CN117947121A - 用于生产(r)-3-氨基丁醇的转氨酶 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用转氨酶制备(R)‑3‑氨基丁醇的方法，包括如下步骤：以4‑羟基‑2‑丁酮为底物，使用转氨酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQ ID NO:3催化还原氨化反应，得到(R)‑3‑氨基丁醇。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种利用转氨酶生产(R)-3-氨基丁醇的方法。
背景技术
手性胺是指一类手性中心含有氨基的化合物，是重要的手性助剂，是医药和天然产物的关键中间体。而许多手性药物的关键中间体，都会用到光学活性的(R)-3-氨基丁醇，如杜鲁韦特，是由英国制药巨头葛兰素史克(GSK)与日本盐野义制药公司(Shionogi)合作开发的一种抗艾滋病新药，2013年8月12日美国食品和药物管理局(FDA)批准用于既往已治疗过、或初治HIV-1成人、12岁及以上体重至少40千克儿童感染者。
目前化学合成法生成的(R)-3-氨基丁醇存在很多问题，如合成原料价格昂贵，工艺复杂，原料危险，还会带来大量废酸废水。专利CN101417954B公开了首先以乙酰乙酸酯和手性苯乙胺进行反应，生成3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸酯非对映异构体3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸酯，再使用三醋酸硼氢化钾将其还原成3-(1’-甲基苄胺)-丁酸酯非对映异构体，成盐后拆分得到手性纯的3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸酯，最后该酯经催化还原脱苄后得光学纯3-氨基丁醇。CN107805205A公开了首先通过(R)-1-甲基苄胺与丁酮醇反应得到3-(1-甲基苄胺)-丁醇消旋体，拆分得到(R,R)-3-(1’-甲基苄胺)-丁醇，经脱苄还原，得到(R)-3-氨基丁醇。该工艺所用手性苯胺价格昂贵，限制了工业化生产。
相比化学合成法，酶法催化合成(R)-3-氨基丁醇更为高效绿色，使用的原料价格便宜，反应条件温和，且不会有大量废水和费酸，产物易于分离，CN201410372024.X公开了D-氨基酸脱氢酶催化10-300mM底物反应生成(R)-3-氨基丁醇，转化率95％，收率85％以上。CN108823179A公开了在最优体系下，对500mM底物的转化率达到78％，ee值达到99.9％，与野生型相比较，对底物转化率分别提高了25％。CN110358804B公开了以3-氨基正丁醇外消旋体和丙酮酸为底物，用ω-转氨酶为催化剂，立体特异性地催化(S)-3-氨基正丁醇与丙酮酸反应，然后从反应体系中回收未参与反应的对映体(R)-3-氨基正丁醇的拆分方法。
CN104131048A、CN104178533A和CN106754806A公开了利用转氨酶及其突变体催化4-羟基-2-丁酮合成(R)-3-氨基丁醇的方法，但由于反应浓度低，转化不稳定等原因，无法进行工业化应用开发。
发明内容
考虑到化合物4-羟基-2-丁酮是廉价的化工原料，发明人尝试使用转氨酶催化其进行还原氨化反应来制备(R)-3-氨基丁醇。尝试了多种转氨酶，包括已拥有的Neosartoryafischeri来源的转氨酶(NCBI登录号KAF4246444.1)及其突变体(见CN112094856A)、Aspergillus terreus来源的ω-转氨酶(NCBI登录号XM_001209325)及其突变体(见CN107058256B)、Arthrobacter sp.KNK168来源的转氨酶及其突变体(见CN115873816A和CN116240189A)等，发现这些转氨酶并不能有效催化4-羟基-2-丁酮反应来合成光学纯度高的(R)-3-氨基丁醇。于是又对近百种微生物来源的转氨酶进行筛选，通过实验和比较，发现一种来源于分枝杆菌(Mycobacterium sp.OAS707)的IV类转氨酶(NCBI登录号：WP_192725813.1)符合预期，该酶具有很高的立体选择性，产物(R)-3-氨基丁醇的光学纯度ee值能够达到99％以上。为了提高其酶活力，我们还通过易错PCR的随机突变方法对该酶进行突变，还得到了一些酶活力进一步提高的突变体。因此，本发明包括如下技术方案。
一种酶催化制备(R)-3-氨基丁醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以4-羟基-2-丁酮为底物，使用分枝杆菌Mycobacterium sp.OAS707来源的IV类转氨酶(NCBI号：WP_192725813.1)或者其酶活力提高的突变体催化反应，得到(R)-3-氨基丁醇。
其中Mycobacterium sp.OAS707来源的野生型转氨酶(NCBI号：WP_192725813.1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：
MTVVDQGTSNLVAVEPGAIREHTPAGSVIQYSDYELDTSSPYAGGVAWIEGEYIPASEARISIFDTGFGHSDLTYTVAHVWHGNIFRLGDHLDRLFDGARKLRLDPGYSKDELADITKRCVAMSQLRESFVNLTVTRGYGKRKGEKDLSKLTHQVYIYAIPYLWAFPPHEQIFGTTAIVPRHVRRAGRNTVDPTIKNYQWGDLTAASFEAKDRGARTAILMDADNCVAEGPGFNVVIVKDGKLASPSRNALPGITRKTVFELADTMGIEATLRDVTSHELYDADELMAVTTAGGVTPINTLDGEPIGDGAPGPLTVAIRDRFWALMDEPSPLIEAIDY(SEQ ID NO:1)。
优选地，所述突变体为选自下述的多肽：
(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；
(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。
上述突变体是野生型转氨酶第23位的苏氨酸突变为丝氨酸(T23S)、第34位的酪氨酸突变为天冬氨酸(Y34D)、第68位的脯氨酸突变为丝氨酸(F68S)、第125位的谷氨酰胺突变成亮氨酸(Q125L)、第193位的脯氨酸突变成精氨酸(P193R)、第231位的脯氨酸突变成亮氨酸(P231L)、第292位的丙氨酸突变成缬氨酸(A292V)、第311位的脯氨酸突变成丙氨酸(P311A)所形成的突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：
MTVVDQGTSNLVAVEPGAIREHSPAGSVIQYSDDELDTSSPYAGGVAWIEGEYIPASEARISIFDTGSGHSDLTYTVAHVWHGNIFRLGDHLDRLFDGARKLRLDPGYSKDELADITKRCVAMSLLRESFVNLTVTRGYGKRKGEKDLSKLTHQVYIYAIPYLWAFPPHEQIFGTTAIVPRHVRRAGRNTVDRTIKNYQWGDLTAASFEAKDRGARTAILMDADNCVAEGLGFNVVIVKDGKLASPSRNALPGITRKTVFELADTMGIEATLRDVTSHELYDADELMAVTTVGGVTPINTLDGEPIGDGAAGPLTVAIRDRFWALMDEPSPLIEAIDY(SEQ ID NO:3)。
在一种实施方式中，反应体系中还添加氨供体，所述氨供体可以是有机胺例如甲基苄胺、异丙胺、三乙醇胺、邻苯二甲胺二盐酸、丙氨酸、醋酸铵等。
优选地，反应体系中添加有磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶。磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶可以促进转氨酶催化的氨基转移反应。
本技术领域公知，磷酸吡哆醛在许多酶促过程中充当辅酶，作用包括脱羧、脱氨、转氨作用、外消旋化等，在本发明中主要发挥促进转氨作用。
反应体系中磷酸吡哆醛的添加量可以为0.05-0.5g/L，优选0.1-0.4g/L，例如为0.2g/L左右。
上述酶催化反应中，反应温度为25-40℃，优选28-35℃，更优选30℃左右。
反应体系pH值为pH7.0-9.0，优选pH7.5-8.5，更优选pH8.0左右。
应理解，本文中在表述数值特征时，术语“左右”或者“大约”是指所表示的本数可以有±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的误差范围或浮动范围。
进一步地，反应体系中添加的底物浓度可以为2-55g/L，例如大约为44-50g/L。
可选地，还可以在反应体系中添加能与水混溶、但对酶伤害不大的有机溶剂比如乙腈、DMSO等来促进底物溶解，达到助溶目的。
进一步地，上述反应中，所述转氨酶或者其突变体除了呈酶形式存在外，还可以呈其表达微生物菌体形式。
上述微生物选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母。优选地，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明第二个方面提供了一种转氨酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
进一步地，本发明还提供了一种编码上述转氨酶突变体SEQ ID NO:3的基因。
例如，上述基因的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:4。
相应地，本发明还提供了一种DNA分子，其包含上述的基因比如SEQ ID NO:4。
本发明另一个方面提供了一种质粒，其包含上述的DNA分子。
上述的质粒载体可以选自PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。
本发明的另一个方面提供了一种微生物，其表达如上述的编码基因比如SEQ IDNO:4。优选是转化了上述质粒的转化子。
本发明筛选出的Mycobacterium sp.OAS707来源的转氨酶(NCBI号：WP_192725813.1)及其突变体SEQ ID NO:3具有很高的立体专一性，可以高效催化底物4-羟基-2-丁酮反应得到(R)-3-氨基丁醇，产物光学纯度ee值高达99％以上，具有工业化开发应用前景。
附图说明
图1是表达野生型转氨酶的质粒pET-ZA-0的结构图谱。
图2是检测转氨酶催化4-羟基-2-丁酮反应的HPLC图谱。
具体实施方式
发明人筛选得到的来源于分枝杆菌Mycobacterium sp.OAS707的IV类转氨酶(NCBI号：WP_192725813.1)具有符合预期的催化4-羟基-2-丁酮发生还原氨化反应的功能，且在反应中表现出很高的立体专一性。为了提高该酶在工业上应用的可行性，增强其酶活力，我们继续对该酶进行突变。在通过易错PCR进行随机突变库高通量筛选中，逐轮提高反应体系的pH值直至pH8.0左右，筛选出一株在pH7.0-pH8.0范围内均有较好酶活的突变株。
经过数轮易错PCR的随机突变库高通量筛选，最终获得了几个酶活力提高明显的突变体，包括一个(T23S、Y34D、F68S、Q125L、P193R、P231L、A292V、P311A)突变体，其酶活力比野生型高出近两倍。
在本文中，术语“野生(型)转氨酶”、“野生酶”表示相同的意义，都是指野生型的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的转氨酶(NCBI号：WP_192725813.1)。
相对应地，术语“转氨酶突变体”、“突变转氨酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指转氨酶的突变体例如SEQ ID NO:3。为简要起见，有时为了表述方便起见，在本发明中可以将野生型转氨酶与其突变体统称为“转氨酶”，只要不与野生酶SEQ ID NO:1混淆即可。
所述的“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、插入、化学修饰，优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代，则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知，保守性置换的常见情况包括：芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换；疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换，极性氨基酸Q、N之间的相互置换，碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换，酸性氨基酸D、E之间的相互置换，羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外，A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。
“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。
“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10％，同时保留酶活性和/或保留工程化醛缩酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。
“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中，改良的工程化醛缩酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的醛缩酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的醛缩酶多肽中。插入可以是在多肽的内部，或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
本发明的转氨酶突变体的氨基酸数量有338个，序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
为了在微生物宿主例如基因工程中最常用的大肠杆菌宿主中最佳地表达转氨酶SEQ ID NO:1及其突变体SEQ ID NO:3，本发明对其表达基因进行了密码子优化。
密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
经过密码子优化，野生型转氨酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQ ID NO:2，而转氨酶突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4。
当作为生物催化剂用于制备(R)-3-氨基丁醇时，本发明的转氨酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。
本领域技术人员容易理解，菌体本身就是一种天然的酶固定化形式，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
另一方面，相比分离出的酶的催化，本发明利用微生物的简单发酵就可以源源不断、取之不尽地提供酶或的供应，无需进一步提取、纯化分离酶等操作，经济性显而易见，为工业化应用创造条件。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4·3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
5L发酵罐的发酵培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/LK2HPO4.3H2O、2.31g/L KH2PO4、5g/L甘油，消泡剂0.5g/L，pH7.0-7.5、每罐的发酵液装液量为2L。
5L发酵罐的补料培养基：60％甘油。
底物和产物HPLC检测方法：安捷伦Agilent 1260液相色谱仪，waters Symmetry(250*4.6mm，5μm)色谱柱，流速1ml/min，波长：338nm，柱温：35℃，进样量20μl，流动相A：B＝40：60。
流动相A相：2.72g/L乙酸钠，0.018％三乙胺，0.3％四氢呋喃(pH7.20)。
流动相B相：50％乙腈，50％甲醇。
需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。
实施例1：表达野生型转氨酶的重组大肠杆菌的构建
筛选出的转氨酶是来源于分枝杆菌Mycobacterium sp.OAS707来源的IV类转氨酶(NCBI号：WP_192725813.1)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，将该转氨酶编号为ZA-0。对其进行适于大肠杆菌表达的密码子优化，优化后的编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:2，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因合成该序列，在两端设计酶切位点NdeI和XhoI，亚克隆到质粒pET24a的NdeI、XhoI位点，获得质粒pET-ZA-0，如图1所示。
将重组质粒pET-ZA-0用电转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，获得表达野生型转氨酶SEQ ID NO:1的重组大肠杆菌菌株BL-ZA-0。
实施例2：第1轮到第4轮随机突变点文库建立及高通量反应筛选
1、易错PCR法构建随机突变点库
以质粒pET-ZA-0为模板，利用易错PCR技术构建随机突变体文库。
设计如下引物对ZA-5/ZA-3：
正向引物ZA-5：5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC-3’，
反向引物ZA-3：5’-ATAATCAATCGCTTCAATCAGCG-3’。
以质粒pET-ZA-0为模板，进行PCR扩增，获得约1.0kb的转氨酶突变体DNA序列。
50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒(pET-ZA-0)模板，50pmol一对引物ZA-5和ZA-3，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(Takara)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。
对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)。以质粒pET-SH-0为模板，以约1.0kb的回收产物(随机突变片段)作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kb，25个循环；68℃10min。DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
2、突变体库的第1轮高通量筛选
挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有340μL的液体TB-Kan-0.2mMIPTG)，在25℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(50mM 4-羟基-2-丁酮，150mM异丙胺，2％ DMSO，1mMPLP，100mM磷酸盐缓冲液，pH值为7.0)重悬菌体，在30℃、250rpm条件下孵育3～6h。反应结束后，取100μl稀释10倍后进液相色谱仪检测(R)-3-氨基丁醇含量，测定产物转化率。
选择活力明显提升的菌株，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行核酸测序，通过基因组测序比对，确定氨基酸突变位点。选取活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株，重复随机突变库建立及以4-羟基-2-丁酮为底物的高通量反应筛选。
3、突变体库的第2轮高通量筛选
参照突变体库的第1轮高通量筛选方法，不同之处在于将反应体系的pH值调整为7.5，其它酶反应条件同第1轮筛选，即每孔为200μL酶反应液(50mM 4-羟基-2-丁酮，150mM异丙胺，2％ DMSO，1mM PLP，100mM磷酸盐缓冲液，pH值为7.5)重悬菌体，在30℃、250rpm条件下孵育3～6h。
4、突变体库的第3轮高通量筛选
参照突变体库的第1轮高通量筛选方法，不同之处在于将反应体系的pH值调整为8.0，其它酶反应条件同第1轮筛选，即每孔为200μL酶反应液(50mM 4-羟基-2-丁酮，150mM异丙胺，2％ DMSO，1mM PLP，100mM磷酸盐缓冲液，pH值为8.0)重悬菌体，在30℃、250rpm条件下孵育3～6h。
5、突变体库的第4轮高通量筛选
参照突变体库的第1轮高通量筛选方法，反应前加入100uL的pH值为8.0的100mM磷酸盐缓冲液，然后在50℃处理1h后进行反应，每孔加入100μL酶反应液(100mM 4-羟基-2-丁酮，300mM异丙胺，4％ DMSO，2mM PLP，100mM磷酸盐缓冲液，pH值为8.0)，在30℃、250rpm条件下孵育3～6h。
经过4轮突变和高通量筛选，筛选出酶活力明显较高的突变菌株BL-ZA-13，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行核酸测序，通过基因组测序比对来确定氨基酸突变位点。发现转氨酶ZA-13编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，相对于野生酶，发生了(T23S、Y34D、F68S、Q125L、P193R、P231L、A292V、P311A)突变。
各轮筛选情况列于表1中。
表1、第1～4轮随机突变库高通量筛选结果
备注：“+”代表活力百分比相对各自出发菌株大于0％小于等于50％；“++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于50％小于等于100％；“+++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于100％小于等于200％。
实施例3：菌株的发酵培养
分别对菌株BL-ZA-0和BL-ZA-13进行发酵罐培养，步骤为：从LB平板上挑取单菌落至5mL含有Kan的液体LB培养基中，在37℃、220rpm过夜培养。次日，按照体积浓度为5％的接种量转接至含有100mL液体TB培养基的摇瓶中，37℃、220rpm条件下培养至OD600nm达到6后，作为种子液转接到5L发酵罐。接种后400～800rpm/min、37℃条件下培养，控制溶氧在20～30％范围内。当菌体OD600nm达到20后，加入IPTG诱导转氨酶表达，IPTG的终浓度为0.2mM，28-30℃继续培养培养16-24h。全发酵过程利用氨水控制pH值为6.8～7.2，控制通气量在2.5～3.5范围内。发酵结束后，于4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体，按照200g/L的浓度使用PBS缓冲液进行重悬，然后高压破碎，得到全细胞反应液(粗酶液)。
实施例4：转氨酶突变体合成(R)-3-氨基丁醇的应用
在1L反应体系中，分别用BL-ZA-0和BL-ZA-13的全细胞反应液催化合成(R)-3-氨基丁醇。1L反应体系包括：0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)、100mL全细胞反应液、44g/L 4-羟基-2-丁酮底物、1mM PLP、2％ DMSO，1.5M异丙胺，用3M磷酸和1M氢氧化钠溶液控制pH值为8.0左右，在30℃，反应48h。反应结束后取样，加入10％盐酸终止反应，过滤后进行液相色谱检测。
结果显示，在反应48h后，BL-ZA-13全细胞反应液反应体系中底物合成(R)-3-氨基丁醇的转化率超过98％，而BL-ZA-0全细胞反应液反应体系中底物合成(R)-3-氨基丁醇的转化率仅为36％，该结果表明，相比表达野生型酶表达菌株，突变菌株BL-ZA-13或突变酶ZA-13催化底物生产(R)-3-氨基丁醇的转化率提升172％。
检测还发现，野生酶和突变酶ZA-13催化的反应产物(R)-3-氨基丁醇的光学纯度ee值都为99.3％以上，提示两者都具有很高的立体专一性，有潜力开发成工业用酶。
Claims (10)
1.一种酶催化制备(R)-3-氨基丁醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以4-羟基-2-丁酮为底物，使用分枝杆菌Mycobacterium sp.OAS707来源的IV类转氨酶(NCBI号：WP_192725813.1)或者其酶活力提高的突变体催化反应，得到(R)-3-氨基丁醇。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变体为选自下述的多肽：
(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；
(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上、且酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中还添加氨供体，所述氨供体是有机胺。
4.一种转氨酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
5.编码如权利要求4所述转氨酶突变体SEQ ID NO:3的基因。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
7.一种DNA分子，其特征在于，包含如权利要求6所述的基因。
8.一种质粒，其特征在于，包含如权利要求7所述的DNA分子。
9.如权利要求8所述的质粒，其特征在于，质粒载体选自PET系列。
10.一种微生物，其表达如权利要求5所述的基因。
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