CN114908129A

CN114908129A - 用于制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的脱氢酶

Info

Publication number: CN114908129A
Application number: CN202111158663.2A
Authority: CN
Inventors: 王金刚; 陈舒明; 梁岩; 任亮
Original assignee: Shanghai Kangxin Chemical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Kangxin Chemical Co Ltd
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN114908129B

Abstract

本发明提供了一种利用脱氢酶制备(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：以4‑氯乙酰乙酸乙酯为底物，使用异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQ ID NO:3催化还原反应，得到(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯。

Description

用于制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的脱氢酶

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种利用NADP依赖型异丙醇脱氢酶制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。

背景技术

4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutyrate，CHBE)有两种立体构型，分别是(R)-CHBE和(S)-CHBE，其中(S)-CHBE作为一种重要的医药中间体，可以用于合成海洋溴吡咯生物碱B和C(Slagenins B和C)、他汀类药物-羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂的重要中间体及1,4-二氢吡啶型β阻断剂等，目前对于(S)-CHBE的研究比较多，技术也相对成熟。(R)-CHBE同样作为原料中间体也被广泛用于医药、农药、化妆品等的生产中，如用于合成(R)-4-氨基-3-羟基丁酸、L-肉碱、大内酰亚胺、(R)-4-氨基-3-羟基丁酸、(R)-4-羟基-2-吡咯烷酮、负霉素等，近年来有报道将(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯用于超级他汀类药物。

(R)-4-氯-3-羟基丁酸酯((R)-CHBE)的制备方法主要有两种，化学法和生物酶催化法。化学法主要是在高压条件下，利用手性钌催化剂对4-氯乙酰乙酸乙酯进行加氢还原获得的，该方法也是大规模生产总常用的方法，该方法制备的产物ee值在97％以上，该方法催化剂价格高、反应条件严格、反应设备要求高、能耗大，且产物副产物多、产物收率低、手性纯度低等，因此工艺也逐渐被淘汰。生物酶催化法又分为两种，一种是外消旋体拆分法，另一种是不对称还原法。外消旋体拆分法是混旋的CHBE经酶催化，使得其中一种构型(S)-CHBE发生转酯、氨解或水解反应，从而实现CHBE对映体的分离，最常用的就是脂肪酶(如Novozym435)催化拆分，该方法制备的产品手性纯度较高，ee值超过99％，但反应产物收率低，底物中有一半左右是不能被转化的，原料利用率低。不对称还原法是利用高催化活性和立体选择性的酮还原酶(羰基还原酶)，以4-氯乙酰乙酸乙酯(以下简称为COBE)最为底物，将其3-位的羰基立体选择性地还原成R型的羟基，该方法制备的(R)-CHBE产物ee值也超过99％，底物基本可以被完全利用掉，原料利用率高。

但该方法存在的问题在于，天然发现的立体选择性较好的酶，其酶活相对不高，产业化成本较高，限制了其工业化开发应用。迄今，大多数报道的微生物来源酶催化产生的都是产(S)型CHBE，并同时具有高对映选择性和高产率。但是，仅有极少有酶能产生(R)型CHBE，并伴随立体选择性较低(如ee值70％)或产率低等特性。

发明内容

发明人对于上述酶催化立体选择性还原途径进行了研究，研究重点集中在微生物来源的酮还原酶(羰基还原酶)及其定向突变进化。期间意外地发现一种细菌Caldanaerobacter subterraneus(地下热厌氧杆形菌)来源的NADP依赖型异丙醇脱氢酶(NADP-dependent isopropanol dehydrogenase)也能催化酮基进行立体选择性还原反应，即还具有酮还原酶的功能，是个双功能酶。该脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1(GenBank登录号KUK09008)，当将其应用于4-氯乙酰乙酸乙酯还原时，能够高度立体选择性地还原得到(R)-CHBE；通过对该酶进行突变，还得到了一些酶活力进一步提高的突变体。因此，本发明包括如下技术方案。

一种酶催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：

以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，使用异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQID NO:3催化还原反应，得到(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

其中，野生型异丙醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MKGFAMLSIGKVGWIEVEKPKAGPFDAIVRPLAVAPCSSDIHTVFEGGLGELHNAVLGHEAVGEVVEVGSEVKDFKPGDKVVIPAITPDWRTLDVQRGYHQHSGGMLAGYKFTVQKPGVFAEYIHVNDADMNLAHLPDGISLEAAVMITDMMTTGFHGAELADIELGATVAVLGIGPVGLMAVAGAKLRGAGRIIAVGSRPVCVDAAKYYGATDIVNYKDGPIDSQIMDLTEGKGVDAAIIAGGNVDIMATAVKIVKPGGTIANVNYFGEGDVLPVPRLEWGCGMAHKTIKGGLCPGGRLRMERLIDLVVYKRVDPSKLVTHVFRGFDNIEKALMLMKDKPKDLIKPVVILA(SEQ ID NO:1)；

所述突变体是野生型异丙醇脱氢酶的Y99C、M106I、A121T、H135R、E165K、R338T突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MKGFAMLSIGKVGWIEVEKPKAGPFDAIVRPLAVAPCSSDIHTVFEGGLGELHNAVLGHEAVGEVVEVGSEVKDFKPGDKVVIPAITPDWRTLDVQRGCHQHSGGILAGYKFTVQKPGVFTEYIHVNDADMNLARLPDGISLEAAVMITDMMTTGFHGAELADIKLGATVAVLGIGPVGLMAVAGAKLRGAGRIIAVGSRPVCVDAAKYYGATDIVNYKDGPIDSQIMDLTEGKGVDAAIIAGGNVDIMATAVKIVKPGGTIANVNYFGEGDVLPVPRLEWGCGMAHKTIKGGLCPGGRLRMERLIDLVVYKRVDPSKLVTHVFRGFDNIEKALMLMTDKPKDLIKPVVILA(SEQ ID NO:3)。

上述反应体系中可以添加有NADPH再生系统，使得反应在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶NADP+的存在下进行。

NADPH再生系统包括葡萄糖、辅酶NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，辅酶II)和葡萄糖脱氢酶。反应时，葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖氧化，NADP+作为氧化剂掠夺电子，还原为NADPH，其作为生物合成的还原剂促进还原反应。

在一种优选的实施方式中，上述异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3呈其表达微生物菌体形式。

相应地，上述葡萄糖脱氢酶(简称GDH)可以呈酶的形式例如游离酶或固定化酶，也可以呈其表达微生物菌体形式。

优选地，上述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。优选地，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第二个方面提供了一种异丙醇脱氢酶/羰基还原酶双功能酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

相应地，本发明还提供了编码上述双功能酶SEQ ID NO:3的基因。

优选地，上述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

本发明的第三个方面提供了一种质粒，其包含上述基因。

上述质粒载体可以选自PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。

本发明的另一个方面提供了一种微生物，其表达上述的基因例如SEQ ID NO:4。

上述微生物可以选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。优选地，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供的脱氢酶突变体SEQ ID NO:3可以催化100g/L底物4-氯乙酰乙酸乙酯底物生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，转化率超过90％，产物ee值超过99.5％，有利于实现生物催化法生产(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的工业化开发应用。

附图说明

图1是表达野生型异丙醇脱氢酶的质粒pET22b-CsADH图谱。

图2是酶催化反应0h、8h及20h反应体系的HPLC图谱。

具体实施方式

发明人筛选得到的野生型异丙醇脱氢酶来源于Caldanaerobacter subterraneus(地下热厌氧杆形菌)，其为NADP依赖型异丙醇脱氢酶，兼具酮还原酶(羰基还原酶)功能，是个双功能酶。

为了提高该双功能酶的实际应用可行性，增强其催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)还原为(R)-CHBE的酶活力，对该酶进行突变。经过三轮易错PCR的随机突变库高通量筛选，最终获得了几个酶活力提高明显的突变体，包括一个(Y99C、M106I、A121T、H135R、E165K、R338T)突变体，其酶活力比野生型高出3倍多。

在本文中，术语“野生(型)异丙醇脱氢酶”、“野生(型)脱氢酶”表示相同的意义，都是指野生型的NADP依赖型异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1。

相对应地，术语“异丙醇脱氢酶突变体”、“突变体异丙醇脱氢酶”、“突变脱氢酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指异丙醇脱氢酶的突变体例如SEQ ID NO:3。为简要起见，有时为了表述方便起见，在本发明中可以将野生型异丙醇脱氢酶与其突变体统称为“异丙醇脱氢酶”，只要不与野生酶SEQ ID NO:1混淆即可。

本发明的脱氢酶突变体的氨基酸数量有352个，序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

为了在微生物宿主例如基因工程中最常用的大肠杆菌宿主中最佳地表达异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1及其突变体SEQ ID NO:3，本发明对其表达基因进行了密码子优化。

密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

经过密码子优化，野生型异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQ IDNO:2，而异丙醇脱氢酶突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4。

当作为生物催化剂用于制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯时，本发明的异丙醇脱氢酶以及添加的葡萄糖脱氢酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。

本领域技术人员容易理解，菌体本身就是一种天然的酶固定化形式，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

另一方面，相比分离出的酶的催化，本发明利用微生物的简单发酵就可以源源不断、取之不尽地提供酶或的供应，无需进一步提取、纯化分离酶等操作，经济性显而易见，为工业化应用创造条件。

在制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸酯的反应体系中，底物4-氯乙酰乙酸乙酯的浓度可选择5～12wt％，优选10wt％。葡萄糖摩尔加量可以是4-氯乙酰乙酸乙酯摩尔量的1.2-2倍，优选1.5倍加量。反应温度选择28～30℃，优选30℃。上述反应体系中还添加辅酶，所述的辅酶可以为NADP+或者NAD+，优选NADP+。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄·3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

底物和产物HPLC检测方法：Agilent C18(5μm，4.6×250mm)；检测波长210nm；流动相A：0.3％磷酸；流动相B：乙腈；流动相A：流动相B＝60：40；操作温度40℃；流速1ml/min)。

需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。比如CsADH既可以代表野生酶表达菌株，也可以代表质粒pET22b-CsADH编号、野生酶SEQ ID NO:1编号、野生酶编码基因SEQ ID NO:2编号。

实施例1：构建表达野生型异丙醇脱氢酶的重组大肠杆菌

根据Caldanaerobacter subterraneus(地下热厌氧杆形菌)来源的NADP依赖型异丙醇脱氢酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1(GenBank登录号KUK09008)，进行适于大肠杆菌表达的密码子优化，优化后的基因序列为SEQ ID NO:2。全基因合成该基因序列，在两端设计酶切位点Nde I和XhoI，并亚克隆到载体pET22b(购自Novagen)上相应位点，从而获得重组质粒pET22b-CsADH，如图1所示，长6426bp。将构建好的重组质粒pET22b-CsADH用电转化法或者氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，得到表达野生型异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-CsADH，简称CsADH。

实施例2：构建表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌

参照实施例1的方法，对Bacillus cereus(蜡样芽孢杆菌)来源的葡萄糖脱氢酶(GenBank登录号AE016877.1)进行密码子优化，获得其编码基因的核酸序列SEQ ID NO:5，全基因合成SEQ ID NO:5，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET22b(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET22b-BcGDH。将重组质粒pET22b-BcGDH转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-BcGDH，简称BcGDH。

实施例3：易错PCR和随机突变库的构建

以野生酶的基因SEQ ID NO:2为模板，进行易错PCR随机突变体库构建。

正向引物CsADH-F为5’-ATGAAAGGTTTCGCTATGCTGTCCATC-3’，

反向引物CsADH-R为5’-TTAAGCCAGGATAACAACCGGTTTGATC-3’。

易错PCR反应体系：1-10ng质粒模板，10μM引物CsADH-F，10μM引物CsADH-R，1×Taqbuffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl₂，(0mM、0.1mM、0.2mM)MnCl₂，5个单位的Taq酶(Takara公司)。

PCR反应条件：95℃5min；95℃40s，58℃50s，72℃1min/kbp，25-30个循环；72℃10min。

胶回收1k bp随机突变片段作为大引物(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃20s，60℃30s，68℃2min/kbp，25-30个循环；68℃10min。

DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过10⁴个克隆的易错PCR随机突变体库。

实施例4：随机突变体库的高通量筛选

4.1选取突变体库中的转化子，接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中，37℃培养过夜，然后取80μl过夜培养物，转接至800μl含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mM IPTG，降温至25℃，培养过夜。4000rpm离心15min，弃上清，加入200μL含无菌水重悬菌体用于酶活力测定。

4.2将上述步骤4.1中200μL菌悬液加入200μL底物反应液(0.1M pH7.0磷酸钾盐缓冲液，100mM 4-氯乙酰乙酸乙酯，200mM葡萄糖，10mM NADPH)在30℃的条件下反应1小时，取反应液300μl，4℃，12000rpm离心10min，取200μl上清到酶标板上读取OD₃₄₀值。

酶活力定义：在30℃下每分钟还原生成1μmol的NADPH或者氧化生成1μmol的NADP+所需要的酶量定义为1个单位(U)。

在每一轮随机突变库，通过对大约20000个突变体克隆筛选，筛选出酶活力明显高出菌种CsADH发酵液酶活性的克隆菌种，进行基因组DNA测序。将正向突变克隆作为下一轮出发菌种，再次按照易错PCR的流程进行新一轮的随机易错PCR突变库的构建及筛选。按照此流程，共进行三轮随机易错PCR突变库的构建及筛选，最终获得一株酶活力提高明显的突变克隆CsAR-mut3-1676菌株。突变菌株CsAR-mut3-1676与野生酶表达菌株发酵液催化活力对比情况显示于表1中。

委托苏州金唯智生物科技有限公司对突变菌株CsAR-mut3-1676进行基因组测序比对，该菌株基因组中的异丙醇脱氢酶基因序列为SEQ ID NO:4，确认其氨基酸序列为SEQID NO:3。

表1、突变菌株与野生酶表达菌株的对比结果(96孔板筛选)

结果表明，突变酶SEQ ID NO:4酶活力较野生型提高了3.2倍左右。

实施例5：突变酶催化还原反应实验

5.1菌株发酵

分别挑取异丙醇脱氢酶突变体表达菌株CsAR-mut3-1676和葡萄糖脱氢酶表达菌株BcGDH单菌落，分别接种至3mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。分别按照1v/v％接种量分别转接至200mL TB培养基中，37℃，250rpm培养至OD₆₀₀0.6-0.8时，加入0.5mM IPTG，28℃，200rpm培养过夜。然后4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体冷冻备用。

5.2催化(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成

反应体系：100mM磷酸钾盐缓冲液(pH6.8)，10wt％4-氯乙酰乙酸乙酯，16.5wt％葡萄糖，1mM ZnCl₂，2mM NADP+，5％w/v CsAR-mut3-1676冻融菌体，2.5％w/v BcGDH冻融菌体，30℃反应8-20小时，HPLC检测产物样品浓度，结果显示反应超过8小时，体系中产物生成率基本稳定在90％左右，产物ee值检测超过99.5％。反应的HPLC图谱见图2。

以上实验表明，异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1及其突变体SEQ ID NO:3能够催化4-氯乙酰乙酸乙酯进行3-位酮基的不对称还原反应，得到(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，具有羰基还原酶功能，拓展了异丙醇脱氢酶的用途。

序列表

<110> 上海康鑫化工有限公司

<120> 用于制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的脱氢酶

<130> SHPI2110378

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 352

<212> PRT

<213> Caldanaerobacter subterraneus

<400> 1

Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu

1 5 10 15

Val Glu Lys Pro Lys Ala Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu

20 25 30

Ala Val Ala Pro Cys Ser Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Gly

35 40 45

Leu Gly Glu Leu His Asn Ala Val Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu

50 55 60

Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Lys

65 70 75 80

Val Val Ile Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Leu Asp Val Gln

85 90 95

Arg Gly Tyr His Gln His Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Tyr Lys Phe

100 105 110

Thr Val Gln Lys Pro Gly Val Phe Ala Glu Tyr Ile His Val Asn Asp

115 120 125

Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Asp Gly Ile Ser Leu Glu Ala

130 135 140

Ala Val Met Ile Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly

165 170 175

Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly

180 185 190

Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys

195 200 205

Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Asp

210 215 220

Ser Gln Ile Met Asp Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ile Ala Gly Gly Asn Val Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val

245 250 255

Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Asp

260 265 270

Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys

275 280 285

Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg

290 295 300

Leu Ile Asp Leu Val Val Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val

305 310 315 320

Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Leu Met Leu

325 330 335

Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile Leu Ala

340 345 350

<210> 2

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgaaaggtt tcgctatgct gtccatcggt aaagttggtt ggatcgaagt tgaaaaaccg 60

aaagctggtc cgttcgacgc tatcgttcgt ccgctggctg ttgctccgtg ctcctccgac 120

atccacaccg ttttcgaagg tggtctgggt gaactgcaca acgctgttct gggtcacgaa 180

gctgttggtg aagttgttga agttggttcc gaagttaaag acttcaaacc gggtgacaaa 240

gttgttatcc cggctatcac cccggactgg cgtaccctgg acgttcagcg tggttaccac 300

cagcactccg gtggtatgct ggctggttac aaattcaccg ttcagaaacc gggtgttttc 360

gctgaataca tccacgttaa cgacgctgac atgaacctgg ctcacctgcc ggacggtatc 420

tccctggaag ctgctgttat gatcaccgac atgatgacca ccggtttcca cggtgctgaa 480

ctggctgaca tcgaactggg tgctaccgtt gctgttctgg gtatcggtcc ggttggtctg 540

atggctgttg ctggtgctaa actgcgtggt gctggtcgta tcatcgctgt tggttcccgt 600

ccggtttgcg ttgacgctgc taaatactac ggtgctaccg acatcgttaa ctacaaagac 660

ggtccgatcg actcccagat catggacctg accgaaggta aaggtgttga cgctgctatc 720

atcgctggtg gtaacgttga catcatggct accgctgtta aaatcgttaa accgggtggt 780

accatcgcta acgttaacta cttcggtgaa ggtgacgttc tgccggttcc gcgtctggaa 840

tggggttgcg gtatggctca caaaaccatc aaaggtggtc tgtgcccggg tggtcgtctg 900

cgtatggaac gtctgatcga cctggttgtt tacaaacgtg ttgacccgtc caaactggtt 960

acccacgttt tccgtggttt cgacaacatc gaaaaagctc tgatgctgat gaaagacaaa 1020

ccgaaagacc tgatcaaacc ggttgttatc ctggcttaa 1059

<210> 3

<211> 352

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu

1 5 10 15

Val Glu Lys Pro Lys Ala Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu

20 25 30

Ala Val Ala Pro Cys Ser Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Gly

35 40 45

Leu Gly Glu Leu His Asn Ala Val Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu

50 55 60

Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Lys

65 70 75 80

Val Val Ile Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Leu Asp Val Gln

85 90 95

Arg Gly Cys His Gln His Ser Gly Gly Ile Leu Ala Gly Tyr Lys Phe

100 105 110

Thr Val Gln Lys Pro Gly Val Phe Thr Glu Tyr Ile His Val Asn Asp

115 120 125

Ala Asp Met Asn Leu Ala Arg Leu Pro Asp Gly Ile Ser Leu Glu Ala

130 135 140

Ala Val Met Ile Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ile Lys Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly

165 170 175

Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly

180 185 190

Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys

195 200 205

Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Asp

210 215 220

Ser Gln Ile Met Asp Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ile Ala Gly Gly Asn Val Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val

245 250 255

Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Asp

260 265 270

Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys

275 280 285

Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg

290 295 300

Leu Ile Asp Leu Val Val Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val

305 310 315 320

Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Leu Met Leu

325 330 335

Met Thr Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile Leu Ala

340 345 350

<210> 4

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgaaaggtt tcgctatgct gtccatcggt aaagttggtt ggatcgaagt tgaaaaaccg 60

aaagctggtc cgttcgacgc tatcgttcgt ccgctggctg ttgctccgtg ctcctccgac 120

atccacaccg ttttcgaagg tggtctgggt gaactgcaca acgctgttct gggtcacgaa 180

gctgttggtg aagttgttga agttggttcc gaagttaaag acttcaaacc gggtgacaaa 240

gttgttatcc cggctatcac cccggactgg cgtaccctgg acgttcagcg tggttgccac 300

cagcactccg gtggtatcct ggctggttac aaattcaccg ttcagaaacc gggtgttttc 360

actgaataca tccacgttaa cgacgctgac atgaacctgg ctcgcctgcc ggacggtatc 420

tccctggaag ctgctgttat gatcaccgac atgatgacca ccggtttcca cggtgctgaa 480

ctggctgaca tcaaactggg tgctaccgtt gctgttctgg gtatcggtcc ggttggtctg 540

atggctgttg ctggtgctaa actgcgtggt gctggtcgta tcatcgctgt tggttcccgt 600

ccggtttgcg ttgacgctgc taaatactac ggtgctaccg acatcgttaa ctacaaagac 660

ggtccgatcg actcccagat catggacctg accgaaggta aaggtgttga cgctgctatc 720

atcgctggtg gtaacgttga catcatggct accgctgtta aaatcgttaa accgggtggt 780

accatcgcta acgttaacta cttcggtgaa ggtgacgttc tgccggttcc gcgtctggaa 840

tggggttgcg gtatggctca caaaaccatc aaaggtggtc tgtgcccggg tggtcgtctg 900

cgtatggaac gtctgatcga cctggttgtt tacaaacgtg ttgacccgtc caaactggtt 960

acccacgttt tccgtggttt cgacaacatc gaaaaagctc tgatgctgat gacagacaaa 1020

ccgaaagacc tgatcaaacc ggttgttatc ctggcttaa 1059

<210> 5

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atgtatagtg atttagcagg gaaagttgtc gttattacag gatcagcaac tggtcttgga 60

agagcgatgg gagtgaggtt tgctaaggaa aaagcgaaag tggttattaa ttatcgctca 120

cgagaatcag aagcgaatga tgtgttagaa gaaattaaaa aggtaggcgg cgaagcgatt 180

gctgtaaaag gtgatgtaac cgtcgaatca gatgttgtga atctcattca atctgctgtg 240

aaagagtttg gtacgcttga cgttatgatt aataatgcag ggatagaaaa cgcggtaccg 300

tcgcatgaaa tgccgcttga agattggaat agggtaatta atacaaattt aacaggtgct 360

tttttaggaa gtcgtgaagc gattaaatat tttgtagaac atgatattaa aggttctgtc 420

attaatatgt ctagtgttca tgagaaaatt ccgtggccac tatttgtgca ctatgcagcg 480

agtaagggtg gtattaaact gatgacagaa acgttagcgc tagaatatgc gccaaaaggt 540

attcgagtaa ataatattgg accaggtgca attaataccc cgattaatgc agaaaagttt 600

gctgatccta aaaaacgtgc tgacgtagaa agtatgatac cgatgggcta tattggaaac 660

cctgaagaaa ttgcagcagt agcaacttgg ctcgcttctt cagaggcgag ttatgtaacg 720

ggcattacgc tatttgcaga tggtggaatg acgttatatc catcgtttca agctgggcgt 780

gggtaa 786

Claims

1.一种酶催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：

以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，使用异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQ IDNO:3催化还原反应，得到(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶NADP+的存在下进行。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NADP依赖型异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3呈其表达微生物菌体形式。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。

5.一种异丙醇脱氢酶/羰基还原酶双功能酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

6.编码如权利要求5所述双功能酶SEQ ID NO:3的基因。

7.如权利要求6所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

8.一种质粒，其特征在于，包含如权利要求6或7所述的基因。

9.如权利要求8所述的质粒，其特征在于，质粒载体选自PET系列。

10.一种微生物，其表达如权利要求7所述的基因。