CN117363591A - 用于合成g-7-adca的扩环酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种扩环酶突变体SEQ ID NO:3，其能在青霉素G浓度高达10mM的反应体系中高效催化底物进行扩环反应生成苯乙酰‑7‑氨基去乙酰氧基头孢烷酸，可用于工业化生产G‑7‑ADCA。

Description

用于合成G-7-ADCA的扩环酶突变体
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种扩环酶突变体及其在制备苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)中的应用。
背景技术
7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-Aminodesacetoxycephalosporanic acid，7-ADCA)是重要的头孢类抗菌素半合成中间体，在医药工业上用于合成头孢氨苄、头孢拉定和头孢羟氨苄等药物。
7-ADCA的合成方法包括化学合成法和生物合成法。化学合成法是以青霉素G(V)为起始原料制取7-ADCA，即青霉素钾盐经氧化、硅酯化扩环、裂解而得到7-ADCA，但是该工艺中使用大量有机试剂，难以达到当今的环保要求，且杂质含量多，生产成本高。利用生物合成法(酶法或微生物发酵法)全合成7-ADCA或替代化学合成步骤，具有环境友好和成本优势，但是主要核心技术掌握在国外公司手中，已报道的主要合成路线包括如下几种：
路线1是以青霉素N为底物扩环合成去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)，随后经多步反应合成7-ADCA(Proc Natl Acad Sci USA 1978.75:6253–6257.)。专利文献CN1357051A公开了利用D-氨基酸-氧化酶(DAO)将DAOC转化为戊二酰-7-ADCA，利用戊二酰基转移酶(GLA)将戊二酰-7-ADCA转化为7-ADCA。路线2是以异青霉素N为底物加入侧链形成侧链-6-APA，随后在扩环酶的作用下合成侧链-7-ADCA(产物)，最后在酰基转移酶的作用下合成7-ADCA。专利文献CN92112278.0公开了以己二酸(或盐(己二酸二钠)或酯)为侧链合成7-ADCA的方法，专利文献CN94192932.9公开了以3,3’-硫代二丙酸或其盐或酯为侧链合成7-ADCA的方法。路线3是以青霉素G的菌株合成产生苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)，进而合成7-ADCA(参见EP-A-0453047、EP-A-0222462)，首先用扩环酶基因转化高产青霉素G的产黄青霉菌株，使青霉素G经体内扩环形成G-7-ADCA，随后从发酵液中回收G-7-ADCA，再脱去酰基，最后回收结晶获得7-ADCA。
青霉素G已有成熟的发酵生产工艺，价格较为低廉，是制备7-ADCA的理想底物。然而天然扩环酶活性较低，是以青霉素G为底物合成7-ADCA的限速步骤。因此，迫切需要提高扩环酶的催化活性。
发明内容
众所周知，氨基酸突变是提高酶活性的主要手段，酶活性中心和口袋区域的关键氨基酸位点改变有时会引起酶性质的明显改变。基于生物信息学分析的多种微生物来源的扩环酶数据比较筛选，发明人选定能够催化青霉素G扩环形成G-7-ADCA的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)来源的扩环酶(WP_003952493.1)作为改造对象，尝试了对其进行突变，通过易错PCR法随机突变，结合突变体库高通量筛选，获得了一些酶活力显著提高的突变体。具体地，本发明提供了如下技术方案：
一种扩环酶突变体，其特征在于，为棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)来源的扩环酶(WP_003952493.1)的氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生下述一个以上、优选两个以上、更优选三个以上、更优选四个以上位点突变所形成的突变体：S98、A129、L159、S261、F294，该扩环酶突变体催化青霉素G转化为苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)的酶活力高于野生型扩环酶SEQ ID NO:1。
优选地，上述的突变选自S98G、A129S、L159M、S261T和F294I。
进一步地，上述扩环酶突变体的氨基酸序列优选为SEQ ID NO:3，是野生扩环酶(WP_003952493.1)的氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生S98G、A129S、L159M、S261T和F294I突变所形成的突变体。
本发明第二个方面提供了一种DNA分子，其包含编码上述扩环酶突变体的基因。
在一种实施方式中，编码上述氨基酸序列SEQ ID NO:3所示扩环酶突变体的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
本发明第三个方面提供了一种重组质粒，其包含上述的DNA分子。例如，该重组质粒上克隆了基因序列SEQ ID NO:4。
该重组质粒的质粒载体可以选自pMAL系列、pGEX系列、pET系列(例如pET22b、pET24a、pET28a)、pQE系列、pBAD系列、pCAl系列、pSH系列、pRSFDuet系列或其他载体。
优选地，上述重组质粒的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:5。
本发明的第四个方面提供了一种转化了上述重组质粒的微生物，即转入了上述重组质粒的转化子(转化体)，是表达上述扩环酶突变体的工程菌。
上述转化子的微生物宿主选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、需钠弧菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母。优选所述微生物宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第四个方面提供了上述扩环酶突变体或者上述微生物在生产苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)中的用途。
具体地，以青霉素G为反应底物、上述扩环酶突变体或者上述微生物催化生产苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)。
可选地，在反应体系中还可以添加有FeSO4、抗坏血酸和α-酮戊二酸。抗坏血酸(维生素C)通过氧化还原反应，将硫酸亚铁(FeSO4)的二价铁离子(Fe2+)转变为三价铁离子(Fe3 +)。
该扩环转化反应可用下述反应式表示：
该反应体系中，底物青霉素G的浓度为5mM以上，优选8mM以上，优选10mM以上，例如15mM以上。
在一种实施方式中，可以采用表达上述扩环酶突变体的上述微生物作为催化剂来催化底物进行扩环反应时，以微生物菌体形式或者其细胞破碎物形式添加于反应体系中。上述细胞破碎物例如是高压破碎菌体、细胞超声波破碎产物。
上述反应体系pH值为pH7.0-8.0，例如大约pH7.5。
上述反应体系的反应温度可以为20-40℃，例如22-35℃，优选25℃左右。
应理解，本文中在表述数值特征时，术语“大约”或者“左右”是指所表示的本数可以有±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的误差范围或浮动范围。
本发明筛选出酶活力显著提高的一些扩环酶突变体，其中氨基酸序列为SEQ IDNO:3的突变体的酶活力相比于野生型扩环酶(WP_003952493.1)提高了4倍，其催化青霉素G扩环反应合成G-7-ADCA时，底物青霉素G的浓度可达10mM以上，工业化应用潜力巨大。
附图说明
图1是本发明构建的用于表达野生酶扩环酶的质粒pET-KH1的结构示意图。
图2是扩环酶突变体SEQ ID NO:3催化青霉素G发生扩环反应过程中的HPLC检测图谱。
具体实施方式
棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)来源的扩环酶(WP_003952493.1)是一种2–酮戊二酸(2-oxoglutarate)和铁离子依赖性的加氧酶(oxygenase)，其能够催化青霉素G扩环形成G-7-ADCA，发明人为了明确其这一催化功能，在本文中将其称为“扩环酶”。本领域技术人员容易理解，其作为(加)氧酶即氧合酶家族成员，功能绝不限于青霉素G扩环。但该酶距离应用于工业化生产G-7-ADCA尚需要大幅度提高其酶活力，因此必须对其进行改造或修饰，尤其是进行氨基酸序列改造。
提高野生酶的酶活力的一个重要途径是对其氨基酸序列进行突变，改变其酶活性中心和/或口袋通道的性质或微环境。于是发明人根据计算机模拟的蛋白序列3D模型，通过理性分析及半理性设计，选择活性口袋周围的氨基酸位点进行定点饱和突变，通过易错PCR法进行随机突变，结合突变体库高通量筛选，获得了一些酶活力显著提高的突变体，以便用于高效催化青霉素G发生扩环反应从而合成出G-7-ADCA。
在本文中，术语“野生(型)”、“野生(扩环)酶”或“原始(扩环)酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:1的扩环酶WP_003952493.1。相对应地，术语“突变体”、“突变酶”、“扩环酶突变体”表示相同的意义，都是指对野生型扩环酶进行氨基酸序列改造后仍保持相同催化反应特点的酶，尤其指酶活力提高的酶，例如氨基酸序列为SEQ ID NO:3的突变体。为了表述方便起见，在本文中可以将野生型扩环酶与其突变体统称为“扩环酶”。
本文中，上述所用术语“(酶活力)提高”表示相较于参考水平(例如野生酶酶的酶活力)提高至少50％或100％，例如相较于参考水平的至少1倍、至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍的提高。
应理解，本文中所用的术语“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、插入、化学修饰，优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代，则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知，保守性置换的常见情况包括：芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换；疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换，极性氨基酸Q、N之间的相互置换，碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换，酸性氨基酸D、E之间的相互置换，羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外，A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。示例性的保守取代例如可以根据下表来进行，其中在第二列中属于同一个分区的氨基酸可以相互取代，在优选的情况下第三列中同一行的氨基酸可互相取代：
“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。
“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10％，同时保留酶活性和/或保留工程化扩环酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。
“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中，改良的工程化扩环酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的扩环酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的扩环酶多肽中。插入可以是在多肽的内部，或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
通过多轮易错PCR随机突变，筛选出一些的突变体，有效的突变位点包括：S98、A129、L159、S261和F294。其中下述位点突变的突变体的酶活力是最出色的：S98G、A129S、L159M、S261T和F294I，该突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
本发明的扩环酶突变体的氨基酸有311个，序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达扩环酶或其突变体，可以对这些酶的表达基因进行密码子优化。
密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
例如，为了在大肠杆菌中表达扩环酶，经密码子优化的氨基酸序列SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
转化体宿主可以使任何适合表达扩环酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、需钠弧菌或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂时，本发明的扩环酶既可以呈酶的形式加入反应体系中，也可以呈菌体的形式加入反应体系中。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体、死亡菌体、固定化菌体等。
当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂直接用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
5L发酵罐的发酵培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/LK2HPO4.3H2O、2.31g/L KH2PO4、5g/L甘油，消泡剂0.5g/L，pH7.0-7.5、每罐的发酵液装液量为2L。
5L发酵罐的补料培养基：60％甘油。
卡那霉素(Kan，50μg/mL)根据质粒所携带抗生素基因按照要求使用。
青霉素G和G-7-ADCA标准品由国药集团威奇达药业有限公司惠赠；亚硫酸铁、抗坏血酸、α-酮戊二酸等试剂购自阿拉丁化学试剂公司。
底物青霉素G和产物苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)的HPLC检测条件：
安捷伦1260高效液相色谱仪；色谱柱：Agilent RX-C18(250*4.6mm,5μm)；流动相：20mM磷酸钾缓冲液(pH3.5)：乙腈(90：10)；流速：1.0mL/min；检测波长：215nm。
需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶/编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。
实施例1：野生型扩环酶基因重组大肠杆菌的构建及活性检测
1、载体及菌株的构建
以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)来源的扩环酶(WP_003952493.1)的氨基酸序列SEQ ID NO:1为基础，根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，其编码基因序列为SEQ ID NO:2，委托苏州金唯智生物科技有限公司全基因合成，克隆到质粒pET24a的NdeI、XhoI位点，获得质粒pET-KH1，质粒示意图如图1所示。
通过电转化将重组质粒pET-KH1转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达初始扩环酶的重组大肠杆菌EcKH1。同时构建阴性对照组(转化pET24a空载体)获得大肠杆菌EcKH0。
2、酶表达
从转化子的LB平板上挑取单菌落，转接至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm条件下过夜培养；随后按照1％v/v接种量转接至含有50μg/mL卡那霉素的100mLTB培养基中，在37℃下培养至OD600达到1.2左右时，加入终浓度0.2mM IPTG诱导蛋白表达，在25℃下诱导16h，获得表达野生扩环酶的重组菌体。
3、酶催化反应体系
将菌液倒入50mL离心管中，4000rpm下离心10min，收集菌体，用100mM pH值为7.5的磷酸盐缓冲液重悬洗涤一次，4000rpm离心10min收集菌体，称重。反应液配方：100mM pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，100μg/mLFeSO4，0.5mM抗坏血酸，5mMα-酮戊二酸，5mM青霉素G。按照5％w/v湿菌体加入到反应液中，在25℃，220rpm条件下反应。反应2h后，在12000rpm下离心1min，取上清进行HPLC检测。
4、酶活力分析
将底物青霉素G转化率或者产物G-7-ADCA生成率作为判断酶活力的指标。产物G-7-ADCA生成率数据结果如下表所示
对于底物浓度5mM，由于产物G-7-ADCA的生成率仅为17.1％，意味着底物青霉素G转化率很低，估计不高于18％甚至接近17.1％，表明野生酶的酶活力较低，应当进行突变大幅度提高酶活力，才有可能用于实际应用。
实施例2：第1轮和第2轮随机突变点文库建立及高通量筛选
1、易错PCR法构建随机突变点库
以质粒pET-KH1为模板，利用易错PCR技术构建随机突变体文库。
设计如下引物对KH-5/KH-3：正向引物KH-5：5’-CTTTAAGAAGGAGATATACATATG-3’，
反向引物KH-3：5’-TTACGCTTTGCTCGTGCGGC-3’。
以质粒pET-KH1为模板，进行PCR扩增，获得约1.0kb的扩环酶突变体DNA序列。
50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒(pET-KH1)模板，50pmol一对引物KH-5和KH-3，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(Takara)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。
对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)。以质粒pET-KH1为模板，以约1.0kb的回收产物(随机突变片段)作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kb，25个循环；68℃10min。DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
2、突变体库的高通量筛选
从突变库菌株的LB平板上挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育12h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mM IPTG)，在25℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(100mM pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，100μg/mLFeSO4，0.5mM抗坏血酸，5mMα-酮戊二酸，5mM青霉素G)进行反应。重悬菌体，在25℃、220rpm条件下孵育0.5h，在12000rpm下离心1min，取上清进行HPLC检测。
选择酶活力(即底物青霉素G转化率或者产物G-7-ADCA生成率)明显提升的菌株，提取质粒进行核酸测序，将基因组中扩环酶相关片段与SEQ ID NO:2进行比对，确定氨基酸突变位点，并将酶活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株，重复随机突变库建立及以青霉素G为底物的高通量反应筛选。前两轮的随机突变库高通量筛选结果如表1所示。
表1、第1轮到第2轮随机突变库高通量筛选结果
备注：“+”代表酶活力相对各自出发菌株大于0％小于等于50％；“++”代表酶活力相对各自出发菌株大于50％小于等于100％；“+++”代表酶活力相对各自出发菌株大于100％小于等于200％；“++++”代表酶活力相对各自出发菌株大于200％。
前两轮获得的突变体KH8(即A129S、L159M、S261T突变体)酶活力相对野生酶有了大幅度提高。
实施例3：第3轮和第4轮随机突变点文库建立及高通量筛选
1、易错PCR法构建随机突变点库
参照实施例2的方法构建扩环酶随机突变点文库。
2、突变体库的高通量筛选
从突变库菌株的LB平板上挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育12h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mM IPTG)，在25℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(100mM pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，100μg/mLFeSO4，0.5mM抗坏血酸，10mMα-酮戊二酸，10mM青霉素G)进行反应。重悬菌体，在25℃、220rpm条件下孵育0.5h，在12000rpm下离心1min，取上清进行HPLC检测。
选择酶活力(即底物青霉素G转化率或者产物G-7-ADCA生成率)明显提升的菌株，提取质粒进行核酸测序，通过碱基比对确定氨基酸突变位点，并将酶活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株，重复随机突变库建立及以青霉素G为底物的高通量反应筛选。筛选结果见表2。
表2、第3轮到第4轮随机突变库高通量筛选结果
备注：“+”代表酶活力相对各自出发菌株大于0％小于等于50％；“++”代表酶活力相对各自出发菌株大于50％小于等于100％；“+++”代表酶活力相对各自出发菌株大于100％小于等于200％。
通过几轮突变，获得的突变体KH15(即S98G、A129S、L159M、S261T和F294I突变体)酶活力相对野生酶显著提高。该突变体KH15的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
3、构建表达突变体KH15的工程菌株
按照实施例1中所述的方法，委托苏州金唯智生物科技有限公司全基因合成突变体KH15的编码基因SEQ ID NO:4，克隆到质粒pET24a的NdeI、XhoI位点，获得质粒pET-KH15，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5；通过电转化将重组质粒pET-KH15转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达突变体KH15的重组大肠杆菌工程菌，仍旧命名为EcKH15。
以下实验对突变菌株EcKH15的催化能力进行考察。
实施例4：扩环酶生产菌株的发酵罐培养
使用5L生物反应器分别对工程菌株EcKH1和突变菌株EcKH15进行发酵培养。分别从两个菌株的LB平板上挑取单菌落至5mL含有Kan的液体LB培养基中，在37℃、220rpm过夜培养。次日，按照体积浓度为5％的接种量转接至含有100mL液体TB培养基的摇瓶中，37℃、220rpm条件下培养至OD600nm达到6后，作为种子液转接到5L发酵罐。接种后400～800rpm、37℃条件下培养，控制溶氧在20～30％范围内。当菌体OD600达到20后，加入IPTG诱导扩环酶表达，IPTG的终浓度为0.2mM，25℃继续培养培养16-24h。全发酵过程利用氨水控制pH值为6.8～7.2，控制通气量在2.5～3.5L/min范围内。发酵结束后，于4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体，使用100mM pH值为7.5的磷酸盐缓冲液进行重悬，然后高压破碎，得到全细胞反应液。
实施例5：细胞催化生产G-7-ADCA
100mL反应体系包括：100mM pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，100μg/mL FeSO4，0.5mM抗坏血酸，10mMα-酮戊二酸，10mM青霉素G，加入对应5g湿菌体的全细胞反应液。在25℃、300rpm条件下反应2h，反应结束后取样，过滤后进行HPLC检测。图2显示了菌株EcKH15细胞催化制备G-7-ADCA的HPLC图谱。
结果显示，在反应2h后，菌株EcKH15全细胞反应液反应体系中G-7-ADCA的生成率为64.8％，而菌株EcKH1全细胞反应液反应体系中G-7-ADCA的生成率只有12.3％。提示突变体KH15的酶活力比野生酶(KH1)的酶活力提高了4倍多。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种扩环酶突变体，其特征在于，为棒状链霉菌来源的扩环酶的氨基酸序列SEQ IDNO:1中发生下述一个以上位点突变所形成的突变体：S98、A129、L159、S261、F294，该扩环酶突变体催化青霉素G转化为苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的酶活力高于扩环酶SEQID NO:1。
2.如权利要求1所述的扩环酶突变体，其特征在于，所述突变选自S98G、A129S、L159M、S261T和F294I。
3.如权利要求2所述的扩环酶突变体，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO:3，是扩环酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生S98G、A129S、L159M、S261T和F294I突变所形成的突变体。
4.一种DNA分子，其包含编码如权利要求3所述扩环酶突变体的基因。
5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，编码氨基酸序列SEQ ID NO:3所示扩环酶突变体的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
6.一种重组质粒，其包含如权利要求4所述的DNA分子。该重组质粒的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:5。
7.转化了如权利要求6所述重组质粒的微生物。
8.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，微生物宿主选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、需钠弧菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母。优选所述微生物宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。
9.如权利要求1所述扩环酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，以青霉素G为反应底物、用权利要求3所述扩环酶突变体或者如权利要求7所述微生物催化生产苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)。
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