CN110904086B - 一种色氨酸酶突变体及其应用 - Google Patents

一种色氨酸酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种色氨酸酶突变体SEQ ID NO:3，其能够催化D‑丝氨酸和吲哚反应生成D‑色氨酸。采用该色氨酸酶突变体全细胞催化1.0mM D‑丝氨酸和5.0mM吲哚反应时，产物D‑色氨酸的浓度能够达到0.41mM，D‑丝氨酸转化率41％，具有开发应用前景。

Description

一种色氨酸酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种色氨酸酶突变体、及其用于催化D-丝氨酸和吲哚反应生产D-色氨酸的新用途。
背景技术
D-色氨酸又名氨基吲哚丙酸，是一种白色或类白色至微黄的结晶性粉末，无臭，甜味，在水中微溶，不溶于乙醇，在稀酸或稀碱中溶解，长时间光照时著色，与水共热产生少量吲哚。D-色氨酸作为一种非蛋白光学活性氨基酸，具有特殊的生理学性质，在食品、饲料工业以及农业中均有一定的价值，可以作为非营养性甜味剂、饲料添加剂和植物生长剂，特别是在医药行业中，D-色氨酸是抗癌剂和免疫抑制剂的重要合成前体。
目前D-色氨酸的制备方法主要有化学合成法和生物法。化学合成法工艺相对繁杂，得到的D-色氨酸一般收率较低，环境污染较大，难以大规模生产。生物法主要为酶或者细胞转化法：1.消旋体拆分法，先把L-色氨酸消旋为DL-色氨酸，再利用多种微生物来源的L-色氨酸酶或者L-氨基酸氧化酶把色氨酸消旋体中的L-色氨酸降解或者氧化，把剩余的D-色氨酸分离出来，但是这种方法产物收率低，有50％的底物L-色氨酸被浪费消耗，转化效率低。2.海因法，利用微生物来源的海因酶水解海因获得氨甲酰D-色氨酸，再通过D-氨甲酰水解酶水解获得D-色氨酸。此方法转化效率高，已经应用于产业化，但是该方法使用底物海因需要化学合成，环境污染较重，而且需要产物分子量相对底物降低，质量收率偏低，导致环境成本和生产成本较高。
色氨酸酶(Tryptophanase，简写TPase，EC4.1.99.1)又称色氨酸吲哚裂合酶，色氨酸酶全酶由酶蛋白和辅酶磷酸吡哆醛组成。色氨酸酶是一种依赖磷酸吡哆醛的多功能酶，它不仅能催化L-色氨酸分解生成丙酮酸、吲哚和氨，而且能催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸。色氨酸酶选择性地作用于L-色氨酸，对D-色氨酸没有活性，但在较高浓度的(NH4)2HPO4溶液中，色氨酸酶能降解D-色氨酸形成吲哚(Watanabe T,S.E.E.“Reversibility ofthe tryptophanase reaction:synthesis of tryptophan from indole,pyruvate andammonia.”Proc Natl Acad Sci USA.1972,69(5):1086.)。同样，在(NH4)2HPO4存在时，色氨酸酶能催化D-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸(Shimada,A.,H.Ozaki,et al..“Tryptophanase-catalyzed L-tryptophan synthesis from D-serine in the presenceof diammonium hydrogen phosphate.”Int J Mol Sci.2009,10(6):2578-2590.)。
发明内容
为了消除现有的D-色氨酸生产方法中的种种限制因素，我们探索了新的色氨酸酶催化法制备工艺，利用基因工程技术来对大肠杆菌(Escherichia coli)来源的色氨酸酶SEQ ID NO:1进行改造和筛选，获得了一个能够催化D-丝氨酸和吲哚合成D-色氨酸的色氨酸酶突变体，改变了色氨酸酶SEQ ID NO:1的底物选择性和催化方向，从而开发一种全新的D-色氨酸制备方法。
Figure BDA0002340704360000021
具体而言，本发明包括如下技术方案：
一种色氨酸酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第111位的P替换为S、第115位的K替换为D突变体，第156位的K替换为E、第345位的L替换为A，第348位的I替换为V、第376位的F替换为G的突变体，其氨基酸序列为：
MENFKHLPEPFRIRVIEPVKRTTRAYREEAIIKSGMNPFLLDSEDVFIDLLTDSGTGAVTQSMQAAMMRGDEAYSGSRSYYALAESVKNIFGYQYTIPTHQGRGAEQIYISVLIDKREQEKGLDRSKMVAFSNYFFDTTQGHSQINGCTVRNVYIEEAFDTGVRYDFKGNFDLEGLERGIEEVGPNNVPYIVATITSNSAGGQPVSLANLKAMYSIAKKYDIPVVMDSARFAENAYFIKQREAEYKDWTIEQITRETYKYADMLAMSAKKDAMVPMGGLLCMKDDSFFDVYTECRTLCVVQEGFPTYGGLEGGAMERLAVGLYDGMNLDWLAYRIAQVQYLVDGAEEVGVVCQQAGGHAAFVDAGKLLPHIPADQGPAQALACELYKVAGIRAVEIGSFLLGRDPKTGKQLPCPAELLRLTIPRATYTQTHMDFIIEAFKHVKENAANIKGLTFTYEPKVLRHFTAKLKEV(SEQ ID NO:3)。
本发明的第二个目的在于提供一种编码上述色氨酸酶突变体SEQ ID NO:3的基因。
优选地，编码上述色氨酸酶突变体SEQ ID NO:3的基因是下述核苷酸序列：ATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGCATTCGTGTTATTGAGCCAGTAAAACGTACTACTCGCGCTTATCGTGAAGAAGCAATTATTAAATCCGGTATGAACCCGTTCCTGCTGGATAGCGAAGATGTGTTTATCGATTTACTGACCGACAGCGGCACCGGGGCGGTAACCCAAAGTATGCAGGCAGCGATGATGCGCGGCGACGAAGCCTACAGCGGCAGCCGCAGCTACTATGCGTTAGCCGAGTCAGTGAAAAATATCTTTGGTTATCAATATACTATTCCGACTCACCAGGGCCGTGGCGCAGAGCAAATCTATATTAGCGTACTGATTGACAAACGCGAGCAGGAAAAAGGCCTGGATCGCAGCAAAATGGTGGCATTCTCTAACTATTTCTTTGATACCACGCAGGGCCATAGCCAGATTAACGGCTGTACCGTGCGTAACGTCTATATCGAAGAAGCCTTCGATACGGGCGTGCGTTACGACTTTAAAGGCAACTTTGACCTCGAAGGATTAGAACGCGGTATTGAAGAAGTTGGCCCGAATAACGTGCCGTATATCGTTGCAACCATCACCAGTAACTCTGCAGGTGGTCAGCCGGTTTCACTGGCAAACTTAAAAGCGATGTACAGCATCGCGAAGAAATACGATATTCCGGTGGTAATGGACTCCGCACGCTTTGCTGAAAACGCCTATTTCATCAAGCAGCGTGAAGCAGAATACAAAGACTGGACCATCGAGCAGATCACCCGCGAAACCTACAAATATGCCGATATGCTGGCGATGTCCGCCAAGAAAGATGCGATGGTACCGATGGGCGGCTTGCTGTGCATGAAAGACGACAGCTTCTTTGATGTGTACACCGAGTGCAGAACCCTTTGCGTGGTGCAGGAAGGGTTCCCGACATATGGCGGCCTGGAAGGCGGCGCGATGGAGCGTCTGGCGGTAGGTCTGTATGACGGCATGAATCTCGACTGGCTGGCTTATCGTATCGCGCAGGTACAGTATCTGGTCGATGGTGCGGAAGAGGTTGGCGTTGTCTGCCAGCAGGCGGGCGGTCACGCGGCATTCGTTGATGCCGGTAAACTGCTGCCGCATATCCCGGCAGACCAGGGCCCGGCACAGGCGCTGGCGTGCGAGCTGTATAAAGTCGCCGGTATCCGTGCGGTAGAAATTGGCTCTTTCCTGTTAGGCCGCGATCCGAAAACCGGTAAACAACTGCCATGCCCGGCTGAACTGCTGCGTTTAACCATTCCGCGCGCAACATATACTCAAACACATATGGACTTCATTATTGAAGCCTTTAAACATGTGAAAGAGAACGCGGCGAATATTAAAGGATTAACCTTTACCTACGAACCAAAAGTATTGCGTCACTTCACCGCAAAACTGAAAGAAGTTTAA(SEQ ID NO:4)。
本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。该质粒载体优选是pET系列，比如载体是pET24a，但并不受限于此。
本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。该微生物可作为宿主用于表达上述色氨酸酶突变体。
优选地，上述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五个目的在于提供上述色氨酸酶突变体或上述微生物在生产D-色氨酸中的用途。
在生产D-色氨酸中，以D-丝氨酸和吲哚为底物原料，用上述色氨酸酶突变体或者微生物作为催化剂来催化反应。上述微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式。
生产D-色氨酸可采用常规的工艺条件，比如，反应体系中D-丝氨酸的浓度可选择0.1-5.0mM，优选1.0mM。D-丝氨酸：吲哚的摩尔比可以在1.0：1.0-10.0范围内。
反应温度可以选择25～50℃，优选30～40℃，更优选36～38℃。
优选地，上述反应体系中可以加入一定量的磷酸吡哆醛(PLP)用于促进合成反应。例如可以加入大约0.05-1mM、优选0.1-0.8mM、更优选0.2-0.5mM的磷酸吡哆醛。
初始色氨酸酶SEQ ID NO:1并不能催化D-丝氨酸与吲哚发生缩合反应来生产D-色氨酸。但是，本发明构建的色氨酸酶突变体SEQ ID NO:3却具有催化D-丝氨酸和吲哚生成D色氨酸的活力，改变了色氨酸酶的底物选择性和催化方向。因此从功能上讲，本发明构建的色氨酸酶突变体SEQ ID NO:3已经是一种完全不同于传统的磷酸吡哆醛依赖性色氨酸酶的新功能酶。当该色氨酸酶突变体催化生产D-色氨酸时，以1.0mM的D-丝氨酸为底物，D-色氨酸生成率可达41％，具备开发利用价值。
具体实施方式
本发明构建的色氨酸酶突变体是初始色氨酸酶SEQ ID NO:1的突变体，是SEQ IDNO:1序列中部分位点的氨基酸发生替换(P111S、K115D、K156E、L345A、I348V、F376G)后形成的新蛋白质，其中SEQ ID NO:1来源于GenBank:CAQ34053.1。初始色氨酸酶的氨基酸序列为：
MENFKHLPEPFRIRVIEPVKRTTRAYREEAIIKSGMNPFLLDSEDVFIDLLTDSGTGAVTQSMQAAMMRGDEAYSGSRSYYALAESVKNIFGYQYTIPTHQGRGAEQIYIPVLIKKREQEKGLDRSKMVAFSNYFFDTTQGHSQINGCTVRNVYIKEAFDTGVRYDFKGNFDLEGLERGIEEVGPNNVPYIVATITSNSAGGQPVSLANLKAMYSIAKKYDIPVVMDSARFAENAYFIKQREAEYKDWTIEQITRETYKYADMLAMSAKKDAMVPMGGLLCMKDDSFFDVYTECRTLCVVQEGFPTYGGLEGGAMERLAVGLYDGMNLDWLAYRIAQVQYLVDGLEEIGVVCQQAGGHAAFVDAGKLLPHIPADQFPAQALACELYKVAGIRAVEIGSFLLGRDPKTGKQLPCPAELLRLTIPRATYTQTHMDFIIEAFKHVKENAANIKGLTFTYEPKVLRHFTAKLKEV(SEQ ID NO:1)。
为表述方便起见，蛋白质的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：
表1氨基酸中英文对照及缩写
丙氨酸 Alanine A或Ala 脂肪族类
精氨酸 Arginine R或Arg 碱性氨基酸类
天冬酰胺 Asparagine N或Asn 酰胺类
天冬氨酸 Aspartic acid D或Asp 酸性氨基酸类
半胱氨酸 Cysteine C或Cys 含硫类
谷氨酰胺 Glutamine Q或Gln 酰胺类
谷氨酸 Glutamic acid E或Glu 酸性氨基酸类
甘氨酸 Glycine G或Gly 脂肪族类
组氨酸 Histidine H或His 碱性氨基酸类
异亮氨酸 Isoleucine I或Ile 脂肪族类
亮氨酸 Leucine L或Leu 脂肪族类
赖氨酸 Lysine K或Lys 碱性氨基酸类
蛋氨酸 Methionine M或Met 含硫类
苯丙氨酸 Phenylalanine F或Phe 芳香族类
脯氨酸 Proline P或Pro 亚氨基酸
丝氨酸 Serine S或Ser 羟基类
苏氨酸 Threonine T或Thr 羟基类
色氨酸 Tryptophan W或Trp 芳香族类
酪氨酸 Tyrosine Y或Tyr 芳香族类
缬氨酸 Valine V或Val 脂肪族类
作为构建色氨酸酶突变体的基础模板，初始色氨酸酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是序列表中的SEQ ID NO:2。
为了获得能够催化D-丝氨酸与吲哚合成生成D-色氨酸的新功能酶，本发明对初始色氨酸酶SEQ ID NO:1的基因序列SEQ ID NO:2进行点突变。通过易错PCR技术获得一个氨基酸第111位的脯氨酸替换为丝氨酸、第115位的赖氨酸替换为天冬氨酸、第156位的赖氨酸替换为谷氨酸、第345位的亮氨酸替换为丙氨酸、第348位的异亮氨酸替换为缬氨酸、第376位的苯丙氨酸替换为甘氨酸的突变体，得到了一种新蛋白质SEQ ID NO:3。
在本文中，术语“初始(型)”、“初始酶”、“初始型色氨酸酶”表示相同的意义，都是指色氨酸酶的初始序列SEQ ID NO:1。
本发明的色氨酸酶突变体的氨基酸数量有471个，序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
为了在不同微生物中进行蛋白质SEQ ID NO:3的最佳表达，可以针对特定的微生物比如大肠杆菌进行密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。在本文中所提供的基因序列SEQ ID NO:4是经过密码子优化的核苷酸序列，但本发明的色氨酸酶突变体表达基因不限于此。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以使任何适合表达色氨酸酶突变体的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂用于生产D-色氨酸时，本发明的色氨酸酶突变体可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等。
作为另一种可选的实施方式，可以采用表达上述色氨酸酶突变体的微生物菌体作为酶催化反应的生物催化剂。微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式，菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，因为当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
产物D-色氨酸的HPLC测定条件：
流动相A的配置：称取0.15g磷酸二氢钾，用500ml纯水溶解，超声至溶清，真空抽滤。
标样的溶解：称取0.002g D-色氨酸标样，用50％的乙腈定容到10ml容量瓶中，超声溶解备用。
检测仪器：安捷伦1260高效液相色谱Agilent(250*4.6，5μm)色谱柱；流动相A：0.03％磷酸二氢钾；流动相B：甲醇(10％)；流速：1mL/min；柱温箱：35℃；检测波长：278nm；进样量：20μl。
实施例1初始型色氨酸酶基因重组大肠杆菌的构建
1.1对于Escherichia coli来源的色氨酸酶，根据GenBank:CAQ34053.1公布的基因序列SEQ ID NO:1，进行密码子优化，全基因合成其编码基因序列SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点NdeI和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-EcTPase。
1.2通过电转化将重组质粒pET24a-EcTPase转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen公司)，得到表达初始色氨酸酶的重组大肠杆菌EcTPase。
实施例2通过易错PCR法构建随机突变点库及筛选
2.1易错PCR法构建随机突变点库
以初始型酶的基因SEQ ID NO:2为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。正向引物EcTPase1-F为5’-ATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3’，反向引物EcTPase1-R为5’-TTAAACTTCTTTCAGTTTTGCGGTGAAGTGACG-3’。
50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒模板pET24a-EcTPase1，50pmol一对引物EcTPase1-F和EcTPase1-R，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(Fermentas公司)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。胶回收1.4kbp随机突变片段作为大引物，(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Invitrogen公司)，得到超过104个克隆的随机突变库。
2.2突变体库的高通量筛选
选取突变体库中的转化子接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中，培养过夜，然后取80μl过夜培养物，转接至800μl含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mM IPTG，降温至25℃，培养过夜。4000rpm离心15min，弃上清，加入100μL含无菌水重悬菌体用于活力测定。
2.3酶活力测定
酶活力定义：在37℃下每分钟催化底物产生1微摩尔(μmol)D-色氨酸所需要的酶量定义为1个单位(U)。
将上述步骤2.2中200μL菌悬液加入200μL底物反应液(0.1M pH8.3磷酸钾盐缓冲液，1.0mM D-丝氨酸，10mM吲哚，0.2mM PLP(磷酸吡哆醛)，在37℃的条件下反应24小时，取反应液300μl，4℃，12000rpm离心10min，取150μl上清到酶标板上，同时加入20μl的PDAB显色液，室温静止显色10min，读取OD415值。
在随机突变库，通过对大约29000个突变体克隆筛选，结果显示获得一株克隆EcTPase-198-E6克隆菌株具有催化D-丝氨酸生产D-色氨酸的能力。
通过蛋白质测序确定了EcTPase-198-E6克隆菌株产生的突变酶的氨基酸序列SEQID NO:3。参见表2，表2显示了在96孔板上筛选得到的突变菌株EcTPase-198-E6与初始型酶表达菌株催化合成D-色氨酸的酶活力对比情况，结果表明突变酶SEQ ID NO:3已经改变了初始型酶的酶性质即催化方向。
为表述方便起见，实施例中可以将EcTPase-198-E6克隆菌株产生的突变酶SEQ IDNO:3沿用其编号“EcTPase-198-E6”，本领域技术人员容易理解它们的区别和对应关系。
表2、突变菌株与初始型酶表达菌株的酶活力对比结果(96孔板筛选)
Figure BDA0002340704360000091
实施例3突变菌株EcTPase-198-E6发酵验证
3.1摇瓶发酵
从EcTPase-198-E6的LB培养平板上挑取单菌落，接种至5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2mL过夜培养物接种至200mL TB培养基中，于37℃，250rpm培养2-3h，至OD600 0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG，于28℃，200rpm培养过夜。然后于4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体。
3.2初始型酶表达菌株发酵
按照步骤3.1的方法，对初始型酶表达菌株EcTPase进行摇瓶发酵，收集菌体。
3.3菌体比活力测定
分别将上述步骤3.1中所得的1.0g EcTPase-198-E6菌体、步骤3.2中所得1.0gEcTPase菌体各自加入到10ml底物反应液(0.1M pH8.3磷酸钾盐缓冲液，1.0mM D-丝氨酸，10mM吲哚，0.2mM PLP(磷酸吡哆醛))中，在37℃的条件下反应4小时，反应液加入500μL的2MHCl溶液混合均匀后，4℃，12000rpm离心5min，取离心上清，HPLC测定D色氨酸的含量，测定结果见表3。
表3、突变菌株发酵液与初始型酶表达菌株发酵液的酶活力对比结果
菌种编号 酶序列编号 活力(U/g湿菌体)
EcTPase1 1 0
EcTPase-198-E6 3 0.6
由表3和表2可以看出，初始型酶SEQ ID NO:1不能催化D-丝氨酸生成D-色氨酸，但本发明的色氨酸酶突变体SEQ ID NO:3具有催化D-丝氨酸生成D-色氨酸的酶活力，改变了色氨酸酶原有的功能。
实施例4色氨酸酶突变体在生产D-色氨酸的应用
在10ml反应体系中，加入反应底物溶液(0.1M pH8.3磷酸钾盐缓冲液，1.0mM D-丝氨酸，10mM吲哚，PLP 0.2mM)，然后加入10v/v％的EcTPase-198-E6冻融菌体，于37℃，200rpm搅拌反应。反应过程中控制温度36-38℃，反应24个小时。通过HPLC检测反应样品，结果显示，在反应24个小时后，反应体系中D-色氨酸的浓度达到0.408mM，转化率达到40.8％。
实施例5色氨酸酶突变体在生产D-色氨酸的应用
在10ml反应体系中，加入反应底物溶液(0.1M pH8.3磷酸钾盐缓冲液，1.0mM D-丝氨酸，5.0mM吲哚，PLP 0.2mM)，然后加入10v/v％的EcTPase-198-E6冻融菌体，于37℃，200rpm搅拌反应。反应过程中控制温度36-38℃，反应24个小时。通过HPLC检测反应样品，结果显示，在反应24个小时后，反应体系中D-色氨酸的浓度达到0.41mM，转化率达到41％。
实施例6色氨酸酶突变体在生产D-色氨酸的应用
在10ml反应体系中，加入反应底物溶液(0.1M pH8.3磷酸钾盐缓冲液，1.0mM D-丝氨酸，2.0mM吲哚，PLP 0.2mM)，然后加入10v/v％的EcTPase-198-E6冻融菌体，于37℃，200rpm搅拌反应。反应过程中控制温度36-38℃，反应24个小时。通过HPLC检测反应样品，结果显示，在反应24个小时后，反应体系中D-色氨酸的浓度达到0.23mM，转化率为23％。
实验表明，本发明构建的色氨酸酶突变体SEQ ID NO:3具有催化D-丝氨酸反应生成D-色氨酸的酶活力，改变了初始色氨酸酶EcTPase1的功能，为D-色氨酸的生物法制备开辟了一条全新的方法。
序列表
<110> 浙江华睿生物技术有限公司
<120> 一种色氨酸酶突变体及其应用
<130> SHPI1910819
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 471
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
Met Glu Asn Phe Lys His Leu Pro Glu Pro Phe Arg Ile Arg Val Ile
1 5 10 15
Glu Pro Val Lys Arg Thr Thr Arg Ala Tyr Arg Glu Glu Ala Ile Ile
20 25 30
Lys Ser Gly Met Asn Pro Phe Leu Leu Asp Ser Glu Asp Val Phe Ile
35 40 45
Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Gly Ala Val Thr Gln Ser Met Gln
50 55 60
Ala Ala Met Met Arg Gly Asp Glu Ala Tyr Ser Gly Ser Arg Ser Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Leu Ala Glu Ser Val Lys Asn Ile Phe Gly Tyr Gln Tyr Thr
85 90 95
Ile Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Gln Ile Tyr Ile Pro Val
100 105 110
Leu Ile Lys Lys Arg Glu Gln Glu Lys Gly Leu Asp Arg Ser Lys Met
115 120 125
Val Ala Phe Ser Asn Tyr Phe Phe Asp Thr Thr Gln Gly His Ser Gln
130 135 140
Ile Asn Gly Cys Thr Val Arg Asn Val Tyr Ile Lys Glu Ala Phe Asp
145 150 155 160
Thr Gly Val Arg Tyr Asp Phe Lys Gly Asn Phe Asp Leu Glu Gly Leu
165 170 175
Glu Arg Gly Ile Glu Glu Val Gly Pro Asn Asn Val Pro Tyr Ile Val
180 185 190
Ala Thr Ile Thr Ser Asn Ser Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser Leu Ala
195 200 205
Asn Leu Lys Ala Met Tyr Ser Ile Ala Lys Lys Tyr Asp Ile Pro Val
210 215 220
Val Met Asp Ser Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala Tyr Phe Ile Lys Gln
225 230 235 240
Arg Glu Ala Glu Tyr Lys Asp Trp Thr Ile Glu Gln Ile Thr Arg Glu
245 250 255
Thr Tyr Lys Tyr Ala Asp Met Leu Ala Met Ser Ala Lys Lys Asp Ala
260 265 270
Met Val Pro Met Gly Gly Leu Leu Cys Met Lys Asp Asp Ser Phe Phe
275 280 285
Asp Val Tyr Thr Glu Cys Arg Thr Leu Cys Val Val Gln Glu Gly Phe
290 295 300
Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Glu Gly Gly Ala Met Glu Arg Leu Ala Val
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Asp Gly Met Asn Leu Asp Trp Leu Ala Tyr Arg Ile Ala
325 330 335
Gln Val Gln Tyr Leu Val Asp Gly Leu Glu Glu Ile Gly Val Val Cys
340 345 350
Gln Gln Ala Gly Gly His Ala Ala Phe Val Asp Ala Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Pro His Ile Pro Ala Asp Gln Phe Pro Ala Gln Ala Leu Ala Cys Glu
370 375 380
Leu Tyr Lys Val Ala Gly Ile Arg Ala Val Glu Ile Gly Ser Phe Leu
385 390 395 400
Leu Gly Arg Asp Pro Lys Thr Gly Lys Gln Leu Pro Cys Pro Ala Glu
405 410 415
Leu Leu Arg Leu Thr Ile Pro Arg Ala Thr Tyr Thr Gln Thr His Met
420 425 430
Asp Phe Ile Ile Glu Ala Phe Lys His Val Lys Glu Asn Ala Ala Asn
435 440 445
Ile Lys Gly Leu Thr Phe Thr Tyr Glu Pro Lys Val Leu Arg His Phe
450 455 460
Thr Ala Lys Leu Lys Glu Val
465 470
<210> 2
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atggaaaact ttaaacatct ccctgaaccg ttccgcattc gtgttattga gccagtaaaa 60
cgtactactc gcgcttatcg tgaagaagca attattaaat ccggtatgaa cccgttcctg 120
ctggatagcg aagatgtgtt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtaacc 180
caaagtatgc aggcagcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag ccgcagctac 240
tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatatactat tccgactcac 300
cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa 360
aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggca ttctctaact atttctttga taccacgcag 420
ggccatagcc agattaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat 480
acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgacctcg aaggattaga acgcggtatt 540
gaagaagttg gcccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca 600
ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac 660
gatattccgg tggtaatgga ctccgcacgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag 720
cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat 780
gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg taccgatggg cggcttgctg 840
tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg 900
caggaagggt tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta 960
ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat 1020
ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca 1080
ttcgttgatg ccggtaaact gctgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg 1140
ctggcgtgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg 1200
ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta 1260
accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa 1320
catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacctacga accaaaagta 1380
ttgcgtcact tcaccgcaaa actgaaagaa gtttaa 1416
<210> 3
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
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Claims (9)

1.一种色氨酸酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2.编码如权利要求1所述色氨酸酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列为SEQ ID NO:4。
4.包含如权利要求3所述基因的质粒。
5.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。
6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，是所述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，是所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。
8.如权利要求1所述色氨酸酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产D-色氨酸中的用途，其特征在于，以D-丝氨酸和吲哚为底物，用权利要求1所述色氨酸酶突变体或者如权利要求6所述微生物催化生产D-色氨酸。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，反应体系中底物D-丝氨酸的浓度为0.1-5.0mM，且D-丝氨酸：吲哚的摩尔比为1.0：1.0-10.0。
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Formation in Vitro of Hybrid Dimers of H463F and Y74F Mutant Escherichia coli Tryptophan Indole-lyase Rescues Activity with L-Tryptophan;Robert S. Phillips et al.;《Biochemistry》;20021231;4012-4019页 *

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