CN115896199A - 一种双酶偶联合成高浓度(s)-构型玻色因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双酶偶联催化合成(S)‑羟丙基四氢吡喃三醇的方法，以β‑丙酮木糖苷为底物、优选的短链醇脱氢酶LkCR利用NADPH催化β‑丙酮木糖苷加氢生成(S)‑羟丙基四氢吡喃三醇和NADP⁺，而优选的醇脱氢酶则起到驱动辅酶循环的作用，利用异丙醇和NADP⁺生成丙酮和NADPH。该生物催化体系可适用1000mM底物β‑丙酮木糖苷(190g/L)。反应高效，转化率>99％；反应立体选择性专一，产物的非对映体选择性>99％。产物分离纯化过程简便，产品纯度>99％。

Description

一种双酶偶联合成高浓度(S)-构型玻色因的方法

(一)技术领域

本发明属于生物催化领域，涉及一种以β-丙酮木糖苷为底物双酶偶联催化合成高浓度(S)-构型玻色因的方法。

(二)背景技术

玻色因，化学名为羟丙基四氢吡喃三醇，分子式C₈H₁₈O₅，分子量为192.21，具有良好的抗衰活性。它可以增加细胞及皮肤的紧致度，还可以帮助维持真皮的弹性，预防皮肤老化。此外，玻色因易于生物降解，不会在生物体内积累，没有毒性，在生物、医药、化妆品等领域的应用日渐宽广。玻色因是一种木糖衍生物，它有多种立体异构体，不同的异构体特征对生物活性具有影响。研究论文(Synthesis of Pro-Xylane^TM:A new biologically activeC-glycoside in aqueous media)中提到β-糖苷键对维持玻色因生物活性的重要性远大于α-糖苷键，而羟丙基四氢吡喃三醇的7位手性碳原子上的(S)-羟基为优势构型，即兼具β-糖苷键和(7S)-羟基的(S)-构型玻色因生物活性更好。

玻色因的合成以木糖为原料，在碱性条件下与2,4-戊二酮缩合反应生成β-丙酮木糖苷，β-丙酮木糖苷的羰基经还原反应生成玻色因。β-丙酮木糖苷的羰基还原合成(S)-构型玻色因，因需要引入手性羟基，是合成(S)-构型玻色因的关键步骤。相较于化学法，生物酶法合成(S)-构型玻色因更加安全高效，成本低廉，立体选择性专一且对环境更加友好。尽管生物酶法具有诸多优点，目前适用的底物浓度不高于50g/L，生物酶法合成高浓度(S)-构型玻色因的方法尚有待开发。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种双酶偶联催化β-丙酮木糖苷还原合成高浓度(S)-构型玻色因的方法，以β-丙酮木糖苷为底物、以异丙醇为辅底物、优选的源自Lentilactobacilluskefiri的短链醇脱氢酶LkCR为生物催化剂，辅酶循环体系由醇脱氢酶和异丙醇组成。生物催化剂利用还原型辅酶(NADH或NADPH)催化β-丙酮木糖苷选择性加氢生成(S)-羟丙基四氢吡喃三醇和氧化型辅酶(NAD⁺或NADP⁺)，而优选的醇脱氢酶和异丙醇则起到驱动辅酶循环的作用，将氧化型辅酶转换为还原型辅酶。该生物催化体系可适用1000mM底物β-丙酮木糖苷(190g/L)，产物非对映体选择性>99％。该方法具有催化效率高、适用底物浓度高和产物易于分离纯化等优点，后续的产物分离纯化过程简便。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种双酶偶联催化合成高浓度(S)-构型玻色因的方法，所述方法为：以含源自Lentilactobacillus kefiri的短链醇脱氢酶LkCR编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的粗酶液作为催化剂，以β-丙酮木糖苷为底物，以NAD⁺或NADP⁺为辅酶，加入辅助催化剂和辅底物驱动辅酶循环，以pH 5.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度为25～45℃，300～600rpm条件下反应完全后，反应液分离纯化，获得(S)-羟丙基四氢吡喃三醇，即(S)-构型玻色因。该催化体系可适用1000mM底物β-丙酮木糖苷(190g/L)，转化率>99％。本发明反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1M NaOH水溶液。所述辅助催化剂包括含葡萄糖脱氢酶BmGDH、甲酸脱氢酶AaFDH或是醇脱氢酶RaADH的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎获得的粗酶液。所述辅底物包括葡萄糖、甲酸铵、异丙醇。

进一步，所述短链醇脱氢酶LkCR是将LkCR编码基因导入大肠杆菌构建获得的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经破碎后获得的粗酶液。所述短链醇脱氢酶LkCR编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。短链醇脱氢酶LkCR基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.1所示LkCR编码基因插入pET28a载体的Nde I和Hind III限制性酶切位点，得到重组载体pET28a-LkCR；将重组载体pET28a-LkCR导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LkCR。

进一步，所述辅助催化剂分别通过将编码基因导入大肠杆菌构建获得基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经破碎后获得的粗酶液。所述葡萄糖脱氢酶BmGDH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述甲酸脱氢酶AaFDH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述醇脱氢酶RaADH编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。葡萄糖脱氢酶BmGDH基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.3所示葡萄糖脱氢酶BmGDH编码基因插入pET28a载体的BamH I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pET28a-BmGDH；将重组载体pET28a-GDH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-BmGDH。甲酸脱氢酶AaFDH基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.5所示甲酸脱氢酶AaFDH编码基因插入pET28a载体的BamH I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pET28a-AaFDH；将重组载体pET28a-AaFDH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AaFDH。醇脱氢酶基因工程菌构建方法为：将SEQ IDNO.7所示醇脱氢酶RaADH编码基因插入pET28a载体的BamH I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pET28a-RaADH；将重组载体pET28a-RaADH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-RaADH。

进一步，所述反应体系中，催化剂加入量以湿菌体重量计为20～100g/L(优选50g/L)；催化剂与辅助催化剂以质量比1:1混合；所述底物加入终浓度为400～1000mM，所述底物与辅底物加入摩尔浓度比为1:1～6(优选1:4)；所述辅酶加入终浓度为0～1mM(优选0.2mM)。

进一步，所述反应时间为6～30h，所述反应温度为40℃，转速300rpm，反应介质为pH 7.0的50mM PBS缓冲液。

进一步，所述催化剂和辅助催化剂的湿菌体或者由湿菌体制得的粗酶液按如下方法制备：将基因工程菌接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0～0.6mM(优选0.2mM)的IPTG，在24℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH 8.0的50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体，所得湿菌体即作为整细胞催化时的生物催化剂或辅助生物催化剂；以1g湿菌体和15mL PBS缓冲液(50mM，pH 7.0)的比例悬浮湿菌体，将悬浮液于超声破碎仪中以工作2s，间歇4s，650W的功率的程序破碎20min。在4℃和12000rpm下离心10min，收集上清液，上清液即为生物催化剂或辅助生物催化剂的粗酶液。

进一步，所述反应液分离纯化方法为：反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入活性炭脱色；脱色结束后，在12000rpm下离心1min，取上清，用截留分子量3000的超滤膜预处理，然后用截留分子量200的纳滤膜脱盐，55℃下减压旋蒸去除水分，获得产物(S)-构型玻色因。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的双酶偶联催化合成(S)-羟丙基四氢吡喃三醇的方法，以β-丙酮木糖苷为底物、优选的短链醇脱氢酶LkCR利用NADPH催化β-丙酮木糖苷加氢生成(S)-羟丙基四氢吡喃三醇和NADP⁺，而优选的醇脱氢酶则起到驱动辅酶循环的作用，利用异丙醇和NADP⁺生成丙酮和NADPH(图1)。该生物催化体系可适用1000mM底物β-丙酮木糖苷(190g/L)。反应高效，转化率>99％；反应立体选择性专一，产物的非对映体选择性>99％。产物分离纯化过程简便，产品纯度>99％。

(四)附图说明

图1为本发明以β-丙酮木糖苷为底物、以异丙醇为辅底物双酶偶联催化合成(S)-羟丙基四氢吡喃三醇的方法示意图。

图2为实施例3短链醇脱氢酶LkCR基因工程菌诱导前后培养液的SDS-PAGE胶图；从左到右，泳道M，Blue plus II protein marker；泳道1，诱导后的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LkCR，加粗条带对应为LkCR，其分子量大小为28kDa；泳道2，未经诱导基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LkCR。

图3为实施例3辅助生物催化剂基因工程菌诱导前后培养液的SDS-PAGE胶图；从左到右，泳道M，Blue plus II protein marker；泳道1，诱导后的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-BmGDH，加粗条带对应为BmGDH，分子量大小为28.15kDa；泳道2，诱导后的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AaFDH，加粗条带对应为AaFDH，其分子量大小为44.72kDa；泳道3，诱导后的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-RaADH，加粗条带对应为RaADH，其分子量大小为35.19kDa。

图4为实施例4中BCA法测蛋白质浓度的标准曲线。

图5为实施例5液相色谱图；a，标样β-丙酮木糖苷(4.50min)；b，羟丙基四氢吡喃三醇(4.95min)。

图6为实施例6双酶偶联催化合成(S)-羟丙基四氢吡喃三醇的最适pH和最适温度。

图7为实施例6双酶偶联催化合成(S)-羟丙基四氢吡喃三醇的最适辅底物与底物之比以及最适转速。

图8为实施例7所制得(S)-构型玻色因的核磁图谱；a，¹H NMR谱；b，¹³C NMR谱。

图9为实施例7手性液相色谱图：a，混旋标样；(S)-构型玻色因，10.813min；(R)-构型玻色因，11.584min；b，实施例7所得的产物；(S)-构型玻色因，10.740min；(R)-构型玻色因，11.638min。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

LB液体培养基组成：胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，用1M的NaOH调节pH值到7.0～7.5。在121℃高压灭菌20min，4℃储存。

实施例1：生物催化剂和辅助生物催化编码基因的获取

1、短链醇脱氢酶LkCR编码基因的获取

人工合成已公开的来源于乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri)的短链醇脱氢酶LkCR编码基因，PDB登录号为7VDO_A(Huang,X.,Feng,J.,Cui,J.,Jiang,G.,Harrison,W.,Zang,X.,Zhou,J.,Wang,B.and Zhao,H.Photoinduced chemomimetic biocatalysis forenantioselective intermolecular radical conjugate addition.Nat.Catal.(2022),5,586–593)，核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

LkCR核苷酸序列

ATGACTGACCGTTTGAAAGGTAAGGTAGCAATTGTAACTGGCGGTACCTTGGGAATTGGCTTGGCAATCGCTGATAAGTTTGTTGAAGAAGGCGCAAAGGTTGTTATTACCGGCCGTCACGCTGATGTAGGTGAAAAAGCTGCCAAATCAATCGGCGGCACAGACGTTATCCGTTTTGTCCAACACGATGCTTCTGATGAAGCCGGCTGGACTAAGTTGTTTGATACGACTGAAGAAGCATTTGGCCCAGTTACCACGGTTGTCAACAATGCCGGAATTGCGGTCAGCAAGAGTGTTGAAGATACCACAACTGAAGAATGGCGCAAGCTGCTCTCAGTTAACTTGGATGGTGTCTTCTTCGGTACCCGTCTTGGAATCCAACGTATGAAGAATAAAGGACTCGGAGCATCAATCATCAATATGTCATCTATCGAAGGTTTAGTTGGTGATCCAACTCAAGGTGCATACAACGCTTCAAAAGGTGCTGTCAGAATTATGTCTAAATCAGCTGCCTTGGATTGCGCTTTGAAGGACTACGATGTTCGGGTTAACACTGTTCATCCAGGTCCTATCAAGACACCATTGGTTGACGATCTTGAAGGGGCAGAAGAAATGATGTCACAGCGGACCAAGACACCAATGGGTCATATCGGTGAACCTAACGATATCGCTTGGATCTGTGTTTACCTGGCATCTGACGAATCTAAATTTGCCACTGGTGCAGAATTCGTTGTCGACGGTGGCTACACTGCTCAATGA。

2、葡萄糖脱氢酶BmGDH编码基因的获取

人工合成已公开的来源于巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium IWG3)的葡萄糖脱氢酶BmGDH编码基因，GenBank登录号为AAA22475.1(Makino,Y.,Negoro,S.,Urabe,I.andOkada,H.Stability-increasing mutants of glucose dehydrogenase from Bacillusmegaterium IWG3.J.Biol.Chem.(1989),264(11),6381-6385)，核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

BmGDH核苷酸序列

ATGTATAAAGATTTAGAAGGAAAAGTAGTGGTCATAACAGGTTCATCTACAGGTTTGGGAAAATCAATGGCGATTCGTTTTGCGACAGAAAAAGCCAAAGTAGTTGTGAACTATCGTTCTAAGGAGGACGAAGCTAACAGCGTTTTAGAAGAAATTAAAAAAGTTGGCGGAGAAGCAATTGCTGTCAAAGGTGATGTAACAGTTGAGTCTGACGTTATCAATTTAGTTCAATCTGCTATTAAAGAGTTTGGAAAGCTAGACGTTATGATTAACAACGCAGGGTTAGAAAATCCGGTTTCATCTCATGAAATGTCTTTAAGCGATTGGAATAAAGTCATTGATACGAACTTAACGGGAGCTTTTTTAGGCAGCCGTGAAGCGATTAAATATTTTGTGGAAAATGATATTAAGGGAACAGTTATTAACATGTCGAGTGTTCACGAGAAAATTCCTTGGCCATTATTTGTTCATTATGCAGCAAGTAAAGGCGGTATGAAGCTTATGACTGAAACACTGGCATTAGAATACGCTCCAAAAGGTATTCGTGTAAATAACATTGGACCAGGAGCGATTAATACACCGATTAACGCTGAGAAATTTGCTGATCCTGAGCAGCGTGCAGATGTAGAAAGCATGATTCCAATGGGATACATCGGAGAGCCGGAAGAAATTGCAGCAGTTGCTGCATGGCTAGCTTCTTCAGAGGCGAGTTATGTAACAGGAATTACGCTCTTTGCTGACGGCGGTATGACACAGTACCCATCATTCCAAGCAGGACGCGGATAA。

3、甲酸脱氢酶AaFDH编码基因的获取

人工合成已公开的来源于屈曲杆菌(Ancylobacter aquaticus)的甲酸脱氢酶AaFDH编码基因，GenBank登录号为BAC65346.1(Nanba,H.,Takaoka,Y.and Hasegawa,J.Purification and characterization of formate dehydrogenase fromAncylobacter aquaticus strain KNK607M,and cloning of the gene.Biosci.Biotechnol.Biochem.6(2003),7(4),720-728)，核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

AaFDH核苷酸序列

ATGGCAAAAGTTCTGTGTGTTCTGTACGATGACCCGATTGACGGGTATCCGACCACGTACGCGCGCGACAATCTGCCGAAAATTGACCACTATCCGGGCGGCCAGACCCTGCCGACCCCTAAAGCAATTGATTTTACCCCGGGTACCATGCTGGGCAGCGTTTCTGGTGAACTGGGTCTGCGTAAATATCTGGAAAGCAACGGACACACCCTGGTAGTTACCTCAGATAAAGATGGTCCGGATAGCGTGTTTGAAAAAGAACTGGTTGATGCAGATATTGTTATTAGTCAACCGTTTTGGCCGGCGTATCTGACCCCAGAACGCTTTGCAAAAGCTAAAAATCTGAAACTGGCACTGACCGCAGGTATTGGAAGCGATCATGTTGATCTGCAAAGCGCAATTGATCGTGGTGTTACTGTAGCCGAAGTTACCTATTGTAATAGCATTAGCGTTGCCGAACATGTGGTCATGATGATTCTGGGTCTGGTTCGTAATTATCTGCCGGCCCATGATTGGGCACGTAAAGGTGGTTGGAATATTGCAGATTGCGTTAAACATAGCTACGATCTGGAAGCAATGAGTGTTGGTACCGTTGCTGCAGGTCGTATTGGACTGGCAGTTCTGCGTCGTCTGGCACCTTTTGATGTGAAACTGCACTATACCGATCGTCATCGTCTGCCGGAATCTGTGGAAAAAGAACTGAATCTGACGTGGCATGCAAGTCCGACAGATATGTATCCTCATTGTGATGTTGTCACGCTGAATTGCCCTCTGCATCCGGAAACCGAACATATGGTCAATGAAGAAACACTGAAACTGTTTAAACGCGGGGCCTATATTGTTAATACCGCACGTGGTAAACTGTGTGATCGTGACGCAATCGCCCGTGCCCTGGAAAATGGAACCCTGGCAGGTTACGCAGGAGATGTTTGGTTTCCGCAGCCTGCACCTGCCGATCATCCGTGGCGTACTATGGCATGGAATGGAATGACCCCTCACATGTCTGGTACTAGCCTGACCGCACAAACACGTTATGCAGCAGGTACGCGTGAGATTCTGGAATGTTTTTTTGAAGGTCGCCCGATTCGTGACGAATATCTGATTGTTCAGGGTGGTAATCTGGCAGGTGTTGGTGCACATAGCTATAGCAAAGGTAATGCAACCGGTGGTAGCGAAGAAGCCGGTAAATTTAAAAAGGCAGGCTAA。

4、醇脱氢酶RaADH编码基因的获取

人工合成已公开的来源于红球菌(Rhodococcus aetherivorans JCM 14343)的醇脱氢酶RaADH编码基因，GenBank登录号为GES38541.1(Inoue,D.,Tsunoda,T.,Yamamoto,N.,Ike,M.and Sei,K.1,4-Dioxane degradation characteristics of Rhodococcusaetherivorans JCM 14343.Biodegradation(2018),29(3),301-310)，核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

RaADH核苷酸序列

ATGAAAGCAGTCCAGTACACCGAAATTGGTAGTGAACCGGTTGTTGTTGACATTCCGACGCCGACGCCGGGTCCGGGTGAAATCCTGCTGAAAGTCACCGCGGCCGGTCTGTGTCATAGCGACATTTTTGTTATGGATATGCCGGCAGCTCAGTATGCATACGGTCTGCCGCTGACGCTGGGTCACGAGGGTGTGGGTACCGTTGCCGAACTGGGCGAAGGTGTGACCGGCTTCGGTGTTGGCGATGCTGTTGCAGTCTATGGTCCGTGGGGTTGCGGTGCATGTCATGCATGCGCACGTGGTCGCGAAAACTACTGCACGCGTGCAGCAGATCTGGGTATCACCCCGCCGGGTCTGGGTAGCCCGGGTTCTATGGCTGAATATATGATTGTGGACTCCGCGCGCCATCTGGTTCCGATCGGTGACCTGGATCCGGTGGCAGCTGCGCCGCTGACGGATGCAGGTCTGACCCCGTACCACGCAATTAGTCGTGTTCTGCCGCTGCTGGGTCCGGGTTCCACCGCAGTGGTTATCGGTGTCGGCGGTCTGGGTCACGTGGGCATTCAAATCCTGCGTGCCGTGAGTGCCGCACGCGTCATTGCAGTGGATCTGGATGACGATCGTCTGGCTCTGGCGCGCGAAGTTGGCGCAGATGCTGCGGTCAAATCAGGTGCCGGCGCCGCAGACGCAATTCGTGAACTGACGGGCGGTCAGGGTGCCACCGCAGTTTTTGACTTCGTCGGCGCGCAAAGCACGATCGATACCGCTCAGCAAGTCGTGGCGGTGGACGGTCATATTTCTGTTGTCGGTATCCATGCTGGCGCGCACGCCAAGGTTGGCTTTTTCATGATTCCGTTTGGCGCCTCAGTGGTTACGCCGTATTGGGGCACCCGCTCGGAACTGATGGAAGTCGTGGCACTGGCTCGTGCAGGTCGTCTGGATATCCACACCGAAACGTTCACCCTGGACGAAGGCCCGGCGGCGTATCGTCGTCTGCGTGAAGGTAGCATTCGTGGTCGTGGTGTCGTGGTTCCGTGA。

实施例2：作为生物催化剂和辅助生物催化剂的基因工程菌湿菌体及其粗酶液制备

1、作为生物催化剂和辅助生物催化剂的基因工程菌的构建

表达LkCR基因工程菌：将LkCR编码基因插入到质粒pET28a上的Nde I和Hind III位点之间，得到重组质粒pET28a-LkCR。将重组质粒导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LkCR。

表达BmGDH、AaFDH或RaADH基因工程菌：分别将葡萄糖脱氢酶BmGDH编码基因、甲酸脱氢酶AaFDH编码基因、醇脱氢酶RaADH编码基因插入到质粒pET28a上的BamH I和Xho I位点之间，得到重组质粒pET28a-BmGDH、pET28a-AaFDH、pET28a-RaADH。将重组质粒分别导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-BmGDH、E.coliBL21(DE3)/pET28a-AaFDH、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RaADH。

工程菌经提取质粒测序表明，各个基因分别插入无误。

2、作为生物催化剂和辅助生物催化剂的基因工程菌的湿菌体制备

湿菌体按如下方法制备：分别将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LkCR、E.coli BL21(DE3)/pET28a-BmGDH、E.coli BL21(DE3)/pET28a-AaFDH和E.coli BL21(DE3)/pET28a-RaADH接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，然后以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在24℃下诱导培养12h，获得诱导培养液。同样条件下，以不添加IPTG的培养液为未诱导对照培养液。再将诱导培养液于4℃、8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH 8.0的50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体作为生物催化剂，于-20℃条件下保存备用。

SDS-PAGE检测样品的制备：取未诱导对照培养液和诱导培养液各1mL，在12000rpm离心1min，弃去上清，留取菌体。菌体随后各加入100μL超纯水，将菌重悬成菌悬液。之后，各取20μL菌悬液，加入4μL 6x Protein Loading Buffer混匀后，煮沸10min。煮沸结束后，12000rpm离心1min，各取15μL上清液用于SDS-PAGE检测，蛋白质Marker为BluePlusProtein Marker(14～120kDa)。如图2、图3所示，SDS-PAGE检测表明，短链醇脱氢酶LkCR编码基因、葡萄糖脱氢酶BmGDH编码基因、甲酸脱氢酶AaFDH编码基因和醇脱氢酶RaADH编码基因均在大肠杆菌中成功表达。

3、表达醇脱氢酶基因工程菌和表达葡萄糖脱氢酶基因工程菌的粗酶液制备

在每1g湿菌体中加入15mL pH 7.0的50mM Tris-HCl缓冲液，用玻璃棒搅拌成菌悬液，在冰浴(0℃)条件下超声破碎20min，超声工作2s，间歇4s，超声功率650W。经超声破碎后的菌悬液在12000rpm、4℃下离心10min，所得到的上清液即为粗酶液，放在4℃保存备用。

实施例4：脱氢酶的比酶活测定

1、脱氢酶的体积比活力测定

脱氢酶的酶活力采用酶标仪的单因素动力学方法测定NADPH在340nm处吸光值的变化来计算酶活。

短链醇脱氢酶LkCR酶活检测体系包括：在酶标板中加入10mMβ-丙酮木糖苷，0.1mMNADPH，15μL粗酶液，用pH 7.0的50mM Tris-HCl缓冲液补足300μL。

葡萄糖脱氢酶BmGDH酶活检测体系包括：在酶标板中加入10mM葡萄糖，0.1mM NADP⁺，15μL粗酶液，用pH 7.0的50mM Tris-HCl缓冲液补足300μL。

甲酸脱氢酶AaFDH酶活检测体系包括：在酶标板中加入10mM甲酸铵，0.1mM NAD⁺，15μL粗酶液，用pH 7.0的50mM Tris-HCl缓冲液补足300μL。

醇脱氢酶RaADH酶活检测体系包括：在酶标板中加入10mM异丙醇，0.1mM NADP⁺，15μL粗酶液，用pH 7.0的50mM Tris-HCl缓冲液补足300μL。

每个测酶体系于30℃下孵育2min后，采用酶标仪检测340nm处吸光值变化。酶活力单位U定义为在30℃下，每分钟转化1μmol的NADPH或NADP⁺所需的酶量。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。脱氢酶的体积酶活力计算如公式1。

公式1：

D：稀释倍数，为1；A₁：样品吸光度；A₂：空白对照吸光度；V_t：反应总体系，为300μL。

e：摩尔吸光系数，为常数6220；V_s：酶液体积，为15μL；d：光程，为1cm。

2、脱氢酶的蛋白浓度测定

根据BCA法蛋白质浓度测定试剂盒绘制蛋白浓度标准曲线，以蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，如图4所示，测得的线性关系公式为y＝0.0567x+0.1423，其中y为562nm处的吸光度值，x为BSA量(μg)，标准偏差为R²＝0.991。

在利用BCA法蛋白质浓度测定试剂盒测量脱氢酶粗酶液的蛋白浓度时，每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。经测定，短链醇脱氢酶LkCR粗酶液的蛋白质浓度为6.90mg/mL；葡萄糖脱氢酶BmGDH粗酶液的蛋白质浓度为5.84mg/mL；甲酸脱氢酶AaFDH粗酶液的蛋白质浓度为5.83mg/mL；醇脱氢酶RaADH粗酶液的蛋白质浓度为6.33mg/mL。

3、比酶活计算

体积酶活与蛋白质浓度的比值，即可得出相应的比酶活。经计算短链醇脱氢酶LkCR粗酶液的比酶活为565.01U/g，葡萄糖脱氢酶BmGDH粗酶液的比酶活为992.59U/g，甲酸脱氢酶AaFDH粗酶液的比酶活为793.41U/g，醇脱氢酶RaADH粗酶液的比酶活为856.01U/g。

实施例5：双酶偶联催化β-丙酮木糖苷还原合成(S)-构型玻色因的初始反应体系构建

1、短链醇脱氢酶LkCR与葡萄糖脱氢酶BmGDH的湿菌体或粗酶液催化合成(S)-构型玻色因的比较

将实施例3制备的短链醇脱氢酶LkCR湿菌体或粗酶液与葡萄糖脱氢酶BmGDH湿菌体或粗酶液以质量比1:1的比例混合作为催化剂，加入pH 7.0的50mM PBS缓冲液中，以β-丙酮木糖苷为底物，葡萄糖为辅底物，加入辅酶NADP⁺，构成10mL的反应总体系。反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1MNaOH水溶液。

初始未进行条件优化的反应体系如下：底物β-丙酮木糖苷终浓度400mM、辅底物葡萄糖终浓度1000mM、辅酶NADP⁺终浓度0.2mM，短链醇脱氢酶LkCR和葡萄糖脱氢酶BmGDH添加量均为50g/L湿菌体或对应于50g/L湿菌体制得的粗酶液，加入pH 7.0的50mM PBS缓冲液中，在pH 7.0、400rpm和40℃下反应6h。反应结束后，取样200μL反应液于12000rpm离心3min，取100μL上清加进400μL dd H₂O中，用0.22μm滤膜过滤后用于液相分析。

液相色谱检测所用的流动相为：色谱级乙腈750mL，使用ddH₂O定容至1L。使用0.22μm有机系滤膜抽滤过膜处理。将过膜后的流动相超声脱气30min，去除其中的气泡，所得即为流动相。液相色谱仪为赛默飞液相U3000，检测器为示差检测器，检测色谱柱为OSAKASODA CAPCELL PAK NH₂液相色谱柱(250×4.6/5μm)柱，流动相流速为1mL/min，进样量为20μL，检测温度为35℃，检测时间为7min。如图5所示，水，3.50min；β-丙酮木糖苷，4.50min；羟丙基四氢吡喃三醇，4.95min。

结果表明，湿菌体催化合成(S)-构型玻色因时，转化率为63.1％；而等量湿菌体制得的粗酶液催化合成(S)-构型玻色因时，转化率达72.4％。由此可见，优选粗酶液催化更优。

2、不同辅酶循环体系在催化合成(S)-构型玻色因中的比较

比较不同辅酶循环体系的反应体系如下：底物β-丙酮木糖苷终浓度400mM、辅底物终浓度1000mM、辅酶NADP⁺终浓度0.2mM，短链醇脱氢酶LkCR和辅助生物催化剂添加量均为50g/L湿菌体或对应于50g/L湿菌体制得的粗酶液，加入pH 7.0的50mM PBS缓冲液中，在pH7.0、400rpm和40℃下反应6h。反应结束后，取样200μL反应液于12000rpm离心3min，取100μL上清加进400μL dd H₂O中，用0.22μm滤膜过滤后用于液相分析。辅助生物催化剂包括葡萄糖脱氢酶BmGDH(辅底物为葡萄糖)、甲酸脱氢酶AaFDH(辅底物为甲酸铵)和醇脱氢酶RaADH(辅底物为异丙醇)。

结果表明，辅酶循环体系为葡萄糖脱氢酶/葡萄糖组合时，转化率为71.2％；辅酶循环体系为甲酸脱氢酶/甲酸铵组合时，转化率为76.7％；而辅酶循环体系为醇脱氢酶/异丙醇组合时，转化率最高，达80.5％。

实施例6：双酶偶联催化β-丙酮木糖苷还原合成(S)-构型玻色因的反应条件优化

条件优化的基准反应体系如下：反应体系为10mL，底物β-丙酮木糖苷终浓度400mM、异丙醇终浓度1000mM、辅酶NADP⁺终浓度0.2mM，短链醇脱氢酶LkCR和醇脱氢酶RaADH添加量均为对应于50g/L湿菌体制得的粗酶液，加入pH 7.0的50mM PBS缓冲液中，在pH7.0、400rpm和40℃下反应6h。反应结束后，取样200μL反应液于12000rpm离心3min，取100μL上清加进400μL dd H₂O中，用0.22μm滤膜过滤后用于液相分析。

在pH 5.5～8.5的范围考察pH的影响，结果如图6中a所示，最适pH为7.0。

在温度25～45℃范围考察不同温度下的催化效果，结果如图6中b所示，最适温度为40℃。

分别考察不同辅底物(异丙醇)与底物投料摩尔浓度比值(1：1～6：1)对催化效果的影响，结果如图7中a所示，最适辅底物与底物投料摩尔浓度比值为4：1。

在转速200～600rpm下考察催化效果，结果如图7中b所示，最适转速为300rpm。

实施例7：双酶偶联催化β-丙酮木糖苷还原合成高浓度(S)-构型玻色因的放大及产物鉴定

优化后的反应体系如下：扩大反应体系至300mL，底物β-丙酮木糖苷终浓度分别为400mM、700mM和1000mM，异丙醇终浓度2600mM，辅酶NADP⁺终浓度0.2mM，短链醇脱氢酶LkCR和醇脱氢酶RaADH添加量均为对应于50g/L湿菌体制得的粗酶液，加入pH 7.0的50mM PBS缓冲液中，在pH 7.0、400rpm和40℃下反应12～36h。反应结束后，取样200μL反应液于12000rpm离心3min，取100μL上清加进400μL dd H₂O中，用0.22μm滤膜过滤后用于液相分析。

结果表明，400mM底物反应12h，转化率达99.35％；700mM底物反应24h，转化率达99.74％。当底物浓度进一步提高到1000mM时，反应36h，转化率仍然高达99.21％，产物浓度高于190g/L。

放大反应结束后，1L反应液(产物浓度为190g/L)在12000rpm下离心10min，取上清，加入活性炭脱色；脱色结束后，在12000rpm下离心1min，取上清，用截留分子量3000的超滤膜去除颗粒，然后用截留分子量200的纳滤膜脱盐，55℃下减压旋蒸去除水分，得产物(S)-构型玻色因138.7g。

利用核磁共振对得到的玻色因进行分析(图8)，得到结果¹H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)δ4.82(s,0H),4.00(dt,J＝7.1,6.0Hz,1H),3.89(dd,J＝11.3,5.4Hz,1H),3.54(ddd,J＝10.7,9.2,5.5Hz,1H),3.39–3.10(m,4H),1.88(ddd,J＝14.4,7.2,2.5Hz,1H),1.62(ddd,J＝14.4,9.6,5.9Hz,1H),1.17(d,J＝6.3Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,Deuterium Oxide)δ78.36,77.26,73.58,69.43,68.76,65.62,39.90,21.40.

所制得的产物经手性液相色谱分析(图9)，其非对映体选择性为99.2％。色谱条件如下：色谱柱：XAmide(4.6*250mm，5μm)，浙江华谱新创科技有限公司；进样体积：20μL；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测器：示差检测器；流动相：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，流动相A:流动相B＝5:95。

Claims (8)

1.一种双酶偶联合成高浓度(S)-构型玻色因的方法，其特征在于，所述方法为：以含短链醇脱氢酶LkCR编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的粗酶液作为催化剂，以β-丙酮木糖苷为底物，以NAD⁺或NADP⁺为辅酶，加入辅助催化剂和辅底物驱动辅酶循环，以pH 5.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度为25～45℃，300～600rpm条件下反应完全后，反应液分离纯化，获得(S)-羟丙基四氢吡喃三醇，即(S)-构型玻色因；所述辅助催化剂包括含葡萄糖脱氢酶BmGDH、甲酸脱氢酶AaFDH或是醇脱氢酶RaADH的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎获得的粗酶液；所述辅底物包括葡萄糖、甲酸铵、异丙醇。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述短链醇脱氢酶LkCR编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶BmGDH编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述甲酸脱氢酶AaFDH编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述醇脱氢酶RaADH编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅助催化剂为含醇脱氢酶RaADH编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎获得的粗酶液；所述辅底物为异丙醇。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，催化剂加入量以湿菌体重量计为20～100g/L；催化剂与辅助催化剂以质量比1:1混合；所述底物加入终浓度为400～1000mM，所述底物与辅底物加入摩尔浓度比为1:1～6；所述辅酶加入终浓度为0～1mM。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应温度为40℃，转速300rpm，反应介质为pH 7.0的50mM PBS缓冲液。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化剂和辅助催化剂的湿菌体或者由湿菌体制得的粗酶液按如下方法制备：将工程菌接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0～0.6mM的IPTG，在24℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH 7.0的50mM PBS缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体，所得菌体即作为整细胞催化时的催化剂或辅助催化剂；以1g湿菌体和15mL的50mM、pH 7.0PBS缓冲液的比例悬浮湿菌体，将悬浮液于超声破碎仪中以工作2s，间歇4s，650W的功率的程序破碎20min；在4℃和12000rpm下离心10min，收集上清液，上清液即为催化剂或辅助催化剂的粗酶液。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应液分离纯化方法为：反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入活性炭脱色；脱色结束后，在12000rpm下离心1min，取上清，用截留分子量3000的超滤膜预处理，然后用截留分子量200的纳滤膜脱盐，55℃下减压旋蒸去除水分，获得产物(S)-构型玻色因。

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