CN113106132A - 制备β-烟酰胺单核苷酸的方法、酶组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了制备β‑烟酰胺单核苷酸的方法、酶组合物及其应用。所述方法包括以下步骤：1)提供微生物的提取物，其中所述微生物的提取物中包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；2)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述微生物的提取物混合，使所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应，生成β‑烟酰胺单核苷酸和AMP；其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的方法不仅能够提高产能，还能够实现绿色生产，总体上创造可观的经济成果。

Description

制备β-烟酰胺单核苷酸的方法、酶组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及制备β-烟酰胺单核苷酸的方法、酶组合物及其应用。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸是生物体中最重要的辅酶。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸调控细胞中的能量代谢，维护生理时钟和各器官细胞的正常功能，并支持基因修复机制和稳定端粒体，为细胞传送氢离子等不可或缺的物质。国内外的研究均证实烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平与衰老和健康有着直接的关联，而且随着年龄增长体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平亦将跟随下降，引发多种由于新陈代谢能力衰退和基因受损所致的顽症。针对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平下降对身体健康的影响，研究指出服用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补充剂能提升新陈代谢的效能并增强体能以有效改善和舒缓相关健康问题，更促使肌肉中的微丝血管增生，赋予在运动上更好的表现和耐力。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸亦能调控身体中的SIRTUIS1-7基因，保护细胞免受自由基(ROS)和炎症因子的破坏。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸除调控睡眠和器官机能外，科学实证其在保护头脑神经和应对脑部退化上也有良好的反应。随着烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的应用研究日趋成熟，且同时在保健和延缓衰老问题上取得了令人鼓舞的进展和成果，使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补充剂近年得到了广泛的关注和认同，成为大众的必需保健品。

在各种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补充剂中，以天然成份β-烟酰胺单核苷酸(NMN)为主。β-烟酰胺单核苷酸(NMN)为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的前体，微量

含于日常食物中。β-烟酰胺单核苷酸容易被人体吸收，并且在短时间内进入细胞中被转化成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。因此服用β-烟酰胺单核苷酸既安全又高效，公认其为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补充剂的最佳选择。

现今各国均面对生育率不足和人口老龄化的问题，对整个社会的生产力和发展带来前所未有的挑战，也为社会上的退休机制、医疗开支和福利保障带来严峻负担。根据国家人口调查结果，中国60岁以上的人口数目已达2.4亿，在七年间的人口占比率更达17.3％；以现时的增长率，在2027年中国将步入老龄社区。为应对人口问题，十九大报告中提出“健康中国”战略，其中摒弃“以药养医、坚持预防为主”的主张，这与服用β-烟酰胺单核苷酸的目的一致。哈佛大学教授David Sinclair主倡维持体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平是延长寿命、维护健康甚至逆转衰老、解决社会和个人健康问题的科学方法。然而，β-烟酰胺单核苷酸的生产方法繁复，价格长期高昂，一般民众难以长期负担。

为了进一步普及服用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，开发可同时降低生产成本和实现大规模生产的β-烟酰胺单核苷酸生产工艺是其中的关键所在。与此同时，工艺还需要充分秉承环境保护和节能的原则。β-烟酰胺单核苷酸的现有生产方法包括提取法、化学合成法和生物酶法。提取法耗能费时，已被业界所摒弃；化学合成法则需要使用多种对环境有害的有机溶剂，成本高昂且对生态和环境带来严重负面影响，也为不可行的工艺。生物酶法则较以上两种方法便宜和环保，但酶法反应中所需要的各种反应物如ATP和核糖等产量长期短缺，不足以应付生产的需求，其价格也因此不断上涨，这成为了量产β-烟酰胺单核苷酸的绊脚石。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了制备β-烟酰胺单核苷酸的方法、酶组合物及其应用。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：

1)提供微生物的提取物，其中所述微生物的提取物中包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

2)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述微生物的提取物混合，使所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应，生成β-烟酰胺单核苷酸和AMP；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(2)根据(1)所述的方法，其中所述方法还包括在磷酸或其衍生物的存在下将AMP磷酸化酶与所述微生物的提取物混合，并且使所述AMP磷酸化酶与所述步骤2)中所产生的AMP反应，其中所述AMP磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(3)根据(1)所述的方法，其中所述微生物提取物中还包含还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，并且所述方法还包括在二氧化碳或其衍生物的存在下将甲酸脱氢酶与所述微生物的提取物混合，并且使所述甲酸脱氢酶与所述还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应，其中所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

(4)根据(1)所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述微生物的提取物的重量比为(0.01-100):1，优选为(0.05-50):1，更优选为(0.1-10):1。

(5)根据(2)所述的方法，其中所述AMP磷酸化酶与所述微生物的提取物的重量比为(0.01-100):1，优选为(0.05-50):1，更优选为(0.1-10):1；并且所述磷酸或其衍生物的量为0.1mM-0.5M。

(6)根据(3)所述的方法，其中所述甲酸脱氢酶与所述微生物的提取物的重量比为(0.01-100):1，优选为(0.05-50):1，更优选为(0.1-10):1；并且所述二氧化碳的通气量为0.01-100vvm，优选为0.1-10vvm，更优选为0.5-3vvm。

(7)根据(1)所述的方法，其中所述微生物选自大肠杆菌、芽孢杆菌、霉菌和酵母菌，优选为酵母菌。

(8)根据(1)所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：

A)提供酵母菌提取物，其中该酵母菌提取物中包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

B)在二氧化碳或其衍生物的存在下，将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和甲酸脱氢酶与所述酵母菌提取物混合；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和甲酸脱氢酶的氨基酸序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.3所示。

(9)根据(8)所述的方法，其中所述步骤B)还包括在磷酸或其衍生物的存在下将AMP磷酸化酶与所述酵母菌提取物混合，其中所述AMP磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

(10)根据(1)所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：

I)提供酵母菌提取物，其中该酵母菌提取物中包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

II)在二氧化碳或其衍生物的存在下，将甲酸脱氢酶与所述酵母菌提取物混合；

III)当所述酵母菌提取物中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的量下降至步骤I)时的0.1-99％以下时，将该酵母菌提取物与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和甲酸脱氢酶的氨基酸序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.3所示。

(11)根据(10)所述的方法，其中所述步骤III)还包括，当所述酵母菌提取物中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的量下降至步骤I)时的0.1-99％以下时，将该酵母菌提取物在磷酸或其衍生物的存在下与AMP磷酸化酶混合，其中所述AMP磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(12)根据(8)所述的方法，其中基于反应体系的初始总体积，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-30％(w/v)，所述甲酸脱氢酶的量为0.1-30％(w/v)，二氧化碳的通气量为0.5-3vvm，所述酵母菌提取物的量为0.1-20％(w/v)。

(13)根据(9)所述的方法，其中基于反应体系的初始总体积，所述AMP磷酸化酶的量为0.1-30％(w/v)，并且所述磷酸或其衍生物的量为0.1mM-0.5M。

(14)根据(10)所述的方法，其中基于步骤II)反应体系的初始总体积，所述甲酸脱氢酶的量为0.1-30％(w/v)，二氧化碳的通气量为0.5-3vvm，所述酵母菌提取物的量为0.1-20％(w/v)；基于步骤III)反应体系的初始总体积，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-30％(w/v)。

(15)根据(11)所述的方法，其中基于步骤III)反应体系的初始总体积，所述AMP磷酸化酶的量为0.1-30％(w/v)，并且所述磷酸或其衍生物的量为0.1mM-0.5M。

(16)根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在25-40℃且pH5-9下进行。

(17)根据(1)-(16)中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、所述甲酸脱氢酶和所述AMP磷酸化酶是利用生物工程法并通过微生物发酵得到的。

(18)根据(1)-(16)中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、所述甲酸脱氢酶和所述AMP磷酸化酶以固定化酶/细胞的形式提供。

(19)根据(3)、(8)和(10)中任一项所述的方法，其中所述二氧化碳的衍生物选自碳酸氢钠、碳酸、碳酸铵和碳酸钾；其中优选为碳酸氢钠、碳酸和碳酸铵，更优选为碳酸氢钠。

(20)根据(2)、(5)、(9)、(11)、(13)和(15)中任一项所述的方法，其中所述磷酸的衍生物选自任何化学形式的磷酸钠、磷酸钾、磷酸镁和磷酸钙；其中优选为任何化学形式的磷酸钠、磷酸钾和磷酸镁，更优选为任何化学形式的磷酸钠和磷酸钾。

(21)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(22)一种酶的组合物，包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、甲酸脱氢酶和AMP磷酸化酶，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、所述甲酸脱氢酶和所述AMP磷酸化酶的摩尔比为(0.1-10):(0.1-10):(0.1-10)，并且其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、甲酸脱氢酶和AMP磷酸化酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

(23)根据(21)所述的酶的组合物在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

本发明开发了一种新的通过生物酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法。该方法利用所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶，并以可通过发酵法获得的微生物为原料。由于发酵技术成熟简单，产量不受限制，因此能够确保在量化生产中的原材料供应充裕，源头广泛且价格低廉，可满足大型工业化生产的必要条件。

由于应用了酶法反应，β-烟酰胺单核苷酸的产量比以往工艺的产量有所提高，因此在产能和成本上更有优势。此外，酶法反应为绿色工艺，不需要化学合成法所使用的有机溶剂，不会因生产而对环境和水体造成生态污染。因此，本发明的方法不仅能够提高产能，还能够实现绿色生产，总体上创造可观的经济成果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明所用术语“氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸”是指NAD⁺。

本发明所用术语“还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸”是指NADH。

本发明所用术语“AMP”是指单磷酸腺苷。

补充烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为延缓衰老、改善新陈代谢和提升体能的科学方法，而其中以口服烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补充剂为当前最有效和安全的做法。在众多声称能提升体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平的物质中，本发明的发明人认识到只有β-烟酰胺单核苷酸能在服用后的短时间内被身体充分吸收，并且由于β-烟酰胺单核苷酸是在人体中转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的最前体，且转化率和时间为众多烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补充剂之首，成效更为显着。因此，本发明以β-烟酰胺单核苷酸的制备工艺为研究目标。

本发明的发明人审视现有的β-烟酰胺单核苷酸的生产技术，认识到其在产能、设备和成本方面均不理想，而且由于原料数量短缺和来头狭窄的原因，吨量级的β-烟酰胺单核苷酸的生产工艺将面对多重困难。一部分现有工艺耗能大，或者需要使用大量有机溶剂和重金属，大规模生产所衍生的污染必定对环境造成沉重负担。再者，有机化合物和重金属可能残留于环境甚至产品当中，对环境和用家皆构成不可预期的伤害，有违使用β-烟酰胺单核苷酸以达到“健康”的期望。因此，本发明提出一种新的制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，该方法以酶法工艺为主导，不仅旨在生产β-烟酰胺单核苷酸，还旨在实现原材料的多样化和大众化，进而建立一套具有可持续性和环保的β-烟酰胺单核苷酸的制备方法。

具体而言，本发明提供了一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：

1)提供微生物的提取物，并且所述微生物的提取物中包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

2)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述微生物的提取物混合，使所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物生成β-烟酰胺单核苷酸和AMP，化学反应结构式如下

所述微生物的提取物可以商购获得，也可以由发酵法获得大量特定微生物，然后由该微生物通过提取步骤获得微生物提取物。

微生物在其生命活动过程中会合成多种维持其自身生命循环的生物活性物质，其中包括氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和三磷酸腺苷等。本发明的发明人巧妙地提出利用微生物提取物，特别是发酵获得的微生物提取物为原料，并且提出利用所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物，不仅可以成功生产β-烟酰胺单核苷酸，而且由于发酵法获得微生物的技术成熟简单，产量易于扩大，能够确保量化生产中原料供应充裕，源头广泛且价格低廉，因此可满足大型工业化生产的必要条件。另一方面，生物发酵和酶法反应均为环境友好型工艺，因此本发明的方法环保、安全、符合可持续性发展的要求。

获得微生物提取物的方法包括使用破碎和离心法收集溶液中的微生物及其中的辅料，进而获得微生物的提取物。

优选地，本发明的方法还包括在磷酸或其衍生物的存在下将AMP磷酸化酶与所述微生物的提取物混合，并且使所述AMP磷酸化酶与所述步骤2)中所产生的AMP反应，其中所述AMP磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

AMP磷酸化酶在磷酸或其衍生物的存在下催化酶反应当中所产生的AMP至1,5二磷酸核酮糖和腺嘌呤，从而促使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶在转化中不会受AMP的增长而出现产物抑制作用，确保酶反应在最佳的情况下生产β-烟酰胺单核苷酸。所涉及的化学反应结构式如下

由于所述微生物提取物中还包含还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，因此优选地，本发明的方法还包括在二氧化碳或其衍生物的存在下将甲酸脱氢酶与所述微生物的提取物混合，并且使所述甲酸脱氢酶与所述还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应，其中所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在甲酸脱氢酶和二氧化碳或其衍生物的作用下被转化为NAD⁺和甲酸，该NAD⁺可进一步被上述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶转化为β-烟酰胺单核苷酸和AMP。在二氧化碳的存在下以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物来提供NAD⁺的化学反应结构式如下：

所述二氧化碳的衍生物选自碳酸氢钠、碳酸、碳酸铵和碳酸钾。优选使用气态二氧化碳、碳酸氢钠、碳酸和碳酸铵，更优选使用气态二氧化碳和碳酸氢钠。

优选地，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述微生物的提取物的重量比为(0.01-100):1，优选为(0.05-50):1，更优选为(0.1-10):1。

还优选地，所述AMP磷酸化酶与所述微生物的提取物的重量比为(0.01-100):1，优选为(0.05-50):1，更优选为(0.1-10):1。所述磷酸或其衍生物的量优选为0.1mM-0.5M。

还优选地，所述甲酸脱氢酶与所述微生物的提取物的重量比为(0.01-100):1，优选为(0.05-50):1，更优选为(0.1-10):1。所述二氧化碳的通气量可以为0.01-100vvm，优选为0.1-10vvm，更优选为0.5-3vvm。所述二氧化碳衍生物的浓度可以为0.1mM-2M。

所述微生物可以为真菌、霉菌、细菌等，例如杆菌，包括大肠杆菌E.Coil、芽孢杆菌等。在优选的实施方案中，所述微生物为酵母菌，更优选为通过发酵法获得的酵母菌。

酵母菌为日常原料，可通过发酵过程而轻易取得，技术成熟且简单，用于本发明的方法可获得高产能。酵母菌包括商业上使用的各种食用酵母菌，包括各种烘焙酵母、各种酿酒酵母和酿制食物中可使用的各种酵母，其中优选使用酿制酒类的酵母。本发明特别提出使用来自酿酒后所弃用的酵母，其中酿制酒类的各种酵母菌种有所不同，优选为酿制葡萄酒、白酒或啤酒的酵母菌种，更优选为酿制啤酒的酵母。

酿酒后的酵母菌除少量用作植物肥料和饲料外，一般皆被视为工业废料，而且中国为全球啤酒的最大生产国，2018年的产量已超过3800万吨，每天的酿酒酵母产量巨大，使用其作为生产β-烟酰胺单核苷酸的原料，除了可保证能长期满足原材料的供应以外，更可同时处理酿酒业的环保问题。

酵母菌提取物可以由酵母菌或酵母菌发酵液获得，也可以商购获得。酵母发酵液可以包括酵母菌、培养液和在发酵过程中加入的所有物料。

本发明也可以跳过制备酵母提取物的步骤，直接使用含有还原型和/或氧化型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的酵母菌进行β-烟酰胺单核苷酸的生产，该酵母菌可以使用离心机在10,000rpm的转速下进行离心脱水和收集后，将细胞固体以20％(w/v)在磷酸盐缓冲液(0.1M,pH 7.5)中进行打浆(即，搅拌以得到没有明显颗粒的悬浮液)来处理。

在利用所述三种酶的情况中，可以单独以分开的步骤分别加入三种酶，以进行所述酶反应；也可以将三种酶同时混合加入以进行所述酶反应。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

A)提供酵母菌提取物，优选地，所述酵母菌由发酵法得到；

B)在二氧化碳或其衍生物的存在下，将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和甲酸脱氢酶与所述酵母菌提取物混合；此步还优选在磷酸或其衍生物的存在下将AMP磷酸化酶与所述酵母菌提取物混合；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、甲酸脱氢酶和AMP磷酸化酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，并且所述酵母菌提取物中包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

所述二氧化碳的衍生物选自碳酸氢钠、碳酸、碳酸铵和碳酸钾。优选使用气态二氧化碳、碳酸氢钠、碳酸和碳酸铵，更优选使用气态二氧化碳和碳酸氢钠。

所述磷酸的衍生物选自任何化学形式的磷酸钠、磷酸钾、磷酸镁和磷酸钙；其中优选为任何化学形式的磷酸钠、磷酸钾和磷酸镁，更优选为任何化学形式的磷酸钠和磷酸钾。

在上述实施方案中，优选地，基于反应体系的初始总体积，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-30％(w/v)(例如0.1-10％(w/v)、0.1-20％(w/v))，所述甲酸脱氢酶的量为0.1-30％(w/v)(例如0.1-10％(w/v)、0.1-20％(w/v))，所述AMP磷酸化酶的量为0.1-30％(w/v)(例如0.1-10％(w/v)、0.1-20％(w/v))。二氧化碳的通气量可以为0.1-100vvm(优选为0.1-10vvm，更优选为0.5-3vvm)。所述二氧化碳衍生物的量可以为反应溶液的0.01-20％(w/v)。所述磷酸或其衍生物的量优选为0.1mM-0.5M。所述酵母菌提取物的量可以为0.1-20％(w/v)。

术语“反应体系的初始总体积”是指加入所有所需的反应物时，反应体系的总体积。随着反应的进行，反应体系的体积有可能发生变化，因此，上述反应物的量是基于加入所有所需的反应物时的反应体系的体积而言的。

在一些实施方案中，所述的反应过程包括将酵母提取物以0.1-20％(w/v)的量溶解于纯水中并以中速滤纸过滤后，加入同等或不同份量的上述三种酶，在特定的反应条件下进行反应。其中二氧化碳可以常压或差压的方式加入至反应溶液中。

在本发明的另一些具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

I)提供酵母菌提取物，优选地，所述酵母菌由发酵法得到；

II)在二氧化碳或其衍生物的存在下，将甲酸脱氢酶与所述酵母菌提取物混合，其中所述酵母菌提取物中包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

III)当所述酵母菌提取物中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的量下降至步骤I)时的0.1-99％以下时，将该酵母菌提取物与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合；此时，还优选将该酵母菌提取物在磷酸或其衍生物的存在下与AMP磷酸化酶混合；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、甲酸脱氢酶和AMP磷酸化酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

所述二氧化碳的衍生物选自碳酸氢钠、碳酸、碳酸铵和碳酸钾。优选使用气态二氧化碳、碳酸氢钠、碳酸和碳酸铵，更优选使用气态二氧化碳和碳酸氢钠。

在步骤II)中，二氧化碳可以常压或差压的方式加入至反应体系中。

在上述实施方案中，优选地，基于步骤II)反应体系的初始总体积，所述甲酸脱氢酶的量为0.1-30％(w/v)(例如0.1-10％(w/v)，优选0.1-20％(w/v))。二氧化碳的通气量可以为0.1-100vvm(优选为0.1-10vvm，更优选为0.5-3vvm)。所述二氧化碳衍生物的量可以为反应溶液的0.01-20％(w/v)。所述酵母菌提取物的量可以为0.1-20％(w/v)。基于步骤III)反应体系的初始总体积，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量优选为0.1-30％(w/v)(例如0.1-20％(w/v)，优选0.1-10％(w/v))，所述AMP磷酸化酶的量优选为0.1-30％(w/v)(例如0.1-20％(w/v)，优选0.1-10％(w/v))。所述磷酸或其衍生物的量优选为0.1mM-0.5M。

本发明的方法可以在25-40℃、pH5-9下进行。反应温度优选为30-40摄氏度，更优选为37-40摄氏度。反应的pH值优选为pH5.5-8.5，更优选为pH6-8，例如pH6-7、pH7-8。

在一些具体的实施方案中，收集已弃用的酿酒酵母后，首先使用离心机得到菌体沉淀物，并以相等重量的纯水清洗菌体后再进行一次离心。完成后加入菌体总量约四倍的纯水，以旋转搅拌的方式(可配合挡板形成乱流状态)将菌体溶于纯水中形成酵母菌液，并以细胞破碎机在约800Pa下进行破碎得到菌体破碎液。菌体破碎液以管式离心机在10,000rpm和流速100L/小时下取上清液。上清液中含有0.1-2％(w/v)的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，其为合成β-烟酰胺单核苷酸的主要原材料。上清液中亦含有0.05-2％(w/v)的NADH，也可用于本发明提出的生物酶法生产β-烟酰胺单核苷酸。在上清液中加入所述酶液或固定化细胞/酶制品，从而制备β-烟酰胺单核苷酸。液酶的总用量可以为整个反应体积的50％(w/v)，优选为1％-20％(w/v)，更优选为2-15％(w/v)；固定化酶/细胞的用量可以为整个反应体积的0.1-30％(w/v)，优选为0.5-25％(w/v)。上清液中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在甲酸脱氢酶和二氧化碳存在下被转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)和甲酸，继而烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶会转化上清液中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)生成β-烟酰胺单核苷酸和AMP，同时AMP磷酸化酶催化酶反应当中所产生的AMP至1,5二磷酸核酮糖和腺嘌呤，促使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶在转化中不会受AMP的增长而出现产物抑制作用，确保酶反应在最佳的情况下生产β-烟酰胺单核苷酸。

在单独以分开的步骤分别加入三种酶以进行所述酶反应的情况中，可以首先加入甲酸脱氢酶并通入气态二氧化碳于含有酵母提取物的反应液中。甲酸脱氢酶会将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和二氧化碳转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)和甲酸。使用高效液相色谱对反应液中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量进行分析，待此步反应完成，即反应液中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸减少至0.1-10mM以下(例如0.1mM以下)，而烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度相对提升，便可同时加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和AMP磷酸化酶。在维持反应条件下，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶会将NAD⁺转化为β-烟酰胺单核苷酸和AMP，而AMP磷酸化酶会同时将前者所产生的AMP在磷酸或其衍生物的存在下催化至1,5二磷酸核酮糖和腺嘌呤。以高效液相色谱进行浓度分析，β-烟酰胺单核苷酸的含量将随反应时间的延长而有所增长，当反应液中的NAD+含量下降至所有反应初始时的10％或以下，而同时β-烟酰胺单核苷酸的含量相对提升时，即可加入0.1M盐酸将反应液的pH调至4.0以结束反应。

在将三种酶同时混合加入以进行所述酶反应的情况中，首先向含有酵母提取物的反应液中通入二氧化碳或加入所述二氧化碳衍生物，并加入磷酸或其衍生物，在温度和pH等反应条件稳定后(例如，温度达到37℃，pH维持在7时)，加入甲酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和AMP磷酸化酶，过程中以高效液相色谱对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、NAD⁺和β-烟酰胺单核苷酸的浓度进行分析，当反应液中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和NAD⁺均下降至所有反应初始时的10％或以下，而同时β-烟酰胺单核苷酸的含量相对提升时，即可加入0.1M盐酸将反应液的pH调至4.0以结束生物酶反应。

优选地，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、所述甲酸脱氢酶和所述AMP磷酸化酶是利用生物工程法并通过微生物发酵得到的。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的基因可以来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(EC3.6.1.22)；AMP磷酸化酶的基因可以来自织里甲烷咸菌(Methanosalsumzhilinae)(EC2.4.2.57)；甲酸脱氢酶的基因可以来自毕赤酵母(Komagataella pastoris)(EC1.17.1.9)。

所述三种酶可以分别用表达载体单独表达重组酶，也可以构建到同一个载体中表达三种酶的重组酶。表达载体可以是分子生物学领域中所常用的表达菌种，如大肠杆菌、酵母菌等。

生物酶法反应可以使用表达重组酶的细胞、细胞破碎液、上清液或纯化酶液进行；也可以将上述重组酶以单独或混合的方式，以任何形式的固定方法和载体制成固定化酶/细胞制品来进行酶反应。

在一些实施方案中，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、所述甲酸脱氢酶和所述AMP磷酸化酶以固定化酶/细胞的形式提供。

本发明还提供了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种酶的组合物，包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、甲酸脱氢酶和AMP磷酸化酶，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、所述甲酸脱氢酶和所述AMP磷酸化酶的摩尔比为(0.1-10):(0.1-10):(0.1-10)(优选为(0.1-1):(0.1-1):(0.1-1))，并且其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、甲酸脱氢酶和AMP磷酸化酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明的酶的组合物能够互相配合从而以微生物提取物高效地生产β-烟酰胺单核苷酸。其中甲酸脱氢酶能够将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，继而烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶将NAD⁺转化成β-烟酰胺单核苷酸，同时在磷酸或其衍生物的存在下AMP磷酸化酶催化酶反应当中所产生的AMP至5’磷酸腺苷和腺嘌呤，促使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶在转化中不会受AMP的增长而出现产物抑制作用，确保酶反应在最佳的情况下生产β-烟酰胺单核苷酸。

本发明还提供了根据本发明所述的酶的组合物在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

例子

以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用本领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。

实施例中所用材料和设备的描述如下：

反应调控罐：来自基因港(香港)生物科技有限公司，BR-1L；

可调节流量式吸水泵：购自SURGEFLO公司，FL-32；

酸碱度调控装置：来自基因港(香港)生物科技有限公司，AR-1；

液化瓶装二氧化碳：购自香港星际气体有限公司。

氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：购自Merck,USA。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐:购自Merck,USA。

单磷酸腺苷二钠盐：购自Merck,USA。

实施例1：制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶(EC 3.6.1.22)

基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶基因序列(基因bank登录号PJP11175)设计PCR引物，具体为

上游引物NDP1：

5'-CTGACCGGATCCATGTCCACTGCAGTGACTTTTTTT-3'(SEQ ID NO.4)

下游引物NDP2：

5'-TATGCGGAATTCCTATAGATGGCTCGATGAGGTCTT-3'(SEQ ID NO.5)。

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因组DNA为模板，以上述引物进行PCR，扩增得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶基因，使用限制性内切酶BamH I和EcoR I处理PCR产物，并将其连接至pET-21a中，得到pET-NDP。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一菌落接种到4mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到容纳有60L LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的大肠杆菌细胞1.37kg。将所得含甲烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的大肠杆菌细胞配制成酶液。酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆(即，搅拌至悬浮没有明显颗粒)后，使用压力式细胞破碎器以700-800bar的设定下进行破碎得细胞破碎液，并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，所得的上清液为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶酶液。根据其酶法反应对酶液进行酶活力检测，该方法为在1ml的反应溶液(200mM PBS，pH 8.0，20Mm氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的β-烟酰胺单核苷酸进行含量分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.71nmol/min/mg。

实施例2：制备AMP磷酸化酶(EC 2.4.2.57)

基于织里甲烷咸菌(Methanosalsum zhilinae DSM 4017)基因组中的AMP磷酸化酶基因序列(基因bank登录号AEH60542)设计PCR引物，具体为

上游引物APP1：

5'-CTGACCGGATCCATGCAATTAAAAGTTCAGCCAATT-3'(SEQ ID NO.6)

下游引物APP2：

5'-TATGCGGAATTCTTAAAGTTCCCTGTAAGTGGGGAC-3'(SEQ ID NO.7)。

以织里甲烷咸菌(Methanosalsum zhilinae DSM 4017)的基因组DNA为模板，以上述引物进行PCR，扩增得AMP磷酸化酶基因。使用限制性内切酶BamH I和EcoR I处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-APP。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到AMP磷酸化酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一菌落接种到4mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到容纳有60L LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含AMP磷酸化酶的大肠杆菌细胞1.11kg。将所得含AMP磷酸化酶的大肠杆菌细胞配制成酶液。酶液的配制方法为，每1g细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS100Mm，pH 7.5)打浆(即，搅拌至悬浮没有明显颗粒)后，使用压力式细胞破碎器以700-800bar的设定下进行破碎得细胞破碎液，并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，所得的上清液为AMP磷酸化酶酶液。根据其酶法反应对酶液进行酶活力检测，该方法为：在1ml的反应溶液(200mM PBS，pH 8.0，20mM单磷酸腺苷二钠盐)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的腺嘌呤进行含量分析。根据上述方法本酶液的酶活约为1.5nmol/min/mg。

实施例3：制备甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)

基于毕赤酵母(Komagataella pastoris)基因组中的甲酸脱氢酶基因序列(基因bank登录号BAH57505)设计PCR引物，具体为：

上游引物FDH1：

5’-CTGACCGGATCCATGAAAATCGTTCTCGTTTTGTAC-3'(SEQ ID NO.8)

下游引物FDH2：

5'-TATGCGGAATTCTTATGCGACCTTTTTGTCATTACC-3'(SEQ ID NO.9)。

以毕赤酵母(Komagataella pastoris)的基因组DNA为模板，以上述引物进行PCR，扩增得甲酸脱氢酶基因，使用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-FDH。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到甲酸脱氢酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一菌落接种到4mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子；完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子；完成后按1％接种比例接到容纳60L LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含甲酸脱氢酶的大肠杆菌细胞1.18kg。将所得含甲酸脱氢酶的大肠杆菌细胞配制成酶液。酶液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆(即，搅拌至悬浮没有明显颗粒)后，使用压力式细胞破碎器以700-800bar的设定下进行破碎得细胞破碎液，并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液，所得的上清液为甲酸脱氢酶酶液。根据其酶法反应对该酶液进行酶活力检测，方法为：在1ml的反应溶液(200mM PBS pH 8.0，10mM碳酸氢钠，2mM还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行含量分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.62nmol/min/mg。

实施例4:制备酵母发酵液

以酿酒酵母为酵母菌种，接种少量于培养液(蛋白胨0.75％，酵母膏0.45％，葡萄糖1％，pH6.9，灭菌)中，在28℃、240rpm的恒温培养摇床中培养24小时。将酿酒酵母菌株挑选单一菌落接种到4mL YFB培养基(蛋白胨0.75％,酵母膏0.45％,葡萄糖1％pH4.6)中，在28℃、240rpm摇床中培养24小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL YFB培养基中，在28℃、200rpm摇床中培养16小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到容纳有60L YFB培养基的100L发酵罐中培养。发酵条件为28℃、100rpm、pH4.6，保持罐压0.03-0.05MPa，每4小时取样一次测量酵母菌的总量，发酵20小时结束。发酵液在室温下以12,500rpm离心10分钟，得酵母菌2.6kg。

实施例5:使用酵母菌以酶上清液进行分步酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

以实施例4的方法得酵母菌进行打浆(即，搅拌至悬浮没有明显颗粒)，取100g酵母菌加入400ml的纯水，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒。以12,500rpm离心10分钟并重复上述步骤三次，冲洗，得85g已处理的酵母菌并进行打浆(即，搅拌至悬浮没有明显颗粒)。将该85g已处理的酵母菌加入340ml的200mM磷酸钠盐缓冲液(pH 7.5)，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒即可。使用细胞破碎机以800Mpa并保持低于30℃的条件进行破碎，完成后得酵母提取物共410ml。酵母提取物中取样并使用高效液相色谱根据实验例1的条件分析其中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量，分别为0.082mM和0.17mM。将上述酵母提取物溶液转至反应罐中，在常压的环境下，将气态二氧化碳通过气石以0.3-0.6vvm打入酵母提取物溶液中持续30分钟，搅拌转速30-100rpm，并控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH 7.5。此时，先加入20ml实施例3制备的甲酸脱氢酶上清液并维持二氧化碳打气和所有反应条件，每一小时取样一次，追踪酵母提取物溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量变化，如表1所示：

表1

反应时间(hr)	NAD<sup>+</sup>(μM)	NADH(μM)
			0	82	170
1	204.5	21.4
			2	206	11.7

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度在反应进行两小时后减少了超过90％，而氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度增加了超过200％，因此第一步反应完成，暂停二氧化碳供气，反应液以12,000rpm离心10分钟后取上清液380ml，使用中速滤纸过滤并进行超滤，加入一倍纯水后取超滤液750ml进行第二步反应。反应液转至反应罐2中，搅拌转速30-100rpm并控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH 7.5，先取样并根据实验例1的条件分析当中的成分含量：氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为0.1mM，β-烟酰胺单核苷酸为0.02mM。首先加入20ml实施例1制备的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶，每一小时取样一次，追踪反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸和AMP的浓度变化(表2)。在反应进行的第四小时，由于酶法反应的速度不理想，AMP作为酶法反应的副产物出现抑制作用，在这时间段中加入5ml实施例2制备的AMP磷酸化酶以催化AMP至1,5二磷酸核酮糖和腺嘌呤。反应速度在第五小时恢复理想，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度下降与β-烟酰胺单核苷酸的浓度上升形成相互关系而AMP的浓度却维持低水平，证明AMP磷酸化酶正发挥其作用。第八小时样本中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度已下降超过90％，滴加2M盐酸将反应液的pH调至3.0使反应立即终止，β-烟酰胺单核苷酸的制备工艺结束，产得β-烟酰胺单核苷酸246mg。

表2

实施例6:使用酵母菌以酶上清液进行混合酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

以实施例4的方法得酵母菌，取100g酵母菌加入400ml的纯水，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒，以12,500rpm离心10分钟并重复上述步骤三次，冲洗，得85g已处理酵母菌，加入340ml的200mM磷酸钠盐缓冲液pH 7.5，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒。当确定酵母菌全部悬浮成浆液后，使用细胞破碎机以800Mpa并保持低于30℃的条件进行破碎，完成后得酵母提取物共410ml。酵母提取物中取样并使用高效液相色谱根据实验例1的条件分析当中的成分含量，分别为0.049mM的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.19mM的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。酵母提取物溶液转至反应罐中，在常压的环境下，气态二氧化碳通过气石以0.3-0.6vvm打入酵母提取物溶液中持续30分钟，搅拌转速30-100rpm，控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH7.5；同时加入20ml实施例3制备的甲酸脱氢酶上清液、20ml实施例1制备的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5ml实施例2制备的AMP磷酸化酶并维持二氧化碳打气和所有反应条件，每一小时取样一次，追踪酵母提取物溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP和β-烟酰胺单核苷酸的含量变化(表3)。

表3

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度在反应进行5小时后减少了超过80％，而β-烟酰胺单核苷酸的浓度则增长至181μM，暂停二氧化碳供气，滴加2M盐酸将反应液的pH调至4.0使反应立即终止。β-烟酰胺单核苷酸的制备工艺结束，产得β-烟酰胺单核苷酸27.5mg。由于AMP磷酸化酶上清液已在初始反应时加入，AMP和磷酸钠盐缓冲液中的磷酸在整个反应过程中被催化至1,5二磷酸核酮糖和腺嘌呤，使AMP的浓度一直维持在低水平，解决了副产物随反应时间延长所导致的抑制作用，故此混合上清液的酶法反应速度较分步进行更快，整个β-烟酰胺单核苷酸的制备方法比实施例5更省时。

实施例7:使用酿酒后弃用的酵母以酶上清液进行分步酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

由啤酒厂取得酿酒后发酵罐中的残渣，其成分包括以弃用的酵母菌和其他原材料，如啤酒花和香料等。混合物的重量为1.2kg，其中酵母的重量约占总量的70％。首先，混合物在粉碎机(型号：YC-910，厂家：上海烨昌机械。粉碎功率：0.75kW)中进行5分钟的粉碎过程，使植物残渣于混合物中变成碎粉，方便后续处理。混合物加入4.8L的纯水，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒。以12,500rpm离心10分钟并重复上述步骤三次，冲洗，得1kg已处理的混合物，并加入4L的200mM磷酸钠盐缓冲液pH 7.5，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒。当混合物中的酵母菌悬浮成浆液后，使用细胞破碎机以950Mpa在保持低于30℃的条件下进行破碎，完成后得酿酒酵母提取物溶液共3.8L。酿酒酵母提取物取样并使用高效液相色谱根据实验例1的条件分析当中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量，分别为0.035mM和0.443mM。酿酒酵母提取物溶液转至反应罐中，在常压的环境下，气态二氧化碳通过气石以0.5-1.0vvm打入酿酒酵母提取物溶液中持续30分钟，搅拌转速30-100rpm，控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH7.5；此时，先加入2000ml甲酸脱氢酶上清液并维持二氧化碳打气和所有反应条件，每一小时取样一次，追踪酵母提取物溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量变化(表4)：

表4

反应时间(hr)	NAD<sup>+</sup>(μM)	NADH(μM)
			0	35	443
1	275	201
			2	521	42.3

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度在反应进行两小时后减少了超过90％，而氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度亦有相对的增长，因此第一步反应完成，暂停二氧化碳供气，反应液以12,000rpm离心10分钟后取上清液6L，使用中速滤纸过滤并进行超滤，加入一倍纯水后取超滤液12L进行第二步反应。反应液转至反应罐2中，搅拌转速30-100rpm并控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH 7.5，先取样并根据实验例1的条件分析当中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-烟酰胺单核苷酸的含量，分别为0.274mM和0mM。首先加入800ml烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶，每一小时取样一次，追踪反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸和AMP的浓度变化(表5)。在反应的第四小时，由于酶法反应的速度不理想，AMP作为酶法反应的副产物出现

制作用，故在此时间加入400ml AMP磷酸化酶在磷酸钠盐缓冲液为磷酸供应体下以催化AMP至1,5二磷酸核酮糖和腺嘌呤。反应速度在第五小时恢复理想；第8小时样本中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度已下降超过90％，滴加2M盐酸将反应液的pH调至3.0使反应立即终止，β-烟酰胺单核苷酸的制备工艺结束，产得β-烟酰胺单核苷酸286mg。

表5

实施例8:使用酿酒后弃用酵母以酶上清液进行混合酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

按实施例7的方法同样处理混合物，得酿酒酵母提取物溶液3.8L。酿酒酵母提取物取样并使用高效液相色谱根据实验例1的条件分析当中的成分含量，当中含有氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.035mM和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.42mM。酿酒酵母提取物溶液转至反应罐中，在常压的环境下，气态二氧化碳通过气石以0.5-1.0vvm打入酿酒酵母提取物溶液中持续30分钟，搅拌转速30-100rpm，控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH7.5；同时加入1000ml甲酸脱氢酶上清液、800ml烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和400ml AMP磷酸化酶并维持二氧化碳的供气和所有反应条件，每一小时取样一次，追踪酵母提取物溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP和β-烟酰胺单核苷酸的含量变化(表6)：

表6

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的综合浓度在反应进行四小时后减少了超过80％，而β-烟酰胺单核苷酸的浓度则增长至261μM，暂停二氧化碳供气，滴加2M盐酸将反应液的pH调至3.0使反应立即终止，β-烟酰胺单核苷酸的制备工艺结束，连准备工序共需4小时，总产得β-烟酰胺单核苷酸444mg。

实施例9:使用酿酒后弃用的酵母以固定化酶进行分步酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

根据中国专利CN1982445B(其全部内容以引用方式并入本文)的实施例3的方法，在固相载体上分别制备含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、AMP磷酸化酶和甲酸脱氢酶的固定化酶；载体的形状皆为条形：长25cm、宽5cm、厚5mm，下表7为各固定化酶成品的重量：

表7

将上述制得的各承载有固定化酶的载体分别安装于三个相同的固定化酶反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高7cm、半径4.5cm。用刀将上述载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成高5cm、半径4.5cm的均质圆柱体，所装配的重量分别为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶固定化酶8.2g、AMP磷酸化酶8.9g和甲酸脱氢酶9.7g。将该圆柱体插入反应器中，使其松紧程度符合中国发明专利申请CN106032520A(其全部内容以引用方式并入本文)中松紧程度符合表1中所述的3级标准，并且使其侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后，按CN106032520A图1进行其它配备装置的安装程序，其中反应调控罐容量为1L；高流量水泵是可调节流量式吸水泵，流速为0.5L/分钟；酸碱度调控装置采用0.1M氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液泵的流量为每分钟1ml。

按实施例7的方法制备酿酒酵母提取物溶液1L后，以12,500rpm进行10分钟的离心，并使用中速滤纸进行过滤后得800mL，取样并使用高效液相色谱根据实验例1的条件分析当中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量(见表8)。将溶液置于反应调控罐中，在常压的环境下，气态二氧化碳通过气石于液下以0.5-1.0vvm打入反应调控罐中持续30分钟，搅拌转速30-100rpm，控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH 7.5，同时反应调控罐连接高流量水泵和装有固定化甲酸脱氢酶的反应器，启动高流量水泵以开始反应，并继续供应二氧化碳。每30分钟取样一次，追踪酵母提取物溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量变化(表8)：

表8

由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度在1hr已降至22μM，因此第一步分反应结束。将固定化甲酸脱氢酶的反应器拆出，换成以并排的方式连接的分别装有固定化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和固定化AMP磷酸化酶的反应器，重新启动高流量水泵进行第二步反应，每小时取样追踪反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP和β-烟酰胺单核苷酸的浓度变化(表9)：

表9

反应时间(hr)	NAD<sup>+</sup>(μM)	AMP(μM)	β-烟酰胺单核苷酸(μM)
				0	588	0.21	0
1	274	16.7	301
				2	151	18.4	468
3	94	12.1	519
				4	32	7.1	542

反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度在四小时后已低至32μM，相对开始时的浓度已耗用超过80％，并且β-烟酰胺单核苷酸的浓度相对上升，第二步反应亦可结束。β-烟酰胺单核苷酸的制备工艺完成，连准备工序共需6小时，总产得β-烟酰胺单核苷酸144mg。

实施例10:使用酿酒后弃用的酵母以固定化酶进行混合酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸

根据中国专利CN1982445B的实施例3的方法，在固相载体上制备含有混合烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、AMP磷酸化酶和甲酸脱氢酶的固定化酶(各酶活力见表7)。载体的形状皆为条形：长25cm、宽5cm、厚5mm重40.5g，下表为混合固定化酶中各液酶所占的重量比(表10)：

表10

将上述制得的混合固定化酶载体安装于固定化酶反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高7cm、半径4.5cm。用刀将上述载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成高5cm、半径4.5cm的均质圆柱体，重量为9.5g。将该圆柱体插入反应器中，使其松紧程度符合中国发明专利申请CN106032520A中松紧程度符合表1中所述的3级标准，并且使其侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后，按CN106032520A图1进行其它配备装置的安装程序，其中反应调控罐容量为1L；高流量水泵是可调节流量式吸水泵，流速为0.5L/分钟；酸碱度调控装置采用0.1M氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液泵的流量为每分钟1ml。

按实施例7的方法制备酿酒酵母提取物溶液1L后，以12,500rpm进行10分钟的离心，并使用中速滤纸进行过滤后得800mL，取样并使用高效液相色谱根据实验例1的条件分析当中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-烟酰胺单核苷酸的浓度和含量(见表11)。将溶液置于反应调控罐中，在常压的环境下，气态二氧化碳通过气石于液下以0.5-1.0vvm打入反应调控罐中持续30分钟，搅拌转速30-100rpm，控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH 7.5，同时反应调控罐连接高流量水泵和装有混合固定化酶的反应器，启动高流量水泵以开始反应，并继续供应二氧化碳。每小时取样一次，追踪反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-烟酰胺单核苷酸的浓度和含量变化(表11)：

表11

由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度在2hr已降至32μM，相对开始时的浓度已耗用超过90％，并且β-烟酰胺单核苷酸的浓度亦相对增加，酶法反应结束，β-烟酰胺单核苷酸的制备工艺完成，连准备工序共需3小时，总产得β-烟酰胺单核苷酸151mg。由于β-烟酰胺单核苷酸的制备工艺中所需要的酶均已固定化于同一载体上，反应的运作能达致紧扣相连，提升β-烟酰胺单核苷酸的生产速度，对整套制备工艺更为有利。

实施例11：使用酵母以酶上清液进行混合酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸(依据实施例6的方式但不使用甲酸脱氢酶)

按实施例4的方法得酵母菌，取100g酵母菌加入400ml的纯水，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒，以12,500rpm离心10分钟并重复上述步骤三次，冲洗，得85g已处理的酵母菌，加入340ml的200mM磷酸钠盐缓冲液pH 7.5，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒，当确定酵母菌全部悬浮成浆液后，使用细胞破碎机以800Mpa并保持低于30℃的条件进行破碎，完成后得酵母提取物共410ml。酵母提取物取样并使用高效液相色谱根据实验例1的条件分析当中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP和β-烟酰胺单核苷酸的含量(见表12)。酵母提取物溶液转至反应罐中，在常压的环境下，气态二氧化碳通过气石以0.3-0.6vvm打入酵母提取物溶液中持续30分钟，搅拌转速30-100rpm，控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH 7.5；按实施例1和2的方法取得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶上清液和AMP磷酸化酶上清液；在上述酵母提取物溶液中同时加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶上清液和AMP磷酸化酶上清液各20ml，并维持二氧化碳供气和所有反应条件，每一小时取样一次，追踪酵母提取物溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP和β-烟酰胺单核苷酸的含量变化(表12)：

表12

反应进行六小时后终止，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度仍然偏高，相比反应开始时的浓度只下调了约15％，而β-烟酰胺单核苷酸的浓度也很低，比实施例6的生产水平减少了超过90％。主要原因为，该实施例的酵母菌提取物中含有较多的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，而酶法反应中缺少了甲酸脱氢酶上清酶液，反应液中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸不能转化至氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，继而没有足够的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行下一步的酶法反应而转化成β-烟酰胺单核苷酸。

实施例12：使用酵母以酶上清液进行混合酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸(依据实施例6的方式但不使用AMP磷酸化酶)

按实施例4的方法得酵母菌，取100g酵母菌加入400ml的纯水，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒，以12,500rpm离心10分钟并重复上述步骤三次，冲洗，得85g已处理的酵母菌，加入340ml的200mM磷酸钠盐缓冲液pH 7.5，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒，当确定酵母菌全部悬浮成浆液后，使用细胞破碎机以800Mpa并保持低于30℃的条件进行破碎，完成后得酵母提取物共410ml。酵母提取物取样并使用高效液相色谱根据实验例1的条件分析当中的氧化型腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP和β-烟酰胺单核苷酸的含量(见表13)。将酵母提取物溶液转至反应罐中，在常压的环境下，气态二氧化碳通过气石以0.3-0.6vvm打入酵母提取物溶液中持续30分钟，搅拌转速30-100rpm，控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH 7.5。按实施例3和1的方法取得甲酸脱氢酶上清液和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶上清液；在反应液中同时加入甲酸脱氢酶上清液和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶上清液各20ml，维持二氧化碳供气和所有反应条件，每一小时取样一次，追踪酵母提取物溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP和β-烟酰胺单核苷酸的含量变化(见表13)：

表13

反应进行六小时后终止，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度虽然相比反应开始时的浓度下降了超过了90％，但氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和AMP的浓度在反应后三小时趋向平稳，而β-烟酰胺单核苷酸的浓度也没有再上升，生产结果逊于实施例6。主要原因为，反应液中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和AMP的浓度随着反应时间增加，当AMP达到高水平时会出现终产物抑制作用，酶法反应效能下降而未能有效地生产β-烟酰胺单核苷酸。导致这情况的原因是酶法反应中缺少了AMP磷酸化酶以催化AMP至1,5二磷酸核酮糖和腺嘌呤。

对比例1：使用酵母以酶上清液进行混合酶法反应制备β-烟酰胺单核苷酸(依据实施例6的方式但不使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶)

按实施例4的方法得酵母菌，取100g酵母菌加入400ml的纯水，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒，以12,500rpm离心10分钟并重复上述步骤三次，冲洗，得85g已处理的酵母菌，并加入340ml的200mM磷酸钠盐缓冲液pH 7.5，搅拌至酵母菌完全悬浮于液体中而没有明显颗粒，当确定酵母菌全部悬浮成浆液后，使用细胞破碎机以800Mpa并保持低于30℃的条件进行破碎，完成后得酵母提取物共410ml。酵母提取物取样并使用高效液相色谱根据实验例1的条件分析当中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP和β-烟酰胺单核苷酸的含量(见表14)。将酵母提取物溶液转至反应罐中，在常压的环境下，气态二氧化碳通过气石以0.3-0.6vvm打入酵母提取物溶液中持续30分钟，搅拌转速30-100rpm，控温于37℃，以0.1M NaOH作调控维持pH 7.5。按实施例3和2的方法取得甲酸脱氢酶上清液和AMP磷酸化酶上清液；在反应液中同时加入甲酸脱氢酶上清液和AMP磷酸化酶上清液各20ml，维持二氧化碳供气和所有反应条件，每一小时取样一次，追踪酵母提取物溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、AMP和β-烟酰胺单核苷酸的含量变化(表14)：

表14

反应进行六小时后终止，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度相比反应开始时的浓度下调了约70％，而没有生产任何β-烟酰胺单核苷酸。制备工艺的方法不能实现。主要原因为酶法反应中缺少了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶上清酶液，反应液中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸不能转化至β-烟酰胺单核苷酸。

实验例1：高效液相色谱分析参数

时间(min)	流速(ml/min)	％流动相A	％流动相B
				0	0.8	100	0
1	0.8	100	0
				13	0.8	90.5	9.5
16	0.8	85	15
				18	0.8	61	39
26	0.8	61	39
				28	0.8	50	50
31	0.8	50	50
				32	0.8	100	0
33	0.8	100	0
				35	1.0	100	0
38.5	1.0	100	0
				39.5	0.8	100	0

SEQUENCE LISTING

<110> 百瑞全球有限公司

<120> 制备β-烟酰胺单核苷酸的方法、酶组合物及其应用

<130> FI-205731-5952

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 384

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 1

Met Ser Thr Ala Val Thr Phe Phe Gly Gln His Val Leu Asn Arg Val

1 5 10 15

Ser Phe Leu Arg Cys Ser Lys Glu Phe Ile Lys Lys Ser Leu Asn His

20 25 30

Asp Ser Thr Val Phe Ile Pro Phe Ile Glu Gly Glu Ala Leu Ile Ser

35 40 45

Pro Glu Asn Gly Asp Leu Val Gln Leu Ser Asn Ser Val Lys Ser Tyr

50 55 60

Lys Asn Ile Leu Ser Ala Ile Val Pro Leu Tyr Thr Thr Leu Leu Asn

65 70 75 80

Thr Thr Arg Ser Arg Ser Asp Glu Ser Gly Ile Asn Val Thr Phe Leu

85 90 95

Gly Leu Leu Glu Gly Thr Asp Ser Ala Phe Asn Phe Glu Trp Ser Asn

100 105 110

Ile Ser Tyr Lys Gly Thr Pro Tyr Phe Gly Leu Asp Ile Arg Val Thr

115 120 125

Glu Ser Thr Leu Phe Lys Lys Val Asp Phe Glu Pro Ile Phe Ser Tyr

130 135 140

Pro Lys Val Thr Arg Asp His Ile Phe Lys Gln Thr Asn Glu Asp Ala

145 150 155 160

Ser Leu Tyr Ser Gln Gly Lys Met Tyr Leu Asp Trp Leu Ala Lys Tyr

165 170 175

Lys Phe Cys Pro Gly Cys Gly Ser Pro Leu Phe Pro Val Glu Ala Gly

180 185 190

Thr Lys Leu Gln Cys Ser Asn Glu Asn Arg Asn Val Tyr Cys Asn Val

195 200 205

Arg Asp Ala Arg Ile Asn Asn Val Cys Phe Pro Arg Thr Asp Pro Thr

210 215 220

Val Ile Ile Ala Leu Thr Asn Ser Asp Tyr Ser Lys Cys Cys Leu Ala

225 230 235 240

Arg Ser Lys Lys Arg Tyr Gly Asp Phe Val Leu Tyr Ser Thr Ile Ala

245 250 255

Gly Phe Met Glu Pro Ser Glu Thr Ile Glu Glu Ala Cys Ile Arg Glu

260 265 270

Ile Trp Glu Glu Thr Gly Ile Ser Cys Lys Asn Ile Asp Ile Val Arg

275 280 285

Ser Gln Pro Trp Pro Tyr Pro Cys Ser Leu Met Ile Gly Cys Leu Gly

290 295 300

Ile Val Gln Phe Asn Ser Lys Asn Glu Val Ile Asn Leu Asn Arg Asp

305 310 315 320

Asp Glu Leu Leu Asp Ala Gln Trp Phe Asp Thr Thr Glu Ile Ile Gln

325 330 335

Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Gly Gly Tyr Arg Val Pro Phe Lys Asn Asp

340 345 350

Ile Asn Leu Pro Gly Ser Thr Thr Ile Ala Phe Gln Leu Ile Asp His

355 360 365

Val Cys Glu Asn Tyr Lys Asn Leu Arg Lys Thr Ser Ser Ser His Leu

370 375 380

<210> 2

<211> 506

<212> PRT

<213> 织里甲烷咸菌（Methanosalsum zhilinae）

<400> 2

Met Gln Leu Lys Val Gln Pro Ile Asp Ile Lys Val Gly Lys Tyr Lys

1 5 10 15

Val Val Leu Asn Ser Ile Asp Ala Lys Glu Leu Gly Val Ile Glu Gly

20 25 30

Asp Arg Val Arg Val Arg Asn His Glu Ser Leu Thr Ala Ile Val Asp

35 40 45

Phe Thr Glu Asp Met Ile Pro Pro Gly Met Ile Gly Val Tyr His Glu

50 55 60

Leu Gln Gln Lys Leu Asn Lys Gln Trp Thr Glu Thr Val Glu Val Thr

65 70 75 80

Pro Ala Ser Arg Pro Lys Ser Ala Arg Leu Ile Arg Lys Ile Met Asp

85 90 95

Arg Gln Ile Leu Thr Lys Asp Glu Ile Tyr Glu Ile Val Arg Gly Ile

100 105 110

Val Asp Glu Ser Leu Ser Asp Ile Glu Leu Ser Ala Phe Ile Thr Ser

115 120 125

Thr Tyr Ile Asn Asp Leu Thr Asp Asp Glu Thr Glu Trp Leu Thr Arg

130 135 140

Ala Met Ile Asp Thr Gly Glu Lys Ile Glu Phe Asp Ser His Pro Ile

145 150 155 160

Met Asp Lys His Ser Ile Gly Gly Val Pro Gly Asn Lys Ile Ser Leu

165 170 175

Leu Ile Val Pro Ile Val Ala Ala Asn Gly Leu Leu Ile Pro Lys Thr

180 185 190

Ser Ser Arg Ala Ile Thr Gly Ala Gly Gly Thr Ala Asp Leu Met Glu

195 200 205

Val Leu Ala Pro Val Asp Phe Ser Ala Ser Glu Ile Lys Glu Met Thr

210 215 220

Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Val Trp Gly Gly Gly Thr Asn Ile Ala

225 230 235 240

Pro Ala Asp Asp Lys Leu Ile Lys Ile Glu Tyr Pro Leu Lys Val Asp

245 250 255

Pro His Ser Gln Leu Leu Ala Ser Ile Met Ala Lys Lys Gly Ala Val

260 265 270

Gly Ala Asp His Val Val Met Asp Ile Pro Met Gly Ala Gly Thr Lys

275 280 285

Ile Pro Asp Ile Lys Thr Gly Arg Lys Leu Ser Arg Asp Leu Ile Asn

290 295 300

Leu Gly Glu Arg Leu Gly Met Thr Val Glu Cys Ala Leu Thr Tyr Gly

305 310 315 320

Ser Ser Pro Val Gly Arg Thr Val Gly Pro Ala Leu Glu Val Arg Glu

325 330 335

Ala Phe Arg Val Leu Glu Ser Met Glu Gly Pro Asn Ser Leu Ile Glu

340 345 350

Lys Ser Thr Val Ile Ala Gly Met Met Leu Glu Met Gly Gly Ile Ala

355 360 365

Gly Lys Gly Asn Gly Gln Glu Leu Ala Met Glu Thr Leu Lys Asn Gly

370 375 380

Lys Ala Leu Glu Lys Met Lys Gln Ile Ile Glu Val Gln Gly Gly Asp

385 390 395 400

Pro Gly Val Thr Ser Ala Asp Ile Ile Ile Gly Glu His Ser Ile Gln

405 410 415

Leu Phe Ala Pro Thr Asn Gly Tyr Ile Leu Glu Phe Asp Asn Lys Arg

420 425 430

Ile Val Glu Ile Ala Arg Ile Ala Gly Ala Pro Ala Asp Lys Gly Ala

435 440 445

Gly Val Val Ile His Lys Lys Arg Gly Glu Pro Val Lys Lys Asn Glu

450 455 460

Pro Val Leu Thr Ile Tyr Ser Glu Lys Lys Trp Lys Leu Asp Asn Ala

465 470 475 480

Ile Lys Ser Ala Gln Leu Asn Leu Pro Ile Val Val Glu Gly Met Leu

485 490 495

Ile Glu Arg Val Pro Thr Tyr Arg Glu Leu

500 505

<210> 3

<211> 365

<212> PRT

<213> 毕赤酵母（Komagataella pastoris）

<400> 3

Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Ser Ala Gly Lys His Ala Ala Asp

1 5 10 15

Glu Pro Lys Leu Tyr Gly Cys Ile Glu Asn Glu Leu Gly Ile Arg Gln

20 25 30

Trp Leu Glu Lys Gly Gly His Glu Leu Val Thr Thr Ser Asp Lys Glu

35 40 45

Gly Glu Asn Ser Glu Leu Glu Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Val Ile

50 55 60

Ile Ser Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Ile Gln

65 70 75 80

Lys Ala Lys Lys Leu Lys Leu Leu Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp

85 90 95

His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Glu Gln Asn Gly Leu Asp Ile Ser Val

100 105 110

Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val

115 120 125

Met Thr Ile Leu Asn Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln

130 135 140

Ile Val Asn His Gly Trp Asp Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr

145 150 155 160

Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly

165 170 175

Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Val Ala Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu

180 185 190

Tyr Tyr Asp Tyr Gln Gly Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly

195 200 205

Ala Arg Arg Val Asp Thr Val Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Val

210 215 220

Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Val Asn

225 230 235 240

Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr

245 250 255

Ala Arg Gly Ala Ile Cys Asn Ala Gln Asp Val Ala Asp Ala Val Ala

260 265 270

Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro

275 280 285

Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Tyr

290 295 300

Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln

305 310 315 320

Val Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Asn Ser Phe Leu Thr

325 330 335

Lys Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Val Ile Leu Leu Asn Gly Lys

340 345 350

Tyr Lys Thr Lys Ala Tyr Gly Asn Asp Lys Lys Val Ala

355 360 365

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

ctgaccggat ccatgtccac tgcagtgact tttttt 36

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

tatgcggaat tcctatagat ggctcgatga ggtctt 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

ctgaccggat ccatgcaatt aaaagttcag ccaatt 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

tatgcggaat tcttaaagtt ccctgtaagt ggggac 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

ctgaccggat ccatgaaaat cgttctcgtt ttgtac 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

tatgcggaat tcttatgcga cctttttgtc attacc 36

Claims (23)

1.一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：

1)提供微生物的提取物，其中所述微生物的提取物中包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

2)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述微生物的提取物混合，使所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应，生成β-烟酰胺单核苷酸和AMP；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在磷酸或其衍生物的存在下将AMP磷酸化酶与所述微生物的提取物混合，并且使所述AMP磷酸化酶与所述步骤2)中所产生的AMP反应，其中所述AMP磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物提取物中还包含还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，并且所述方法还包括在二氧化碳或其衍生物的存在下将甲酸脱氢酶与所述微生物的提取物混合，并且使所述甲酸脱氢酶与所述还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应，其中所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与所述微生物的提取物的重量比为(0.01-100):1，优选为(0.05-50):1，更优选为(0.1-10):1。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述AMP磷酸化酶与所述微生物的提取物的重量比为(0.01-100):1，优选为(0.05-50):1，更优选为(0.1-10):1；并且所述磷酸或其衍生物的量为0.1mM-0.5M。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述甲酸脱氢酶与所述微生物的提取物的重量比为(0.01-100):1，优选为(0.05-50):1，更优选为(0.1-10):1；并且所述二氧化碳的通气量为0.01-100vvm，优选为0.1-10vvm，更优选为0.5-3vvm。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物选自大肠杆菌、芽孢杆菌、霉菌和酵母菌，优选为酵母菌。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：

A)提供酵母菌提取物，其中该酵母菌提取物中包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

B)在二氧化碳或其衍生物的存在下，将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和甲酸脱氢酶与所述酵母菌提取物混合；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和甲酸脱氢酶的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述步骤B)还包括在磷酸或其衍生物的存在下将AMP磷酸化酶与所述酵母菌提取物混合，其中所述AMP磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：

I)提供酵母菌提取物，其中该酵母菌提取物中包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

II)在二氧化碳或其衍生物的存在下，将甲酸脱氢酶与所述酵母菌提取物混合；

III)当所述酵母菌提取物中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的量下降至步骤I)时的0.1-99％以下时，将该酵母菌提取物与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和甲酸脱氢酶的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述步骤III)还包括，当所述酵母菌提取物中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的量下降至步骤I)时的0.1-99％以下时，将该酵母菌提取物在磷酸或其衍生物的存在下与AMP磷酸化酶混合，其中所述AMP磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

12.根据权利要求8所述的方法，其中基于反应体系的初始总体积，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-30％(w/v)，所述甲酸脱氢酶的量为0.1-30％(w/v)，二氧化碳的通气量为0.5-3vvm，所述酵母菌提取物的量为0.1-20％(w/v)。

13.根据权利要求9所述的方法，其中基于反应体系的初始总体积，所述AMP磷酸化酶的量为0.1-30％(w/v)，并且所述磷酸或其衍生物的量为0.1mM-0.5M。

14.根据权利要求10所述的方法，其中基于步骤II)反应体系的初始总体积，所述甲酸脱氢酶的量为0.1-30％(w/v)，二氧化碳的通气量为0.5-3vvm，所述酵母菌提取物的量为0.1-20％(w/v)；基于步骤III)反应体系的初始总体积，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-30％(w/v)。

15.根据权利要求11所述的方法，其中基于步骤III)反应体系的初始总体积，所述AMP磷酸化酶的量为0.1-30％(w/v)，并且所述磷酸或其衍生物的量为0.1mM-0.5M。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在25-40℃且pH5-9下进行。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、所述甲酸脱氢酶和所述AMP磷酸化酶是利用生物工程法并通过微生物发酵得到的。

18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、所述甲酸脱氢酶和所述AMP磷酸化酶以固定化酶/细胞的形式提供。

19.根据权利要求3、8和10中任一项所述的方法，其中所述二氧化碳的衍生物选自碳酸氢钠、碳酸、碳酸铵和碳酸钾；其中优选为碳酸氢钠、碳酸和碳酸铵，更优选为碳酸氢钠。

20.根据权利要求2、5、9、11、13和15中任一项所述的方法，其中所述磷酸的衍生物选自任何化学形式的磷酸钠、磷酸钾、磷酸镁和磷酸钙；其中优选为任何化学形式的磷酸钠、磷酸钾和磷酸镁，更优选为任何化学形式的磷酸钠和磷酸钾。

21.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

22.一种酶的组合物，包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、甲酸脱氢酶和AMP磷酸化酶，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、所述甲酸脱氢酶和所述AMP磷酸化酶的摩尔比为(0.1-10):(0.1-10):(0.1-10)，并且其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、甲酸脱氢酶和AMP磷酸化酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

23.根据权利要求21所述的酶的组合物在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。