CN112359082B - 一种烟酰胺单核苷酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，向缓冲液中加入烟酰胺、三磷酸腺苷、尿苷和含有Mg2+的化合物，调节pH为6.0～8.0，再加入嘌呤核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶及烟酰胺核糖激酶制得的粗酶液，进行酶促反应，即得。本发明首次使用尿苷作为底物，且对底物烟酰胺以及ATP、尿苷的转化率达到90％以上。
Description
技术领域
本发明属于产烟酰胺单核苷酸制备领域，具体涉及一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide缩写NMN)是生物细胞内存在的一种生化物质，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成细胞赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，又称辅酶I)，并且同时直接参与体内腺苷转移，其在生物细胞内的水平直接影响到NAD的浓度，在生物细胞能量生成扮演着重要角色，并且对人体无危害。
截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多医疗保健作用，更多的用途还在不断研发出来，随着人们对烟酰胺单核苷酸药用及保健效果认知的增加，以及作为一种反应底物在化工方面的广泛应用，市场上对烟酰胺单核苷酸的需求与日俱增。
目前，NMN的制备方法主要包括以下三种：1)酵母发酵法；2)化学合成法；3)生物催化法。其中，化学合成法具有成本较高且产生手性化合物的缺点；而酵母菌发酵法生产的NMN含一定的有机溶剂残留；生物催化法因不含有机溶剂的残留，也不存在手性问题且制备的NMN与机体内的同型而成为目前最绿色环保无公害的NMN制备方法，现有的制备NMN的生物催化法一般是以烟酰胺和5’磷酸核糖基-1’-焦磷酸(PRPP)或AMP或核糖为底物催化下制备NMN，其中PRPP市场价格昂贵且来源受限，导致该生物催化法成本较高，严重制约了其应用和发展。与现有的生产NMN方法的底物而言，尿苷最为经济，且尚未见有采用尿苷为底物生产NMN的报道。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，该方法催化合成周期短，成本低。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，向缓冲液中加入烟酰胺、三磷酸腺苷(ATP)、尿苷和含有Mg2+的化合物，调节pH为6.0～8.0，再加入嘌呤核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶及烟酰胺核糖激酶制得的粗酶液，进行酶促反应，即得；优选地，所述的含有Mg2+的化合物为MgCl2。
其中，所述的缓冲液的pH为6～8。
其中，所述的尿苷、烟酰胺和三磷酸腺苷的摩尔比为1-3:1-3:1-5，在不添加ATP再生酶的情况下优选为1：1：1。
其中，酶促反应的体系中烟酰胺的终浓度为5～50mM，三磷酸腺苷的终浓度为5～50mM，尿苷的终浓度为5～50mM，含有Mg2+的化合物的终浓度为5～25mM。
其中，所述的粗酶液的制备方法为将三种酶构建至所需的载体上，构建好的重组菌株在合适的条件下进行诱导表达、将表达好的重组菌收集破碎，收集上清液即粗酶液并测蛋白浓度。
具体的，包括如下步骤：
(1)分别复制嘌呤核苷磷酸化酶基因、嘧啶核苷磷酸化酶基因和烟酰胺核糖激酶基因，并分别构建于表达载体pET28a中，再转化大肠杆菌Trans1-T1，得到重组质粒；再分别将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，分别得到重组菌BL21(DE3)-pET28a-E2、重组菌BL21(DE3)-pET28a-E3和重组菌BL21(DE3)-pET28a-Nadr；
(2)将步骤(1)得到的三种重组菌的菌液均接种于LB/KanR液体培养基中，培养至OD600为0.5～0.7，加入IPTG，培养，离心，收集菌体；其中，所述的LB/KanR液体培养基中各组分的浓度为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，溶剂为水；
(3)将步骤(2)得到的菌体重悬于pH6.0-8.0的缓冲液中，破碎，离心，所得上清液即为粗酶液，并测蛋白浓度。
步骤(1)中，复制嘌呤核苷磷酸化酶基因的方法为以具有嘌呤核苷磷酸化酶的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增复制嘌呤核苷磷酸化酶的核苷酸编码序列。
所用上、下游引物带有同源臂，其序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃10s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。
步骤(1)中，复制嘧啶核苷磷酸化酶基因的方法为以具有嘧啶核苷磷酸化酶的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增复制嘧啶核苷磷酸化酶的核苷酸编码序列。
所用上、下游引物带有同源臂，其序列分别如序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃20s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。
步骤(1)中，所述的复制烟酰胺核糖激酶基因的方法为以具有烟酰胺核糖激酶的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增烟酰胺核糖激酶的核苷酸编码序列。
所用上游引物带有Nco I酶切位点，如序列表SEQ ID No.5所示；下游引物带有EcoR I酶切位点，如序列表SEQ ID No.6所示。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，50℃20s，72℃25s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。
步骤(1)中，所述的表达载体pET28a用Takara公司的Nco I和EcoR I酶切。
步骤(2)中，三种菌液均按照一定的体积比接种于LB/KanR液体培养基中，优选为按照10％的体积比；加入IPTG至终浓度0.025mM～1mM，优选为0.5mM。
步骤(2)中，所述的培养为在15～37℃、100-200rpm条件下振荡培养12～24h。
其中，酶促反应的体系中，粗酶液中蛋白的终浓度为18～24g/L；重组菌BL21(DE3)-pET28a-E2、重组菌BL21(DE3)-pET28a-E3和重组菌BL21(DE3)-pET28a-Nadr的粗酶液中蛋白的浓度均为6～8g/L。
由于三磷酸腺苷价格昂贵，用量需降至最低，为降低经济成本本发明将底物ATP进行再生，通过基因工程改造、商购获得ATP再生酶，在细菌体内存在利用多聚磷酸或其盐ATP再生酶。
优选地，所述的酶促反应的体系还包括多磷酸钠和ATP再生酶。
其中，所述的ATP再生酶为聚磷酸激酶(EC:2.7.4.1，Ppk)、腺苷酸激酶(EC:2.7.4.3，Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(EC:2.7.4.4，Pap)中的任意一种或几种组合，本发明统称三种酶为“ATP再生酶”。其中，Ppk催化ADP与多聚磷酸或其盐反应生成ATP，Adk催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，Pap催化AMP与多聚磷酸或其盐反应生成ADP，三种酶合理组合利用再生ATP。
其中，酶促反应的体系中烟酰胺的终浓度为5～50mM，三磷酸腺苷的终浓度为2.5～5mM，尿苷的终浓度为5～50mM，含有Mg2+的化合物的终浓度为5～25mM，多磷酸钠的终浓度为10～25mM，ATP再生酶的总用量为300～1000U/L。
其中，使用现有技术记载的公知的测定酶活性的方法，检测到1mg/mL的Ppk、Adk、Pap酶液活性为800U、500U、300U。酶活定义为：将1μmol产物完全转化定义为1个活性单位(U)。
其中，所述的反应为pH 6.0～8.0，35～37℃反应4～9h。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
1、与现有的烟酰胺单核苷酸的制备方法相比，本发明首次使用尿苷作为底物，对底物烟酰胺以及ATP、尿苷的转化率达到90％以上。
2、将底物ATP消耗产生的ADP，通过多磷酸和ATP再生酶再次将ATP再生，极大地节约成本。
3、重组表达菌株经破碎后分离上清，采用表达上清液直接进行催化反应，减少了酶的纯化、分离等操作步骤，极大地简化了工艺，节约成本。
4、酶催化反应的反应过程较为温和，对环境、设备及操作人员均无害。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为本发明中HPLC检测催化胞苷酸的生成，其中，(a)为ATP标准品；(b)为尿苷标准品，(c)为烟酰胺标准品，(d)为烟酰胺单核苷酸标品(e)为实施例7烟酰胺单核苷酸的产量。
图2为重组蛋白表达情况。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术，另外，使用的大肠杆菌Trans1-T1、pET28a等材料都是商业化产品，可直接购买。
实施例中，所述的尿苷、烟酰胺、三磷酸腺苷、MgCl2、多磷酸钠和ATP再生酶的浓度均指的是该体系中的终浓度。
NMN测定方法：Agilent HC-C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)，流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾；流速0.8mL·min-1；检测波长为260nm。
实施例1 BL21(DE3)-PET28a-E2表达菌株的构建
以具有嘌呤核苷磷酸化酶的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增复制嘌呤核苷磷酸化酶的核苷酸编码序列。
所用上游引物带有同源臂，序列为：
GACGGAGCTCGAATTTTACTCTTTATCACCCAGCAGTACGGAT。
下游引物带有同源臂，序列为：
AGGAGATATACCATGATGGCCACCCCACACAT。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃10s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将表达载体pET28a用Takara公司的Nco I和EcoR I酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1μL，Nco I 1μL，EcoR I 1μL，pET28a载体7μL。酶切体系于37℃条件下反应2小时。将酶切后线性化载体末端15-20bp序列作为同源臂，并将其分别添加到基因特异性上下游引物序列的5'端。重组反应体系为：使用Vazyme公司的5X CE II buffer 4μL，Exnase II 2μL，基因片段10μL，载体2μL。连接于37℃下反应1小时。将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-PET28a-E2并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至5mL LB/KanR液体培养基，LB/KanR液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pET28a-E2。取2μL pET28a-E2质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。PCR筛选阳性菌株BL21(DE3)-PET28a-E2。
实施例2 BL21(DE3)-PET28a-E3表达菌株的构建
以具有嘧啶核苷磷酸化酶的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增复制嘧啶核苷磷酸化酶的核苷酸编码序列。
所用上游引物带有同源臂，序列为：
AGGAGATATACCATGATGAGAATGGTTGATATCATCACAAAAAAACAAAAT。
下游引物带有同源臂，序列为：
GACGGAGCTCGAATTCTATTCCGTAATCACCGTATGCACAAG。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃20s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将表达载体pET28a用Takara公司的Nco I和EcoR I酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1μL，Nco I 1μL，EcoR I 1μL，pET28a载体7μL。酶切体系于37℃条件下反应2小时。将酶切后线性化载体末端15-20bp序列作为同源臂，并将其分别添加到基因特异性上下游引物序列的5'端。重组反应体系为：使用Vazyme公司的5X CE II buffer 4μL，Exnase II 2μL，基因片段10μL，载体2μL。连接于37℃下反应1小时。将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-PET28a-E3并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至5mL LB/KanR液体培养基，LB/KanR液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pET28a-E3。取2μL pET28a-E3质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。PCR筛选阳性菌株BL21(DE3)-PET28a-E3。
实施例3 BL21(DE3)-PET28a-Nadr表达菌株的构建
以具有烟酰胺核糖激酶的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增烟酰胺核糖激酶的核苷酸编码序列。
所用上游引物带有Nco I酶切位点，序列为：
CATGCCATGGAACACCACCACCACCACCACATGTCGTCATTTGATTACCTGAAAACTGC。
下游引物带有EcoR I酶切位点，序列为：
CCGGAATTCTTATCTCTGCTCCCCCATCATCT。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，50℃20s，72℃25s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将该序列与表达载体pET28a用Takara公司的Nco I和EcoR I酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1μL，Nco I 1μL，EcoR I 1μL，基因片段或pET28a载体7μL。酶切体系于37℃条件下反应2小时。将酶切产物连接，反应体系为：10×Ligase buffer 1μL，T4 DNA Ligase(Takara)1μL，基因片段7μL，载体1μL。连接于25℃下反应3小时。将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-PET28a-Nadr并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至5mL LB/KanR液体培养基，LB/KanR液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pET28a-Nadr。取2μLpET28a-Nadr质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。PCR筛选阳性菌株BL21(DE3)-PET28a-Nadr。
实施例4三种重组菌株的诱导表达
将三种阳性重组菌株分别接种至100mL LB/KanR液体培养基，37℃、200rpm条件下振荡培养至OD600≈1。将培养后的三种菌液均按10:100的体积比分别接种于500mL新鲜的LB/KanR液体培养基，37℃、200rpm条件下振荡培养至OD600≈0.5～0.7，加入IPTG至终浓度0.5mM，在15～37℃、200rpm条件下振荡培养18h。6000rpm离心10min，收集菌体。从图2可以看出重组蛋白在上清和包涵体均有较好表达。
实施例5菌体破碎
将得到的三种重组菌株菌体用pH6.0-8.0的缓冲液重悬，用高压匀质机破碎，条件为12000psi，4℃，四个循环。6000rpm离心10min收集上清即粗酶液，Bradford法测定蛋白浓度，其中pET28a-E2、pET28a-E3、pET28a-Nadr蛋白浓度分别为3mg/mL、4mg/mL、6mg/mL。
实施例6催化合成NMN
20mL反应体系中：在15.5mL50mM Tris-Hcl缓冲液加入浓度为10mM尿苷、10mM烟酰胺、10mM的三磷酸腺苷、5mM MgCl2，搅拌均匀调至pH 8.0、加入粗酶液4.5mL，其中反应体系中三种重组菌的终浓度均为6g/L，三种粗酶液按初始浓度计算加入的体积。37℃条件下反应4h，完成酶促反应合成烟酰胺单核苷酸，产量为2.5g/L。
实施例7催化合成NMN
20mL反应体系中：在14.8mL50mM Tris-Hcl缓冲液加入浓度为50mM尿苷、50mM烟酰胺、50mM的三磷酸腺苷、10mM MgCl2，搅拌均匀调至pH 8.0、加入粗酶液5.2mL，其中反应体系中三种重组菌的终浓度均为7g/L，三种粗酶液按初始浓度计算加入的体积。37℃条件下反应4h，完成酶促反应合成烟酰胺单核苷酸，产量为15.2g/L(图1)，其对ATP的转化率达到90％以上
实施例8催化合成NMN
20mL反应体系中：在15.5mL 20mM PBS缓冲液缓冲液加入浓度为50mM尿苷、50mM烟酰胺、50mM的三磷酸腺苷、5mM MgCl2，搅拌均匀调至pH 6.2、加入粗酶液4.5mL，其中反应体系中三种重组菌的终浓度均为6g/L，三种粗酶液按初始浓度计算加入的体积。35℃条件下反应6h，完成酶促反应合成烟酰胺单核苷酸，产量为13g/L。
实施例9催化合成NMN
20mL反应体系中：在15.5mL50mM MOPS缓冲液缓冲液加入浓度为25mM尿苷、25mM烟酰胺、25mM的三磷酸腺苷、5mM MgCl2，搅拌均匀调至pH 7.2、加入粗酶液4.5mL，其中反应体系中三种重组菌的终浓度均为6g/L，三种粗酶液按初始浓度计算加入的体积。36℃条件下反应8h，完成酶促反应合成烟酰胺单核苷酸，产量为7g/L。
实施例10 ATP的再生
方法同实施例6，其中三磷酸腺苷降低至2.5mM，体系中添加500U/L ATP再生酶Ppk、10mM多聚磷酸钠，37℃条件下反应4h。检测NMN产量达到2.98g/L。
实施例11 ATP的再生
方法同实施例6，其中三磷酸腺苷降低至2.5mM，体系中添加ATP再生酶Ppk、Adk各500U/L、10mM多聚磷酸钠，37℃条件下反应4h。检测NMN产量达到3.1g/L。
实施例12 ATP的再生
方法同实施例6，其中三磷酸腺苷降低至2.5mM，体系中添加ATP再生酶Ppk、Pap各500U/L、10mM多聚磷酸钠，37℃条件下反应4h。检测NMN产量达到2.96g/L。
实施例13 ATP的再生
方法同实施例6，其中三磷酸腺苷降低至2.5mM，体系中添加ATP再生酶Ppk、Pap、Adk各500U/L、10mM多聚磷酸钠，37℃条件下反应4h。检测NMN产量达到3.2g/L。
实施例14 ATP的再生
方法同实施例9，其中三磷酸腺苷降低至5mM，体系中添加800U/L ATP再生酶Ppk、25mM多聚磷酸钠，36℃条件下反应8h。检测NMN产量达到8.0g/L。
本发明提供了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种烟酰胺单核苷酸的制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 嘌呤核苷磷酸化酶-上游同源臂(PNP-UP)
<400> 1
gacggagctc gaattttact ctttatcacc cagcagtacg gat 43
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 嘌呤核苷磷酸化酶-下游同源臂(PNP-DOWN)
<400> 2
aggagatata ccatgatggc caccccacac at 32
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 嘧啶核苷磷酸化酶-上游同源臂(nuclosidephosphoryalse-UP)
<400> 3
aggagatata ccatgatgag aatggttgat atcatcacaa aaaaacaaaa t 51
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 嘧啶核苷磷酸化酶-下游同源臂(nuclosidephosphoryalse-DOWN)
<400> 4
gacggagctc gaattctatt ccgtaatcac cgtatgcaca ag 42
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 烟酰胺核糖激酶-上游同源臂(NR-UP)
<400> 5
catgccatgg aacaccacca ccaccaccac atgtcgtcat ttgattacct gaaaactgc 59
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 烟酰胺核糖激酶-下游同源臂(NR-DOWN)
<400> 6
ccggaattct tatctctgct cccccatcat ct 32
Claims (3)
1.一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，为以下方式中的任意一种：
方式一：在15.5 mL 50 mM Tris-Hcl缓冲液加入浓度为10 mM 尿苷、10 mM 烟酰胺、2.5 mM 的三磷酸腺苷、5 mM MgCl2，搅拌均匀调至pH 8.0、加入粗酶液4.5 mL，粗酶液按初始浓度计算加入的体积，体系中添加ATP再生酶Ppk、Adk各500 U/L、10 mM 多聚磷酸钠，37℃条件下反应4 h；
方式二：在15.5 mL 50 mM Tris-Hcl缓冲液加入浓度为10 mM 尿苷、10 mM 烟酰胺、2.5 mM 的三磷酸腺苷、5 mM MgCl2，搅拌均匀调至pH 8.0、加入粗酶液4.5 mL，三种粗酶液按初始浓度计算加入的体积，体系中添加ATP再生酶Ppk、Pap、Adk各500 U/L、10 mM 多聚磷酸钠，37℃条件下反应4 h；
其中，所述的粗酶液的制备方法包括如下步骤：
（1）分别复制嘌呤核苷磷酸化酶基因、嘧啶核苷磷酸化酶基因和烟酰胺核糖激酶基因，并分别构建于表达载体pET28a中，再转化大肠杆菌Trans1-T1，得到重组质粒；再分别将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）中，分别得到重组菌BL21(DE3)-pET28a-E2、重组菌BL21(DE3)-pET28a-E3和重组菌BL21(DE3)-pET28a-Nadr；
（2）将步骤（1）得到的三种重组菌的菌液均接种于LB/KanR液体培养基中，培养至OD600为0.5~0.7，加入IPTG，培养，离心，收集菌体；其中，所述的LB/KanR液体培养基中各组分的浓度为：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠5 g/L，溶剂为水；
（3）将步骤（2）得到的菌体重悬于pH6.0- 8.0 的缓冲液中，破碎，离心，所得上清液即为粗酶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，加入IPTG 至终浓度0.025mM~1 mM。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的培养为在15~37℃、100-200 rpm条件下振荡培养12~24 h。
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Application publication date: 20210212 Assignee: Wuhan Kaiming Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: NANJING University OF TECHNOLOGY Contract record no.: X2024980000326 Denomination of invention: A method for preparing nicotinamide mononucleotide Granted publication date: 20230221 License type: Common License Record date: 20240110 |
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