu Leu Ser Lys Gln Asn Phe Ile Asn Leu Ile Cys Gly Phe
260 265 270
Leu Arg Lys Ile Ala
275
<210> 3
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Thr Glu Phe Lys Gln Thr Pro His Ile Asn Ala Lys Gly Glu Ile
1 5 10 15
Ala Glu Thr Val Leu Leu Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Phe Ile
20 25 30
Ala Glu Arg Phe Leu Thr Asp Val Val Gln Phe Asn Ser Val Arg Asn
35 40 45
Met Phe Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Asn Gly Lys Arg Ile Ser Val Met
50 55 60
Gly Thr Gly Met Gly Met Pro Ser Met Gly Ile Tyr Ser Tyr Glu Leu
65 70 75 80
Ile His Val Phe Gly Val Lys Asn Leu Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly
85 90 95
Ala Leu Gln Asp Asp Leu Asn Leu Tyr Asp Val Ile Leu Gly Met Gly
100 105 110
Ala Ser Thr Asn Ser Asn Tyr Val Asn Gln Tyr His Leu Pro Gly Thr
115 120 125
Phe Ala Pro Leu Ala Ser Tyr Ser Leu Leu Glu Lys Ala Lys Lys Ala
130 135 140
Ala Asp Glu Lys Gly Val Pro Val His Val Gly Asn Ile Leu Ser Ser
145 150 155 160
Asp Thr Phe Tyr Asn Ala Asp Glu Asp Ala Ala Gly Lys Trp Arg Asp
165 170 175
Met Gly Ile Leu Gly Ile Glu Met Glu Ala Ala Ala Leu Tyr Met Asn
180 185 190
Ala Ala Gln Ala Gly Val Asn Ala Leu Cys Ile Leu Thr Val Ser Asp
195 200 205
His Ile Phe Lys Glu Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Glu Thr Ser
210 215 220
Phe Thr Asn Met Met Glu Ile Ala Leu Glu Leu Ala
225 230 235
<210> 4
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Lys Tyr Phe Pro Ser Ser Glu Leu Ile Ile Asn Glu Asp Gly
1 5 10 15
Ser Val Phe His Leu His Val Lys Pro Glu Trp Leu Ala Asp Lys Val
20 25 30
Ile Leu Val Gly Asp Pro Gly Arg Val Ala Leu Val Ala Ser His Phe
35 40 45
Glu Asn Lys Glu Cys Glu Val Glu Ser Arg Glu Phe Lys Thr Val Thr
50 55 60
Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Arg Ile Thr Val Val Ser Thr Gly Ile Gly
65 70 75 80
Cys Asp Asn Ile Asp Ile Val Val Asn Glu Leu Asp Ala Leu Ala Asn
85 90 95
Ile Asp Phe Gln Thr Arg Glu Glu Lys Glu His Leu Arg Ser Leu Glu
100 105 110
Leu Val Arg Ile Gly Thr Cys Gly Gly Leu Gln Pro Asn Thr Pro Val
115 120 125
Gly Thr Phe Val Cys Ser Glu Lys Ser Ile Gly Phe Asp Gly Leu Leu
130 135 140
Asn Phe Tyr Ala Gly Arg Asn Ala Val Cys Asp Leu Pro Phe Glu Arg
145 150 155 160
Ala Phe Leu Asn His Met Gly Trp Ser Gly Asn Met Cys Ala Pro Ala
165 170 175
Pro Tyr Val Ile Asp Ala Asn Ala Glu Leu Ile Asp Arg Ile Ala Gln
180 185 190
Glu Asp Met Val Arg Gly Val Thr Ile Ala Ala Gly Gly Phe Phe Gly
195 200 205
Pro Gln Gly Arg Glu Leu Arg Val Pro Leu Ala Asp Pro Lys Gln Asn
210 215 220
Asp Lys Ile Glu Lys Phe Glu Tyr Lys Gly Tyr Lys Ile Thr Asn Phe
225 230 235 240
Glu Met Glu Ser Ser Ala Leu Ala Gly Leu Ser Lys Leu Met Gly His
245 250 255
Lys Ala Met Thr Val Cys Met Val Ile Ala Asn Arg Leu Ile Lys Glu
260 265 270
Ala Asn Thr Gly Tyr Lys Asn Thr Ile Asp Thr Leu Ile Lys Thr Ile
275 280 285
Leu Asp Arg Ile
290
<210> 5
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Thr Pro His Ile Asn Ala Glu Met Gly Asp Phe Ala Asp Val
1 5 10 15
Val Leu Met Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys His Ile Ala Glu Thr
20 25 30
Phe Leu Glu Asn Val Arg Glu Val Asn Asn Val Arg Gly Met Leu Gly
35 40 45
Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Arg Lys Ile Ser Val Met Gly His Gly
50 55 60
Met Gly Ile Pro Ser Cys Ser Ile Tyr Thr Lys Glu Leu Ile Thr Asp
65 70 75 80
Phe Gly Val Lys Lys Ile Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Val Arg
85 90 95
Met Asp Val Lys Leu Arg Asp Val Val Ile Gly Met Gly Ala Cys Thr
100 105 110
Asp Ser Lys Val Asn Arg Ile Arg Phe Lys Asp His Asp Phe Ala Ala
115 120 125
Ile Ala Asp Phe Asp Met Val Arg Asn Ala Val Asp Ala Ala Lys Ala
130 135 140
Leu Gly Val Asp Ala Arg Val Gly Asn Leu Phe Ser Ala Asp Leu Phe
145 150 155 160
Tyr Ser Pro Asp Gly Glu Met Phe Asp Val Met Glu Lys Tyr Gly Val
165 170 175
Leu Gly Val Glu Met Glu Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Val Ala Ala Glu
180 185 190
Phe Gly Ala Lys Ala Leu Thr Ile Cys Thr Val Ser Asp His Ile Arg
195 200 205
Thr His Glu Gln Thr Thr Ala Ala Glu Arg Gln Thr Thr Phe Asn Asp
210 215 220
Met Ile Lys Ile Ala Leu Glu Ser Val Leu Leu Gly Asp Lys Glu
225 230 235
<210> 6
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Gln Gln Asp Pro Val Leu Asn Ala Val Ala Thr Ile Leu Ala Arg
1 5 10 15
Lys Pro Gly Phe Ala Pro Arg Ala Ala Met Ile Leu Gly Ser Gly Leu
20 25 30
Gly Val Leu Ala Asp Gly Leu Glu Glu Lys Val Thr Ile Pro Tyr Glu
35 40 45
Glu Leu Asp Gly Phe Pro Val Ser Thr Val Ala Gly His Ser Gly Glu
50 55 60
Leu Val Leu Gly Lys Leu His Gly Val Asp Val Val Cys Met Lys Gly
65 70 75 80
Arg Gly His Tyr Tyr Glu His Glu Thr Met Lys Val Met Thr Thr Pro
85 90 95
Val Arg Thr Phe Lys Arg Leu Gly Cys Glu Leu Leu Leu Val Thr Asn
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Arg Pro Glu Arg Ile Gly Val Gly Ser Leu Val
115 120 125
Ile Phe Asn Asp His Ile Asn Thr Met Pro Gly Thr Pro Met Thr Gly
130 135 140
Ala Asn Asp Glu Ala Tyr Gly Pro Arg Phe Phe Ser Leu Ala Asn Ala
145 150 155 160
Tyr Asp Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ala Leu Ala Leu Ala Glu Arg Glu
165 170 175
Gly Ile Ala Val Asn Gln Gly Val Phe Val Ser Tyr Ser Gly Pro Cys
180 185 190
Phe Glu Thr Ala Ala Glu Ile Arg Met Met Gln Ile Ile Gly Gly Asp
195 200 205
Val Val Gly Met Ser Val Val Pro Glu Val Val Ser Ala Ala His Cys
210 215 220
Ala Leu Pro Val Leu Ala Ile Cys Ala Ile Thr Asn Met Ala Glu Gly
225 230 235 240
Leu Gly Asp Val Gln Leu Ser His Glu Gln Thr Leu Lys Cys Ala Lys
245 250 255
Leu Ala Glu Thr Asp Phe Ile Arg Leu Ile Asn Ala Phe Ile Lys His
260 265 270
His Phe Gln
275
<210> 7
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Asp Ile Gly Glu Leu Phe Gly Leu Ala His Val His Glu Gln Arg
1 5 10 15
Pro Leu Leu His Gln Leu Leu Pro Phe Gly Gly Gly Asp Phe Phe His
20 25 30
Gly Gly Ser Ile Ala Asn Pro Thr Glu Lys Lys Ala Gly Arg Ala Ala
35 40 45
Asn Arg Arg Lys Phe Gly Arg Asn Ala Leu Arg Ser Pro Asp Thr Leu
50 55 60
Arg Gly Met Ser Ile His Leu Asn Ala Glu Lys Gly Gln Ile Ala Glu
65 70 75 80
Thr Val Leu Leu Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Arg His Ile Ala Glu
85 90 95
Thr Phe Leu Glu Asn Pro Val Gln His Asn Thr Val Arg Gly Met Leu
100 105 110
Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Glu Arg Val Ser Val Gln Gly Thr
115 120 125
Gly Met Gly Ile Pro Ser Cys Met Ile Tyr Val Asn Glu Leu Ile Gln
130 135 140
Asp Tyr Gly Cys Lys Asn Leu Ile Arg Val Gly Thr Ala Gly Ser Tyr
145 150 155 160
Gln Glu Gly Val His Val Arg Asp Leu Val Leu Ala Gln Ala Ala Cys
165 170 175
Thr Asp Ser Asn Ile Asn Arg Val Arg Phe Gly Glu Arg Thr Phe Ala
180 185 190
Pro Ile Ala Asp Phe Glu Leu Leu Leu Arg Ala Tyr Gln Ile Ala Gln
195 200 205
Glu Arg Gly Phe Ser Ala His Val Gly Asn Ile Met Ser Ser Asp Thr
210 215 220
Phe Tyr Asn Asp Asn Pro Thr Glu Phe Gln Arg Trp Ala Glu Phe Gly
225 230 235 240
Val Leu Ala Val Glu Met Glu Ala Ala Gly Leu Tyr Thr Leu Ala Ala
245 250 255
Lys Tyr Gly Val Arg Ala Leu Thr Ile Leu Thr Ile Ser Asp His Leu
260 265 270
Val Thr His Glu Val Thr Ser Ala Glu Glu Arg Gln Leu Thr Phe Asn
275 280 285
Gly Met Ile Glu Val Ala Leu Asp Ala Ala Leu Gly Leu Glu Lys Lys
290 295 300
Ala
305
<210> 8
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Glu Asn Glu Phe Thr Tyr Glu Asp Tyr Gln Arg Thr Ala Glu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Ser His Thr Lys His Arg Pro Gln Val Ala Val Ile Cys Gly
20 25 30
Ser Gly Leu Gly Gly Leu Thr Ala Lys Leu Thr Gln Pro Gln Ala Phe
35 40 45
Asp Tyr Asn Glu Ile Pro Asn Phe Pro Gln Ser Thr Val Gln Gly His
50 55 60
Ala Gly Arg Leu Val Phe Gly Phe Leu Asn Gly Arg Ser Cys Val Met
65 70 75 80
Met Gln Gly Arg Phe His Met Tyr Glu Gly Tyr Ser Leu Ser Lys Val
85 90 95
Thr Phe Pro Val Arg Val Phe His Leu Leu Gly Val Asp Thr Leu Val
100 105 110
Val Thr Asn Ala Ala Gly Gly Leu Asn Pro Lys Phe Glu Val Gly Asp
115 120 125
Ile Met Leu Ile Arg Asp His Ile Asn Leu Pro Gly Phe Cys Gly Gln
130 135 140
Asn Pro Leu Arg Gly Pro Asn Asp Glu Arg Phe Gly Val Arg Phe Pro
145 150 155 160
Ala Met Ser Asp Ala Tyr Asp Arg Asp Met Arg Gln Lys Ala Phe Asn
165 170 175
Ala Trp Lys Gln Met Gly Glu Gln Arg Glu Leu Gln Glu Gly Thr Tyr
180 185 190
Ile Met Ser Ala Gly Pro Thr Phe Glu Thr Val Ala Glu Ser Cys Leu
195 200 205
Leu Arg Met Leu Gly Ala Asp Ala Val Gly Met Ser Thr Val Pro Glu
210 215 220
Val Ile Val Ala Arg His Cys Gly Leu Arg Val Phe Gly Phe Ser Leu
225 230 235 240
Ile Thr Asn Lys Val Val Met Asp Tyr Asn Asn Leu Glu Lys Ala Ser
245 250 255
His Gln Glu Val Leu Glu Ala Gly Lys Ala Ala Ala Gln Lys Leu Glu
260 265 270
Gln Phe Val Ser Ile Leu Met Glu Ser Ile Pro Pro Arg Glu Arg Ala
275 280 285
Asn
<210> 9
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Gly Phe Thr Thr Gly Arg Glu Phe His Pro Ala Leu Arg Met Arg
1 5 10 15
Ala Lys Tyr Asn Ala Lys Tyr Leu Gly Thr Lys Ser Glu Arg Glu Lys
20 25 30
Tyr Phe His Leu Ala Tyr Asn Lys His Thr Gln Phe Leu Arg Tyr Gln
35 40 45
Glu Gln Ile Met Ser Lys Thr Lys Glu Lys Lys Val Gly Val Ile Phe
50 55 60
Gly Lys Phe Tyr Pro Val His Thr Gly His Ile Asn Met Ile Tyr Glu
65 70 75 80
Ala Phe Ser Lys Val Asp Glu Leu His Val Ile Val Cys Ser Asp Thr
85 90 95
Val Arg Asp Leu Lys Leu Phe Tyr Asp Ser Lys Met Lys Arg Met Pro
100 105 110
Thr Val Gln Asp Arg Leu Arg Trp Met Gln Gln Ile Phe Lys Tyr Gln
115 120 125
Lys Asn Gln Ile Phe Ile His His Leu Val Glu Asp Gly Ile Pro Ser
130 135 140
Tyr Pro Asn Gly Trp Gln Ser Trp Ser Glu Ala Val Lys Thr Leu Phe
145 150 155 160
His Glu Lys His Phe Glu Pro Ser Ile Val Phe Ser Ser Glu Pro Gln
165 170 175
Asp Lys Ala Pro Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Leu Glu Val Ser Leu Val
180 185 190
Asp Pro Asp Arg Thr Phe Phe Asn Val Ser Ala Thr Lys Ile Arg Thr
195 200 205
Thr Pro Phe Gln Tyr Trp Lys Phe Ile Pro Lys Glu Ala Arg Pro Phe
210 215 220
Phe Ala Lys Thr Val Ala Ile Leu Gly Gly Glu Ser Ser Gly Lys Ser
225 230 235 240
Val Leu Val Asn Lys Leu Ala Ala Val Phe Asn Thr Thr Ser Ala Trp
245 250 255
Glu Tyr Gly Arg Glu Phe Val Phe Glu Lys Leu Gly Gly Asp Glu Gln
260 265 270
Ala Met Gln Tyr Ser Asp Tyr Pro Gln Met Ala Leu Gly His Gln Arg
275 280 285
Tyr Ile Asp Tyr Ala Val Arg His Ser His Lys Ile Ala Phe Ile Asp
290 295 300
Thr Asp Phe Ile Thr Thr Gln Ala Phe Cys Ile Gln Tyr Glu Gly Lys
305 310 315 320
Ala His Pro Phe Leu Asp Ser Met Ile Lys Glu Tyr Pro Phe Asp Val
325 330 335
Thr Ile Leu Leu Lys Asn Asn Thr Glu Trp Val Asp Asp Gly Leu Arg
340 345 350
Ser Leu Gly Ser Gln Lys Gln Arg Gln Gln Phe Gln Gln Leu Leu Lys
355 360 365
Lys Leu Leu Asp Lys Tyr Lys Val Pro Tyr Ile Glu Ile Glu Ser Pro
370 375 380
Ser Tyr Leu Asp Arg Tyr Asn Gln Val Lys Ala Val Ile Glu Lys Val
385 390 395 400
Leu Asn Glu Glu Glu Ile Ser Glu Leu Gln Asn Thr Thr Phe Pro Ile
405 410 415
Lys Gly Thr Ser Gln
420
<210> 10
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Ser Ser Phe Asp Tyr Leu Lys Thr Ala Ile Lys Gln Gln Gly Cys
1 5 10 15
Thr Leu Gln Gln Val Ala Asp Ala Ser Gly Met Thr Lys Gly Tyr Leu
20 25 30
Ser Gln Leu Leu Asn Ala Lys Ile Lys Ser Pro Ser Ala Gln Lys Leu
35 40 45
Glu Ala Leu His Arg Phe Leu Gly Leu Glu Phe Pro Arg Arg Gln Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Val Val Phe Gly Lys Phe Tyr Pro Leu His Thr Gly His
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Ile Gln Arg Ala Cys Ser Gln Val Asp Glu Leu His Ile
85 90 95
Ile Met Gly Tyr Asp Asp Thr Arg Asp Arg Gly Leu Phe Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Met Ser Gln Gln Pro Thr Val Ser Asp Arg Leu Arg Trp Leu Leu
115 120 125
Gln Thr Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Ile Arg Ile His Ala Phe Asn Glu
130 135 140
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145 150 155 160
Ile Lys Ala Phe Met Ala Glu Lys Gly Ile Gln Pro Ser Trp Ile Tyr
165 170 175
Thr Ser Glu Glu Ala Asp Ala Pro Gln Tyr Leu Glu His Leu Gly Ile
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Glu Val Lys Pro Phe Phe Val Arg Thr Val Ala Ile Leu Gly Gly Glu
225 230 235 240
Ser Ser Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Lys Leu Ala Asn Ile Phe Asn
245 250 255
Thr Thr Ser Ala Trp Glu Tyr Gly Arg Asp Tyr Val Phe Ser His Leu
260 265 270
Gly Gly Asp Glu Met Ala Leu Gln Tyr Ser Asp Tyr Asp Lys Ile Ala
275 280 285
Leu Gly His Ala Gln Tyr Ile Asp Phe Ala Val Lys Tyr Ala Asn Lys
290 295 300
Val Ala Phe Ile Asp Thr Asp Phe Val Thr Thr Gln Ala Phe Cys Lys
305 310 315 320
Lys Tyr Glu Gly Arg Glu His Pro Phe Val Gln Ala Leu Ile Asp Glu
325 330 335
Tyr Arg Phe Asp Leu Val Ile Leu Leu Glu Asn Asn Thr Pro Trp Val
340 345 350
Ala Asp Gly Leu Arg Ser Leu Gly Ser Ser Val Asp Arg Lys Ala Phe
355 360 365
Gln Asn Leu Leu Val Glu Met Leu Lys Glu Asn Asn Ile Glu Phe Val
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410
<210> 11
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Pro Glu Pro Gly Val Gly Ala His Ala Gly Gly Leu Asp Ala Asp
1 5 10 15
Ala Ala Leu Ala Arg Phe Phe Val Ile Thr Gly Gly Pro Gly Ser Gly
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
His Ala Leu Pro Trp Arg Asp Arg Ala Ala Phe Ala Asp Met Met Leu
65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Val Val Glu Ala Ala Ala Ala Val
195 200
<210> 12
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Thr Ser Lys Lys Val Ile Leu Val Ala Leu Ser Gly Cys Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gly Lys Thr Thr Ile Ala Lys Leu Thr Ala Ser Leu Phe Thr Lys
20 25 30
Ala Thr Leu Ile His Glu Asp Asp Phe Tyr Lys His Asp Asn Glu Val
35 40 45
Pro Val Asp Ala Lys Tyr Asn Ile Gln Asn Trp Asp Ser Pro Glu Ala
50 55 60
Leu Asp Phe Lys Leu Phe Gly Lys Glu Leu Asp Val Ile Lys Gln Thr
65 70 75 80
Gly Lys Ile Ala Thr Lys Leu Ile His Asn Asn Asn Val Asp Asp Pro
85 90 95
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100 105 110
Lys Tyr Asp Ser Ile Asn Asp Asp Lys Tyr Glu Val Val Ile Val Asp
115 120 125
Gly Phe Met Ile Phe Asn Asn Thr Gly Ile Ser Lys Lys Phe Asp Leu
130 135 140
Lys Ile Leu Val Arg Ala Pro Tyr Glu Val Leu Lys Lys Arg Arg Ala
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Ser Arg Lys Gly Tyr Gln Thr Leu Asp Ser Phe Trp Val Asp Pro Pro
165 170 175
Tyr Tyr Phe Asp Glu Phe Val Tyr Glu Ser Tyr Arg Ala Asn His Ala
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Gln Leu Phe Val Asn Gly Asp Val Glu Gly Leu Leu Asp Pro Arg Lys
195 200 205
Ser Lys Asn Ile Lys Glu Phe Ile Asn Asp Asp Asp Thr Pro Ile Ala
210 215 220
Lys Pro Leu Ser Trp Val Cys Gln Glu Ile Leu Lys Leu Cys Lys Asp
225 230 235 240
<210> 13
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Thr Ser Gln Leu Ala Gly Phe Lys Gly Thr Arg Gly Thr Leu Leu
1 5 10 15
Val Gly Ile Gly Gly Cys Ser Ser Ser Gly Lys Ser Thr Ile Ala Lys
20 25 30
Leu Ala Val Gln Val Leu Glu Asp Ala Val Leu Val His Gln Asp Asp
35 40 45
Phe Tyr Arg His Asp Asp Glu Val Pro Phe Asp Glu Glu Tyr Gln Ile
50 55 60
Gly Asn Trp Asp Val Pro Glu Ala Leu Asp Met Ala Gln Phe Glu Arg
65 70 75 80
Glu Leu Asp His Ile Arg Ala Thr Gly Arg Pro Ala Ala Lys Leu Val
85 90 95
His Asn Gly Asn Ile Asp Asp Val Gly Lys Phe Gly Ile Ser Glu Glu
100 105 110
Tyr Leu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Tyr Arg Gly Arg Ile Ser Gln Pro
115 120 125
Val Val Leu Val Asp Gly Phe Met Leu Tyr His Asp Asp Lys Val Ala
130 135 140
Ala Arg Phe Asp Cys Arg Leu Leu Val Arg Ala Pro Tyr Ala Thr Met
145 150 155 160
Lys Ala Arg Arg Ala Ser Arg Gly Gly Tyr Lys Thr Leu Asp Ser Phe
165 170 175
Trp Gln Asp Pro Pro Phe Tyr Phe Asp Lys Phe Val Tyr Lys Ser Tyr
180 185 190
Ala Ala Thr His Ala Arg Leu Phe Arg Asn Cys Asp Val Glu Asp Arg
195 200 205
Leu Val Ala Pro Asp Val Gln Glu Ile Tyr Asn Gly Asp Glu Ala Gln
210 215 220
Ile Thr Cys Val Leu Glu Gln Val Leu Asp Ala Ile Ala Ala Ala Gln
225 230 235 240
Cys
<210> 14
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Ser Glu Glu Pro Thr Val Ser Pro Pro Ser Pro Glu Gln Pro Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Lys Pro Ala Arg Pro Ala Ala Arg Arg Ala Pro Arg
20 25 30
Lys Pro Ala Thr Arg Arg Pro Arg Val Ala Ser Pro Ala Gln Lys Ala
35 40 45
Arg Glu Glu Ile Gln Ala Ile Ser Gln Lys Pro Val Ala Leu Gln Val
50 55 60
Ala Ser Ala Pro His Gly Ser Ser Glu Asp Ser Thr Ser Ala Ser Leu
65 70 75 80
Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr His Thr Arg Met Arg Arg Asn Glu Tyr Glu
85 90 95
Lys Ala Lys His Asp Leu Gln Ile Glu Leu Leu Lys Val Gln Ser Trp
100 105 110
Val Lys Glu Thr Gly Gln Arg Val Val Val Leu Phe Glu Gly Arg Asp
115 120 125
Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met Glu His Leu Asn
130 135 140
Pro Arg Gly Ala Arg Ile Val Ala Leu Glu Lys Pro Ser Ser Gln Glu
145 150 155 160
Gln Gly Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Ile Gln His Leu Pro Thr Ala
165 170 175
Gly Glu Met Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val
180 185 190
Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Ser Pro Leu Gln Tyr Leu Glu Phe Met
195 200 205
Arg Gln Ala Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Thr Asn Ser Gly Ile Leu
210 215 220
Leu Phe Lys Tyr Trp Phe Ser Val Ser Arg Glu Glu Gln Leu Arg Arg
225 230 235 240
Phe Ile Ser Arg Arg Asp Asp Pro Leu Lys His Trp Lys Leu Ser Pro
245 250 255
Ile Asp Ile Lys Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Ala Ala Lys
260 265 270
Gln Ala Met Phe Phe His Thr Asp Thr Ala Asp Ala Pro Trp Thr Val
275 280 285
Ile Lys Ser Asp Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn Cys Ile Arg His
290 295 300
Phe Leu His Ser Leu Asp Tyr Pro Asp Lys Asp Arg Arg Ile Ala His
305 310 315 320
Glu Pro Asp Pro Leu Leu Val Gly Pro Ala Ser Arg Val Ile Glu Glu
325 330 335
Asp Glu Lys Val Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Gly His Ala Asn
340 345 350
Leu Asp Ile Pro Ala
355

Claims (9)

1.一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法，其特征在于，以腺苷，烟酰胺，ATP或其盐，多聚磷酸激酶，Mg离子或锰离子，多聚磷酸盐，以及磷酸盐为原料，在EC编号为EC2.4.2.1的嘌呤核苷磷酸化酶和EC编号为EC 2.7.1.22 烟酰胺核糖激酶的酶催化作用下合成β-烟酰胺单核苷酸，所述磷酸盐不包含多聚磷酸盐。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述嘌呤核苷磷酸化酶包含来源于calfspleen，Bos taurus，Escherichia coli，Salmonella typhimurium，Bacillus cereus，Bacillus clausii，Aeromonas hydrophila，Bovine Salmonella enterica， Bacteroidesfragilis ，Mycobacterium tuberculosis，Aeromonas hydrophila中的一种或两种以上的嘌呤核苷磷酸化酶。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述烟酰胺核糖激酶来源于B.pseudomallei，Ashbya gossypii，Haemophilus influenzae，Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces pombe，Salmonella typhimurium，Cupriavidus metallidurans，Xanthomonas campestris pv. Campestris，Agrobacterium vitis ， Pseudarthrobacterchlorophenolicus，Actinobacillus succinogenes ，Homo sapiens ，Saccharomycescerevisiae ，Ashbya gossypii中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，各所述酶以表达各酶的宿主细胞、各酶的酶液或各酶的固定化酶形式参与酶催化反应。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述表达各酶的宿主细胞为含有表达各酶的载体或共表达两种酶的载体的大肠杆菌。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述各酶的酶液为从表达各酶的宿主细胞中提取的酶液。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，反应过程维持反应液的pH在6.5-9.5之间。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，反应温度在25-50℃。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括β-烟酰胺单核苷酸的纯化步骤：
经过滤、层析分析，浓缩结晶干燥后获得β-烟酰胺单核苷酸的纯品。
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