CN111019915B - 羰基还原酶突变体在手性邻位卤代-α-苯乙醇合成中的应用 - Google Patents

羰基还原酶突变体在手性邻位卤代-α-苯乙醇合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了羰基还原酶突变体在手性邻位卤代‑α‑苯乙醇合成中的应用，一种羰基还原酶BaSDR1的突变体，突变体为以羰基还原酶BaSDR1的氨基酸序列SEQ ID No.2为基础，在139位谷氨酰胺和253位天冬氨酸单点位突变或双点位突变得到。该羰基还原酶BaSDR1的突变体及其重组工程菌酶活性，为手性邻位卤代‑α‑苯乙醇的合成提供强有力的生物催化剂。

Description

羰基还原酶突变体在手性邻位卤代-α-苯乙醇合成中的应用
【技术领域】
本发明属于生物催化和蛋白质工程技术领域，尤其涉及羰基还原酶突变体在 手性邻位卤代-α-苯乙醇合成中的应用。
【背景技术】
手性邻位卤代-α-苯乙醇因具有手性碳羟基紧邻芳香环卤素的特殊结构，又兼 具手性醇、芳香环和卤素各自独特的生物化学性质而成为手性药物合成的重要中 间体。作为重要的手性合成砌块，手性邻位卤代-α-苯乙醇同样被广泛应用于精细 化学品、农用化学品和香精香料等高附加值化学产品的合成。手性邻位卤代-α- 苯乙醇类化合物在手性合成领域所扮演的重要角色使其成为手性化合物市场最 重要的手性砌块之一，拥有广阔的市场和应用前景。因此，手性邻位卤代-α-苯乙 醇的合成工艺开发成为业界研究的热点。
潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法，理论上能将底物100％转化为单一对映体的手性醇，具有很高的工业应用价值。与化学法不对称 还原相比，生物催化法在化学选择性、区域选择性和立体选择性方面更具优势， 产物光学纯度高；此外，生物催化通常在温和条件下进行，避免了剧烈化学反应 过程中异构化、消旋和重排等现象的发生。另一方面，利用生物法不对称合成实 现全化学合成工艺的过程替代，能够有效减少有害过渡金属催化剂和有机溶剂反 应介质的使用量，显著提高工艺路线的原子经济性，降低过程的环境因子。选择 性优良、反应条件温和及环境友好等特点使生物催化技术成为体现绿色化学理念 的“典范”，化学家和过程工程师已将其作为化学品合成和化学反应过程替代的重 要备选工具。因此，生物催化不对称还原潜手性酮成为最受瞩目的手性醇绿色合 成技术之一。
虽然生物催化不对称还原合成手性醇已被广泛认可且有诸多成功的工业化 范例，但是，目前所报道能够催化邻位卤代苯乙酮不对称还原合成手性邻位卤代 -α-苯乙醇的羰基还原酶数量屈指可数，且存在催化活性低、立体选择性差和底物 谱窄等问题，根本无法满足手性邻位卤代-α-苯乙醇工业化生产的要求和市场对多 样化手性邻位卤代-α-苯乙醇合成用酶的需求。前期筛选得到一株能够立体选择性 催化邻位卤代苯乙酮还原的菌株Bacillus aryabhattai NWPU-1801，保藏于中国典 型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M 2018700；并从其基因组中挖掘并 克隆表达了能够高立
体选择性还原邻位卤代苯乙酮的羰基还原酶BaSDR1(专利公开号CN110129382A)。但是，该羰基还原酶的催化活性远不能满足工业化生产要求， 因此，有必要通过相关技术提高该酶的催化效率以充分挖掘其应用价值。
【发明内容】
本发明的目的是提供羰基还原酶突变体在手性邻位卤代-α-苯乙醇合成中的 应用，羰基还原酶BaSDR1的突变体及其重组工程菌酶活性，为手性邻位卤代-α- 苯乙醇的合成提供强有力的生物催化剂。
本发明采用以下技术方案：一种羰基还原酶BaSDR1的突变体，突变体为以 羰基还原酶BaSDR1的氨基酸序列SEQ ID No.2为基础，在139位谷氨酰胺和253 位天冬氨酸单点位突变或双点位突变得到。
进一步地，是将139位谷氨酰胺突变为丝氨酸，突变体的核苷酸序列如序列 表中SEQ ID No.3所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。
进一步地，是将253位天冬氨酸突变为酪氨酸，突变体的核苷酸序列如序列 表中SEQ ID No.5所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示。
进一步地，是将139位谷氨酰胺突变为丝氨酸和253位天冬氨酸突变为酪氨 酸，突变体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示，其编码氨基酸序列如序 列表SEQ IDNo.8所示。
本发明还公开了一种重组表达载体，包含上述的一种羰基还原酶的突变体的 核苷酸序列。
本发明还公开了一种表达重组羰基还原酶突变体的基因工程菌，由上述的一 种重组表达载体转换至宿主微生物中获得。
上述的一种羰基还原酶BaSDR1的突变体或一种重组表达载体或一种表达 重组羰基还原酶突变体的基因工程菌在手性邻位卤代-α-苯乙醇合成中的应用。
进一步地，以式I的邻位卤代苯乙酮为底物，羰基还原酶BaSDR1的突变体 纯酶、或重组表达载体、或基因工程菌为催化剂，于pH 5.5～10的缓冲液构成的 转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化即得；其中，当选用羰基 还原酶BaSDR1的突变体纯酶为催化剂时，还需加入辅酶NADH；
Figure BDA0002266034570000031
其中，X为F，Cl和Br中的一种；R1为卤素。
本发明还公开了上述的一种羰基还原酶的突变体的制备方法，该方法包括如 下：培养羰基还原酶突变体的重组表达转化体，诱导获得重组羰基还原酶突变体 蛋白；其中，培养重组表达转化体所用的培养基为LB培养基，包括如下：蛋白 胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2；将重组大肠杆菌接种至含卡那 霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，在终浓度 为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即得。
本发明的有益效果是：1.提供了催化活性显著提高的羰基还原酶突变体及其 核苷酸序列，以及含有相应突变体基因的重组表达载体和重组工程菌，通过这些 羰基还原酶突变体或含有相应突变体蛋白的重组细胞不对称还原可制备高光学 纯度的手性邻位卤代-α-苯乙醇。2.该羰基还原酶突变体或含有突变体蛋白的重组 细胞不对称还原制备手性邻位卤代-α-苯乙醇具有高催化活性和高立体选择性，能 够合成高光学纯度的手性邻位卤代-α-苯乙醇(ee>99％)。3.在合成手性邻位卤代-α- 苯乙醇时，易于制备、反应条件温和、底物适应性广、环境友好，且其重组细胞 能够在不外加任何辅酶的含葡萄糖反应体系中高效催化潜手性酮的不对称还原， 具有很好的工业化应用开发前景。
【具体实施方式】
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明公开了一种羰基还原酶BaSDR1的突变体，突变体为以羰基还原酶 BaSDR1的氨基酸序列SEQ ID No.2为基础，在139位谷氨酰胺和253位天冬氨 酸单点位突变或双点位突变得到。该羰基还原酶核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
当是将139位谷氨酰胺突变为丝氨酸，突变体的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.3所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。
当是将253位天冬氨酸突变为酪氨酸，突变体的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.5所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示。
当是将139位谷氨酰胺突变为丝氨酸和253位天冬氨酸突变为酪氨酸，突变 体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示。任何对上述突变体氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一 个或几个氨基酸且具有邻位卤代苯乙酮不对称还原活性的，仍属于本发明的保护 范围。
本发明公开了一种重组表达载体，包含上述的一种羰基还原酶的突变体的核 苷酸序列。重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明的羰基还原酶突变体核 苷酸序列连接于各种载体上构建而成。载体可为本领域常规的各种载体，如各种 质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-30a。
本发明公开了一种表达重组羰基还原酶突变体的基因工程菌，由上述的一种 重组表达载体转换至宿主微生物中获得。宿主微生物可为本领域常规的各种宿主 微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的羰基还原 酶突变体基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
上述一种羰基还原酶BaSDR1的突变体或一种重组表达载体或一种表达重组 羰基还原酶突变体的基因工程菌在手性邻位卤代-α-苯乙醇合成中的应用。具体 的，以式I的邻位卤代苯乙酮为底物，羰基还原酶BaSDR1的突变体纯酶、或重 组表达载体、或基因工程菌为催化剂，于pH 5.5～10的缓冲液构成的转化反应体 系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化即得；其中，当选用羰基还原酶BaSDR1 的突变体纯酶为催化剂时，还需加入辅酶NADH；
Figure BDA0002266034570000061
其中，X为F，Cl和Br中的一种；R1为卤素。
该转化反应体系中潜手性邻位卤代苯乙酮底物的初始浓度为5～300mmol/L； 羰基还原酶的浓度为0.1～2.0mg/mL，或者含有羰基还原酶突变体的工程菌菌体 用量以菌体湿重计为10～400g/L。优选地，反应在pH 7.5的缓冲液中进行。
该转化反应体系中还添加有质量浓度为1～50％的醇或糖作为辅底物。糖为葡 萄糖，葡萄糖的质量浓度为5％(w/w)。
上述转化反应液分离纯化方法为：反应结束后，将转化反应液离心，取上清 液用等体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含相应手性邻位卤代-α-苯乙醇的粗品， 将粗品提纯即获得相应手性邻位卤代-α-苯乙醇。粗品提纯的方法为本领域公知技 术，通常为有机溶剂萃取、色谱分离和吸附分离等。
上述一种羰基还原酶BaSDR1的突变体的制备方法，其特征在于，该方法包 括如下：培养羰基还原酶突变体的重组表达转化体，诱导获得重组羰基还原酶突 变体蛋白；其中，培养重组表达转化体所用的培养基为LB培养基，包括如下： 蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2；将重组大肠杆菌接种至含 卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，在终 浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即得。上述 的反应条件可按本领域所用的常规条件进行选择，只要使转化体能够生长并产生 羰基还原酶突变体蛋白即可。
在文中，Gln139指代139位谷氨酰胺，Asp253指代253位天冬氨酸，Q139S 表示将139位谷氨酰胺突变为丝氨酸的突变体，D253Y表示将253位天冬氨酸突 变为酪氨酸的突变体；Q139S/D253Y表示将将139位谷氨酰胺突变为丝氨酸、253 位天冬氨酸突变为酪氨酸的组合双点位突变的突变体。
实施例1：上述突变体的构建：
以含有突变点的寡核苷酸片段为引物，如表1所示，采用QuickChangeTM 方法扩增含有羰基还原酶BaSDR1基因的pET-30a重组质粒。
表1突变体构建引物
Figure BDA0002266034570000071
a下划线标示为突变位点。
PCR反应体系：上游引物10μM，1.0μL；下游引物10μM，1.0μL；重组 质粒模板，10ng；PrimerSTAR Max DNA Polymerase(2X)，12.5μL；加ddH2O 至总体积为25μL。
PCR程序：步骤(1)98℃，1min；步骤(2)98℃，10s；步骤(3)55℃，10s； 步骤(4)72℃，6min。步骤(2)-(4)循环15次后冷却至4℃。得PCR产物。
PCR产物经清洗后，利用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶DpnI进行 消化以降解模板质粒。酶切反应体系及条件：17μL经清洗处理的PCR产物，2.0 μL 10×缓冲液，1.0μL限制性内切酶DpnI，37℃保温1h。
将上述经酶切处理的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的 重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进 行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有羰基还原酶突变体基因的重组表达 载体成功转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中。最终获得突变体Q139S、D253Y 和Q139S/D253Y核苷酸序列，测序结果分别如序列表中SEQ ID No.3、SEQ ID No. 5和SEQ ID No.7所示，相应编码蛋白质氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4、 SEQ ID No.6和SEQ ID No.8所示。
实施例2：上述羰基还原酶突变体的诱导表达：
将实施例1构建的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中， 37℃培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种到含50μg/mL卡那霉素的50mL LB 培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，30℃诱导培养6h后，4℃、4000rpm离心10min收集菌体细胞， 于-80℃贮存备用。
实施例3：羰基还原酶突变体的分离纯化：
由实施例2收集的菌体细胞悬浮于10mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液100 mM，pH 8.0中，振荡摇匀后置超声波下破碎，有效时间10min。破碎液于12,000 rpm离心15min去除细胞碎片，收集上清液，即为粗酶液，用于酶的后续的分离 纯化。纯化柱为Ni-NTA，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液20mM磷酸 钠，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 7.4平衡Ni-NTA柱，以5mL/min的速率 上样粗酶液，用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液， 20mM磷酸钠，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4洗脱收集目标蛋白。酶液 用HiTrap脱盐柱进行脱盐，脱盐缓冲液为Na2HPO4-NaH2PO4 100 mM,pH 7.5 缓冲液，所得纯酶液于4℃贮存备用。
实施例4：羰基还原酶BaSDR1及其突变体的比活：
反应体系总体积为1.0mL，包括：10mM邻位卤代苯乙酮，2mM NADH， 5％(w/w)葡萄糖，1.0mM Co2+，Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液100mM,pH 7.5和适 量的纯酶。酶活单位U的定义为：35℃下，每分钟催化1μmol底物还原所需的 酶量；比活为每毫克蛋白所具有的酶活U/mg。底物分别为2’-氟苯乙酮1a，2’ -氯苯乙酮2a，2’-溴苯乙酮3a，2’,3’-二氟苯乙酮4a，2’,4’-二氟苯乙酮5a， 2’,5’-二氟苯乙酮6a，2’,6’-二氟苯乙酮7a，2’-氟-3’-氯苯乙酮8a，2’-氟-4’-氯苯乙酮9a，2’-氟-3’-溴苯乙酮10a，2’-氟-4’-溴苯乙酮11a。羰基 还原酶BaSDR1及其突变体催化相应底物比活和立体选择性如表2所示。由表2 可知，与羰基还原酶相比，羰基还原酶突变体的比活比羰基还原酶的比活高，则 突变体催化活性提高明显，且立体选择性未受影响。
表2羰基还原酶BaSDR1及其突变体催化活性
Figure BDA0002266034570000091
Figure BDA0002266034570000101
实施例5：羰基还原酶BaSDR1及其突变体的动力学参数：
在标准条件下，通过改变反应体系中底物的浓度进行酶活力测定，根据双倒 数作图法计算相应的动力学常数。动力学常数计算中所用底物为2’-氟苯乙酮 1a，2’-氯苯乙酮2a，2’-溴苯乙酮3a，2’,3’-二氟苯乙酮4a，2’,4’-二氟 苯乙酮5a，2’,5’-二氟苯乙酮6a，2’,6’-二氟苯乙酮7a，2’-氟-3’-氯苯乙 酮8a，2’-氟-4’-氯苯乙酮9a，2’-氟-3’-溴苯乙酮10a，2’-氟-4’-溴苯乙酮 11a。底物浓度为2.5～20mM。野生型BaSDR1及其突变体催化相应底物的表观 动力学参数如表3所示。结果表明，对大多数底物而言，还原酶突变体表现出较还原酶更低的Km值，说明底物与还原酶突变体之间的亲和性增加。相对羰基还 原酶BaSDR1而言，还原酶突变体的Kcat/Km值均显著提高，催化效率显著提高。
表3 BaSDR1及其突变体不对称还原潜手性酮表观动力学参数
Figure BDA0002266034570000102
Figure BDA0002266034570000111
实施例6：羰基还原酶BaSDR1及其突变体Q139S/D253Y转化高浓度2’-氯 苯乙酮：
反应体系总体积为10.0mL，包括：0.4g湿菌体细胞，100mM 2’-氯苯乙酮， 5％(w/w)葡萄糖，1.0mM Co2+，10.0mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液100mM,pH 7.5。于35℃，200rpm条件下反应。羰基还原酶BaSDR1重组大肠杆菌全细胞 催化活性明显低于突变体Q139S/D253Y，反应5.5h后，突变体Q139S/D253Y全 细胞催化反应产率达到95％以上，而羰基还原酶BaSDR1反应组产率仅为49.5％； 反应8h后，羰基还原酶BaSDR1重组大肠杆菌全细胞催化反应速率下降明显， 至13h，转化率仅达到70.1％。此外，突变体Q139S/D253Y催化高浓度底物转 化时仍然展现出良好的立体选择性，产物ee值保持99％以上。突变体 Q139S/D253Y全细胞能够在无外源辅酶添加的情况下，以葡萄糖作为辅底物实现 辅酶循环，有效催化高浓度2’-氯苯乙酮不对称还原，表明该全细胞生物催化剂 具有工业化应用前景。
实施例7：羰基还原酶BaSDR1及其突变体Q139S转化高浓度2’,4’-二氟苯 乙酮：
反应体系总体积为10.0mL，包括：0.4g湿菌体细胞，100mM 2’,4’-二氟苯 乙酮，5％(w/w)葡萄糖，1.0mM Co2+，10.0mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液100mM, pH 7.5，于35℃，200rpm条件下反应。羰基还原酶BaSDR1重组大肠杆菌全细 胞催化活性明显低于突变体Q139S，反应7h后，突变体Q139S全细胞催化反应 产率达到95％以上，而羰基还原酶BaSDR1反应组产率仅为44.2％；反应8.5h 后，羰基还原酶BaSDR1重组大肠杆菌全细胞催化反应转化率不再增加，至13h， 转化率仅达到54.1％。此外，突变体Q139S催化高浓度底物转化时仍然展现出良 好的立体选择性，产物ee值保持99％以上。突变体Q139S全细胞能够在无外源辅酶添加的情况下，以葡萄糖作为辅底物实现辅酶循环，有效催化高浓度2’,4’- 二氟苯乙酮不对称还原，表明该全细胞生物催化剂具有工业化应用前景。
实施例8：羰基还原酶BaSDR1及其突变体D253Y转化高浓度2’,6’-二氟苯 乙酮：
反应体系总体积为10.0mL，包括：0.4g湿菌体细胞，100mM 2’,6’-二氟苯 乙酮，5％(w/w)葡萄糖，1.0mM Co2+，10.0mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液100mM， pH 7.5。于35℃，200rpm条件下反应。羰基还原酶BaSDR1重组大肠杆菌全细 胞催化活性明显低于突变体D253Y，反应1h后，突变体D253Y全细胞催化反 应产率达到95％以上，而羰基还原酶BaSDR1反应组产率仅为41.3％；反应2.5h 后，羰基还原酶BaSDR1重组大肠杆菌全细胞催化反应转化率达到96.4％。此外， 突变体Q139S/D253Y催化高浓度底物转化时仍然展现出良好的立体选择性，产 物ee值保持99％以上。突变体D253Y全细胞能够在无外源辅酶添加的情况下，以葡萄糖作为辅底物实现辅酶循环，有效催化高浓度2’,6’-二氟苯乙酮不对称还 原，表明该全细胞生物催化剂具有工业化应用前景。
SEQ ID No.1如下：
Figure BDA0002266034570000131
Figure BDA0002266034570000141
SEQ ID No.2如下：
Figure BDA0002266034570000142
SEQ ID No.3如下：
Figure BDA0002266034570000143
Figure BDA0002266034570000151
SEQ ID No.4如下：
Figure BDA0002266034570000152
SEQ ID No.5如下
Figure BDA0002266034570000153
Figure BDA0002266034570000161
SEQ ID No.6如下：
Figure BDA0002266034570000162
Figure BDA0002266034570000171
SEQ ID No.7如下：
Figure BDA0002266034570000172
SEQ ID No.8如下：
Figure BDA0002266034570000181
<110> 西北工业大学深圳研究院 西北工业大学
<120> 羰基还原酶突变体在手性邻位卤代-α-苯乙醇合成中的应用
<130> 无
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> SEQ ID No.1
<211> 885
<212> 核苷酸
<213> 人工序列
<400> SEQ ID No.1
ATGTCAAAGT TAAATAATCC ATTAACTCAA TATTTCCATG AAGACTATCC 50
AAAACAGTAT CAAGAACCGC CCGGTGTACA GAAAGAAATG AACGTCATCC 100
CGGACTGCGG GGAAAACAGT TACATAGGTG CAGGTAAATT AAAAGGCAGA 150
AAAGCTCTTG TGACGGGTGG AGATTCAGGT ATTGGCCGGG CAGCAGCGAT 200
CGCTTACGCA AGAGAAGGTG CAGACGTTGC GCTTAATTAC TTGCCACAAG 250
AGCAAGCAGA TGCAGAAGAA GTACAAAAGC TTATTGAAGC AGAAGGAAGA 300
AAAGCCGTTC TCATACCTGG TGATGTAGGC GAAGAATCTT TTTGCAAAGA 350
GCTAGTAGAA AAAGCTTATA AAGAATTAGA TGGTTTAGAT GTTCTAGCGC 400
TCGTAGCTGG CAAACAGCAG GCAGTAGAAG ATATTGCTGA TTTAGAAACG 450
GACCAACTGC GCAAAACCTT TGAAGTAAAT GTATTCTCTT TATATTGGAC 500
CGTAAAAGCA GCGCTGCCTT ATTTACCGGC AGGTGCTTCT ATTATTACCA 550
CAAGTTCTGT ACAAGGCTAT AGCCCAAGTC CTAATTTATT AGACTATGCA 600
GCTACAAAGT TTGCCATTAA CGGATTCACT CGCGGACTAG CCAAGCAATT 650
AGCTCCAAAA GGTATTCGCG TCAACTCCGT TGCTCCAGGA CCTATCTGGA 700
CGCCGCTGCA AATTTCTGGA GGGCAGCCAA GCGACGCTAT TCCAGGCTTT 750
GGACAAGATA CACCTTTGCA GCGTGCTGGT CAGCCGGTAG AGTTAGCAAA 800
TGTATACGTA TTTTTAGCTT CAACGGATGC AAGCTACGTA ACAGCTCAAG 850
TTTACGGGAT TACAGGCGGA ATAGAACTAG CTTAA 885
<210> SEQ ID No.2
<211> 294
<212> 氨基酸
<213> 人工序列
<400> SEQ ID No.2
MSKLNNPLTQ YFHEDYPKQY QEPPGVQKEM NVIPDCGENS YIGAGKLKGR 50
KALVTGGDSG IGRAAAIAYA REGADVALNY LPQEQADAEE VQKLIEAEGR 100
KAVLIPGDVG EESFCKELVE KAYKELDGLD VLALVAGKQQ AVEDIADLET 150
DQLRKTFEVN VFSLYWTVKA ALPYLPAGAS IITTSSVQGY SPSPNLLDYA 200
ATKFAINGFT RGLAKQLAPK GIRVNSVAPG PIWTPLQISG GQPSDAIPGF 250
GQDTPLQRAG QPVELANVYV FLASTDASYV TAQVYGITGG IELA 294
<210> SEQ ID No.3
<211> 855
<212> 核苷酸
<213> 人工序列
<400> SEQ ID No.3
ATGTCAAAGT TAAATAATCC ATTAACTCAA TATTTCCATG AAGACTATCC 50
AAAACAGTAT CAAGAACCGC CCGGTGTACA GAAAGAAATG AACGTCATCC 100
CGGACTGCGG GGAAAACAGT TACATAGGTG CAGGTAAATT AAAAGGCAGA 150
AAAGCTCTTG TGACGGGTGG AGATTCAGGT ATTGGCCGGG CAGCAGCGAT 200
CGCTTACGCA AGAGAAGGTG CAGACGTTGC GCTTAATTAC TTGCCACAAG 250
AGCAAGCAGA TGCAGAAGAA GTACAAAAGC TTATTGAAGC AGAAGGAAGA 300
AAAGCCGTTC TCATACCTGG TGATGTAGGC GAAGAATCTT TTTGCAAAGA 350
GCTAGTAGAA AAAGCTTATA AAGAATTAGA TGGTTTAGAT GTTCTAGCGC 400
TCGTAGCTGG CAAAAGCCAG GCAGTAGAAG ATATTGCTGA TTTAGAAACG 450
GACCAACTGC GCAAAACCTT TGAAGTAAAT GTATTCTCTT TATATTGGAC 500
CGTAAAAGCA GCGCTGCCTT ATTTACCGGC AGGTGCTTCT ATTATTACCA 550
CAAGTTCTGT ACAAGGCTAT AGCCCAAGTC CTAATTTATT AGACTATGCA 600
GCTACAAAGT TTGCCATTAA CGGATTCACT CGCGGACTAG CCAAGCAATT 650
AGCTCCAAAA GGTATTCGCG TCAACTCCGT TGCTCCAGGA CCTATCTGGA 700
CGCCGCTGCA AATTTCTGGA GGGCAGCCAA GCGACGCTAT TCCAGGCTTT 750
GGACAAGATA CACCTTTGCA GCGTGCTGGT CAGCCGGTAG AGTTAGCAAA 800
TGTATACGTA TTTTTAGCTT CAACGGATGC AAGCTACGTA ACAGCTCAAG 850
TTTACGGGAT TACAGGCGGA ATAGAACTAG CTTAA 855
<210> SEQ ID No.4
<211> 294
<212> 氨基酸
<213> 人工序列
<400> SEQ ID No.4
MSKLNNPLTQ YFHEDYPKQY QEPPGVQKEM NVIPDCGENS YIGAGKLKGR 50
KALVTGGDSG IGRAAAIAYA REGADVALNY LPQEQADAEE VQKLIEAEGR 100
KAVLIPGDVG EESFCKELVE KAYKELDGLD VLALVAGKSQ AVEDIADLET 150
DQLRKTFEVN VFSLYWTVKA ALPYLPAGAS IITTSSVQGY SPSPNLLDYA 200
ATKFAINGFT RGLAKQLAPK GIRVNSVAPG PIWTPLQISG GQPSDAIPGF 250
GQDTPLQRAG QPVELANVYV FLASTDASYV TAQVYGITGG IELA 294
<210> SEQ ID No.5
<211> 885
<212> 核苷酸
<213> 人工序列
<400> SEQ ID No.5
ATGTCAAAGT TAAATAATCC ATTAACTCAA TATTTCCATG AAGACTATCC 50
AAAACAGTAT CAAGAACCGC CCGGTGTACA GAAAGAAATG AACGTCATCC 100
CGGACTGCGG GGAAAACAGT TACATAGGTG CAGGTAAATT AAAAGGCAGA 150
AAAGCTCTTG TGACGGGTGG AGATTCAGGT ATTGGCCGGG CAGCAGCGAT 200
CGCTTACGCA AGAGAAGGTG CAGACGTTGC GCTTAATTAC TTGCCACAAG 250
AGCAAGCAGA TGCAGAAGAA GTACAAAAGC TTATTGAAGC AGAAGGAAGA 300
AAAGCCGTTC TCATACCTGG TGATGTAGGC GAAGAATCTT TTTGCAAAGA 350
GCTAGTAGAA AAAGCTTATA AAGAATTAGA TGGTTTAGAT GTTCTAGCGC 400
TCGTAGCTGG CAAACAGCAG GCAGTAGAAG ATATTGCTGA TTTAGAAACG 450
GACCAACTGC GCAAAACCTT TGAAGTAAAT GTATTCTCTT TATATTGGAC 500
CGTAAAAGCA GCGCTGCCTT ATTTACCGGC AGGTGCTTCT ATTATTACCA 550
CAAGTTCTGT ACAAGGCTAT AGCCCAAGTC CTAATTTATT AGACTATGCA 600
GCTACAAAGT TTGCCATTAA CGGATTCACT CGCGGACTAG CCAAGCAATT 650
AGCTCCAAAA GGTATTCGCG TCAACTCCGT TGCTCCAGGA CCTATCTGGA 700
CGCCGCTGCA AATTTCTGGA GGGCAGCCAA GCGACGCTAT TCCAGGCTTT 750
GGACAATATA CACCTTTGCA GCGTGCTGGT CAGCCGGTAG AGTTAGCAAA 800
TGTATACGTA TTTTTAGCTT CAACGGATGC AAGCTACGTA ACAGCTCAAG 850
TTTACGGGAT TACAGGCGGA ATAGAACTAG CTTAA 885
<210> SEQ ID No.6
<211> 294
<212> 氨基酸
<213> 人工序列
<400> SEQ ID No.6
MSKLNNPLTQ YFHEDYPKQY QEPPGVQKEM NVIPDCGENS YIGAGKLKGR 50
KALVTGGDSG IGRAAAIAYA REGADVALNY LPQEQADAEE VQKLIEAEGR 100
KAVLIPGDVG EESFCKELVE KAYKELDGLD VLALVAGKQQ AVEDIADLET 150
DQLRKTFEVN VFSLYWTVKA ALPYLPAGAS IITTSSVQGY SPSPNLLDYA 200
ATKFAINGFT RGLAKQLAPK GIRVNSVAPG PIWTPLQISG GQPSDAIPGF 250
GQYTPLQRAG QPVELANVYV FLASTDASYV TAQVYGITGG IELA 294
<210> SEQ ID No.7
<211> 885
<212> 核苷酸
<213> 人工序列
<400> SEQ ID No.7
ATGTCAAAGT TAAATAATCC ATTAACTCAA TATTTCCATG AAGACTATCC 50
AAAACAGTAT CAAGAACCGC CCGGTGTACA GAAAGAAATG AACGTCATCC 100
CGGACTGCGG GGAAAACAGT TACATAGGTG CAGGTAAATT AAAAGGCAGA 150
AAAGCTCTTG TGACGGGTGG AGATTCAGGT ATTGGCCGGG CAGCAGCGAT 200
CGCTTACGCA AGAGAAGGTG CAGACGTTGC GCTTAATTAC TTGCCACAAG 250
AGCAAGCAGA TGCAGAAGAA GTACAAAAGC TTATTGAAGC AGAAGGAAGA 300
AAAGCCGTTC TCATACCTGG TGATGTAGGC GAAGAATCTT TTTGCAAAGA 350
GCTAGTAGAA AAAGCTTATA AAGAATTAGA TGGTTTAGAT GTTCTAGCGC 400
TCGTAGCTGG CAAAAGCCAG GCAGTAGAAG ATATTGCTGA TTTAGAAACG 450
GACCAACTGC GCAAAACCTT TGAAGTAAAT GTATTCTCTT TATATTGGAC 500
CGTAAAAGCA GCGCTGCCTT ATTTACCGGC AGGTGCTTCT ATTATTACCA 550
CAAGTTCTGT ACAAGGCTAT AGCCCAAGTC CTAATTTATT AGACTATGCA 600
GCTACAAAGT TTGCCATTAA CGGATTCACT CGCGGACTAG CCAAGCAATT 650
AGCTCCAAAA GGTATTCGCG TCAACTCCGT TGCTCCAGGA CCTATCTGGA 700
CGCCGCTGCA AATTTCTGGA GGGCAGCCAA GCGACGCTAT TCCAGGCTTT 750
GGACAATATA CACCTTTGCA GCGTGCTGGT CAGCCGGTAG AGTTAGCAAA 800
TGTATACGTA TTTTTAGCTT CAACGGATGC AAGCTACGTA ACAGCTCAAG 850
TTTACGGGAT TACAGGCGGA ATAGAACTAG CTTAA 885
<210> SEQ ID No.8
<211> 885
<212> 氨基酸
<213> 人工序列
<400> SEQ ID No.8
MSKLNNPLTQ YFHEDYPKQY QEPPGVQKEM NVIPDCGENS YIGAGKLKGR 50
KALVTGGDSG IGRAAAIAYA REGADVALNY LPQEQADAEE VQKLIEAEGR 100
KAVLIPGDVG EESFCKELVE KAYKELDGLD VLALVAGKSQ AVEDIADLET 150
DQLRKTFEVN VFSLYWTVKA ALPYLPAGAS IITTSSVQGY SPSPNLLDYA 200
ATKFAINGFT RGLAKQLAPK GIRVNSVAPG PIWTPLQISG GQPSDAIPGF 250
GQYTPLQRAG QPVELANVYV FLASTDASYV TAQVYGITGG IELA 294

Claims (6)

1.一种羰基还原酶BaSDR1的突变体，其特征在于，所述突变体为以羰基还原酶BaSDR1的氨基酸序列SEQ ID No.2为基础，在139位谷氨酰胺或253位天冬氨酸单点位突变得到，或在139位谷氨酰胺和253位天冬氨酸双点位突变得到；
具体为：是将139位谷氨酰胺突变为丝氨酸，所述突变体的核苷酸序列如序列表中SEQID No. 3所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 4所示；
是将253位天冬氨酸突变为酪氨酸，所述突变体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 6所示；
是将139位谷氨酰胺突变为丝氨酸和253位天冬氨酸突变为酪氨酸，所述突变体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 7所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 8所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1中所述的一种羰基还原酶的突变体的核苷酸序列。
3.一种表达重组羰基还原酶突变体的基因工程菌，其特征在于，由权利要求2中的一种重组表达载体转换至宿主微生物中获得。
4.根据权利要求1中所述的一种羰基还原酶BaSDR1的突变体或权利要求2中的一种重组表达载体或权利要求3中的一种表达重组羰基还原酶突变体的基因工程菌在手性邻位卤代-α-苯乙醇合成中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，以式I的邻位卤代苯乙酮为底物，所述羰基还原酶BaSDR1的突变体纯酶、或重组表达载体、或基因工程菌为催化剂，于pH 5.5~10的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化即得；其中，当选用羰基还原酶BaSDR1的突变体纯酶为催化剂时，还需加入辅酶NADH；
Figure 845349DEST_PATH_IMAGE001
(I)；
其中，X为F，Cl和Br中的一种；R1为氢或卤素。
6.根据权利要求1中所述的一种羰基还原酶突变体的制备方法，其特征在于，该方法包括如下：培养羰基还原酶突变体的重组表达转化体，诱导获得重组羰基还原酶突变体蛋白；其中，培养重组表达转化体所用的培养基为LB培养基，包括如下：蛋白胨10 g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.2；将重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5~0.7时，在终浓度为0.1~1.0 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG的诱导下，即得。
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