CN116926028B

CN116926028B - 一种脱氢酶突变体及其在合成s-玻色因中的应用

Info

Publication number: CN116926028B
Application number: CN202311146214.5A
Authority: CN
Inventors: 范震
Original assignee: Shanghai Yunluo Biotechnology Co ltd; Yunhe Tianjin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Yunluo Biotechnology Co ltd; Yunhe Tianjin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-09-07
Filing date: 2023-09-07
Publication date: 2023-12-01
Anticipated expiration: 2043-09-07
Also published as: CN116926028A

Abstract

本发明提供了一种脱氢酶突变体及其在合成S‑玻色因中的应用，所述的脱氢酶KPADH突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列。本发明所述的S‑玻色因的合成方法是以廉价、常见物质木糖和葡萄糖作为底物，以筛选得到的脱氢酶或突变后的脱氢酶作为催化剂，直接制备出高价值的化妆品原料玻色因，方法简单可靠直接，成本低，安全且对环境友好，更加有利于工业化生产。

Description

一种脱氢酶突变体及其在合成S-玻色因中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种脱氢酶突变体及其在合成S-玻色因中的应用。

背景技术

玻色因，化学名称为羟丙基四氢吡喃三醇，具有促使皮肤中黏多糖的合成，促进生成透明质酸和胶原蛋白，改善真皮与表皮间的粘合度，促进受损组织的再生，帮助维持真皮的弹性，预防皮肤老化等功能，是一种常用于化妆品的活性物。羟丙基四氢吡喃三醇有多种立体构型，有关研究报道S构型羟丙基四氢吡喃三醇(S-玻色因)活性最优。因此近两年出现了化学/酶法合成S-玻色因的报道。化学合成的方法存在污染、步骤繁琐、使用昂贵的催化剂、产量低、且产物难以提纯等缺点。最近报道的酶催化合成的方法存在催化效率低，产物难分离等缺点。因此，亟需开发一种简单高效，适用于商业化大规模生产制备立体专一玻色因的催化方法，以满足市场对于S构型玻色因的需求。

以现有的合成方法来看，用酶催化的方法具有以下优势：方法简单，对环境友好无污染，无需高温高压，效率高，副产物少，成本低，对提升化妆品原料工业化水平具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种脱氢酶突变体及其在合成S-玻色因中的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供了一种脱氢酶KPADH突变体，所述的脱氢酶KPADH突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述的突变体为如下（1）-（8）中任一种：

（1）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺；

（2）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为天冬酰胺；

（3）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺；

（4）第161位苯丙氨酸突变为天冬酰胺；

（5）第161位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺；

（6）第237位丝氨酸突变为天冬酰胺；

（7）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为天冬酰胺、谷氨酰胺、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸或蛋氨酸，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺；

（8）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，且第318位丙氨酸突变为天冬酰胺。

优选的，所述的脱氢酶KPADH突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述的突变体为如下（1）-（25）中任一种：

（1）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，命名为KPADH^Q136N，氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示；

（2）第161位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH^F161N，氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示；

（3）第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH^S237N，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；

（4）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH^Q136N/F161N，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

（5）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH^Q136N/S237N，氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

（6）第161位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH^F161N/S237N，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

（7）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161N/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；

（8）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161Q/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；

（9）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为亮氨酸，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161L/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；

（10）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为甘氨酸，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161G/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；

（11）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为谷氨酸，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161E/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；

（12）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为丝氨酸，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161S/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；

（13）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为缬氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161V/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；

（14）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为异亮氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161I/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示；

（15）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为半胱氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161C/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示；

（16）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为色氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161W/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示；

（17）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为丙氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161A/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示；

（18）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为精氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161R/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示；

（19）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为赖氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161K/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示；

（20）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为苏氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161T/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示；

（21）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为脯氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161P/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示；

（22）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为天冬氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161D/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示；

（23）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为蛋氨酸；且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^{Q136N/F161M/S237N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；

（24）第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，且第318位丙氨酸突变为天冬酰胺，命名为KPADH ^Q136N ^{/F161I/S237N/A318N}，氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示。

本发明还提供了一种核苷酸分子，所述的核苷酸分子编码权利要求1所述的脱氢酶KPADH突变体。

本发明还提供了一种重组载体，所述的重组载体包含有权利要求2所述的核苷酸分子。

本发明还提供了所述的脱氢酶KPADH突变体在合成S-玻色因中的应用。

本发明还提供了一种野生型脱氢酶KPADH在合成S-玻色因中的应用，所述的野生型脱氢酶KPADH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。KPADH酶和pMGDH以β-丙酮木糖苷为底物，葡萄糖提供还原力，在30度条件下进行反应，即可得到S-玻色因。

本发明还提供了一种S-玻色因的合成方法，包括如下步骤：

步骤1是将木糖、乙酰丙酮和强碱在水溶液中进行混合加热，反应后进行脱色、除盐，得到玻色因中间产物；

步骤2是将所述的玻色因中间产物、脱氢酶、辅酶与葡萄糖在缓冲液中混合，反应后经过滤、除盐、浓缩后得到所述的S-玻色因。

进一步，所述的步骤1中的加热步骤的温度为50-56℃，时间为2-4小时；所述的步骤1中的木糖、乙酰丙酮和强碱的摩尔比为1:1.2-1.5:1.3-1.6；所述的强碱为氢氧化钠。

进一步，所述的步骤1中的脱色步骤采用活性碳进行脱色，所述的活性碳与木糖的质量比为1:2-5；所述的步骤1中的脱色步骤的温度为50-56℃；所述的步骤1中的除盐步骤采用电渗析的方式进行除盐。

进一步，所述的步骤2中的脱氢酶包括酶1和酶2，所述的酶1为野生型脱氢酶KPADH或权利要求1所述的脱氢酶KPADH突变体，所述的酶2为脱氢酶pMGDH；所述的酶1和酶2的添加量之比为3000-4000:5000 U/L。

所述的野生型脱氢酶pMGDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。

进一步，所述的步骤2中的辅酶为β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸单钠盐；所述的辅酶与玻色因中间产物、葡萄糖的摩尔比为1：500-1000：500-1500。

进一步，所述的步骤2中的缓冲液为磷酸缓冲液；所述的步骤2中的反应的温度为25-30℃，时间为4-12小时。

优选的，所述的步骤2中的反应的温度为30℃。

所述的S-玻色因的结构式如下。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明所述的脱氢酶KPADH突变体的酶活力比野生型酶活力提高3-100倍，并且经过A318G位点突变后，酶的热稳定性有很大提高。

本发明所述的S-玻色因的合成方法是以廉价、常见物质木糖和葡萄糖作为底物，以筛选得到的脱氢酶或突变后的脱氢酶作为催化剂，直接制备出高价值的化妆品原料玻色因，方法简单可靠直接，成本低，安全且对环境友好，更加有利于工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例所述的S-玻色因的¹H NMR图谱。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明。

实施例1 玻色因中间体（β-丙酮木糖苷）的制备

将36 L水与2.4 kg的氢氧化钠投入100 L反应釜中，控制温度在25℃±3℃，使氢氧化钠完全溶解，并搅拌均匀；随后投入6 kg D-木糖与4.8 kg乙酰丙酮，充分溶解，并搅拌均匀后，保温53℃±3℃搅拌反应3 h后；加约35 kg的2.5 N的稀盐酸调pH值到7.0-8.0之间；再加入1.2 kg的活性炭保温53℃±3℃搅拌脱色1 h，过滤除去活性炭，得澄清滤液再经过电渗析除盐，得第二步酶反应所需用到的玻色因中间体（β-丙酮木糖苷），浓度为15%（质量/体积分数）。

实施例2 KPADH野生型及突变体基因的克隆与重组菌构建

本发明所需的脱氢酶KPADH野生型是通过公司合成基因后，构建在pET-28a表达质粒上，再通过大肠杆菌发酵生产制得；KPADH突变体在KPADH野生型基因表达载体基础上进行突变改造，再通过大肠杆菌发酵生产制得，其具体包含以下步骤：

KPADH野生型基因来源于Kluyveromyces polyspora，NCBI保藏号为XM_001644455，基因序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；基因经过密码子序列优化后，优化后序列如SEQ ID NO.28所示，将序列送到擎科生物公司进行全基因合成，采用NdeI/XhoI酶进行双酶切后亚克隆到pET-28a表达载体上。再以确认序列正确的质粒为模板，用单位点突变/双位点突变/饱和突变的引物进行PCR克隆，对KPADH野生型基因进行突变，得到KPADH^Q136N、KPADH^Q136N/S237N、KPADH^{Q136N/F161I/S237N}和KPADH^{Q136N/F161I/S237N/A318N}等24个1-4个位点突变的KPADH突变体，突变体序列如SEQ ID NO.3-26所示。

实施例3 KPADH野生型、突变体以及pMGDH蛋白表达

1、KPADH野生型和突变体蛋白的摇瓶表达

将构建好的KPADH野生型/突变体表达载体转入E.coliBL21（DE3）感受态细胞进行平板培养，获得阳性单克隆菌株；单菌落转入2.5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃，220 rpm摇床进行过夜培养，然后取1 mL菌液接种到250 mL摇瓶中含50 mL LB液体培养基含50 μg/mL卡那霉素中，37℃，220 rpm摇床继续培养到细胞OD₆₀₀= 0.6时，加入250μMIPTG，18oC继续培养，进行蛋白表达诱导表达，16 h后，6000g离心10 min收集菌体，获得湿细胞约0.7 g。蛋白表达LB液体培养基构成为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉，5g/L NaCl。菌体细胞用50 mM，pH 7.0的磷酸钾缓冲液冰浴混均后，进行低温超声破碎，12000 g高速离心15 min除细胞壁，获得含酶清液，-80 ℃保存，待酶活力和酶热稳定性实验使用。

2、KPADH^{Q136N/F161I/S237N/A318N}突变体蛋白5L发酵罐表达

KPADH^{Q136N/F161I/S237N/A318N}突变体氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，将单菌落转入5ml含50 μM卡那霉素的LB培养液中（37 ℃）进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250 ml含50 μM卡那霉素的TB液体培养基，生长到对数期时转入5 L培养发酵罐，37 ℃进行培养，当细胞OD₆₀₀ ≈ 20时加入250μM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）20 ℃进行蛋白诱导表达，补料20 ℃继续发酵约35小时后，6000 g离心10 min收集细胞，获得酶过量表达湿细胞约450g。

取1 g细胞，用50 mM，pH 7.0的磷酸钾缓冲液重悬细胞，冰浴超声破碎细胞后，12000 g高速离心45 min除细胞壁，获得含酶清液，含酶清液进行SDS-PAGE凝胶电泳（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）检测，确定蛋白表达情况，并对含酶清液进行酶活力检测。蛋白正确表达，且酶活力达到600 U/g左右的的菌体细胞用来进行S-玻色因生产的催化实验。LB液体培养基构成为：1%胰蛋白胨，0 .5%酵母粉和1% NaCl。TB液体培养基构成为：1.2 %胰蛋白胨，2.4%酵母粉，0.236%磷酸二氢钾，1.563 % 三水合磷酸氢二钾以及0.5 %甘油。

3、pMGDH蛋白5L发酵罐表达

pMGDH来源于Priestia megateriumNBRC 15308，NCBI登录号为NP_388275.1，氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示，基因送到擎科生物公司合成到pET-28a表达载体上，确认序列正确的质粒用热激法转入E.coli （BL21）感受态细胞进行平板培养（擎科生物），挑取单菌落转入5 ml含50 μM卡那霉素的LB培养液中（37℃）进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250 ml含50 μM卡那霉素的TB培养液中，同样生长到对数期时转入5 L培养发酵罐里进行培养，37 ℃培养到细胞OD≈20时加入250 μM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）20 ℃进行蛋白诱导表达，35小时后高速离心收集细胞（6000 rpm，10 min）获得酶过量表达湿细胞约450g。

取1 g细胞，用50 mM，pH 7.0的磷酸钾缓冲液重悬细胞，冰浴超声破碎细胞后，12000 g高速离心45 min除细胞壁，获得含酶清液，含酶清液进行SDS-PAGE凝胶电泳（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）检测，确定蛋白表达情况，并对含酶清液进行酶活力检测。蛋白正确表达，且酶活力达到1000 U/g左右的的菌体细胞用来进行S-玻色因生产的催化实验。LB液体培养基构成为：1%胰蛋白胨，0 .5%酵母粉和1% NaCl。TB液体培养基构成为：1.2 %胰蛋白胨，2.4%酵母粉，0.236%磷酸二氢钾，1.563 % 三水合磷酸氢二钾以及0.5 %甘油。

实施例4 KPADH野生型、突变体以及pMGDH酶活力的检测

将玻色因中间体、磷酸钾缓冲液和含酶清液混合后加入比色皿中，对仪器进行空白处理，再加入20 mM NADPH迅速混匀后，立即放入紫外分光光度计中进行吸光度变化的检测，三分钟后，计算△A，根据酶活力计算公式计算出野生型和突变体的酶活力（pMGDH酶活力为1200U/g）。

酶活检测反应体系为：

测试条件总体积 3 mL：

250 g/L玻色因中间体 30 μL

20 mM NADPH 30 μL

蛋白 30 μL

50 mM pH 7.0 磷酸钾buffer 2910 μL

测试时间3 min，测试波长340 nM，测试结果酶活力单位为U/g，计算公式为：U =[（△A × Va）/（6.22 × Vb）] × 200。KPADH野生型、突变体以及pMGDH酶活力见表1。

U为酶活力；△A是反应时间内吸光值的变化；Va为反应总体积；Vb为加入的酶的体积。

表1 酶活力结果

实施例5 KPADH野生型和突变体热稳定性分析

KPADH野生型和突变体蛋白，在37 ℃条件下孵育1h后，检测蛋白的酶活力，酶活力检测方式同实施例4，酶活力见表2。

表2 酶活力结果

实施例6 酶催化制备S-玻色因

将玻色因中间体溶解于50 mM，pH 7.0磷酸盐缓冲液中，中间体浓度为100g/L，再加入氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠磷酸四钠(NADP⁺)0.5g/L，葡萄糖115 g/L。恒温30 ℃加入KPADH突变体酶清液10 g/L和pMGDH酶清液4 g/L，30 ℃缓慢搅拌，反应结束后，取20 L反应液，加入980μL（900 μL ACN + 80 μL H₂O），0.22μm的滤膜过滤后，进行HPLC检测，KPADH^{Q136N/F161N/S237N/A318N}突变体在4-6 h左右底物转化率达到99%以上（玻色因与中间体峰面积比）；反应液经过纳滤除盐后，浓缩低温结晶得到S-玻色因，S-玻色因核磁氢谱如图1。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种脱氢酶KPADH突变体在合成S-玻色因中的应用，其特征在于：所述的脱氢酶KPADH突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述的突变体为第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺，且第161位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，且第237位丝氨酸突变为天冬酰胺，且第318位丙氨酸突变为天冬酰胺。

2.使用权利要求1所述的脱氢酶KPADH突变体的S-玻色因的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤2是将所述的玻色因中间产物、脱氢酶、辅酶与葡萄糖在缓冲液中混合，反应后经过滤、除盐、浓缩后得到所述的S-玻色因；

所述的步骤1中的木糖、乙酰丙酮和强碱的摩尔比为1:1.2-1.5:1.3-1.6；

所述的步骤2中的脱氢酶包括酶1和酶2，所述的酶1为权利要求1所述的脱氢酶KPADH突变体，所述的酶2为脱氢酶pMGDH；所述的酶1和酶2的添加量之比为3000-4000:5000 U/L；

脱氢酶pMGDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；

所述的辅酶与玻色因中间产物、葡萄糖的摩尔比为1：500-1000：500-1500。

3.根据权利要求2所述的脱氢酶KPADH突变体的S-玻色因的合成方法，其特征在于：所述的步骤1中的加热步骤的温度为50-56℃，时间为2-4小时；所述的强碱为氢氧化钠。

4.根据权利要求2所述的脱氢酶KPADH突变体的S-玻色因的合成方法，其特征在于：所述的步骤1中的脱色步骤采用活性碳进行脱色，所述的活性碳与木糖的质量比为1:2-5；所述的步骤1中的脱色步骤的温度为50-56℃；所述的步骤1中的除盐步骤采用电渗析的方式进行除盐。

5.根据权利要求2所述的脱氢酶KPADH突变体的S-玻色因的合成方法，其特征在于：所述的步骤2中的辅酶为β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸单钠盐；所述的步骤2中的缓冲液为磷酸缓冲液；所述的步骤2中的反应的温度为25-30℃，时间为4-12小时。