CN117737149A - 一种酶催化高效合成高纯度s-玻色因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物催化制药领域，涉及一种酶催化高效合成高纯度S‑玻色因的方法。以β‑丙酮木糖苷作为反应原料，以氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的酶作为催化酶，添加还原型辅酶进行酶催化合成反应获得S‑玻色因。本发明经过筛选获得了具有高催化活性的酶，利用该酶制备S‑玻色因在常温常压条件下即可实现，具有反应时间短、副产物少、纯度高等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物催化制药领域，涉及一种酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
羟丙基四氢吡喃三醇，又名玻色因，具有良好的生物抗衰活性，其分子量为192.21。玻色因易于生物降解、无毒不积累，在生物医药和化妆品等领域具有广泛的应用。现有的合成技术主要以化学法为主，以木糖为起始原料首先缩合生成β-丙酮木糖苷再进一步还原最终合成玻色因，第一步反应相对来说简单，第二步化学法还原步骤，一般采用硼氢化钠之类，引入大量的无机盐及硼酸，造成后期分离纯化较为困难。
公开号CN 113717997 A 和 CN 115896199 A等专利均提到了化学酶法合成玻色因的方法，但是发明人研究发现，目前化学酶法合成玻色因的方法存在反应时间过长（一般为36 h）的问题，另外底物浓度过高(大于100g/L)则不能够实现完全转化，在高浓度底物反应体系下转化率仅有83%左右，减低了产率同时大大增加了成本。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，本发明经过筛选获得了具有高催化活性的酶，利用该酶制备S-玻色因在常温常压条件下即可实现，具有反应时间短、副产物少、纯度高等优点。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，以β-丙酮木糖苷作为反应原料，以氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的酶作为催化酶，添加还原型辅酶进行酶催化合成反应获得S-玻色因。
采用酶催化合成S-玻色因的反应式如下所示：
由该反应式可知，该反应将侧链酮基还原得到羟基，据此本发明前期确定催化该反应过程需要的酶类可能属于脱氢酶类或酮还原酶类，因此，本发明酶数据库中分析确定8条候选序列基因，分别为命名为ADH4、ADHA、ADHB、ADHD、ADHR、ADHT、EVBA和LACO，经过研究表明，该8条基因表达的酶中，仅有ADH4、ADHR、EVBA和LACO表达的酶可以催化该反应获得S-玻色因，经过进一步研究表明，其中EVBA表达的酶具有高催化活性和高转化率，能够大大降低酶法合成S-玻色因的合成时间，降低反应成本。
在一些实施例中，催化酶由含有EVBA编码基因的工程菌进行发酵培养获得。
在一种或多种实施例中，EVBA编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在一种或多种实施例中，所述工程菌中，负载EVBA编码基因的载体为质粒。具体地，所述质粒为pET30a。更为具体地，EVBA编码基因的多克隆位点位于NdeI 与XhoI双酶切位点之间。
在一种或多种实施例中，将所述工程菌依次采用LB培养基和TB培养基进行培养，然后添加诱导剂IPTG继续培养，将收集的菌体重悬后进行细胞破碎，获得的粗酶液作为催化酶的添加形式。具体地，粗酶液的添加量为总反应体系体积的15~25%。
在一些实施例中，反应温度为20~30 ℃，反应时间为6~8 h。
在一些实施例中，反应体系中含有Mg2+。Mg2+的添加量为20~40 mM。
在一些实施例中，反应体系中，β-丙酮木糖苷的浓度为500~1000 mM。研究表明，β-丙酮木糖苷的浓度与转化率有关，浓度越低，转化率越高，当β-丙酮木糖苷的浓度750~850mM时，处理效率最高。
在一些实施例中，采用pH7.2~7.6的Tris-HCl缓冲液调整反应体系的反应体积。
在一些实施例中，所述辅酶为还原型辅酶II（NADPH）。还原型辅酶包括还原型辅酶I（NADH）和还原型辅酶II（NADPH），研究表明，该反应体系采用NADPH的效果更好。
在一些实施例中，反应体系中添加葡萄糖脱氢酶BmGDH。本发明通过添加葡萄糖脱氢酶BmGDH实现辅酶的再生。
在一种或多种实施例中，葡萄糖脱氢酶BmGDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
在一种或多种实施例中，葡萄糖脱氢酶BmGDH由含有BmGDH编码基因的工程菌进行发酵培养获得。
在一种或多种实施例中，BmGDH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明的有益效果为：
本发明提供的酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，通过对酶的选择，最终得到了性能更优良的基因的酶，采用该酶合成S-玻色因，反应时长大大缩减，为提高产能规模化生产奠定了基础。同时能够在常温常压实现催化反应，成本低，副产物少，经过研究表明，本发明可在8小时内基本反应完全，转化率可达94%以上，甚至可达99%以上，获得的玻色因产品中S-玻色因的纯度较高，例如S/R异构体比例为99.935/0.065。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中基因pET30a-ADH4的粗酶液催化制备S-玻色因的液相色谱图（小试）；
图2为本发明实施例中基因pET30a-ADHR的粗酶液催化制备S-玻色因的液相色谱图（小试）；
图3为本发明实施例中基因pET30a-EVBA的粗酶液催化制备S-玻色因的液相色谱图（小试）；
图4为本发明实施例中基因pET30a-LACO的粗酶液催化制备S-玻色因的液相色谱图（小试）；
图5为本发明实施例中基因pET30a-EVBA的粗酶液催化制备S-玻色因的核磁碳谱图（小试）；
图6为本发明实施例中基因pET30a-EVBA的粗酶液催化制备S-玻色因的核磁氢谱图；
图7为本发明实施例中酶催化放大小试实验的玻色因的色谱图（放大试验）。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例
表达菌株构建
确定的8条基因序列以氨基酸的形式由北京华大基因进一步进行密码子优化并合成，最终按照我方要求被亚克隆进入载体pET30a的多克隆位点NdeI 与XhoI双酶切位点之间。合成载体被命名为pET30a-ADH4、pET30a-ADHA、pET30a-ADHB、pET30a-ADHD、pET30a-ADHR、pET30a-ADHT、pET30a-EVBA、pET30a-LACO。通过化学法转化这些载体进入大肠杆菌BL21(DE3)，该大肠杆菌菌株来源于上海唯地生物，涂平板得到表达菌株。
ADH4 氨基酸序列为：
MKAIQYTRIGAEPELTEIPKPEPGPGEVLLEVTAAGVCHSDDFIMSLPEEQYTYGLPLTLGHEGAGKVAAVGEGVEGLDIGTNVVVYGPWGCGNCWHCSQGLENYCSRAQELGINPPGLGAPGALAEFMIVDSPRHLVPIGDLDPVKTVPLTDAGLTPYHAIKRSLPKLRGGSYAVVIGTGGLGHVAIQLLRHLSAATVIALDVSADKLELATKVGAHEVVLSDKDAAENVRKITGSQGAAVVLDFVGYQPTIDTAMAVAGVGSDVTIVGIGDGQAHAKVGFFQSPYEASVTVPYWGARNELIELIDLAHAGIFDIAVETFSLDNGAEAYRRLAAGTLSGRAVVVPGL，如SEQ ID NO.1所示。
ADH4 氨基酸密码子优化后核酸序列为：
ATGAAAGCTATCCAGTACACTCGTATCGGTGCTGAACCAGAACTGACCGAAATCCCGAAACCAGAACCGGGTCCGGGTGAAGTTCTGCTGGAAGTTACCGCTGCTGGTGTTTGCCACTCTGATGACTTCATCATGAGCCTGCCAGAAGAACAGTACACCTACGGTCTGCCGCTGACCTTGGGTCACGAAGGTGCGGGTAAAGTTGCTGCTGTTGGTGAAGGTGTTGAAGGTCTGGACATCGGTACTAACGTGGTTGTTTACGGTCCGTGGGGTTGCGGTAACTGCTGGCACTGTTCTCAGGGTTTGGAGAACTACTGCTCTCGTGCGCAAGAACTGGGTATCAATCCGCCGGGTCTGGGTGCACCAGGTGCTCTGGCTGAGTTCATGATCGTTGACTCTCCACGTCACCTGGTTCCAATCGGCGATCTCGATCCGGTTAAGACCGTTCCACTGACCGACGCTGGTCTGACTCCATACCACGCAATCAAACGTTCTCTGCCGAAACTGCGTGGTGGTAGCTACGCGGTTGTTATCGGCACCGGCGGTCTTGGTCACGTTGCGATCCAGCTGCTGCGTCACCTGTCTGCTGCAACTGTGATCGCGCTGGACGTTTCTGCGGACAAACTGGAACTGGCGACCAAAGTTGGTGCACACGAAGTGGTTCTGTCCGACAAAGATGCGGCTGAGAACGTTCGTAAGATCACCGGCTCTCAGGGCGCTGCTGTTGTACTGGACTTCGTTGGTTACCAGCCGACCATCGACACCGCTATGGCTGTAGCAGGTGTGGGTTCTGACGTTACCATCGTTGGTATCGGTGATGGTCAGGCTCACGCGAAAGTTGGTTTCTTCCAGAGTCCGTATGAAGCGTCTGTGACTGTTCCGTACTGGGGTGCTCGTAACGAACTCATCGAACTGATCGACCTGGCACACGCTGGTATCTTCGACATCGCAGTGGAAACCTTCAGCCTGGACAACGGTGCTGAGGCTTACCGTCGTCTGGCTGCTGGTACTCTGTCTGGTCGTGCGGTTGTTGTTCCAGGCCTGtaa，如SEQ IDNO.2所示。
ADHA 氨基酸序列为：
MKAVQYTEIGSEPVVVDIPTPTPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAAQYAYGLPLTLGHEGVGTVAELGEGVTGFGVGDAVAVYGPWGCGACHACARGRENYCTRAADLGITPPGLGSPGSMAEYMIVDSARHLVPIGDLDPVAAAPLTDAGLTPYHAISRVLPLLGPGSTAVVIGVGGLGHVGIQILRAVSAARVIAVDLDDDRLALAREVGADAAVKSGAGAADAIRELTGGQGATAVFDFVGAQSTIDTAQQVVAVDGHISVVGIHAGAHAKVGFFMIPFGASVVTPYWGTRSELMEVVALARAGRLDIHTETFTLDEGPAAYRRLREGSIRGRGVVVP，如SEQ ID NO.3所示。
ADHA 氨基酸密码子优化后核酸序列为：
ATGAAAGCGGTTCAGTACACCGAAATCGGTTCTGAACCAGTTGTTGTTGACATTCCAACTCCGACTCCAGGTCCAGGTGAAATCCTGCTGAAAGTTACCGCAGCAGGTTTGTGCCACTCTGACATCTTCGTTATGGACATGCCGGCTGCTCAGTACGCTTACGGTCTGCCATTGACTCTGGGTCATGAAGGTGTGGGTACTGTTGCTGAACTGGGTGAAGGTGTTACTGGCTTCGGTGTTGGTGATGCAGTTGCTGTTTACGGTCCGTGGGGTTGTGGTGCATGTCACGCATGTGCTCGTGGTCGTGAGAACTACTGCACTCGTGCTGCTGATCTGGGTATCACTCCACCAGGTTTGGGTTCTCCGGGTAGCATGGCTGAATACATGATCGTTGACTCTGCACGTCACCTGGTTCCAATCGGTGACCTTGATCCAGTAGCTGCTGCTCCACTGACCGATGCTGGTCTGACTCCATACCACGCGATCTCTCGTGTTCTGCCGTTGTTGGGTCCGGGTTCTACCGCTGTTGTTATCGGTGTGGGTGGTTTGGGTCACGTTGGTATCCAGATTCTGCGTGCTGTTTCTGCGGCACGTGTTATCGCGGTTGATCTGGACGATGACCGTCTGGCACTGGCACGTGAAGTTGGTGCTGATGCAGCTGTGAAATCTGGTGCAGGTGCAGCAGATGCGATCCGTGAACTGACTGGTGGTCAGGGTGCAACCGCAGTGTTCGACTTCGTTGGTGCACAGTCTACCATCGACACTGCTCAGCAGGTTGTTGCTGTTGACGGTCACATCTCTGTTGTTGGCATCCACGCTGGTGCTCATGCGAAAGTTGGCTTCTTCATGATTCCGTTCGGTGCATCTGTTGTTACTCCGTACTGGGGTACTCGTTCTGAACTGATGGAAGTTGTTGCTCTGGCTCGTGCTGGTCGTTTGGACATCCACACCGAAACCTTCACTCTGGACGAAGGTCCAGCAGCATACCGTCGTCTTCGTGAAGGTTCTATCCGTGGTCGTGGTGTTGTTGTTCCAtaa，如SEQ ID NO.4所示。
ADHB 氨基酸序列为：MSVPIALPRIMRIGAGAVADIGEVVTSLGLSRPLVVTDSFLVGTGAAEQMIKNLETAGLSPRLFDGTVPDPTTASLEAGLVAIREHNSDSVIGFGGGSPMDTAKALGLLGRQGGKMRDYKAPRINVGPALPIIAVPTTAGSGSEATQFTVISDSESDEKMLCPGLAFLPLAAVIDYELTVSMPPRLTADTGVDALTHAIEAYVSKKANPFSDSLALIAIGTIGRVLRRAYTDGHDAQAREQMMLAATQAGIAFSNSSVALVHGMSRPIGAHFHVAHGLSNAMLFPAVTAFSVRAAESRYADCARALGVAAEHDSDASAADRLVRALTDLCRDVEVPTPKAYGIDKARWDELTPLMAEQALASGSPNNNPRVPTEAEIRDLYAQIYG，如SEQ ID NO.5所示。
ADHB 氨基酸密码子优化后核酸序列为：
ATGTCTGTTCCGATCGCATTGCCGCGCATCATGCGTATCGGCGCTGGTGCAGTAGCTGACATCGGTGAAGTGGTGACCTCTCTGGGTTTGAGCCGTCCGCTGGTTGTTACCGATAGCTTTCTGGTAGGTACTGGTGCAGCTGAACAGATGATCAAGAACCTGGAAACTGCTGGTCTGTCTCCGCGTCTGTTCGACGGTACTGTTCCAGATCCGACCACTGCGTCTCTGGAAGCTGGTCTGGTTGCTATCCGTGAACACAACAGCGACTCTGTTATCGGTTTCGGTGGTGGTAGTCCGATGGACACCGCGAAAGCTCTGGGTCTGCTGGGTCGCCAGGGTGGCAAGATGCGTGACTACAAAGCACCGCGTATCAACGTTGGTCCGGCATTGCCGATCATCGCAGTGCCAACCACTGCTGGTTCTGGTTCTGAAGCGACTCAGTTCACCGTTATCTCCGACTCTGAATCTGATGAGAAAATGCTGTGCCCGGGTCTGGCATTCTTGCCGCTGGCAGCAGTAATCGACTACGAACTGACCGTATCTATGCCGCCGCGTCTGACCGCGGATACTGGTGTTGACGCGCTGACTCACGCTATCGAGGCTTACGTTAGCAAGAAAGCGAATCCGTTCTCTGACAGCCTGGCGCTGATCGCAATCGGTACTATCGGTCGTGTTCTGCGTCGTGCTTACACCGATGGTCACGATGCACAAGCTCGTGAACAGATGATGCTGGCTGCAACTCAGGCAGGTATCGCTTTCTCTAACTCTTCTGTTGCTCTGGTTCACGGTATGTCTCGTCCGATCGGTGCTCACTTCCACGTTGCACACGGCCTGTCTAACGCTATGCTGTTTCCGGCGGTTACTGCGTTCTCTGTTCGTGCTGCTGAATCTCGTTACGCGGACTGTGCTCGTGCTCTGGGTGTTGCAGCTGAACATGATTCCGACGCAAGCGCAGCGGACCGTCTGGTTCGTGCACTGACTGACCTGTGCCGTGACGTTGAAGTTCCGACTCCGAAGGCTTACGGTATCGACAAAGCTCGTTGGGATGAACTGACTCCACTGATGGCTGAACAGGCTCTGGCATCTGGTTCTCCGAACAACAACCCGCGTGTTCCGACCGAAGCGGAAATCCGTGACCTGTACGCGCAAATCTACGGTtaa，如SEQ ID NO.6所示。
ADHD 氨基酸序列为：
MKTKAAVLLEPGKPFEIMELDLDGPGVGEVLIKYTAAGLCHSDLHLTDGDLPPRYPIVGGHEGSGIIEEVGPGVTKVKPGDHVVCSFIPNCGTCRYCSTGRQNLCDMGATILEGSMTDGSFRFHGNGMDFGGMCMLGTFSERATISQHSVVKIDDWLPLETAVVVGCGVPSGWGTAVNAGNLRAGDTAVIYGIGGLGINAVQGAVSAGCKYVVVVDPVALKRETALKFGATHAFADAESAAAKVNELTWGQGADAALILVGTVDEDVVSAATAVIGKGGTVVITGLADPAKLTVHVSGTDLTLNQKTIKGTLFGSMNPQYDIVRLLRLYDAGQLKLDELITNTYSLEDVNQGYQDLRDGKNIRGVIIHDK，如SEQ ID NO.7所示。
ADHD 氨基酸密码子优化后核酸序列为：
ATGAAGACCAAAGCTGCTGTACTGCTGGAACCGGGTAAACCATTCGAAATCATGGAACTGGACCTGGATGGTCCGGGTGTTGGTGAAGTTCTGATCAAATACACCGCGGCGGGTCTGTGCCACTCTGATCTGCACCTGACCGATGGTGATCTTCCGCCGCGTTATCCGATCGTAGGTGGTCACGAAGGTTCTGGTATCATCGAAGAAGTTGGTCCAGGTGTTACCAAAGTTAAACCAGGTGACCACGTTGTATGCTCTTTCATCCCGAACTGTGGTACTTGTCGTTATTGCTCTACGGGTCGTCAGAACCTGTGCGATATGGGTGCGACCATTCTGGAAGGTTCTATGACCGACGGTTCTTTCCGTTTCCACGGTAACGGCATGGACTTCGGCGGTATGTGCATGCTGGGTACTTTCTCTGAACGTGCGACTATCTCTCAGCACTCCGTGGTAAAGATCGACGATTGGCTGCCGTTGGAAACCGCAGTTGTAGTTGGCTGTGGTGTTCCATCTGGTTGGGGTACTGCGGTTAACGCAGGTAACCTGCGTGCTGGTGATACCGCGGTTATCTACGGTATCGGTGGTCTGGGTATCAACGCGGTACAGGGTGCGGTTTCCGCAGGTTGTAAGTACGTTGTGGTTGTTGATCCGGTTGCACTTAAACGTGAAACTGCACTGAAATTCGGTGCTACTCACGCGTTCGCTGACGCGGAATCTGCGGCGGCTAAAGTTAACGAACTGACTTGGGGTCAGGGTGCAGATGCGGCACTGATCTTGGTGGGCACCGTGGACGAAGACGTTGTTTCTGCGGCAACTGCTGTAATCGGTAAAGGTGGTACTGTTGTTATCACCGGCCTGGCAGATCCGGCTAAACTGACCGTTCACGTTTCTGGCACTGACCTGACTCTGAACCAGAAGACTATCAAAGGCACCTTGTTCGGTTCCATGAATCCGCAATACGACATCGTTCGTCTGCTGCGTCTGTACGATGCTGGTCAGCTGAAACTGGATGAACTGATCACCAACACCTACTCTCTGGAAGATGTTAACCAGGGTTACCAGGATCTGCGTGATGGTAAGAACATCCGTGGTGTGATCATCCACGACAAGtaa，如SEQ ID NO.8所示。
ADHR 氨基酸序列为：
MTDRLKGKVAIVTGGTLGIGLAIADKFVEEGAKVVITGRHADVGEKAAKSIGGTDVIRFVQHDASDEAGWTKLFDTTEEAFGPVTTVVNNAGIAVSKSVEDTTTEEWRKLLSVNLDGVFFGTRLGIQRMKNKGLGASIINMSSIEGFVGDPTLGAYNASKGAVRIMSKSAALDCALKDYDVRVNTVHPGYIKTPLVDDLEGAEEMMSQRTKTPMGHIGEPNDIAWICVYLASDESKFATGAEFVVDGGYTAQ，如SEQ ID NO.9所示。
ADHR 氨基酸密码子优化后核酸序列为：
ATGACCGATCGTTTGAAAGGTAAAGTTGCGATCGTTACTGGTGGTACGTTGGGTATCGGTCTGGCGATCGCTGACAAATTCGTAGAAGAAGGCGCTAAAGTTGTGATCACTGGTCGTCACGCTGACGTTGGCGAGAAAGCTGCTAAATCTATCGGCGGTACTGACGTTATCCGTTTCGTTCAGCACGATGCGTCCGATGAAGCAGGCTGGACCAAACTGTTCGATACCACTGAAGAAGCATTCGGTCCGGTAACCACCGTAGTGAACAACGCTGGTATCGCAGTGTCCAAATCTGTTGAAGATACTACCACCGAAGAATGGCGTAAACTGCTGTCTGTTAACCTGGATGGTGTATTCTTCGGTACTCGTCTGGGTATCCAGCGTATGAAGAACAAAGGTCTGGGTGCGTCCATCATCAACATGTCTTCCATCGAAGGTTTCGTGGGTGATCCGACCCTGGGTGCATACAACGCGTCCAAAGGCGCAGTTCGTATCATGTCTAAATCTGCTGCGTTGGATTGCGCATTGAAAGACTACGATGTGCGTGTTAACACCGTGCATCCGGGTTACATCAAGACTCCGCTGGTTGATGATCTGGAAGGTGCTGAAGAAATGATGTCTCAGCGTACTAAGACTCCGATGGGTCACATCGGCGAACCGAACGACATCGCGTGGATCTGCGTTTACCTGGCGAGCGATGAATCCAAATTCGCAACCGGCGCAGAATTTGTTGTGGATGGTGGCTACACTGCGCAGtaa，如SEQ ID NO.10所示。
ADHT 氨基酸序列为：
MKAAQLMGPGLLEINDVPIPEISPSELLIRVGAAGICHSDLHLLHFPYKMREEPLTIGHEIAGTIEAVGAGVDGRSVGERGVVYLCWSCGQCRECMSGNENMCLAAGRTAMPPCPGLGPEGGMAEYVKIPARSFVPIGDLDFLQAAPLADAALTSYHAIRGAREHLQPGATAVVIGVGGLGHVAVQILRAISAVRIIAVDVGQDQLDLAKRCGADITLESGPDTAQHILDLTSARGAEVIFDFVGIDATAQMSVQAVAPNGAYRMVGLGGGNPGITAEAAGGPGWPWGASIRKSYGGTRNDLVDSIALAQAGLVTVEVARFDLADARDALDRLEHGKVTGRAVLVP，如SEQ ID NO.11所示。
ADHT 氨基酸密码子优化后核酸序列：
ATGAAAGCAGCACAGCTGATGGGTCCGGGTCTGCTGGAAATCAACGACGTTCCGATTCCGGAAATCAGTCCGTCTGAACTGCTGATCCGTGTTGGTGCAGCGGGTATCTGCCACTCTGATCTGCACCTGCTGCACTTCCCGTACAAGATGCGTGAAGAACCGCTGACCATCGGTCACGAAATCGCGGGTACTATCGAAGCTGTAGGTGCTGGTGTAGACGGTCGTTCTGTTGGTGAACGTGGTGTTGTTTACCTGTGCTGGAGCTGTGGTCAGTGCCGTGAATGCATGTCTGGTAACGAGAACATGTGTCTGGCTGCGGGTCGTACTGCTATGCCACCGTGTCCAGGTCTTGGTCCAGAAGGTGGTATGGCTGAATACGTGAAGATCCCGGCACGTAGCTTCGTTCCGATCGGTGACCTGGACTTTCTGCAAGCAGCACCGTTGGCTGATGCAGCTCTGACCAGCTACCACGCAATCCGTGGTGCACGTGAACACCTGCAACCAGGTGCAACCGCTGTTGTTATCGGTGTTGGTGGTCTGGGTCACGTTGCTGTTCAGATTCTGCGTGCGATCTCTGCGGTACGTATCATCGCTGTTGACGTTGGTCAAGATCAGCTGGATCTGGCGAAACGTTGCGGTGCAGACATCACTCTGGAATCTGGTCCAGATACCGCGCAGCACATCTTGGACCTGACCTCTGCGCGTGGTGCTGAAGTTATCTTCGACTTCGTTGGTATCGACGCTACCGCTCAGATGTCTGTTCAGGCAGTTGCTCCAAACGGTGCGTACCGTATGGTGGGTCTGGGTGGTGGTAATCCGGGTATCACCGCGGAAGCAGCAGGTGGTCCAGGTTGGCCTTGGGGTGCATCTATCCGCAAATCTTACGGTGGTACTCGTAACGACCTGGTTGACTCTATCGCACTGGCTCAGGCTGGTCTGGTTACCGTTGAAGTTGCGCGTTTCGATCTGGCTGACGCTCGTGATGCACTGGATCGTCTGGAACACGGCAAAGTTACTGGTCGTGCTGTTCTGGTTCCAtaa，如SEQ ID NO.12所示。
EVBA 氨基酸序列为：
MSNRLDGKVAIVTGGTLGIGLAIATKFVEEGAKVMITGRHSDVGEKAAKSVGTPDQIQFFQHDSSDEDGWTKLFDATEKAFGPVSTLVNNAGIAVNKSVEETTTAEWRKLLAVNLDGVFFGTRLGIQRMKNKGLGASIINMSSIEGFVGDPSLGAYNASKGAVRIMSKSAALDCALKDYDVRVNTVHPGYIKTPLVDDLPGAEEAMSQRTKTPMGHIGEPNDIAYICVYLASNESKFATGSEFVVDGGYTAQ，如SEQ ID NO.13所示。
EVBA 氨基酸密码子优化后核酸序列为：
ATGTCCAACCGTCTGGATGGTAAAGTAGCCATCGTGACTGGTGGTACTCTGGGTATCGGCCTGGCTATCGCGACCAAATTCGTGGAAGAAGGTGCAAAGGTGATGATCACCGGCCGTCATAGCGACGTAGGTGAGAAAGCGGCGAAATCCGTAGGTACGCCGGATCAGATCCAGTTCTTCCAGCACGACAGCTCTGACGAAGATGGTTGGACCAAACTGTTCGACGCTACTGAGAAAGCGTTTGGTCCGGTGTCTACCTTGGTTAACAACGCGGGTATCGCGGTTAACAAATCCGTGGAAGAAACCACCACCGCAGAATGGCGTAAACTGCTGGCAGTTAACCTGGACGGTGTCTTCTTCGGCACCCGTCTGGGCATCCAGCGTATGAAGAACAAAGGTCTGGGTGCGTCCATCATCAACATGTCCAGCATCGAAGGTTTCGTAGGTGATCCAAGCCTGGGTGCTTACAACGCGTCTAAAGGTGCTGTTCGTATCATGAGCAAATCTGCTGCACTGGACTGTGCGCTGAAAGATTACGATGTGCGTGTGAACACCGTTCATCCGGGTTACATCAAGACTCCGTTGGTTGACGACCTGCCGGGCGCAGAAGAAGCTATGTCTCAGCGTACCAAAACTCCGATGGGCCATATCGGTGAACCGAACGACATCGCGTACATCTGCGTTTACCTGGCATCCAACGAATCCAAATTCGCTACTGGTAGCGAGTTCGTTGTTGACGGTGGCTATACCGCTCAGtaa，如SEQ ID NO.14所示。
LACO 氨基酸序列为：
MAERLAGKVALITGGTKGIGLGCAQHFVAEGAKVVITGRNPDTGKKALADINAPEAAVFMQQDTSDDQQWQQIIKAVQDRFGHLDILVNNAGICFFKDVEHTTTEEWRKLLGINLDGVFFGTKYAMIAMKEHGGSIINMCSIEGLIGEPMLAAYNASKGGVRLFSKSAALYAAKQGYNVRVNTVHPGYIHTPLVDVAPDVVEHEERLTPMGHLGEPSDIANICVYLASDEAKFATGSEFVVDGGYTAQ，如SEQ ID NO.15所示。
LACO 氨基酸密码子优化后核酸序列为：
ATGGCTGAACGTCTGGCGGGTAAAGTGGCTCTGATCACTGGTGGCACCAAAGGTATCGGTTTGGGTTGCGCGCAGCACTTCGTGGCGGAAGGTGCGAAAGTGGTTATCACTGGTCGTAACCCGGATACCGGCAAGAAAGCTCTGGCAGATATCAACGCTCCGGAAGCTGCGGTGTTCATGCAGCAAGACACCAGCGACGATCAGCAGTGGCAGCAGATCATCAAAGCGGTTCAAGATCGTTTCGGTCACCTGGACATCTTGGTTAACAACGCGGGCATCTGCTTCTTCAAAGACGTTGAACACACTACCACCGAAGAATGGCGTAAATTGCTGGGTATCAACCTGGACGGCGTCTTCTTCGGTACGAAATACGCGATGATCGCGATGAAAGAACATGGTGGCTCTATCATCAACATGTGCTCCATCGAAGGTCTGATCGGTGAACCGATGCTGGCCGCGTACAACGCCTCCAAAGGTGGTGTTCGTCTGTTCAGCAAATCTGCTGCACTGTACGCTGCCAAACAGGGTTACAACGTTCGCGTTAACACTGTGCATCCAGGCTACATCCACACTCCACTGGTTGACGTTGCGCCGGATGTTGTTGAACACGAAGAACGTCTGACGCCAATGGGTCACCTGGGCGAACCGAGCGACATCGCGAACATCTGCGTGTACCTGGCGTCCGACGAAGCGAAATTCGCGACTGGTTCCGAATTTGTGGTTGATGGTGGCTACACCGCTCAGtaa，如SEQID NO.16所示。
粗酶液制备
挑取单克隆到100mL 摇瓶带有20mL LB（0.5% 酵母粉，1%蛋白胨，1% NaCl）培养基中，37℃，220r摇床过夜培养作为种子液，按1%接种量转接种子液进入500mL 摇瓶带有100mL TB培养基中，37℃，220r摇床培养至OD600到0.8~1，加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mM，25℃，220r摇床过夜培养。然后用离心机12000r离心收集菌体。将收集的菌体用10mLpH7.5，Tris-HCl 缓冲液重悬，通过超声破碎仪进行细胞破碎，参数设定，在冰上进行400W，10s 超声 10s间隔，超声10min。然后离心获得粗酶液。
酶筛选反应体系建立
总反应体系5mL：1 mg/L NAD(P)H、20mM Mg2+、1 mL 酶液、100 mM β-丙酮木糖苷，用pH7.5、Tris-HCl 缓冲液调整反应体系至5mL。25℃反应6~8h，然后加入500μl 20%的醋酸溶液终止反应，12000r离心去除杂质，取上清使用0.22μm有机系滤膜抽滤过膜处理得到进样样品，进行液相分析检测。结果表明基因pET30a-ADH4、pET30a-ADHR、pET30a-EVBA、pET30a-LACO均能催化该反应得到产物(S)羟丙基四氢吡喃三醇(玻色因)，如图1~6所示，其中基因pET30a-EVBA，具有高催化活性，高转化率。液相色谱结果如下：基因ADH4具有极低的转化率，基因ADHR具有相对较高的转化率，但与基因EVBA相比仍有差距，对于基因LACO来说其转化率仅有50%左右。
液相分析
液相色谱检测所用的流动相为：色谱级乙腈750mL，使用ddH2O定容至1L。使用0.22μm有机系滤膜抽滤过膜处理。将过膜后的流动相超声脱气30min，去除其中的气泡，所得即为流动相。液相色谱仪为赛默飞液相U3000，检测器为示差检测器，检测色谱柱为OSAKASODA CAPCELL PAK NH2液相色谱柱(250× 4.6/5μm)柱，流动相流速为1mL/min，进样量为20μL，检测温度为35℃。
试剂配制
LB培养基：10g NaCl、10g 蛋白胨、5g酵母粉，加去离子水至1L 调pH 7.0-7.2 分装灭菌。
TB培养基：去离子水加至 900 ml，添加胰蛋白胨 12 g、酵母提取物 24 g、甘油 4ml摇动容器使溶质完全溶解，高压下蒸汽灭菌20 min。当溶液冷却至 60°C或 60°C以下时加入100 ml无菌的磷酸缓冲液。该溶液的配置方法是：用90 ml 去离子水溶解2.31 gKH2PO4和12.54 g K2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至 100 ml，高压下蒸汽灭菌 20min 。
50Mm Tris-HCl缓冲液：称6g的tris-base，加水至900mL，加HCl调至7.5，补水至1L。
酶催化放大小试实验
根据筛选结果，选取高酶活，高专一性合成S-玻色因的基因进行放大实验。通过5L发酵罐进行大量酶蛋白的制备，反应体系扩大到1L，将100g的湿菌体制备成粗酶液并全部投入反应，分别添加500mM、800mM、1000mM的底物β-丙酮木糖苷，以及40mM Mg2+、0.5mM NADP+，用pH7.5、Tris-HCl 缓冲液调整反应体系至1L，25℃反应8h。在此过程中为实现低浓度NADPH再生，本实施例引入了葡萄糖脱氢酶BmGDH来实现辅酶NADPH再生，因此同样100g的湿菌体制备成粗酶液（表达菌株构建与上述一致）全部投入反应。所述反应式如下：
结果表明，底物β-丙酮木糖苷添加量为500mM时，8h、25℃反应完全，底物转化率为99.95%以上，底物β-丙酮木糖苷添加量为800mM时，8h、25℃反应，转化率99.3%，底物β-丙酮木糖苷添加量为1000mM时，8h、25℃反应，底物转化率94.1%。因此优选底物浓度800mM左右时，底物β-丙酮木糖转化效率更高。产品S/R异构体比例为99.935/0.065，如图7所示。
BmGDH氨基酸序列为：
MYKDLEGKVVVITGSSTGLGKSMAIRFATEKAKVVVNYRSKEDEANSVLEEIKKVGGEAIAVKGDVTVESDVINLVQSAIKEFGKLDVMINNAGLENPVSSHEMSLSDWNKVIDTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGTVINMSSVHEKIPWPLFVHYAASKGGMKLMTKTLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPEQRADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASSEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG，如SEQ ID NO.17所示。
BmGDH氨基酸密码子优化后核酸序列为：
ATGTACAAGGATCTGGAAGGTAAAGTAGTAGTTATTACTGGTAGCTCTACTGGCCTGGGTAAATCTATGGCCATCCGTTTCGCGACCGAGAAGGCGAAAGTGGTAGTCAACTACCGCTCTAAGGAAGATGAAGCGAACTCCGTCCTGGAAGAAATCAAAAAAGTGGGTGGCGAAGCAATCGCAGTCAAGGGCGATGTTACTGTAGAATCCGACGTTATCAACCTGGTTCAGTCCGCAATCAAAGAGTTCGGCAAACTGGACGTTATGATCAACAATGCGGGTCTGGAAAACCCGGTGTCTTCCCACGAAATGTCCCTGTCTGATTGGAACAAGGTTATCGATACGAACCTGACGGGTGCATTCCTGGGCTCCCGTGAAGCGATTAAGTATTTCGTCGAAAATGACATCAAAGGCACCGTAATCAACATGTCTTCTGTGCACGAGAAAATCCCGTGGCCACTGTTTGTTCACTATGCGGCGTCCAAGGGTGGTATGAAACTGATGACGAAAACCCTGGCGCTGGAATACGCACCGAAAGGTATCCGTGTTAACAATATCGGTCCGGGTGCCATCAATACCCCGATCAACGCAGAGAAGTTCGCTGATCCAGAACAGCGTGCGGATGTTGAATCCATGATCCCTATGGGTTATATCGGCGAACCAGAAGAAATTGCAGCGGTCGCTGCGTGGCTGGCTTCTTCCGAGGCCAGCTACGTAACGGGTATTACCCTGTTCGCGGACGGTGGTATGACTCTGTATCCGAGCTTCCAAGCTGGCCGTGGTtaa，如SEQ ID NO.18所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，其特征是，以β-丙酮木糖苷作为反应原料，以氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的酶作为催化酶，添加还原型辅酶进行酶催化合成反应获得S-玻色因。
2.如权利要求1所述的酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，其特征是，催化酶由含有EVBA编码基因的工程菌进行发酵培养获得。
3.如权利要求2所述的酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，其特征是，EVBA编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
4.如权利要求2所述的酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，其特征是，所述工程菌中，负载EVBA编码基因的载体为质粒。
5.如权利要求2所述的酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，其特征是，将所述工程菌依次采用LB培养基和TB培养基进行培养，然后添加诱导剂IPTG继续培养，将收集的菌体重悬后进行细胞破碎，获得的粗酶液作为催化酶的添加形式。
6.如权利要求1所述的酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，其特征是，反应温度为20~30 ℃，反应时间为6~8 h；
或，反应体系中含有Mg2+。
7.如权利要求1所述的酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，其特征是，反应体系中，β-丙酮木糖苷的浓度为500~1000 mM。
8.如权利要求1所述的酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，其特征是，采用pH7.2~7.6的Tris-HCl缓冲液调整反应体系的反应体积。
9.如权利要求2所述的酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，其特征是，所述辅酶为还原型辅酶II。
10.如权利要求1所述的酶催化高效合成高纯度S-玻色因的方法，其特征是，反应体系中添加葡萄糖脱氢酶BmGDH。
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2024
- 2024-02-20 CN CN202410187482.XA patent/CN117737149B/zh active Active
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