CN113817693A

CN113817693A - 一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体、编码基因、重组表达载体、基因工程菌及应用

Info

Publication number: CN113817693A
Application number: CN202111123587.1A
Authority: CN
Inventors: 于洪巍; 洪一鸣
Original assignee: Hangzhou Xinhai Enzyme Source Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Xinhai Enzyme Source Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-24
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2041-09-24
Also published as: CN113817693B

Abstract

本发明涉及睾酮制备技术领域，公开了可用于不对称催化制备睾酮的短链羰基还原酶PpYSDR突变体，该突变体由短链羰基还原酶PpYSDR的氨基酸序列的第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺、第88位亮氨酸突变为天冬酰胺、第136位亮氨酸突变为丙氨酸和第143位天冬氨酸突变为丙氨酸中的一种或几种后得到；短链羰基还原酶PpYSDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。上述突变得到的短链羰基还原酶PpYSDR的突变体具有很高的催化雄烯二酮转化成睾酮的活性，可以游离酶、固定化酶或重组游离细胞的形式催化合成睾酮，雄烯二酮的转化率高，睾酮的收率高，选择性高。

Description

一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体、编码基因、重组表达载体、基因工程菌及应用

技术领域

本发明涉及睾酮制备技术领域，具体涉及一种可用于不对称催化制备睾酮的短链羰基还原酶PpYSDR的突变体、突变体的编码基因、重组表达载体、基因工程菌及其具体应用。

背景技术

睾酮是由男性的睾丸或女性的卵巢分泌的类固醇荷尔蒙，其分子式为C₁₉H₂₈O₂，是一种分子量较小的细胞骨架联合蛋白，通过与其他细胞骨架蛋白间的相互结合发生作用，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。目前睾酮的体外制备方法主要是化学合成方法，即使用雄烯二酮(4-AD)合成睾酮，通常采用如下两种合成路线：

路线一:雄烯二酮选择性醚化后，用硼氢化钠或硼氢化钾进行还原，后加酸水解；

路线二:雄烯二酮先用硼氢化钠或硼氢化钾进行还原生成睾丸素及双醇混合物，后用MnO₂进行选择性氧化生成睾酮。

但化学合成涉及金属催化剂使用等，存在成本高、污染大、能耗高、投料量小等问题。

采用生物合成方法合成睾酮是一种新的发展方向，目前生物合成方主要有两类：一是通过水解酶或脂肪酶对睾酮酯进行水解生成睾酮，如专利号CA2767052C的加拿大专利使用

51032水解酶水解睾酮酯，可以做到产物浓度为25g/L；另一类则是通过固醇脱氢酶还原雄烯二酮合成睾酮的一步反应合成路线。如专利号ITMI20091168A1专利报道使用17位固醇脱氢酶与雄烯二酮反应生成睾酮底物浓度可以到10g/L。

但是生物合成法与化学合成法相比虽然更加绿色，但是产量小，且成本高。

发明内容

针对现有睾酮的生物合成方法存在投放量小、合成效率低的问题，本发明的目的在于提供一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体，可用于生物合成睾酮，具有投放量大、合成效率高等优点。

本发明的另一目的为提供上述短链羰基还原酶PpYSDR突变体的编码基因。

本发明的另一目的为提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的另一目的为提供用于制备上述突变体的基因工程菌。

本发明的另一目的为提供上述突变体、编码基因、重组表达载体或基因工程菌在以雄烯二酮为底物不对称催化制备睾酮上的应用。

本发明提供如下的技术方案：

一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺、第88位亮氨酸突变为天冬酰胺、第136位亮氨酸突变为丙氨酸和第143位天冬氨酸突变为丙氨酸中的一种或几种后得到；

所述短链羰基还原酶PpYSDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

发明人研究发现，通过上述突变得到的短链羰基还原酶PpYSDR突变体具有很高的催化雄烯二酮转化成睾酮的活性，可以游离酶、固定化酶或重组游离细胞的形式催化合成睾酮，雄烯二酮的转化率高，睾酮的收率高，选择性高。其中对应的短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列SEQ ID NO.2如下所示：

MANAKTALIIGASRGLGLGLVQRLNEDGWNIVATVRNPQQPGALADVPGVRIEQLEMNDTAQLDGLKQRLQGQVFDLVFVNAGVMGPLPQDLETVQNKDIGDLFMTNAVSPIRVARRLVGQVREGSGVLAFMSSILGSVTIPDGGEICLYKASKAALNSMINSFVVEQQRPDLCVLAMHPGWVKTDMGGENAEIDVFTSTRGMLDQINAQSGNGGLRFINYKGEPLVW。

作为本发明的优选，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型氨基酸序列的第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺后得到，即突变体M85Q，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，

SEQ ID NO.4：

MANAKTALIIGASRGLGLGLVQRLNEDGWNIVATVRNPQQPGALADVPGVRIEQLEMNDTAQLDGLKQRLQGQVFDLVFVNAGVQGPLPQDLETVQNKDIGDLFMTNAVSPIRVARRLVGQVREGSGVLAFMSSILGSVTIPDGGEICLYKASKAALNSMINSFVVEQQRPDLCVLAMHPGWVKTDMGGENAEIDVFTSTRGMLDQINAQSGNGGLRFINYKGEPLVW；

或者，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列第88位亮氨酸突变为天冬酰胺后得到，即突变体L88N，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，

SEQ ID NO.6：

MANAKTALIIGASRGLGLGLVQRLNEDGWNIVATVRNPQQPGALADVPGVRIEQLEMNDTAQLDGLKQRLQGQVFDLVFVNAGVMGPNPQDLETVQNKDIGDLFMTNAVSPIRVARRLVGQVREGSGVLAFMSSILGSVTIPDGGEICLYKASKAALNSMINSFVVEQQRPDLCVLAMHPGWVKTDMGGENAEIDVFTSTRGMLDQINAQSGNGGLRFINYKGEPLVW；

或者，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列第136位亮氨酸突变为丙氨酸后得到，即突变体L136A，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，

SEQ ID NO.8：

MANAKTALIIGASRGLGLGLVQRLNEDGWNIVATVRNPQQPGALADVPGVRIEQLEMNDTAQLDGLKQRLQGQVFDLVFVNAGVMGPLPQDLETVQNKDIGDLFMTNAVSPIRVARRLVGQVREGSGVLAFMSSIAGSVTIPDGGEICLYKASKAALNSMINSFVVEQQRPDLCVLAMHPGWVKTDMGGENAEIDVFTSTRGMLDQINAQSGNGGLRFINYKGEPLVW；

或者，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列第143位天冬氨酸突变为位丙氨酸后得到，即突变体D143A，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，

SEQ ID NO.10：

MANAKTALIIGASRGLGLGLVQRLNEDGWNIVATVRNPQQPGALADVPGVRIEQLEMNDTAQLDGLKQRLQGQVFDLVFVNAGVMGPLPQDLETVQNKDIGDLFMTNAVSPIRVARRLVGQVREGSGVLAFMSSILGSVTIPAGGEICLYKASKAALNSMINSFVVEQQRPDLCVLAMHPGWVKTDMGGENAEIDVFTSTRGMLDQINAQSGNGGLRFINYKGEPLVW；

或者，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺、第88位亮氨酸突变为天冬酰胺、第136位亮氨酸突变为丙氨酸和第143位天冬氨酸突变为丙氨酸后得到，即突变体M85Q/L88N/L136A/D143A，氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示，

SEQ ID NO.12：

MANAKTALIIGASRGLGLGLVQRLNEDGWNIVATVRNPQQPGALADVPGVRIEQLEMNDTAQLDGLKQRLQGQVFDLVFVNAGVQGPNPQDLETVQNKDIGDLFMTNAVSPIRVARRLVGQVREGSGVLAFMSSIAGSVTIPAGGEICLYKASKAALNSMINSFVVEQQRPDLCVLAMHPGWVKTDMGGENAEIDVFTSTRGMLDQINAQSGNGGLRFINYKGEPLVW。

进一步研究发现，四个位点氨基酸同时突变时得突变体M85Q/L88N/L136A/D143A具有更好的催化活性。

用于编码上述短链羰基还原酶PpYSDR突变体的编码基因，所述突变体的编码基因由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因经特异性引物扩增得到，其中：

短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述特异性引物为85Q、88N、136A和143A中的一种或多种；

所述特异性引物85Q的核苷酸序列为：

85Q-F gcgtccaaggccccctgccgcaagac；

85Q-R ggggccttggacgcccgcattgacgaatac；

所述特异性引物88N的核苷酸序列为：

88N-F ggccccaacccgcaagacctggagacggtt；

88N-R ttgcgggttggggcccatgacgcccg；

所述特异性引物136A的核苷酸序列为：

136A-F tcgatcgctggcagcgtaaccatccccga；

136A-R gctgccagcgatcgaactcatgaaggccagcacg；

所述特异性引物143A的核苷酸序列为：

143A-F atccccgctgggggcgaaatttgcctgtac；

143A-R gcccccagcggggatggttacgctgccc。

短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因经特异性引物85Q扩增可获得编码突变体M85Q的基因片段；经特异性引物88N扩增可获得编码突变体L88N的基因片段；经特异性引物136A扩增可获得编码突变体L136A的基因片段；经特异性引物143A扩增可获得编码突变体D143A的基因片段；经上述四组特异性引物同时扩增可获得编码突变体M85Q/L88N/L136A/D143A的基因片段。

短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1如下所示：

atggctaatgcaaaaaccgcacttatcatcggcgcctcgcgcgggcttggcctgggcctggtgcaacgcctgaacgaagacggctggaatatcgttgccaccgtgcgcaacccccagcaacccggtgccctggcggacgtgcccggcgtgcgcatcgaacagctggaaatgaacgacaccgcccaactcgatgggctgaaacaacgcctgcaaggccaggtgttcgacctggtattcgtcaatgcgggcgtcatgggccccctgccgcaagacctggagacggttcagaacaaggacatcggcgacctgttcatgaccaatgccgtgtcgcccatccgcgtggcccgccgcctggtcggccaggtgcgcgagggcagcggcgtgctggccttcatgagttcgatcctgggcagcgtaaccatccccgacgggggcgaaatttgcctgtacaaggccagcaaggcagcgctcaactcgatgatcaacagcttcgtggttgaacaacagcgccccgacctgtgcgtgctggccatgcacccgggctgggtgaaaaccgacatgggcggcgaaaacgccgaaatcgacgtgttcaccagcacccgcggcatgctcgaccagatcaacgcacaaagcggcaacggcggcctgcgcttcatcaactacaagggcgaacccttggtctggtga。

作为本发明的优选，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺后得到时，即突变体M85Q，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

SEQ ID NO.3：

atggctaatgcaaaaaccgcacttatcatcggcgcctcgcgcgggcttggcctgggcctggtgcaacgcctgaacgaagacggctggaatatcgttgccaccgtgcgcaacccccagcaacccggtgccctggcggacgtgcccggcgtgcgcatcgaacagctggaaatgaacgacaccgcccaactcgatgggctgaaacaacgcctgcaaggccaggtgttcgacctggtattcgtcaatgcgggcgtccaaggccccctgccgcaagacctggagacggttcagaacaaggacatcggcgacctgttcatgaccaatgccgtgtcgcccatccgcgtggcccgccgcctggtcggccaggtgcgcgagggcagcggcgtgctggccttcatgagttcgatcctgggcagcgtaaccatccccgacgggggcgaaatttgcctgtacaaggccagcaaggcagcgctcaactcgatgatcaacagcttcgtggttgaacaacagcgccccgacctgtgcgtgctggccatgcacccgggctgggtgaaaaccgacatgggcggcgaaaacgccgaaatcgacgtgttcaccagcacccgcggcatgctcgaccagatcaacgcacaaagcggcaacggcggcctgcgcttcatcaactacaagggcgaacccttggtctggtga；

所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列第88位亮氨酸突变为天冬酰胺后得到时，即突变体L88N，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

SEQ ID NO.5：

atggctaatgcaaaaaccgcacttatcatcggcgcctcgcgcgggcttggcctgggcctggtgcaacgcctgaacgaagacggctggaatatcgttgccaccgtgcgcaacccccagcaacccggtgccctggcggacgtgcccggcgtgcgcatcgaacagctggaaatgaacgacaccgcccaactcgatgggctgaaacaacgcctgcaaggccaggtgttcgacctggtattcgtcaatgcgggcgtcatgggccccaacccgcaagacctggagacggttcagaacaaggacatcggcgacctgttcatgaccaatgccgtgtcgcccatccgcgtggcccgccgcctggtcggccaggtgcgcgagggcagcggcgtgctggccttcatgagttcgatcctgggcagcgtaaccatccccgacgggggcgaaatttgcctgtacaaggccagcaaggcagcgctcaactcgatgatcaacagcttcgtggttgaacaacagcgccccgacctgtgcgtgctggccatgcacccgggctgggtgaaaaccgacatgggcggcgaaaacgccgaaatcgacgtgttcaccagcacccgcggcatgctcgaccagatcaacgcacaaagcggcaacggcggcctgcgcttcatcaactacaagggcgaacccttggtctggtga；

所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列第136位亮氨酸突变为丙氨酸后得到时，即突变体L136A，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

SEQ ID NO.7：

atggctaatgcaaaaaccgcacttatcatcggcgcctcgcgcgggcttggcctgggcctggtgcaacgcctgaacgaagacggctggaatatcgttgccaccgtgcgcaacccccagcaacccggtgccctggcggacgtgcccggcgtgcgcatcgaacagctggaaatgaacgacaccgcccaactcgatgggctgaaacaacgcctgcaaggccaggtgttcgacctggtattcgtcaatgcgggcgtcatgggccccctgccgcaagacctggagacggttcagaacaaggacatcggcgacctgttcatgaccaatgccgtgtcgcccatccgcgtggcccgccgcctggtcggccaggtgcgcgagggcagcggcgtgctggccttcatgagttcgatcgctggcagcgtaaccatccccgacgggggcgaaatttgcctgtacaaggccagcaaggcagcgctcaactcgatgatcaacagcttcgtggttgaacaacagcgccccgacctgtgcgtgctggccatgcacccgggctgggtgaaaaccgacatgggcggcgaaaacgccgaaatcgacgtgttcaccagcacccgcggcatgctcgaccagatcaacgcacaaagcggcaacggcggcctgcgcttcatcaactacaagggcgaacccttggtctggtga；

所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第143位天冬氨酸突变为丙氨酸后得到时，即突变体D143A，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

SEQ ID NO.9：

atggctaatgcaaaaaccgcacttatcatcggcgcctcgcgcgggcttggcctgggcctggtgcaacgcctgaacgaagacggctggaatatcgttgccaccgtgcgcaacccccagcaacccggtgccctggcggacgtgcccggcgtgcgcatcgaacagctggaaatgaacgacaccgcccaactcgatgggctgaaacaacgcctgcaaggccaggtgttcgacctggtattcgtcaatgcgggcgtcatgggccccctgccgcaagacctggagacggttcagaacaaggacatcggcgacctgttcatgaccaatgccgtgtcgcccatccgcgtggcccgccgcctggtcggccaggtgcgcgagggcagcggcgtgctggccttcatgagttcgatcctgggcagcgtaaccatccccgctgggggcgaaatttgcctgtacaaggccagcaaggcagcgctcaactcgatgatcaacagcttcgtggttgaacaacagcgccccgacctgtgcgtgctggccatgcacccgggctgggtgaaaaccgacatgggcggcgaaaacgccgaaatcgacgtgttcaccagcacccgcggcatgctcgaccagatcaacgcacaaagcggcaacggcggcctgcgcttcatcaactacaagggcgaacccttggtctggtga；

所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺、第88位亮氨酸突变为天冬酰胺、第136位亮氨酸突变为丙氨酸和第143位天冬氨酸突变为丙氨酸后得到时，即突变体M85Q/L88N/L136A/D143A，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

SEQ ID NO.11：

atggctaatgcaaaaaccgcacttatcatcggcgcctcgcgcgggcttggcctgggcctggtgcaacgcctgaacgaagacggctggaatatcgttgccaccgtgcgcaacccccagcaacccggtgccctggcggacgtgcccggcgtgcgcatcgaacagctggaaatgaacgacaccgcccaactcgatgggctgaaacaacgcctgcaaggccaggtgttcgacctggtattcgtcaatgcgggcgtccaaggccccaacccgcaagacctggagacggttcagaacaaggacatcggcgacctgttcatgaccaatgccgtgtcgcccatccgcgtggcccgccgcctggtcggccaggtgcgcgagggcagcggcgtgctggccttcatgagttcgatgctgggcagcgtaaccatccccgctgggggcgaaatttgcctgtacaaggccagcaaggcagcgctcaactcgatgatcaacagcttcgtggttgaacaacagcgccccgacctgtgcgtgctggccatgcacccgggctgggtgaaaaccgacatgggcggcgaaaacgccgaaatcgacgtgttcaccagcacccgcggcatgctcgaccagatcaacgcacaaagcggcaacggcggcctgcgcttcatcaactacaagggcgaacccttggtctggtga。

一种含有上述突变体的编码基因片段的核苷酸序列的重组表达载体。

作为本发明的优选，所述重组表达载体为质粒、噬菌体或病毒载体。

作为本发明的优选，所述重组表达载体为质粒pET-30a。

这些重组载体可通过本领域常规方法将上述短链羰基还原酶突变体编码基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。这些载体均可选择本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-30a。

一种表达重组羰基还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌含有上述突变体的编码基因片段的核苷酸序列，或者所述基因工程菌含有上述重组表达载体。

作为本发明的优选，所述基因工程菌为大肠杆菌E.coli BL21。

可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体稳定自我复制且所携带的短链羰基还原酶突变体编码基因有效表达即可，优选大肠杆菌，更优选为大肠杆菌E.coli BL21。

上述突变体或者上述突变体的编码基因或者上述重组表达载体或者上述基因工程菌在以雄烯二酮为底物催化制备睾酮上的应用。

在采用上述突变体催化雄烯二酮制备睾酮时，可直接采用重组大肠杆菌，或者破碎发酵收集的湿菌体制备粗酶液，或者通过常规方法分离出各突变体蛋白制备纯酶，在辅酶NADH存在下催化雄烯二酮转化成睾酮，比如将发酵培养后收集的湿菌体与雄性二酮、辅酶NADH置于pH值为5.5～8.5的缓冲液中构成转化反应体系，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。为减少NADH的使用量，可在反应体系中添加表达谷氨酸脱氢酶GDH的基因工程菌、粗酶液或者纯酶，也可添加共表达羰基还原酶突变体和谷氨酸脱氢酶GDH的基因工程菌、粗酶液或者纯酶，然后添加少量的辅酶NADH进行转化反应，获得产物睾酮，反应过程为：

其中，反应体系中雄烯二酮底物的初始浓度为10～1000mmol/L；菌体的质量用量以菌体湿重计为10～500g/L。

反应体系中还可加入有机溶剂，增强共溶性，有机溶剂为异丙醇、吐温80中的一种或多种，优选的为吐温80；吐温80的质量浓度为4％；反应体系还可添加醇或糖作为辅底物，提高反应的活力和立体选择性。辅底物醇或糖的质量分数为反应体系总质量的1～15％。

反应后的反应液分离纯化方法为：反应结束后，用乙酸乙酯萃取，有机层即为含睾酮的粗品，将粗品提纯即获得相应睾酮。所述粗品提纯的方法为本领域公知技术，通常为有机溶剂萃取、色谱分离和吸附分离等。

本发明所提供的羰基还原酶PpYSDR突变体具有更优良的催化活性，在催化雄烯二酮转化为睾酮的反应中，实验室级别底物雄烯二酮的投放浓度可达到100g/L，转化率达99％，产率98％，与现有生物合成方法相比，底物投料量大，节约了成本，有很好的应用开发前景。

附图说明

图1是重组突变体和GDH编码基因的质粒图谱。

图2是制备的各突变体与GDH共表达的蛋白质电泳图谱。

图3是实施例7制备的睾酮的液相色谱检测图。

具体实施方式

下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

本发明提供了短链羰基还原酶PpYSDR突变体，可以游离酶、固定化酶和重组游离细胞的形式不对称催化雄烯二酮制备睾酮，其中短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变体由短链羰基还原酶PpYSDR的氨基酸序列中第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺、第88位亮氨酸突变为天冬酰胺、第136位亮氨酸突变为丙氨酸和第143位天冬氨酸突变为丙氨酸中的一种或几种后得到。

其中，第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺得到突变体M85Q，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；第88位亮氨酸突变为天冬酰胺为突变体L88N，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；第136位亮氨酸突变为丙氨酸为突变体L136A，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；第143位天冬氨酸突变为丙氨酸为突变体D143A，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；第85位、第88位、第136位、第143位按上述各自方式同时突变时得到突变体M85Q/L88N/L136A/D143A，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，各突变体的编码基因片段由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因片段经特异性引物85Q、88N、136A和143A中的一种或多种扩增得到；

各特异性引物的核苷酸序列如下所示：

特异性引物85Q的核苷酸序列为：

85Q-F gcgtccaaggccccctgccgcaagac；

85Q-R ggggccttggacgcccgcattgacgaatac；

特异性引物88N的核苷酸序列为：

88N-F ggccccaacccgcaagacctggagacggtt；

88N-R ttgcgggttggggcccatgacgcccg；

特异性引物136A的核苷酸序列为：

136A-F tcgatcgctggcagcgtaaccatccccga；

136A-R gctgccagcgatcgaactcatgaaggccagcacg；

特异性引物143A的核苷酸序列为：

143A-F atccccgctgggggcgaaatttgcctgtac；

143A-R gcccccagcggggatggttacgctgccc。

其中，突变体M85Q的编码基因由特异性引物85Q扩增得到，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；突变体L88N的编码基因由特异性引物88N扩增得到，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；突变体L136A的编码基因由特异性引物136A扩增得到，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；突变体D143A的编码基因由特异性引物143A扩增得到，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；突变体M85Q/L88N/L136A/D143A的编码基因由特异性引物85Q、88N、136A、143A同时扩增得到，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

各突变体的编码基因通过常规方法转移到重组表达载体上，所选用的重组表达载体为常规的质粒、噬菌体或病毒载体，如质粒pET-30a，然后将各重组表达载体转移到宿主生物中，宿主生物的选取以满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的羰基还原酶突变体基因可以有效表达即可，如本领域常用的基因工程菌，进一步的如大肠杆菌，更进一步的，选择大肠杆菌E.coli BL21。

将短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因经特异性引物扩增得到可编码各突变体的突变体编码基因，然后将突变体编码基因转移到重组表达载体，如质粒pET-30a上，然后将质粒质粒pET-30a转移到宿主生物如大肠杆菌E.coli BL21内，通过培养使得突变体编码基因在大肠杆菌E.coli BL21得到有效表达，这样获得了可制备各突变体的重组的大肠杆菌。

重组大肠杆菌制备各突变体时采用一般的培养方法即可，只要使重组大肠杆菌能够生长并产生羰基还原酶突变体蛋白即可。如摇瓶培养时，重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB液体培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组羰基还原酶突变体蛋白。其中LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2-7.4，溶剂为去离子水。实际上，对于培养方法和培养条件没有特殊限制。

实现突变体规模表达的发酵培养方法可采用如下过程：

(1)斜面培养：将含PpYSDR羰基还原酶突变体编码基因的重组大肠杆菌接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养8-16h，获得斜面菌体；

斜面培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，pH 7.0，使用前加入50μg/ml卡那霉素；

(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；

种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，50μg/ml卡那霉素，溶剂为去离子水，pH 7.0；

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种至无菌的装有18L发酵培养基的30L机械搅拌通风通用式发酵罐中，37℃发酵培养14h，将已灭菌的浓度为15g/L的IPTG分批添加到发酵罐中于26℃下诱导培养，IPTG添加的终浓度为0.1～1mM，待培养12～24h、OD600达到80～100时，放罐收集湿菌体；发酵培养基的组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，甘油15g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 1.36g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.28g/L，MgSO₄·7H₂O 0.375g/L，溶剂为去离子水。

实际上，发酵培养基无特别要求，为本领域所熟知的可使突变体生长并产生本发明羰基还原酶突变体蛋白的培养基即可。

通过上述过程，雄烯二酮的实验室内投放量可高达100g/L，转化率达到99％，睾酮产率可达98％。

为进一步的阐明本申请的技术方案，提供如下实施方式予以说明。

下述实施例和对比例中所用辅酶GDH的氨基酸序列如SEQ ID 14所示：

MGYSDLEGKVVVITGSATGLGRAMGVRFAKEKAKVVINYRSRDSEANDVLEEIKKVGGEAIAVKGDVTVEADVMNLIQSAVKEFGTLDVMINNAGIENAVPSHEMPLEDWNKVINTNLTGAFLGSREAIKYFVEHDIKGSVINMSSVHEKIPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQRADVESMIPMGYIGKPEEIAAVATWLASSEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG。

所用辅酶GDH的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID 13所示：

atgggttacagcgatctggaaggtaaagttgttgtgattactggctctgctaccggtctgggccgcgcgatgggtgtacgtttcgcgaaagagaaggctaaagtcgtgatcaattaccgtagccgtgattctgaggccaacgatgtactggaagaaattaagaaggtgggcggcgaagctatcgctgtcaaaggcgatgtaaccgtggaagcagatgttatgaacctgattcaatctgcggttaaagagttcggtactctggatgtgatgatcaacaacgctggcattgagaacgctgttccaagccacgaaatgccgctggaggattggaacaaagtcatcaacaccaacctgaccggtgcgttcctgggttcccgtgaagccatcaaatatttcgtagagcacgacattaaaggcagcgttatcaacatgagctctgtacacgaaaaaatcccgtggccgctgtttgtgcactacgctgcatctaaaggtggcattaaactgatgaccgaaactctggcactggaatacgctccgaaaggcattcgcgttaataacatcggcccgggcgcgatcaacaccccgatcaacgctgaaaaattcgcggatccaaaacagcgtgcggatgttgagtccatgatcccgatgggctatattggtaaaccggaagagattgcggcggtcgcaacctggctggcttcctctgaggcttcctatgtaaccggtattaccctgttcgcggatggcggtatgacgctgtacccatccttccaggccggtcgtggttaa。

扩增辅酶GDH的编码基因的特异性引物GDH-Primer如下：

GDH-F catatgggttacagcgatctggaag；

GDH-R gaattcttaaccacgaccggcctgg。

实施例1表达突变体M85Q和辅酶GDH的大肠杆菌的构建

1)以短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因(核苷酸序列SEQ ID NO.1)为模板基因、以质粒pET-30a为模板质粒，特异性引物为85Q进行PCR扩增，扩增程序为：

(1)98℃、3min；(2)98℃、10s；(3)55℃，5s；(4)68℃、30s，步骤(2)-(4)循环30次后冷却至4℃；然后利用T4连接酶对骨架和片段进行连接；

2)以GDH的编码基因(核苷酸序列SEQ ID NO.13)为模板基因，将步骤1)重组后的质粒pET-30a为模板质粒，利用GDH编码基因的特异性引物GDH-Primer进行扩增，扩增程序为：(1)98℃、3min；(2)98℃、10s；(3)55℃，5s；(4)68℃、30s，步骤(2)-(4)循环30次后冷却至4℃；然后利用T4连接酶对骨架和片段进行连接；从而得到整合突变体L85Q编码基因和GDH编码基因的的重组质粒pET-30a，质粒结构见图1所示；

3)PCR产物清洗后，利用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶DpnⅠ进行消化以降解模板质粒，酶切反应体系及条件：17μL经清洗处理的PCR产物，2.0μL 10×缓冲液，1.0μL限制性内切酶DpnⅠ，37℃保温1h；

4)将上述经酶切处理的PCR产物转化至大肠杆菌E.coli BL21即DE3中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有羰基还原酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主大肠杆菌DE3中，突变体M85Q的编码基因核苷酸序列测序结果如序列表中SEQ ID NO.3所示，相应突变体M85Q的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4。

实施例2表达突变体L88N和辅酶GDH的大肠杆菌的构建

与实施例1的不同之处为，步骤1)中短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因扩增所用特异性引物为88N，最终大肠杆菌DE3的突变体编码基因的核苷酸序列测序结果如序列表中SEQ ID NO.5所示，相应突变体氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6。

实施例3表达突变体L136A和辅酶GDH的大肠杆菌的构建与实施例1的不同之处为，步骤1)中短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因扩增所用特异性引物为136A，最终大肠杆菌DE3的突变体编码基因核苷酸序列测序结果如序列表中SEQ ID NO.7所示，相应突变体氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.8。

实施例4表达突变体D143A和辅酶GDH的大肠杆菌的构建与实施例1的不同之处为，步骤1)中短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因扩增所用特异性引物为143A，最终大肠杆菌DE3的突变体核苷酸序列测序结果如序列表中SEQ ID NO.9所示，相应突变体氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.10。

实施例5表达突变体M85Q/L88N/L136A/D143A和辅酶GDH的大肠杆菌的构建与实施例1的不同之处为，步骤1)中短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因扩增所用特异性引物为85Q、88N、136A、143A，最终可检测到核苷酸序列测序结果如序列表中SEQ ID NO.11所示的大肠杆菌DE3，相应突变体氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.12。

实施例6各突变体和GDH的诱导表达(摇瓶培养)

将实施例1-5构建的大肠杆菌分别接种至50μg/mL卡那霉素的LB斜面培养基中，37℃、220rpm培养过夜，再以2％接种量(v/v)接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6，加入IPTG溶液至终浓度0.1mM，25℃诱导培养16h后，4000rpm离心10min收集菌体，-20℃储存备用；

其中，LB斜面培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，pH 7.0。LB液体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，50μg/ml卡那霉素，溶剂为去离子水，pH 7.0。

最终获得的各突变体和GDH共表达的蛋白质电泳图谱见图2所示，GDH的大小为30kb左右，PpYSDR野生型及各突变体的大小为25kb左右。

实施例7突变体M85Q/L88N/L136A/D143A以重组游离细胞形式催化雄烯二酮

1)斜面培养：将含突变体M85Q/L88N/L136A/D143A和GDH的编码基因的重组大肠杆菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB斜面培养基，在37℃培养12h，获得斜面菌体；

2)种子培养：将斜面菌体接种至LB液体培养基，在37℃培养8h，获得种子液；

3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种至无菌的装有18L发酵培养基的30L机械搅拌通风通用式发酵罐中，37℃发酵培养14h后将已灭菌的浓度为15g/L的IPTG溶液分批添加到发酵罐中于26℃下诱导培养至IPTG终浓度为1mM，待培养至OD600达到100放罐收集湿菌体细胞；

发酵培养基浓度组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，甘油15g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 1.36g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.28g/L，MgSO₄·7H₂O 0.375g/L，溶剂为去离子水；

4)催化高浓度雄烯二酮制备睾酮

取上述步骤3)得到的湿菌体细胞3g与底物雄烯二酮、0.4ml吐温80、6.0mLNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(100mM,PH 7.5)混合得到混合反应体系，并加入辅酶NADH至浓度0.2mmol/L，雄烯二酮的浓度为100g/L，在30℃、220rpm条件下反应20h，然后用5倍体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含睾酮的粗品，将粗品提纯即获得睾酮，雄烯二酮的转化率为99.5％，睾酮的产率为99％；

5)睾酮的纯度测定，其中，采用液相色谱柱，GL Sciences公司Inertsil ods-35um(4.6*250mm)柱，检测波长254nm，甲醇:水＝7:3，流速1ml/min，结果见图3所示，睾酮在10.519min处出峰，与睾酮纯品保持一致。

实施例8雄烯二酮制备睾酮的工程放大反应体系

与实施例7的不同之处为，步骤4)中，向步骤3)获得的湿菌体细胞3kg中加入1kg雄烯二酮，0.4L吐温80，6L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(100mM，pH7.5)，并加入辅酶NADH至浓度0.2mmol/L，于30℃，400rpm条件下反应，反应24h后，雄烯二酮转化率达到99％，睾酮的产率为98％。

实施例9突变体M85Q/L88N/L136A/D143A以游离酶形式催化雄烯二酮制备睾酮与实施例7的不同之处为，将步骤3)得到的湿菌体细胞超声破碎得到细胞破碎液，然后取3g破碎液与底物雄烯二酮、0.4ml吐温80、6.0mL Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(100mM,_PH 7.5)混合得到混合反应体系，并加入辅酶NADH至浓度0.2mmol/L，雄烯二酮的浓度为100g/L，在30℃、220rpm条件下反应20h，然后用5倍体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含睾酮的粗品，将粗品提纯即获得睾酮，雄烯二酮的转化率为70％，睾酮的产率为60％。

对比例1

与实施例7的不同之处为，所用重组大肠杆菌为含短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因和GDH的编码基因的重组大肠杆菌E.coli BL21，其余条件均相同，最终获得的雄烯二酮的转化率为30％，睾酮的产率为24％。采用本发明的突变体的重组大肠杆菌湿细胞与短链羰基还原酶PpYSDR的重组大肠杆菌湿细胞相比，雄烯二酮的转化率和睾酮的产率提升至3倍左右。结果表明，采用本发明的突变体转化雄烯二酮制备睾酮在小试和放大试验中均取得较佳效果，明显高于直接采用短链羰基还原酶PpYSDR的催化效果。

上述对比例1中，短链羰基还原酶PpYSDR的编码基因的扩增用特异性引物PpYSDR-Primer如下所示：

PpYSDR-F ggatccatggctaatgcaaaaaccgcac；

PpYSDR-R ctcgagtcaccagaccaagggttcgc。

序列表

<110> 杭州馨海酶源生物科技有限公司

<120> 一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体、编码基因、重组表达载体、基因工程菌及应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 687

<212> DNA

<213> 野生型(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 1

atggctaatg caaaaaccgc acttatcatc ggcgcctcgc gcgggcttgg cctgggcctg 60

gtgcaacgcc tgaacgaaga cggctggaat atcgttgcca ccgtgcgcaa cccccagcaa 120

cccggtgccc tggcggacgt gcccggcgtg cgcatcgaac agctggaaat gaacgacacc 180

gcccaactcg atgggctgaa acaacgcctg caaggccagg tgttcgacct ggtattcgtc 240

aatgcgggcg tcatgggccc cctgccgcaa gacctggaga cggttcagaa caaggacatc 300

ggcgacctgt tcatgaccaa tgccgtgtcg cccatccgcg tggcccgccg cctggtcggc 360

caggtgcgcg agggcagcgg cgtgctggcc ttcatgagtt cgatcctggg cagcgtaacc 420

atccccgacg ggggcgaaat ttgcctgtac aaggccagca aggcagcgct caactcgatg 480

atcaacagct tcgtggttga acaacagcgc cccgacctgt gcgtgctggc catgcacccg 540

ggctgggtga aaaccgacat gggcggcgaa aacgccgaaa tcgacgtgtt caccagcacc 600

cgcggcatgc tcgaccagat caacgcacaa agcggcaacg gcggcctgcg cttcatcaac 660

tacaagggcg aacccttggt ctggtga 687

<210> 2

<211> 228

<212> PRT

<213> 野生型(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 2

Met Ala Asn Ala Lys Thr Ala Leu Ile Ile Gly Ala Ser Arg Gly Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu Asn Glu Asp Gly Trp Asn Ile Val

20 25 30

Ala Thr Val Arg Asn Pro Gln Gln Pro Gly Ala Leu Ala Asp Val Pro

35 40 45

Gly Val Arg Ile Glu Gln Leu Glu Met Asn Asp Thr Ala Gln Leu Asp

50 55 60

Gly Leu Lys Gln Arg Leu Gln Gly Gln Val Phe Asp Leu Val Phe Val

65 70 75 80

Asn Ala Gly Val Met Gly Pro Leu Pro Gln Asp Leu Glu Thr Val Gln

85 90 95

Asn Lys Asp Ile Gly Asp Leu Phe Met Thr Asn Ala Val Ser Pro Ile

100 105 110

Arg Val Ala Arg Arg Leu Val Gly Gln Val Arg Glu Gly Ser Gly Val

115 120 125

Leu Ala Phe Met Ser Ser Ile Leu Gly Ser Val Thr Ile Pro Asp Gly

130 135 140

Gly Glu Ile Cys Leu Tyr Lys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Met

145 150 155 160

Ile Asn Ser Phe Val Val Glu Gln Gln Arg Pro Asp Leu Cys Val Leu

165 170 175

Ala Met His Pro Gly Trp Val Lys Thr Asp Met Gly Gly Glu Asn Ala

180 185 190

Glu Ile Asp Val Phe Thr Ser Thr Arg Gly Met Leu Asp Gln Ile Asn

195 200 205

Ala Gln Ser Gly Asn Gly Gly Leu Arg Phe Ile Asn Tyr Lys Gly Glu

210 215 220

Pro Leu Val Trp

225

<210> 3

<211> 687

<212> DNA

<213> 突变体M85Q(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 3

atggctaatg caaaaaccgc acttatcatc ggcgcctcgc gcgggcttgg cctgggcctg 60

gtgcaacgcc tgaacgaaga cggctggaat atcgttgcca ccgtgcgcaa cccccagcaa 120

cccggtgccc tggcggacgt gcccggcgtg cgcatcgaac agctggaaat gaacgacacc 180

gcccaactcg atgggctgaa acaacgcctg caaggccagg tgttcgacct ggtattcgtc 240

aatgcgggcg tccaaggccc cctgccgcaa gacctggaga cggttcagaa caaggacatc 300

ggcgacctgt tcatgaccaa tgccgtgtcg cccatccgcg tggcccgccg cctggtcggc 360

caggtgcgcg agggcagcgg cgtgctggcc ttcatgagtt cgatcctggg cagcgtaacc 420

atccccgacg ggggcgaaat ttgcctgtac aaggccagca aggcagcgct caactcgatg 480

atcaacagct tcgtggttga acaacagcgc cccgacctgt gcgtgctggc catgcacccg 540

ggctgggtga aaaccgacat gggcggcgaa aacgccgaaa tcgacgtgtt caccagcacc 600

cgcggcatgc tcgaccagat caacgcacaa agcggcaacg gcggcctgcg cttcatcaac 660

tacaagggcg aacccttggt ctggtga 687

<210> 4

<211> 228

<212> PRT

<213> 突变体M85Q(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 4

Met Ala Asn Ala Lys Thr Ala Leu Ile Ile Gly Ala Ser Arg Gly Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu Asn Glu Asp Gly Trp Asn Ile Val

20 25 30

Ala Thr Val Arg Asn Pro Gln Gln Pro Gly Ala Leu Ala Asp Val Pro

35 40 45

Gly Val Arg Ile Glu Gln Leu Glu Met Asn Asp Thr Ala Gln Leu Asp

50 55 60

Gly Leu Lys Gln Arg Leu Gln Gly Gln Val Phe Asp Leu Val Phe Val

65 70 75 80

Asn Ala Gly Val Gln Gly Pro Leu Pro Gln Asp Leu Glu Thr Val Gln

85 90 95

Asn Lys Asp Ile Gly Asp Leu Phe Met Thr Asn Ala Val Ser Pro Ile

100 105 110

Arg Val Ala Arg Arg Leu Val Gly Gln Val Arg Glu Gly Ser Gly Val

115 120 125

Leu Ala Phe Met Ser Ser Ile Leu Gly Ser Val Thr Ile Pro Asp Gly

130 135 140

Gly Glu Ile Cys Leu Tyr Lys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Met

145 150 155 160

Ile Asn Ser Phe Val Val Glu Gln Gln Arg Pro Asp Leu Cys Val Leu

165 170 175

Ala Met His Pro Gly Trp Val Lys Thr Asp Met Gly Gly Glu Asn Ala

180 185 190

Glu Ile Asp Val Phe Thr Ser Thr Arg Gly Met Leu Asp Gln Ile Asn

195 200 205

Ala Gln Ser Gly Asn Gly Gly Leu Arg Phe Ile Asn Tyr Lys Gly Glu

210 215 220

Pro Leu Val Trp

225

<210> 5

<211> 687

<212> DNA

<213> 突变体L88N(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 5

atggctaatg caaaaaccgc acttatcatc ggcgcctcgc gcgggcttgg cctgggcctg 60

gtgcaacgcc tgaacgaaga cggctggaat atcgttgcca ccgtgcgcaa cccccagcaa 120

cccggtgccc tggcggacgt gcccggcgtg cgcatcgaac agctggaaat gaacgacacc 180

gcccaactcg atgggctgaa acaacgcctg caaggccagg tgttcgacct ggtattcgtc 240

aatgcgggcg tcatgggccc caacccgcaa gacctggaga cggttcagaa caaggacatc 300

ggcgacctgt tcatgaccaa tgccgtgtcg cccatccgcg tggcccgccg cctggtcggc 360

caggtgcgcg agggcagcgg cgtgctggcc ttcatgagtt cgatcctggg cagcgtaacc 420

atccccgacg ggggcgaaat ttgcctgtac aaggccagca aggcagcgct caactcgatg 480

atcaacagct tcgtggttga acaacagcgc cccgacctgt gcgtgctggc catgcacccg 540

ggctgggtga aaaccgacat gggcggcgaa aacgccgaaa tcgacgtgtt caccagcacc 600

cgcggcatgc tcgaccagat caacgcacaa agcggcaacg gcggcctgcg cttcatcaac 660

tacaagggcg aacccttggt ctggtga 687

<210> 6

<211> 228

<212> PRT

<213> 突变体L88N(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 6

Met Ala Asn Ala Lys Thr Ala Leu Ile Ile Gly Ala Ser Arg Gly Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu Asn Glu Asp Gly Trp Asn Ile Val

20 25 30

Ala Thr Val Arg Asn Pro Gln Gln Pro Gly Ala Leu Ala Asp Val Pro

35 40 45

Gly Val Arg Ile Glu Gln Leu Glu Met Asn Asp Thr Ala Gln Leu Asp

50 55 60

Gly Leu Lys Gln Arg Leu Gln Gly Gln Val Phe Asp Leu Val Phe Val

65 70 75 80

Asn Ala Gly Val Met Gly Pro Asn Pro Gln Asp Leu Glu Thr Val Gln

85 90 95

Asn Lys Asp Ile Gly Asp Leu Phe Met Thr Asn Ala Val Ser Pro Ile

100 105 110

Arg Val Ala Arg Arg Leu Val Gly Gln Val Arg Glu Gly Ser Gly Val

115 120 125

Leu Ala Phe Met Ser Ser Ile Leu Gly Ser Val Thr Ile Pro Asp Gly

130 135 140

Gly Glu Ile Cys Leu Tyr Lys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Met

145 150 155 160

Ile Asn Ser Phe Val Val Glu Gln Gln Arg Pro Asp Leu Cys Val Leu

165 170 175

Ala Met His Pro Gly Trp Val Lys Thr Asp Met Gly Gly Glu Asn Ala

180 185 190

Glu Ile Asp Val Phe Thr Ser Thr Arg Gly Met Leu Asp Gln Ile Asn

195 200 205

Ala Gln Ser Gly Asn Gly Gly Leu Arg Phe Ile Asn Tyr Lys Gly Glu

210 215 220

Pro Leu Val Trp

225

<210> 7

<211> 687

<212> DNA

<213> 突变体L136A(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 7

atggctaatg caaaaaccgc acttatcatc ggcgcctcgc gcgggcttgg cctgggcctg 60

gtgcaacgcc tgaacgaaga cggctggaat atcgttgcca ccgtgcgcaa cccccagcaa 120

cccggtgccc tggcggacgt gcccggcgtg cgcatcgaac agctggaaat gaacgacacc 180

gcccaactcg atgggctgaa acaacgcctg caaggccagg tgttcgacct ggtattcgtc 240

aatgcgggcg tcatgggccc cctgccgcaa gacctggaga cggttcagaa caaggacatc 300

ggcgacctgt tcatgaccaa tgccgtgtcg cccatccgcg tggcccgccg cctggtcggc 360

caggtgcgcg agggcagcgg cgtgctggcc ttcatgagtt cgatcgctgg cagcgtaacc 420

atccccgacg ggggcgaaat ttgcctgtac aaggccagca aggcagcgct caactcgatg 480

atcaacagct tcgtggttga acaacagcgc cccgacctgt gcgtgctggc catgcacccg 540

ggctgggtga aaaccgacat gggcggcgaa aacgccgaaa tcgacgtgtt caccagcacc 600

cgcggcatgc tcgaccagat caacgcacaa agcggcaacg gcggcctgcg cttcatcaac 660

tacaagggcg aacccttggt ctggtga 687

<210> 8

<211> 228

<212> PRT

<213> 突变体L136A(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 8

Met Ala Asn Ala Lys Thr Ala Leu Ile Ile Gly Ala Ser Arg Gly Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu Asn Glu Asp Gly Trp Asn Ile Val

20 25 30

Ala Thr Val Arg Asn Pro Gln Gln Pro Gly Ala Leu Ala Asp Val Pro

35 40 45

Gly Val Arg Ile Glu Gln Leu Glu Met Asn Asp Thr Ala Gln Leu Asp

50 55 60

Gly Leu Lys Gln Arg Leu Gln Gly Gln Val Phe Asp Leu Val Phe Val

65 70 75 80

Asn Ala Gly Val Met Gly Pro Leu Pro Gln Asp Leu Glu Thr Val Gln

85 90 95

Asn Lys Asp Ile Gly Asp Leu Phe Met Thr Asn Ala Val Ser Pro Ile

100 105 110

Arg Val Ala Arg Arg Leu Val Gly Gln Val Arg Glu Gly Ser Gly Val

115 120 125

Leu Ala Phe Met Ser Ser Ile Ala Gly Ser Val Thr Ile Pro Asp Gly

130 135 140

Gly Glu Ile Cys Leu Tyr Lys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Met

145 150 155 160

Ile Asn Ser Phe Val Val Glu Gln Gln Arg Pro Asp Leu Cys Val Leu

165 170 175

Ala Met His Pro Gly Trp Val Lys Thr Asp Met Gly Gly Glu Asn Ala

180 185 190

Glu Ile Asp Val Phe Thr Ser Thr Arg Gly Met Leu Asp Gln Ile Asn

195 200 205

Ala Gln Ser Gly Asn Gly Gly Leu Arg Phe Ile Asn Tyr Lys Gly Glu

210 215 220

Pro Leu Val Trp

225

<210> 9

<211> 687

<212> DNA

<213> 突变体D143A(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 9

atggctaatg caaaaaccgc acttatcatc ggcgcctcgc gcgggcttgg cctgggcctg 60

gtgcaacgcc tgaacgaaga cggctggaat atcgttgcca ccgtgcgcaa cccccagcaa 120

cccggtgccc tggcggacgt gcccggcgtg cgcatcgaac agctggaaat gaacgacacc 180

gcccaactcg atgggctgaa acaacgcctg caaggccagg tgttcgacct ggtattcgtc 240

aatgcgggcg tcatgggccc cctgccgcaa gacctggaga cggttcagaa caaggacatc 300

ggcgacctgt tcatgaccaa tgccgtgtcg cccatccgcg tggcccgccg cctggtcggc 360

caggtgcgcg agggcagcgg cgtgctggcc ttcatgagtt cgatcctggg cagcgtaacc 420

atccccgctg ggggcgaaat ttgcctgtac aaggccagca aggcagcgct caactcgatg 480

atcaacagct tcgtggttga acaacagcgc cccgacctgt gcgtgctggc catgcacccg 540

ggctgggtga aaaccgacat gggcggcgaa aacgccgaaa tcgacgtgtt caccagcacc 600

cgcggcatgc tcgaccagat caacgcacaa agcggcaacg gcggcctgcg cttcatcaac 660

tacaagggcg aacccttggt ctggtga 687

<210> 11

<211> 228

<212> PRT

<213> 突变体D143A(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 11

Met Ala Asn Ala Lys Thr Ala Leu Ile Ile Gly Ala Ser Arg Gly Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu Asn Glu Asp Gly Trp Asn Ile Val

20 25 30

Ala Thr Val Arg Asn Pro Gln Gln Pro Gly Ala Leu Ala Asp Val Pro

35 40 45

Gly Val Arg Ile Glu Gln Leu Glu Met Asn Asp Thr Ala Gln Leu Asp

50 55 60

Gly Leu Lys Gln Arg Leu Gln Gly Gln Val Phe Asp Leu Val Phe Val

65 70 75 80

Asn Ala Gly Val Met Gly Pro Leu Pro Gln Asp Leu Glu Thr Val Gln

85 90 95

Asn Lys Asp Ile Gly Asp Leu Phe Met Thr Asn Ala Val Ser Pro Ile

100 105 110

Arg Val Ala Arg Arg Leu Val Gly Gln Val Arg Glu Gly Ser Gly Val

115 120 125

Leu Ala Phe Met Ser Ser Ile Leu Gly Ser Val Thr Ile Pro Ala Gly

130 135 140

Gly Glu Ile Cys Leu Tyr Lys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Met

145 150 155 160

Ile Asn Ser Phe Val Val Glu Gln Gln Arg Pro Asp Leu Cys Val Leu

165 170 175

Ala Met His Pro Gly Trp Val Lys Thr Asp Met Gly Gly Glu Asn Ala

180 185 190

Glu Ile Asp Val Phe Thr Ser Thr Arg Gly Met Leu Asp Gln Ile Asn

195 200 205

Ala Gln Ser Gly Asn Gly Gly Leu Arg Phe Ile Asn Tyr Lys Gly Glu

210 215 220

Pro Leu Val Trp

225

<210> 11

<211> 687

<212> DNA

<213> 突变体M85Q/L88N/L136A/D143A(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 11

atggctaatg caaaaaccgc acttatcatc ggcgcctcgc gcgggcttgg cctgggcctg 60

gtgcaacgcc tgaacgaaga cggctggaat atcgttgcca ccgtgcgcaa cccccagcaa 120

cccggtgccc tggcggacgt gcccggcgtg cgcatcgaac agctggaaat gaacgacacc 180

gcccaactcg atgggctgaa acaacgcctg caaggccagg tgttcgacct ggtattcgtc 240

aatgcgggcg tccaaggccc caacccgcaa gacctggaga cggttcagaa caaggacatc 300

ggcgacctgt tcatgaccaa tgccgtgtcg cccatccgcg tggcccgccg cctggtcggc 360

caggtgcgcg agggcagcgg cgtgctggcc ttcatgagtt cgatgctggg cagcgtaacc 420

atccccgctg ggggcgaaat ttgcctgtac aaggccagca aggcagcgct caactcgatg 480

atcaacagct tcgtggttga acaacagcgc cccgacctgt gcgtgctggc catgcacccg 540

ggctgggtga aaaccgacat gggcggcgaa aacgccgaaa tcgacgtgtt caccagcacc 600

cgcggcatgc tcgaccagat caacgcacaa agcggcaacg gcggcctgcg cttcatcaac 660

tacaagggcg aacccttggt ctggtga 687

<210> 12

<211> 228

<212> PRT

<213> 突变体M85Q/L88N/L136A/D143A(短链羰基还原酶PpYSDR)

<400> 12

Met Ala Asn Ala Lys Thr Ala Leu Ile Ile Gly Ala Ser Arg Gly Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu Asn Glu Asp Gly Trp Asn Ile Val

20 25 30

Ala Thr Val Arg Asn Pro Gln Gln Pro Gly Ala Leu Ala Asp Val Pro

35 40 45

Gly Val Arg Ile Glu Gln Leu Glu Met Asn Asp Thr Ala Gln Leu Asp

50 55 60

Gly Leu Lys Gln Arg Leu Gln Gly Gln Val Phe Asp Leu Val Phe Val

65 70 75 80

Asn Ala Gly Val Gln Gly Pro Asn Pro Gln Asp Leu Glu Thr Val Gln

85 90 95

Asn Lys Asp Ile Gly Asp Leu Phe Met Thr Asn Ala Val Ser Pro Ile

100 105 110

Arg Val Ala Arg Arg Leu Val Gly Gln Val Arg Glu Gly Ser Gly Val

115 120 125

Leu Ala Phe Met Ser Ser Ile Ala Gly Ser Val Thr Ile Pro Ala Gly

130 135 140

Gly Glu Ile Cys Leu Tyr Lys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Met

145 150 155 160

Ile Asn Ser Phe Val Val Glu Gln Gln Arg Pro Asp Leu Cys Val Leu

165 170 175

Ala Met His Pro Gly Trp Val Lys Thr Asp Met Gly Gly Glu Asn Ala

180 185 190

Glu Ile Asp Val Phe Thr Ser Thr Arg Gly Met Leu Asp Gln Ile Asn

195 200 205

Ala Gln Ser Gly Asn Gly Gly Leu Arg Phe Ile Asn Tyr Lys Gly Glu

210 215 220

Pro Leu Val Trp

225

<210> 13

<211> 789

<212> DNA

<213> 谷氨酸脱氢酶(GDH)

<400> 13

atgggttaca gcgatctgga aggtaaagtt gttgtgatta ctggctctgc taccggtctg 60

ggccgcgcga tgggtgtacg tttcgcgaaa gagaaggcta aagtcgtgat caattaccgt 120

agccgtgatt ctgaggccaa cgatgtactg gaagaaatta agaaggtggg cggcgaagct 180

atcgctgtca aaggcgatgt aaccgtggaa gcagatgtta tgaacctgat tcaatctgcg 240

gttaaagagt tcggtactct ggatgtgatg atcaacaacg ctggcattga gaacgctgtt 300

ccaagccacg aaatgccgct ggaggattgg aacaaagtca tcaacaccaa cctgaccggt 360

gcgttcctgg gttcccgtga agccatcaaa tatttcgtag agcacgacat taaaggcagc 420

gttatcaaca tgagctctgt acacgaaaaa atcccgtggc cgctgtttgt gcactacgct 480

gcatctaaag gtggcattaa actgatgacc gaaactctgg cactggaata cgctccgaaa 540

ggcattcgcg ttaataacat cggcccgggc gcgatcaaca ccccgatcaa cgctgaaaaa 600

ttcgcggatc caaaacagcg tgcggatgtt gagtccatga tcccgatggg ctatattggt 660

aaaccggaag agattgcggc ggtcgcaacc tggctggctt cctctgaggc ttcctatgta 720

accggtatta ccctgttcgc ggatggcggt atgacgctgt acccatcctt ccaggccggt 780

cgtggttaa 789

<210> 14

<211> 262

<212> PRT

<213> 谷氨酸脱氢酶(GDH)

<400> 14

Met Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser

1 5 10 15

Ala Thr Gly Leu Gly Arg Ala Met Gly Val Arg Phe Ala Lys Glu Lys

20 25 30

Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser Arg Asp Ser Glu Ala Asn Asp

35 40 45

Val Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys

50 55 60

Gly Asp Val Thr Val Glu Ala Asp Val Met Asn Leu Ile Gln Ser Ala

65 70 75 80

Val Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Ile

85 90 95

Glu Asn Ala Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Glu Asp Trp Asn Lys

100 105 110

Val Ile Asn Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala

115 120 125

Ile Lys Tyr Phe Val Glu His Asp Ile Lys Gly Ser Val Ile Asn Met

130 135 140

Ser Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu

165 170 175

Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile

180 185 190

Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Arg Ala

195 200 205

Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Lys Pro Glu Glu

210 215 220

Ile Ala Ala Val Ala Thr Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val

225 230 235 240

Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser

245 250 255

Phe Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 野生型编码基因上游引物(PpYSDR-F)

<400> 15

ggatccatgg ctaatgcaaa aaccgcac 28

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 野生型编码基因下游引物(PpYSDR-R)

<400> 16

ctcgagtcac cagaccaagg gttcgc 26

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> M85Q编码基因上游引物(85Q-F)

<400> 17

gcgtccaagg ccccctgccg caagac 26

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> M85Q编码基因下游引物(85Q-R)

<400> 18

ggggccttgg acgcccgcat tgacgaatac 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 88N编码基因上游引物(88N-F)

<400> 19

ggccccaacc cgcaagacct ggagacggtt 30

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 88N编码基因下游引物(88N-R)

<400> 20

ttgcgggttg gggcccatga cgcccg 26

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 136A编码基因上游引物(136A-F)

<400> 21

tcgatcgctg gcagcgtaac catccccga 29

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 136A编码基因下游引物(136A-R)

<400> 22

gctgccagcg atcgaactca tgaaggccag cacg 34

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 143A编码基因上游引物(143A-F)

<400> 23

atccccgctg ggggcgaaat ttgcctgtac 30

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 143A编码基因下游引物(143A-R)

<400> 24

gcccccagcg gggatggtta cgctgccc 28

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> GDH编码基因上游引物(GDH-F)

<400> 25

catatgggtt acagcgatct ggaag 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> GDH编码基因下游引物(GDH-R)

<400> 26

gaattcttaa ccacgaccgg cctgg 25

Claims

1.一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体，其特征在于，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺、第88位亮氨酸突变为天冬酰胺、第136位亮氨酸突变为丙氨酸和第143位天冬氨酸突变为丙氨酸中的一种或几种后得到；

所述短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的短链羰基还原酶PpYSDR突变体，其特征在于，

所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺后得到，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

或者，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第88位亮氨酸突变为天冬酰胺后得到，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

或者，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第136位亮氨酸突变为丙氨酸后得到，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

或者，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第143位天冬氨酸突变为位丙氨酸后得到，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

或者，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺、第88位亮氨酸突变为天冬酰胺、第136位亮氨酸突变为丙氨酸和第143位天冬氨酸突变为丙氨酸后得到，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

3.如权利要求1所述的短链羰基还原酶PpYSDR突变体的编码基因，其特征在于，所述突变体的编码基因由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因经特异性引物扩增得到，其中：

短链羰基还原酶PpYSDR野生型的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述特异性引物为85Q、88N、136A和143A中的一种或多种；

所述特异性引物85Q的核苷酸序列为：

85Q-F gcgtccaaggccccctgccgcaagac；

85Q-R ggggccttggacgcccgcattgacgaatac；

所述特异性引物88N的核苷酸序列为：

88N-F ggccccaacccgcaagacctggagacggtt；

88N-R ttgcgggttggggcccatgacgcccg；

所述特异性引物136A的核苷酸序列为：

136A-F tcgatcgctggcagcgtaaccatccccga；

136A-R gctgccagcgatcgaactcatgaaggccagcacg；

所述特异性引物143A的核苷酸序列为：

143A-F atccccgctgggggcgaaatttgcctgtac；

143A-R gcccccagcggggatggttacgctgccc。

4.根据权利要求3所述的短链羰基还原酶PpYSDR突变体的编码基因，其特征在于，

所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺后得到时，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第88位亮氨酸突变为天冬酰胺后得到时，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第136位亮氨酸突变为丙氨酸后得到时，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第143位天冬氨酸突变为丙氨酸后得到时，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列的第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺、第88位亮氨酸突变为天冬酰胺、第136位亮氨酸突变为丙氨酸和第143位天冬氨酸突变为丙氨酸后得到时，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

5.一种含有如权利要求3或4所述的突变体的编码基因的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为质粒、噬菌体或病毒载体。

7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为质粒pET-30a。

8.一种表达重组羰基还原酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有如权利要求3或4所述的突变体的编码基因，或者所述基因工程菌含有如权利要求5或6或7所述的重组表达载体。

9.根据权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌E.coli BL21。

10.如权利要求1至2任一所述的突变体或者如权利要求3至4任一所述的编码基因或者如权利要求5至7任一所述的重组表达载体或者权利要求8至9任一所述的基因工程菌在以雄烯二酮为底物制备睾酮上的应用。