CN116096869A

CN116096869A - 工程化酶及其制备和使用方法

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Publication number: CN116096869A
Application number: CN202180039402.0A
Authority: CN
Inventors: A·M·沙赫; D·张; J·R·瓦尔纳; B·M·格里芬; R·S·科莫; H·纳卡拉占; S·加塔克; T·H·理查森
Original assignee: Genomatica Inc
Current assignee: Genomatica Inc
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2023-05-09
Also published as: EP4139444A2; KR20230003072A; WO2021216952A3; WO2021216952A2; US20230348865A1

Abstract

本发明提供了一种工程化羧酸还原酶(CAR)酶、编码CAR酶的核酸以及包含编码CAR的外源核酸、工程化转氨酶(TA)酶和/或六亚甲基二胺(HMD)转氨酶(TA2)酶的非天然存在的微生物。本发明提供了一种具有1,6‑己二醇(HDO)途径的非天然存在的微生物，所述途径具有以足以产生6‑氨基己酸半醛、HDO或两者的量表达的HDO途径酶。本发明还提供了一种具有HMD途径的非天然存在的微生物，所述途径具有以足以产生6‑氨基己酸半醛、HMD或两者的量表达的HMD途径酶。本发明另外提供了生物衍生的HMD、6‑氨基己酸半醛和/或HDO，和用于产生生物衍生的HMD、6‑氨基己酸半醛和/或HDO的方法。

Description

工程化酶及其制备和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年4月24日提交的美国临时专利申请第63/015,428号的权益，其以全文引用的方式并入本文。

序列表

本申请通过引用并入与本申请一起提交的ASCII文本文件形式的序列表，所述文件名为12956-492-228_SEQ_LISTING.txt，创建于2021年4月20日，并且大小为1,773,544字节。

背景技术

尼龙是可以通过二胺与二羧酸的缩聚或内酰胺的缩聚来合成的聚酰胺。尼龙6,6是由六亚甲基二胺(HMD)和己二酸反应生产的，而尼龙6是由己内酰胺开环聚合生产的。因此，己二酸、六亚甲基二胺和己内酰胺是尼龙生产中的重要中间体。

微生物已经被工程化用来生产一些尼龙中间体。然而，工程化的微生物会由于途径中间体和最终产物的不期望的酶活性而产生不期望的副产物。因此，此类副产物和杂质增加了生物合成化合物的成本和复杂性，并且会降低期望产物的效率或产率。

发明内容

本发明提供了一种工程化羧酸还原酶(CAR)酶，其能够(a)从6-氨基己酸底物形成6-氨基己酸半醛，(b)以与野生型CAR相比更高的速率从6-氨基己酸底物形成6-氨基己酸半醛，(c)与野生型CAR相比对6-氨基己酸底物具有更高的亲和力，或(a)、(b)和(c)的任何组合。工程化CAR酶可以在本文公开的一个或多个残基位置包含一个或多个氨基酸改变，例如SEQ ID NO:152、153或254的氨基酸的至少一个改变。本文提供了一种工程化CAR，其活性比SEQ ID NO:152、153或254的CAR的活性高至少20％。

本发明还提供了编码本文公开的工程化CAR的核酸，其可以与启动子可操作地连接并且可以位于载体中。

本发明还提供了一种非天然存在的微生物，其包含编码以下各物的外源核酸：本文公开的工程化CAR、具有与本文公开的CAR具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的CAR、或与本文公开的TA2具有至少50％序列同一性的六亚甲基二胺(HMD)转氨酶(TA2)酶。在一些方面，非天然存在的微生物还含有编码具有本文公开的序列的工程化转氨酶(TA)酶的外源核酸，例如，在选自本文公开的残基的一个或多个位置处具有一个或多个氨基酸改变或与本文公开的任何TA序列的至少25个或更多个连续氨基酸具有至少50％序列同一性的TA酶。外源核酸可以是异源的或同源的。非天然存在的微生物可包含本文公开的CAR变体、TA2变体和/或TA变体。

本发明提供了根据权利要求中任一项所述的非天然存在的微生物，其包含六亚甲基二胺(HMD)途径，所述途径具有以足以产生HMD的量表达的HMD途径酶。HMD途径包含(1)3-氧代己二酰-CoA硫解酶、(2)羟基己二酰-CoA脱氢酶(HBD)、(3)巴豆酸酶、(4)反式烯酰CoA还原酶(TER)、(5)6ACA-醛脱氢酶(6ACA-ALD)、(6)6ACA-转氨酶(TA)、(7)羧酸还原酶(CAR)和(8)HMD-转氨酶(TA2)。非天然存在的微生物还可包含一种或多种编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HMD途径酶的外源核酸。外源核酸可以是异源核酸。在一些方面，非天然存在的微生物位于基本上厌氧的培养基中。微生物可以是一种细菌、酵母或真菌。在一些方面，与不包含外源核酸的对照微生物相比，非天然存在的微生物能够多产生至少10％的6-氨基己酸半醛、HMD或两者。本文还提供了一种非天然存在的微生物，其与不包含外源核酸的对照微生物相比将更多的：(a)己二酸半醛转化为6-氨基己酸；(b)6-氨基己酸转化为6-氨基己酸半醛，和/或(c)6-氨基己酸半醛转化为HMD。

本文提供了一种非天然存在的微生物，其具有编码以下各物的外源核酸：本文公开的工程化CAR，或包含与本文公开的CAR的序列的至少25个或更多个连续氨基酸具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的CAR。非天然存在的微生物还可含有编码以下各物的外源核酸：(a)工程化转氨酶(TA)酶，其包含SEQ ID NO:1、13或31的氨基酸的至少一个改变；(b)工程化TA酶，其在选自本文公开的残基的一个或多个位置处包含一个或多个氨基酸改变；(c)工程化TA酶，其包含工程化蛋白质的至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自SEQ IDNO:1的本文公开的改变及其组合，或(d)包含与本文公开的序列的至少25个或更多个连续氨基酸具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的转氨酶。外源核酸可以是异源的或同源的。非天然存在的微生物可含有具有选自由本文公开的CAR变体组成的组的氨基酸序列的CAR，和/或具有本文公开的TA变体的氨基酸序列的工程化TA。在一些方面，非天然存在的微生物包含具有以足以产生HDO的量表达的HDO途径酶的1,6-己二醇(HDO)途径，其中所述HDO途径包含(1)硫解酶、(2)羟基己二酰-CoA脱氢酶(HBD)、(3)巴豆酸酶、(4)反式烯酰CoA还原酶(TER)、(5)6ACA-醛脱氢酶(6ACA-ALD)、(6)6ACA-转氨酶(TA)、(7)羧酸还原酶(CAR)、(8)6-氨基己酸半醛还原酶、(9)6-氨基己醇氨基转移酶或氧化还原酶和(10)6-羟基己醛还原酶。非天然存在的微生物还可含有一种或多种编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HDO途径酶的外源核酸。外源核酸可以是异源核酸。在一些方面，非天然存在的微生物位于基本上厌氧的培养基中。微生物可以是一种细菌、酵母或真菌。在一些方面，与不包含本文公开的外源核酸的对照微生物相比，非天然存在的微生物能够多产生至少10％的6-氨基己酸半醛、HDO或两者。与不包含本文公开的外源核酸的对照微生物相比，本文提供的非天然存在的微生物将更多的：(a)己二酸半醛转化为6-氨基己酸，和/或(b)6-氨基己酸转化为6-氨基己酸半醛。

本发明还提供了一种生产六亚甲基二胺(HMD)的方法，其包括在一定条件下培养本文公开的非天然存在的微生物足够的一段时间以生产HMD。本发明还提供了一种生产1,6-己二醇(HDO)的方法，其包括在一定条件下培养本文公开的非天然存在的微生物足够的一段时间以生产HDO。在一些方面，所述方法还包括将HMD或HDO与培养物中的其它成分分离。分离可以包括萃取、连续液-液萃取、渗透蒸发(pervaporation)、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、吸收色谱或超滤。

本文提供了包含生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO的培养基，其具有反映大气二氧化碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一些方面，生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO由本文公开的非天然存在的微生物或本文公开的方法产生。在一些方面，培养基包含本文公开的工程化CAR、工程化TA酶、工程化六亚甲基二胺(HMD)转氨酶(TA2)酶和/或醛脱氢酶(ALD)酶。在一些方面，培养基含有编码本文公开的工程化CAR、工程化TA酶、工程化TA2酶和/或醛脱氢酶(ALD)酶的核酸。在一些方面，培养基含有本文公开的非天然存在的微生物。培养基可以与产生生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO的非天然存在的微生物分离。

本文还提供了具有反映大气二氧化碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率的生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO。在一些方面，生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO由本文公开的非天然存在的微生物和/或方法产生。在一些方面，生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的Fm值。本发明还提供了含有本文公开的生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO，以及除生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO之外的化合物的组合物。所述组合物可含有本文公开的非天然存在的微生物的一部分或细胞裂解物或培养上清液。

附图说明

图1显示了从琥珀酰-CoA和乙酰-CoA生成6-氨基己酸盐、六亚甲基二胺(HMD)和己内酰胺的示例性途径。酶被指定如下：A)3-氧代己二酰-CoA硫解酶，B)3-氧代己二酰-CoA还原酶，C)3-羟基己二酰-CoA脱水酶，D)5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶，E)3-氧代己二酰-CoA/酰基-CoA转移酶，F)3-氧代己二酰-CoA合酶，G)3-氧代己二酰-CoA水解酶，H)3-氧代己二酸盐还原酶，I)3-羟基己二酸盐脱水酶，J)5-羧基-2-戊烯酸盐还原酶，K)己二酰-CoA/酰基-CoA转移酶，L)己二酰-CoA合酶，M)己二酰-CoA水解酶，N)己二酰-CoA还原酶(醛形成)，O)6-氨基己酸盐转氨酶，P)6-氨基己酸盐脱氢酶，Q)6-氨基己酰-CoA/酰基-CoA转移酶，R)6-氨基己酰-CoA合酶，S)酰胺水解酶，T)自发环化，U)6-氨基己酰-CoA还原酶(醛形成)，V)HMD转氨酶，W)HMD脱氢酶，X)己二酸盐还原酶，Y)己二酸盐激酶，Z)己二酰磷酸盐还原酶。

图2是SEQ ID NO:1中突变的氨基酸位置的图形表示。

图3是变体相对于野生型SEQ ID NO:1对照(SEQ ID NO:1)的活性的图形表示。

图4显示了使用赖氨酸作为起点合成6-氨基己酸和己二酸盐的示例性途径。

图5显示了使用己二酰-CoA作为起点的示例性己内酰胺合成途径。

图6显示了从丙酮酸盐和琥珀酸半醛生成6-氨基己酸盐的示例性途径。酶是A)HODH醛缩酶，B)OHED水合酶，C)OHED还原酶，D)2-OHD脱羧酶，E)己二酸半醛氨基转移酶和/或己二酸半醛氧化还原酶(胺化)，F)OHED脱羧酶，G)6-OHE还原酶，H)2-OHD氨基转移酶和/或2-OHD氧化还原酶(胺化)，I)2-AHD脱羧酶，J)OHED氨基转移酶和/或OHED氧化还原酶(胺化)，K)2-AHE还原酶，L)HODH甲酸盐裂解酶和/或HODH脱氢酶，M)3-羟基己二酰-CoA脱水酶，N)2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶，O)己二酰-CoA脱氢酶，P)OHED甲酸盐裂解酶和/或OHED脱氢酶，Q)2-OHD甲酸盐裂解酶和/或2-OHD脱氢酶。缩写是：HODH＝4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸盐，OHED＝2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸盐，2-OHD＝2-氧代庚烷-1,7-二酸盐，2-AHE＝2-氨基庚-4-烯-1,7-二酸盐，2-AHD＝2-氨基庚烷-1,7-二酸盐，和6-OHE＝6-氧代己-4-烯酸盐。

图7显示了从6-氨基己酸盐生成六亚甲基二胺的示例性途径。酶是A)6-氨基己酸盐激酶，B)6-AHOP氧化还原酶，C)6-氨基己酸半醛氨基转移酶和/或6-氨基己酸半醛氧化还原酶(胺化)，D)6-氨基己酸盐N-乙酰转移酶，E)6-乙酰氨基己酸盐激酶，F)6-AAHOP氧化还原酶，G)6-乙酰氨基己醛氨基转移酶和/或6-乙酰氨基己醛氧化还原酶(胺化)，H)6-乙酰氨基己胺N-乙酰转移酶和/或6-乙酰氨基己胺水解酶(酰胺)，I)6-乙酰氨基己酸盐CoA转移酶和/或6-乙酰氨基己酸盐CoA连接酶，J)6-乙酰氨基己酰基-CoA氧化还原酶，K)6-AAHOP酰基转移酶，L)6-AHOP酰基转移酶，M)6-氨基己酸盐CoA转移酶和/或6-氨基己酸盐CoA连接酶，N)6-氨基己酰基-CoA氧化还原酶。缩写是：6-AAHOP＝[(6-乙酰氨基己酰基)氧基]膦酸盐和6-AHOP＝[(6-氨基己酰基)氧基]膦酸盐。

图8显示了生成1,6-己二醇的示例性生物合成途径。A)是6-氨基己酰-CoA转移酶或合成酶，催化6ACA转化为6-氨基己酰-CoA；B)是6-氨基己酰-CoA还原酶，催化6-氨基己酰-CoA转化为6-氨基己酸半醛；C)是6-氨基己酸半醛还原酶，催化6-氨基己酸半醛转化为6-氨基己醇；D)是6-氨基己酸还原酶，催化6ACA转化为6-氨基己酸半醛；E)是己二酰-CoA还原酶，催化己二酰-CoA转化为己二酸半醛；F)是己二酸半醛还原酶，催化己二酸半醛转化为6-羟基己酸盐；G)是6-羟基己酰-CoA转移酶或合成酶，催化6-羟基己酸盐转化为6-羟基己酰-CoA；H)是6-羟基己酰-CoA还原酶，催化6-羟基己酰-CoA转化为6-羟基己醛；I)是6-羟基己醛还原酶，催化6-羟基己醛转化为HDO；J)是6-氨基己醇氨基转移酶或氧化还原酶，催化6-氨基己醇转化为6-羟基己醛；K)是6-羟基己酸还原酶，催化6-羟基己酸盐转化为6-羟基己醛；L)是己二酸盐还原酶，催化ADA转化为己二酸半醛；和M)是己二酰-CoA转移酶、水解酶或合酶，催化己二酰-CoA转化为ADA。

图9显示了从己二酸盐或己二酰-CoA生成己内酯的示例性途径。酶是A.己二酰-CoA还原酶，B.己二酸半醛还原酶，C.6-羟基己酰-CoA转移酶或合成酶，D.6-羟基己酰-CoA环化酶或自发环化，E.己二酸盐还原酶，F.己二酰-CoA转移酶，合成酶或水解酶，G.6-羟基己酸盐环化酶，H.6-羟基己酸盐激酶，I.6-羟基己酰磷酸盐环化酶或自发环化，J.磷酸转-6-羟基己酰化酶。

图10显示了示例性六亚甲基二胺(HMD)生物合成途径。从琥珀酰-CoA和乙酰-CoA开始，酶被指定如下：(A)硫解酶；(B)羟基己二酰-CoA脱氢酶(HBD)；(C)巴豆酸酶；(D)反式烯酰-CoA还原酶(Ter)；(E)6ACA-醛脱氢酶(ALD)；(F)6ACA-转氨酶(TA)；(G)CoA转移酶/CoA连接酶；(H)HMD-醛脱氢酶(ALD)；(I)羧酸还原酶(CAR)，和(J)HMD-转氨酶(TA2)。PPTase对应于磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。

图11显示了来自鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)的CAR同源物(SEQ ID NO:153)对四碳底物(丁酸盐、4-羟基丁酸盐(4-HB)、琥珀酸盐和4-氨基丁酸(GABA))和六碳底物(己酸盐、6-羟基己酸、己二酸盐和6ACA)的酶活性。

图12显示了来自鸟分枝杆菌的CAR同源物(SEQ ID NO:153；亲本)与表9所示的变体1相比的酶活性。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本发明的实施方案所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同。与本文所述的那些相似或等效的任何方法、装置和材料都可以用于实施本发明的实施方案。提供以下定义是为了便于理解本文中经常使用的某些术语，并不意味着限制本公开的范围。本文提及的所有文件(例如专利申请或专利)通过以全文引用的方式并入。

描述了氨基转移酶，也称为转氨酶(E.C.2.6.1)，其催化氨基、一对电子和一个质子从氨基供体底物的伯胺转移到氨基受体分子的羰基。转氨酶的期望反应是将谷氨酸盐或丙氨酸的氨基转移到己二酸半醛以形成6-氨基己酸(6ACA)，如下所示：

己二酸半醛+谷氨酸盐→6ACA +α-酮戊二酸

然而，转氨酶对琥珀酸半醛或丙酮酸盐也具有特异性，如下所示：

琥珀酸半醛+谷氨酸盐→γ-氨基丁酸+α-酮戊二酸

丙酮酸盐+谷氨酸盐→丙氨酸+α-酮戊二酸

丙氨酸可以代替谷氨酸盐作为胺供体。

所描述的转氨酶(TA)酶被鉴定为对己二酸半醛底物具有活性以形成6-氨基己酸。该酶可用于产生尼龙中间体的各种途径。

通过同源性搜索以及宏基因组发现可以在产生6ACA的途径中进行期望反应的酶，来鉴定出期望的转氨酶。为了评估转氨酶对己二酸半醛的利用，在一些实施方案中，可以用6ACA或本文举例说明的另一种候选底物以正向或反向进行测定。可以使用本领域熟知的方法通过直接或间接测量酶产物来进行测定。一种示例性方法是在下文和实施例中举例说明的间接方法。

在一些实施方案中，鉴定了由SEQ ID NO:1编码的来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)的转氨酶。为了鉴定其它TA酶，使用SEQ ID NO:1。同源酶的鉴定如表6所示。在一些实施方案中，转氨酶或序列通过BLAST鉴定。在一些实施方案中，转氨酶与表6的转氨酶的氨基酸序列的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，表6中鉴定的转氨酶与SEQ ID NO:1、13或31的转氨酶的氨基酸序列的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，转氨酶与SEQ ID NO:1、3、4、5、9、12、13、26、27、30、31、38、50、52、64、74、78、79、81、91、106、108和116中任一者的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约50％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，与己二酸半醛反应形成6ACA的转氨酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、3、4、5、9、12、13、26、27、30、31、38、50、52、64、74、78、79、81、91、106、108和116的氨基酸序列。

在一些实施方案中，对于己二酸半醛作为底物，TA酶的催化效率和/或转换数与当琥珀酸半醛是底物时相似。在一些实施方案中，对于己二酸半醛作为底物，催化效率和/或转换数与当琥珀酸半醛是底物时相似的酶与SEQ IDNO:1、3、4、5、9、12、13、26、27、30、31、38、50、52、64、74、78、79、81、91、106、108和116的转氨酶的氨基酸序列的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

如关于本文所述的任何酶所使用的，术语转换数(也称为k_cat)定义为对于给定的酶浓度[E_T]，单个催化位点每秒将执行的底物分子化学转化的最大数量。它可以由最大反应速率Vmax和催化剂位点浓度[E_T]计算如下：

Kcat＝Vmax/[E_T]。单位为s^-1。

如关于本文所述的任何酶所使用的，术语“催化效率”是酶将底物转化为产物的效率的量度。催化效率的比较也可用作衡量酶对不同底物的偏好(即底物特异性)的量度。催化效率越高，酶越“偏爱”该底物。其可通过公式：k_cat/K_M计算，其中k_cat为转换数，K_M为米氏常数，K_M为反应速率是Vmax一半时的底物浓度。催化效率的单位可以表示为s^-1M^-1。

所鉴定的转氨酶来源于非常遗传多样的有机体。下面显示的是一些示例性转氨酶的成对序列比对，如表1所示。

表1.

	SEQ ID NO:1	SEQ ID NO:13	SEQ ID NO:31
				SEQ ID NO:1		44％	87％
SEQ ID NO:13	44％		43％
				SEQ ID NO:31	87％	43％

转氨酶具有保守结构域。基于多序列比对和隐马尔可夫模型(HMM)，转氨酶被归入来自欧洲生物信息学研究所的Pfam数据库(pfam.xfam.org)的Pfam PF00202。

在一些实施方案中，通过检查蛋白质的晶体结构鉴定SEQ ID NO:1中突变的氨基酸位置，并且在选定的氨基酸位置对编码SEQ ID NO:1的基因进行饱和诱变。鉴定了催化相关残基，其可以进行改变以提供活性优于野生型(未修饰)SEQ ID NO:1的氨基酸变体。

在一些实施方案中，转氨酶被改造为对己二酸半醛底物比其对应的野生型具有更高的特异性。

如本文所用，“工程化的”或“变体”当关于本文所述的任何多肽或核酸使用时是指与亲本序列相比在氨基酸位置或核酸位置具有至少一种变异或改变的序列。亲本序列可以是例如未修饰的野生型序列、其同源物或例如野生型序列或其同源物的经修饰变体。

在一些实施方案中，工程化转氨酶具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31的氨基酸的一个或多个改变。在一些实施方案中，工程化转氨酶相对于SEQ ID NO:1、SEQID NO:13或SEQ ID NO:31具有氨基酸序列的改变，所述改变具有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个氨基酸改变。

在一些实施方案中，工程化TA具有从对应于SEQ ID NO:1的残基V114、S136、T148、P153、I203、I204、P206、V207、V111、T216、A237、T264、M265和L386、G19、C22、D70、R94、D99、T109、E112、A113、F137、G144、I149、K150、Y154、S178、L186、Q208、L234、T242、A315、K318、R338、G336、L386、V390、A406、S416、A421的一个或多个位置中选出的一个或多个氨基酸改变，或SEQ ID NO:1的所述氨基酸改变和氨基酸残基位置的一种或多种组合。

在一些实施方案中，工程化蛋白质的一个或多个氨基酸改变是对应于SEQ ID NO:1的残基V114、S136、T148、P153、I203、I204、P206、V207、V111、T216、A237、T264、M265和L386、G19、C22、D70、R94、D99、T109、E112、A113、F137、G144、I149、K150、Y154、S178、L186、Q208、L234、T242、A315、K318、R338、G336、L386、V390、A406、S416和A421的一个或多个位置上的保守或非保守氨基酸的取代，或SEQ ID NO:1的所述氨基酸改变和氨基酸残基位置的一种或多种组合。

在一些实施方案中，工程化TA具有工程化蛋白质的一个或多个氨基酸改变，所述氨基酸改变是在对应于表7中所示的残基的位置处的改变。

在一些实施方案中，与具有SEQ ID NO:1、13或31的相应野生型酶相比，工程化TA酶对己二酸半醛底物的催化效率为至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍或1.5-25倍。

在一些实施方案中，工程化转氨酶在已知标准条件下对己二酸半醛的酶促转化比具有SEQ ID NO:1、13或31的相应野生型酶的酶促活性高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

在一些实施方案中，为了提供TA变体，选择本公开的SEQ ID NO:1代表的木糖氧化无色杆菌TA作为模板或亲本序列。如本文所述的变体可以通过向模板中引入一个或多个氨基酸改变(例如取代)来产生。可以筛选变体以鉴定对它们的底物具有增加的活性和/或特异性的那些变体。例如，筛选TA变体以鉴定导致对己二酸半醛或其类似物的活性和/或特异性增加的那些改变。将类似地筛选本文所述的其它变体以鉴定对亲本酶的一种或多种底物的增加的活性和/或特异性。

出于氨基酸位置编号的目的，在一些实施方案中，SEQ ID NO:1用作参考序列。因此，例如，关于SEQ ID NO:1提及氨基酸位置79，但在不同TA序列(靶序列或其它模板序列)的上下文中，用于变体产生的相应氨基酸位置可以具有相同或不同的位置编号(例如78、79或80)。在某些情况下，原始氨基酸及其在SEQ ID NO:1参考模板上的位置将与原始氨基酸及其在靶TA序列上的位置精确相关。在其它情况下，原始氨基酸及其在SEQ ID NO:1参考模板上的位置将与原始氨基酸有关，但其在靶标上的位置将不在相应模板位置上。然而，靶标上的相应氨基酸可以与模板上的位置相距预定距离，例如距参考模板位置在10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置内。在其它情况下，SEQ ID NO:1参考模板上的原始氨基酸将不与靶标上的原始氨基酸精确相关。然而，人们可以根据模板上氨基酸的一般位置和靶氨基酸附近的氨基酸序列来理解靶序列上相应的氨基酸是什么。应当理解，可以用本文未具体公开的TA序列产生序列比对，并且鉴于本公开的教导和指导，这些比对可以用于理解和产生新的TA变体。在一些实施方案中，序列比对可以允许人们理解靶氨基酸附近的共同或相似的氨基酸，并且这些氨基酸可以被视为在模板和靶序列之间具有一定量的同一性或相似性的“序列基序”。这些序列基序可用于描述TA序列中变异氨基酸所在的部分，以及基序中可能存在的变异类型。

此外，还描述了羧酸还原酶(CAR)，其催化羧酸的ATP和NADPH依赖性还原，生成它们对应的醛(Venkitasubramanian等人,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))。本文描述的CAR可用于将中间体6ACA转化为6-氨基己酸半醛，并具有E.C.编号E.C.1.2.1.30。6ACA和6-氨基己酸半醛是本文所述的六亚甲基二胺(HMD)和己二醇(HDO)途径中的中间体，且6ACA转化为6-氨基己酸半醛是其中的酶促步骤。因此，CAR可用于产生尼龙中间体的各种途径中，包括例如本文所述的HMD和HDO途径。

通过同源性搜索以及宏基因组发现对可以在产生6-氨基己酸半醛的途径中进行期望反应的酶，鉴定出期望的CAR。为了评估CAR对6ACA的利用，在一些实施方案中，可以用6ACA或本文举例说明的另一种候选底物以正向进行测定。类似地，所述测定也可以用6-氨基己酸半醛或另一种候选底物以反向进行。可以使用本领域熟知的方法通过直接或间接测量酶产物来进行测定。一种示例性方法是在下文和实施例中举例说明的间接方法。

在一些实施方案中，鉴定了来自由SEQ ID NO:150编码的耻垢分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis)MC2 155的CAR酶。在一些实施方案中，鉴定了来自由SEQID NO:153编码的鸟分枝杆菌的CAR酶。为了鉴定其它CAR酶，使用了SEQ ID NO:150和SEQID NO:153。同源酶的鉴定如表8所示。在一些实施方案中，CAR酶或序列由BLAST鉴定。在一些实施方案中，CAR与表8的CAR的氨基酸序列的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，表8中鉴定的CAR与SEQ ID NO:152、153或254的CAR的氨基酸序列的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，CAR酶与SEQ ID NO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264中任一者的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约50％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，与6ACA反应形成6-氨基己酸半醛的CAR酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264的氨基酸序列。

在一些实施方案中，对于6ACA作为底物，CAR酶的催化效率和/或转换数与当琥珀酸盐是底物时相似。在一些实施方案中，对于6ACA作为底物，CAR酶的催化效率和/或转换数与当己酸盐是底物时降低。在其它实施方案中，对于6ACA作为底物，催化效率和/或转换数与当琥珀酸盐是底物时相似的CAR酶与SEQ ID NO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264的CAR的氨基酸序列的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在其它实施方案中，对于6ACA作为底物，催化效率和/或转换数与当己酸盐是底物时降低的CAR酶与SEQ ID NO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264的CAR的氨基酸序列的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

所鉴定的CAR酶来源于非常遗传多样的有机体。下面显示的是一些示例性CAR的成对序列比对，如表2所示。

表2.示例性CAR的成对序列比对中的同一性百分比

	SEQ ID NO:152	SEQ ID NO:153	SEQ ID NO:159	SEQ ID NO:254
					SEQ ID NO:152		99％	34％	74％
SEQ ID NO:153	99％		34％	75％
					SEQ ID NO:159	34％	34％		36％
SEQ ID NO:254	74％	75％	36％

CAR酶具有保守结构域。基于多序列比对和隐马尔可夫模型(HMM)，CAR酶可以包含来自欧洲生物信息学研究所的Pfam数据库(pfam.xfam.org)的以下结构域：AMP结合结构域(Pfam PF00501)、NAD结合结构域(Pfam PF07993)和磷酸泛酰巯基乙胺(PP)结合结构域(Pfam PF00550)。

在一些实施方案中，通过检查蛋白质的晶体结构鉴定SEQ ID NO:152中突变的氨基酸位置，并且在选定的氨基酸位置对编码SEQ ID NO:152或其同源物的基因进行饱和诱变。鉴定了催化相关残基，其可以进行改变以提供活性优于野生型(未修饰)SEQ ID NO:152或其同源物的变异氨基酸。在一些实施方案中，鉴定SEQ ID NO:153中突变的氨基酸位置，并且编码SEQ IDNO:153或其同源物的基因被用作蛋白质工程的模板(例如，在选定的氨基酸位置进行诱变)。在一些实施方案中，鉴定SEQ ID NO:254中突变的氨基酸位置，并且编码SEQ ID NO:254或其同源物的基因被用作蛋白质工程的模板(例如，在选定的氨基酸位置进行诱变)。

在一些实施方案中，CAR酶被改造为对6ACA底物比其对应的野生型具有更高的特异性。

在一些实施方案中，工程化CAR酶具有SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153或SEQ IDNO:254的氨基酸的一个或多个改变。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:152、SEQ IDNO:153或SEQ ID NO:254，工程化CAR具有氨基酸序列的改变，所述改变具有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个氨基酸改变。在一些实施方案中，工程化CAR具有选自对应于SEQ ID NO:152、153或254的残基P141、L245、I247、W270、S274、K275、N276、F278、G279、N279插入、A282、A283、S299、I300、N335、S336、M389、G391、G414、G421、M422、F425、G636、D809、I810、L811、A812和F929的一个或多个位置中的一个或多个氨基酸改变，或SEQ ID NO:152、153或254的所述氨基酸改变和氨基酸残基位置的一种或多种组合。

在一些实施方案中，工程化CAR包含选自由以下组成的组的一个或多个残基位置上的一个或多个氨基酸改变：N335E；N335D；S274D；S274E；K275D；K275E；S299D；S299E；M389D；M389E；G414D；G414E；G421D；G421E；M422D；M422E；F425D；F425E；N335D和A282P；N335D和A282V；N335D和A283C；N335D、A283C和F929L；N335D、A283C和G636D；N335D和A283G；N335D和F278A；N335D和F278C；N335D和F278S；N335D和F278V；N335D和G279V；N335D和I247M；N335D和I247Q；N335D和I247T；N335D和I247V；N335D和I300C；N335D和I300G；N335D和I300M；N335D和I300M；N335D和I300Y；N335D和K275A；N335D和K275D；N335D和K275D；N335D和K275E；N335D和K275M；N335D和K275N；N335D和K275S；N335D和K275T；N335D和K275V；N335D和K275W；N335D和L245C；N335D和L245G；N335D和L245S；N335D和L245T；N335D和L245V；N335D和M389I；N335D和M389W；N335D和M422D；N335D和N276S；N335D和N279插入；N335D和P141G；N335D和S299D；N335D和S299E；N335D和S391G；N335D和W270M；K275D、N276S、F278S、A283C和N335D；L245V、K275D、N276S、F278S、A283C和N335D；I247M、K275D、N276S、F278A、A283C和N335D；L245V、K275T、N276S、F278S、A283C和N335D；I247M、K275T、N276S、F278S、A283C和N335D；K275D、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；L245T、K275D、N276S、F278A、A283C和N335D；K275N、F278S、A283C、S299D和N335D；I247M、K275N、N276S、F278S、A283C和N335D；K275N、F278S、A283C、I300G和N335D；K275N、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；I247M、K275T、F278S、A283C和N335D；L245V、K275D、N276S、F278A、A283C和N335D；K275N、F278S、A283C、I300G和N335D；K275N、F278A、A283C、S299D和N335D；K275N、N276S、F278A、A283C和N335D；L245V、K275N、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；L245T、K275N、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275N、F278A、S299D和N335D；I247M、K275N、F278A、A283C、I300Y和N335D；I247M、K275N、F278A、A283C和N335D；K275D、N276S、F278A和N335D；K275T、F278A、A283C、S299D和N335D；F278A、A282P和N335D；F278A、A283C和N335D；K275N、S299D和N335D；L245T、S299D和N335D；K275D、S299D和N335D；K275N、F278S和N335D；S299D、M389W和N335D；G279V、S299D和N335D；F278A、S283C和N335D；K275D、N276S和N335D；G279V、S299E和N335D；I247M、S299D和N335D；P141G、A282P和N335D；L245T、A282P和N335D；F278S、A283C和N335D；K275D、S284I、S299D和N335D；I247M、I282P和N335D；I247V、K275D、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；I247V、K275D、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275D、S274A、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275D、S274P、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A282F、A283C、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A282P、A283C、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A283C、S299I、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A283C、I300G、N335D和M389C；K275D、N276S、F278S、A283C、I300G、N335D和M389Y；和K275D、N276S、F278S、A283C、I300G、N335D和M389S。

在一些实施方案中，工程化蛋白质的一个或多个氨基酸改变是在对应于SEQ IDNO:152、153或254的残基P141、L245、I247、W270、S274、K275、N276、F278、G279、N279插入、A282、A283、S299、I300、N335、S336、M389、G391、G414、G421、M422、F425、G636、D809、I810、L811、A812和F929的一个或多个位置处的保守或非保守氨基酸的取代，或所述氨基酸改变和氨基酸残基位置的一种或多种组合。

在一些实施方案中，工程化蛋白质的一个或多个氨基酸改变是在对应于表9中所示的残基的位置处的改变。

在一些实施方案中，与具有SEQ ID NO 152、153或254的相应野生型或亲本酶相比，工程化CAR酶对6ACA底物的催化效率为至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍或1.5-25倍。

在一些实施方案中，工程化CAR酶在已知标准条件下对6ACA的酶促转化比具有SEQID NO 152、153或254的相应野生型或亲本酶的酶促活性高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

在一些实施方案中，为了提供CAR变体，鸟分枝杆菌或其同源物CAR由本公开的SEQID NO:152或153表示，并且被选择作为模板或亲本序列。在一些实施方案中，为了提供CAR变体，分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)JS623或其同源物CAR由本公开的SEQ ID NO:254表示，并且被选择作为模板或亲本序列。可以筛选本文所述的CAR变体以鉴定导致对6ACA或本文举例说明的其它候选底物的活性和/或特异性增加的那些改变。

出于对本文所述的CAR进行氨基酸位置编号的目的，在一些实施方案中，SEQ IDNO:152用作参考序列。因此，例如，关于SEQ ID NO:152提及氨基酸位置89，但在不同CAR序列(靶序列或其它模板序列)的上下文中，用于变体产生的相应氨基酸位置可以具有相同或不同的位置编号(例如88、89或90)。在某些情况下，原始氨基酸及其在SEQ ID NO:152参考模板上的位置将与原始氨基酸及其在靶CAR序列上的位置精确相关。在其它情况下，原始氨基酸及其在SEQ ID NO:152参考模板上的位置将与原始氨基酸有关，但其在靶标上的位置将不在相应模板位置上。然而，靶标上的相应氨基酸可以与模板上的位置相距预定距离，例如距参考模板位置在10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置内。在其它情况下，SEQ ID NO:152参考模板上的原始氨基酸将不与靶标上的原始氨基酸精确相关。然而，人们可以根据参考模板上氨基酸的一般位置和靶氨基酸附近的氨基酸序列来理解靶序列上相应的氨基酸是什么。应当理解，可以用本文未具体公开的CAR序列产生序列比对，并且鉴于本公开的教导和指导，这些比对可以用于理解和产生新的CAR变体。在一些实施方案中，序列比对可以允许人们理解靶氨基酸附近的共同或相似的氨基酸，并且这些氨基酸可以被视为在模板和靶序列之间具有一定量的同一性或相似性的“序列基序”。这些序列基序可用于描述CAR序列中变异氨基酸所在的部分，以及基序中可能存在的变异类型。

在一些实施方案中，工程化CAR具有工程化蛋白质的一个或多个氨基酸改变，其中所述一个或多个改变是在对应于表10中所示的残基的位置处的改变。在一些实施方案中，相对于表10所示的SEQ ID NO:153，工程化CAR具有氨基酸序列的改变，所述改变具有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个氨基酸改变。在一些实施方案中，除了氨基酸改变N335D之外，工程化CAR还具有表10所示的一个或多个氨基酸改变。在一些实施方案中，工程化CAR具有从对应于SEQ IDNO:153的L245、I247、S274、K275、N276、F278、A282、A283、S299、I300和M389的残基的一个或多个位置中选出的一个或多个氨基酸改变。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQ ID NO:153的位置245处包含L、T或V。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQ ID NO:153的位置247处包含I、M或T。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQ ID NO:153的位置274处包含S、C、A或P。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQ ID NO:153的位置275处包含K、D、N或T。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQ ID NO:153的位置276处包含N或S。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQ ID NO:153的位置278处包含F、S或A。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQID NO:153的位置282处包含A、F或P。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQ ID NO:153的位置283处包含A或C。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQ ID NO:153的位置299处包含S或D。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQ ID NO:153的位置300处包含I、G或Y。在一些实施方案中，工程化CAR可以在SEQ ID NO:153的位置389处包含M、C、Y或S。突变可以单独进行，也可以与表10中所示的其它氨基酸位置的突变组合进行。

此外，还描述了不同于上述TA转氨酶的转氨酶(E.C.2.6.1)。这些转氨酶在本文中称为TA2转氨酶、转氨酶TA2或TA2并且可用于将6-氨基己酸半醛转化为HMD。6-氨基己酸半醛是中间体，并且6-氨基己酸盐向HMD的转化是本文所述的HMD途径中的酶促步骤。因此，TA2可用于产生尼龙中间体的各种途径，包括例如本文所述的HMD途径。

通过同源性搜索以及宏基因组发现可以在产生六亚甲基二胺(HMD)的途径中进行期望反应的酶中鉴定出期望的TA2转氨酶。为了评估TA2对6-氨基己酸半醛的利用，在一些实施方案中，可以用6-氨基己酸半醛或本文举例说明的另一种候选底物以正向进行测定。类似地，所述测定也可以用HMD或另一种候选底物以反向进行。所述分析也可以使用6ACA进行，就像使用TA转氨酶一样。然后可以针对6-氨基己酸半醛转化为HMD中的活性筛选那些对6ACA具有活性的TA2转氨酶。可以使用本领域熟知的方法通过直接或间接测量酶产物来进行测定。一种示例性方法是在下文和实施例中举例说明的间接方法。

在一些实施方案中，鉴定了由SEQ ID NO:265编码的来自大肠杆菌的TA2酶。为了鉴定其它TA2酶，使用了SEQ ID NO:265。同源酶的鉴定如表11所示。在一些实施方案中，TA2酶或序列由BLAST鉴定。在一些实施方案中，TA2与表11的TA2的氨基酸序列的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，表11中鉴定的TA2与SEQ ID NO:265的TA2的氨基酸序列的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，TA2酶与SEQ ID NO:265和267-296中任一者的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约50％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，与6-氨基己酸半醛反应形成HMD的TA2酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO:265和267-296的氨基酸序列。

在一些实施方案中，对于6-氨基己酸半醛作为底物，TA2酶的催化效率和/或转换数与当6ACA是底物时相似。在一些实施方案中，对于6-氨基己酸半醛作为底物，催化效率和/或转换数与当6ACA是底物时相似的酶与SEQ IDNO:265和267-296的TA2中任一者的氨基酸序列的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

所鉴定的TA2酶来源于非常遗传多样的有机体。下面显示的是一些示例性TA2的成对序列比对，如表3所示。

表3.示例性TA2的成对序列比对中的同一性百分比

TA2酶具有保守结构域。基于多序列比对和隐马尔可夫模型(HMM)，TA2酶被归入来自欧洲生物信息学研究所的Pfam数据库(pfam.xfam.org)的Pfam PF00202。TA2酶在磷酸吡哆醛(PLP)结合的活性位点中具有保守的赖氨酸残基。PLP的赖氨酸残基和醛基团可以形成希夫碱结构，导致活性构象。

在一个方面，提供了一种非天然存在的微生物，其包含外源核酸，所述外源核酸编码：(a)工程化羧酸还原酶(CAR)酶，其包含SEQ ID NO:152、153或254的氨基酸的至少一个改变；(b)包含与SEQ ID NO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264中任一者的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的CAR；或(c)与SEQ ID NO:265和267-296中任一者的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少50％序列同一性的六亚甲基二胺(HMD)转氨酶(TA2)酶；并且所述微生物还包含(d)至少一种编码与己二酰-CoA反应形成己二酸半醛的醛脱氢酶(ALD)酶的外源核酸，其中与琥珀酰-CoA、乙酰-CoA或琥珀酰-CoA和乙酰-CoA底物两者相比，所述醛脱氢酶对己二酰-CoA底物具有更高的催化效率，和/或与琥珀酰-CoA、乙酰-CoA或琥珀酰-CoA和乙酰-CoA底物两者相比，所述醛脱氢酶对己二酰-CoA底物具有更高的周转数。

在一些实施方案中，编码ALD酶的一种外源核酸整合到非天然存在的微生物的基因组中。在一些实施方案中，编码ALD酶的外源核酸没有整合到微生物的基因组中，例如质粒。在一些实施方案中，编码ALD酶的外源核酸对于微生物是异源的。

在一些实施方案中，与包含编码3-氧代己二酰-CoA硫解酶(Thl)、3-氧代己二酰-CoA脱氢酶(Hbd)和3-氧代己二酰-CoA脱水酶(“巴豆酸酶”或Crt)、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶(Ter)和转氨酶(TA)、六亚甲基二胺(HMD)转氨酶(TA2)和羧酸还原酶(CAR)的基因但不含编码ALD酶的外源核酸的对照微生物相比，至少一种编码ALD酶的外源核酸在包含编码3-氧代己二酰-CoA硫解酶(Thl)、3-氧代己二酰-CoA脱氢酶(Hbd)和3-氧代己二酰-CoA脱水酶(“巴豆酸酶”或Crt)、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶(Ter)和转氨酶(TA)、六亚甲基二胺(HMD)转氨酶(TA2)和羧酸还原酶(CAR)的基因的非天然存在的微生物中的表达增加了HMD的产生。

为了鉴定对于己二酰CoA底物比对于琥珀酰-CoA、乙酰CoA或这两种底物具有更高催化效率、更大周转数或两者的ALD酶，使用由基因adh编码的克鲁维梭菌(Clostridiumkluyveri)DSM555的示例性序列(SEQ ID NO:141)来鉴定其它醛脱氢酶。同源酶的鉴定如表4所示。

在一些实施方案中，醛脱氢酶或序列由BLAST鉴定。在一些实施方案中，醛脱氢酶与表4的ALD的氨基酸序列的至少50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

这些ALD酶来源于非常遗传多样的有机体。通常，序列之间的简单氨基酸序列同一性并不表示它们的共同功能。例如，表4中公开的一些示例性醛脱氢酶的成对序列比对结果如以下表12所示。

表12.示例性ALD的成对序列比对中的同一性百分比

这些ALD酶具有多个保守结构域，例如N端结构域、C端结构域、和其活性位点处的半胱氨酸残基。ALD包含具有罗斯曼折叠型核苷酸结合结构的辅因子结合结构域。罗斯曼折叠，也称为βαβ折叠，是一种超二级结构，其特征是β-链-α螺旋-β链二级结构的交替基序。β-链参与β-片层的形成。βαβ折叠结构通常在具有二核苷酸辅酶的酶(例如FAD、NAD和NADP)中观察到。βαβ折叠结构与第一个β-链和α-螺旋之间的紧密环区域处的的特定富Gly序列(GxGxxG)相关。此外，辅因子结合结构域也是结合底物CoA的同一个结构域。这是ALD的典型特征，其中底物CoA首先结合，形成中间体，然后辅因子结合并完成化学并进行氢负离子转移。

基于多序列比对和隐马尔可夫模型(HMM)，ALD酶被归入来自欧洲生物信息学研究所的Pfam数据库(pfam.xfam.org)的Pfam PF00171,Clan CL0099。根据酶委员会命名法，这些酶被归类为EC 1.2.1。

对于这里描述的任何酶，在某些情况下，使用基本局部比对搜索工具(BLAST)算法来理解模板序列和靶序列中的氨基酸基序之间的序列同一性是有用的。因此，在优选的实践模式中，BLAST用于鉴定或理解模板和靶蛋白之间较短的氨基酸段(例如序列基序)的同一性。BLAST使用一种启发式方法找到相似的序列，所述方法通过定位两个序列之间的短匹配来近似Smith-Waterman算法。所述(BLAST)算法可以鉴定高于某个阈值的与查询序列相似的库序列。使用BLAST算法确定两个或更多个序列的关联性的示例性参数可例如列举如下。简而言之，氨基酸序列比对可以使用BLASTP版本2.0.8(Jan-05-1999)和以下参数进行：矩阵：0BLOSUM62；空位开放：11；空位延伸：1；x_dropoff：50；预期：10.0；字长：3；过滤器：开。核酸序列比对可以使用BLASTN版本2.0.6(Sept-16-1998)和以下参数进行：匹配：1；错配：-2；空位开放：5；空位延伸：2；x_dropoff：50；预期：10.0；字长：11；过滤器：关。本领域技术人员知悉，为了增加或降低比较的严格度并确定两种或更多种序列的关联性，可对上述参数作哪些修改。

定点诱变或序列改变(例如，位点特异性诱变或寡核苷酸定向的)可用于对靶TADNA序列进行特异性改变，以提供编码TA的具有期望氨基酸取代的变体DNA序列。通常，使用具有提供编码变体氨基酸的密码子的序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，进行变体TADNA序列的整个编码区的人工基因合成，因为优选的靶向取代的TA通常小于150个氨基酸长。

使用诱变寡核苷酸产生变体TA或CAR序列的示例性技术包括Kunkel方法，其可以利用放置在噬菌粒中的TA或CAR基因序列。大肠杆菌TA ssDNA中的噬菌粒是使用寡核苷酸进行诱变的模板，所述寡核苷酸是在模板上延伸的引物。

取决于TA或CAR DNA中目的位置侧翼的限制性酶位点，盒式诱变可用于产生目的变体序列。对于盒式诱变，合成DNA片段以合成方式插入质粒，用限制酶裂解，然后连接到一对含有TA或CAR变异突变的互补寡核苷酸上。质粒和寡核苷酸的限制性片段可以彼此连接。

在其它实施方案中，用于产生变体TA或CAR序列的另一种技术是PCR定点诱变。诱变寡核苷酸引物用于引入期望的突变并提供携带突变序列的PCR片段。额外的寡核苷酸可用于延伸突变片段的末端，以提供适合限制酶消化和插入基因中的限制位点。

也有用于定点诱变技术的商业试剂盒。例如，QuikchangeTM试剂盒使用互补诱变引物，以使用高保真非链置换DNA聚合酶如pfu聚合酶来PCR扩增基因区域。所述反应产生一个松弛的有缺口的环状DNA。模板DNA通过酶促消化用限制酶(如对甲基化DNA特异的DpnI)消除。

在一些实施方案中，优化方法是定向进化。定向进化是一种强有力的方法，它涉及引入靶向特定基因的突变，以改进和/或改变酶的特性。改进的和/或改变的酶可以通过开发和实施灵敏的高通量筛选试验来鉴定，这些试验允许自动筛选许多酶变体(例如>104)。通常进行反复轮次的诱变和筛选以提供具有优化特性的酶。还开发了可以帮助鉴定用于诱变的基因区域的计算算法，这些计算算法可以显著减少需要生成和筛选的酶变体的数量。已经开发了许多定向进化技术(关于综述，参见Hibbert等人,Biomol.Eng 22:11-19(2005)；Huisman和Lalonde,In Biocatalysis in the pharmaceutical andbiotechnology industries第717-742页(2007),Patel(编),CRC Press；Otten和Quax.Biomol.Eng 22:1-9(2005)；和Sen等人,Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007))，以有效地创建不同的变体文库，并且这些方法已经成功地应用于许多酶类别的广泛性质的改进。已通过定向进化技术改进和/或改变的酶特性包括例如：选择性/特异性，用于非天然底物的转化；温度稳定性，用于稳健的高温加工；pH稳定性，用于较低或较高pH条件下的生物加工；底物或产物的耐受性，从而可以获得高的产物滴度；结合(Km)，包括扩大底物结合以包括非天然底物；抑制(Ki)，用于去除产物、底物或关键中间体的抑制作用；活性(kcat)，用于增加酶促反应速率以获得期望的通量；表达水平，用于增加蛋白质产量和总途径通量；氧稳定性，用于空气敏感酶在需氧条件下的操作；和厌氧活性，用于需氧酶在不存在氧气的情况下的操作。

已经开发了许多示例性方法用于基因的诱变和多样化以靶向特定酶的期望特性。这类技术是本领域技术人员熟知的。这些技术中的任何一种都可用于改变和/或优化6ACA、六亚甲基二胺、己内酰胺或1,6-己二醇途径酶或蛋白质的活性。这类方法包括但不限于EpPCR，其通过降低PCR反应中DNA聚合酶的保真度而引入随机点突变(Pritchard等人,JTheor.Biol.234:497-509(2005))；易错滚环扩增(Error-prone Rolling CircleAmplification)(epRCA)，其类似于epPCR，除了使用整个环状质粒作为模板，并且使用在最后2个核苷酸上具有核酸外切酶抗性硫代磷酸盐连接的随机6聚体来扩增质粒，然后转化到其中质粒在串联重复处再环化的细胞中(Fujii等人,Nucleic Acids Res.32:e145(2004)；和Fujii等人,Nat.Protoc.1:2493-2497(2006))；DNA或家族改组(DNA or FamilyShuffling)，其通常涉及用核酸酶如Dnase I或EndoV消化两个或更多个变异基因以产生随机片段池，所述随机片段池在DNA聚合酶存在下通过退火和延伸循环重新组装以产生嵌合基因文库(Stemmer,Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751(1994)；和Stemmer,Nature370:389-391(1994))；交错延伸(Staggered Extension)(StEP)，其需要模板引发，随后重复循环具有变性和非常短的持续时间的退火/延伸(短至5秒)的2步PCR(Zhao等人,Nat.Biotechnol.16:258-261(1998))；随机引物重组(Random Priming Recombination)(RPR)，其中使用随机序列引物产生与模板的不同链段互补的许多短DNA片段(Shao等人,Nucleic Acids Res26:681-683(1998))。

另外的方法包括异源双链体重组(Heteroduplex Recombination)，其中线性化的质粒DNA用于形成通过错配修复进行修复的异源双链体(Volkov等人,Nucleic AcidsRes.27:e18(1999)；Volkov等人,Methods Enzymol.328:456-463(2000))；过渡模板随机嵌合生长(Random Chimeragenesis on Transient Templates)(RACHITT)，其采用Dnase I片段化和单链DNA(ssDNA)的大小分级(Coco等人,Nat.Biotechnol.19:354-359(2001))；截短模板上的重组延伸(Recombined Extension on Truncated templates)(RETT)，其需要在存在用作模板池的单向ssDNA片段的情况下从引物进行单向生长链的模板转换(Lee等人,J.Molec.Catalysis 26:119-129(2003))；简并寡核苷酸基因改组(DegenerateOligonucleotide Gene Shuffling)(DOGS)，其中简并引物用于控制分子之间的重组(Bergquist和Gibbs,Methods Mol.Biol 352:191-204(2007)；Bergquist等人,Biomol.Eng22:63-72(2005)；Gibbs等人,Gene271:13-20(2001))；用于产生杂化酶的递增截短(Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes)(ITCHY)，其产生具有目的基因或基因片段的1个碱基对缺失的组合文库(Ostermeier等人,Proc.Natl.AcadSci.USA96:3562-3567(1999)；和Ostermeier等人,Nat.Biotechnol.17:1205-1209(1999))；用于产生杂化酶的硫代递增截短(Thio-Incremental Truncation for theCreation of Hybrid Enzymes)(THIO-ITCHY)，其类似于ITCHY，除了硫代磷酸盐dNTP用于产生截短(Lutz等人,Nucleic Acids Res 29:E16(2001))；SCRATCHY，其结合了用于重组基因的两种方法，即ITCHY和DNA改组(Lutz等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA 98:11248-11253(2001))；随机漂移诱变(Random Drift Mutagenesis)(RNDM)，其中通过epPCR产生突变，之后筛选/选择那些保留可用活性的突变(Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63-72(2005))；序列饱和诱变(Sequence Saturation Mutagenesis)(SeSaM)，一种随机诱变方法，其使用硫代磷酸核苷酸的随机掺入和裂解产生随机长度片段的池，所述池被用作模板以在“通用”碱基如肌苷的存在下延伸，并且含有肌苷的补体的复制发生随机碱基掺入并因此发生诱变(Wong等人,Biotechnol.J.3:74-82(2008)；Wong等人,Nucleic Acids Res.32:e26(2004)；和Wong等人,Anal.Biochem.341:187-189(2005))；合成改组(Synthetic Shuffling)，其使用被设计为编码“靶标中的所有遗传多样性”的重叠寡核苷酸，并允许改组的后代具有非常高的多样性(Ness等人,Nat.Biotechnol.20:1251-1255(2002))；核苷酸交换和切除技术NexT(Nucleotide Exchange and Excision Technology NexT)，其利用dUTP掺入，然后先用尿嘧啶DNA糖基化酶再用哌啶处理，以进行终点DNA片段化(Muller等人,Nucleic AcidsRes.33:e17(2005))。

其它方法包括不依赖序列同源性的蛋白质重组(Sequence Homology-Independent Protein Recombination)(SHIPREC)，其中接头用于促进两个关系很远或不相关基因之间的融合，并且在这两个基因之间产生一系列嵌合体，从而产生单交叉杂交体的文库(Sieber等人,Nat.Biotechnol.19:456-460(2001))；基因位点饱和诱变^TM(GeneSite Saturation Mutagenesis^TM)(GSSM^TM)，其中起始材料包括含有插入片段的超螺旋双链DNA(dsDNA)质粒和在期望突变位点简并的两个引物(Kretz等人,Methods Enzymol.388:3-11(2004))；组合盒式诱变(Combinatorial Cassette Mutagenesis)(CCM)，其涉及使用短寡核苷酸盒来替换具有大量可能的氨基酸序列改变的有限区域(Reidhaar-Olson等人,Methods Enzymol.208:564-586(1991)；和Reidhaar-Olson等人,Science 241:53-57(1988))；组合多重盒式诱变(Combinatorial Multiple Cassette Mutagenesis)(CMCM)，其基本上类似于CCM，并且使用高突变率的epPCR来鉴定热点和热区域，然后通过CMCM进行延伸以覆盖蛋白质序列空间的限定区域(Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589-3591(2001))；增变菌株技术(Mutator Strains technique)，其中条件性ts增变质粒利用编码DNA聚合酶III的突变亚单位的mutD5基因，以允许在选择期间随机和自然突变频率增加20到4000倍，并在不需要选择时阻断有害突变的积累(Selifonova等人,Appl.Environ.Microbiol.67:3645-3649(2001))；Low等人,J.Mol.Biol.260:359-3680(1996))。

另外的示例性方法包括透视诱变(Look-Through Mutagenesis)(LTM)，其是评估和优化所选氨基酸的组合突变的多维诱变方法(Rajpal等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA102:8466-8471(2005))；基因重装配(Gene Reassembly)，这是一种DNA改组方法，可以一次应用于多个基因或利用计算机蛋白质设计自动化(Silico Protein Design Automation)(PDA)创建单个基因的嵌合体(多重突变)的大型文库(由Verenium Corporation提供的Tunable GeneReassembly^TM(TGR^TM)技术)，这是一种优化算法，其锚定具有特定折叠的结构上定义的蛋白质主链，并在序列空间中搜索可以稳定折叠和整体蛋白质能量学的氨基酸取代，并且通常对具有已知三维结构的蛋白质最有效地工作(Hayes等人,Proc.Natl.AcadSci.USA 99:15926-15931(2002))；以及迭代饱和诱变(Iterative SaturationMutagenesis)(ISM)，其涉及使用结构/功能的知识来选择用于酶改进的可能位点，使用诱变方法例如Stratagene QuikChange(Stratagene；San Diego Calif.)在所选择的位点进行饱和诱变，筛选/选择期望的性质，和使用改进的克隆，在另一个位点重新开始并继续重复，直到实现期望的活性(Reetz等人,Nat.Protoc.2:891-903(2007)；和Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.45:7745-7751(2006))。

上述任何诱变方法都可以单独使用或以任何组合使用。此外，如本文所述，定向进化方法中的任何一种或组合可以与自适应进化技术结合使用。

可以使用本领域已知的任何方法鉴定具有期望的酶活性的细胞。例如，酶活性测定可用于鉴定具有酶活性的细胞，参见例如Enzyme Nomenclature,Academic Press,Inc.,New York 2007。可用于确定TA对己二酸半醛、CAR对6ACA和/或TA2对6-氨基己酸半醛的反应的其它测定包括GC/MS分析。在其它实施例中，可以监测NADH/NADPH的水平。例如，可以使用NADP/NADPH测定试剂盒(例如可从ABCAM^TM获得的ab65349)用比色法或光谱法监测NADH/NADPH。

公开的TA酶可用于生产尼龙中间体的途径中。在一些实施方案中，非天然存在的微生物可用于生产己二酸半醛或使用己二酸半醛作为中间体生产的其它尼龙中间体。一种使用己二酸半醛作为本文所述的TA酶的底物的示例性中间体是6ACA。

所公开的CAR酶可用于生产尼龙中间体和/或生产1,6-己二醇中间体的途径中。在一些实施方案中，非天然存在的微生物可用于生产6ACA或使用6ACA作为中间体生产的其它尼龙中间体或1,6-己二醇中间体。使用6ACA作为本文所述的CAR酶的底物，尼龙和1,6-己二醇的一种示例性中间体是6-氨基己酸半醛。因此，某些尼龙中间体也可以是1,6-己二醇中间体(参见例如图8)，并且除非另有说明，否则在本文中被称为尼龙中间体。

公开的TA2酶可用于生产尼龙中间体的途径中。在一些实施方案中，非天然存在的微生物可用于生产6-氨基己酸半醛或使用6-氨基己酸半醛作为中间体生产的其它尼龙中间体。使用6-氨基己酸半醛作为本文所述的TA2酶的底物的一种示例性中间体是六亚甲基二胺。

在一些实施方案中，遗传修饰的细胞(例如非天然存在的微生物)能够生产尼龙中间体，例如6-氨基己酸、己内酰胺和六亚甲基二胺。

在一些实施方案中，使用图1所述的途径生物合成尼龙中间体。在一些实施方案中，图1途径是在本文所述的遗传修饰细胞(例如，非天然存在的微生物)中提供的，其中所述途径包括至少一种外源核酸，所述外源核酸编码以足够量表达以产生6-氨基己酸、己内酰胺和六亚甲基二胺的途径酶。

在一些实施方案中，所述途径是如图1所述的HMD途径。HMD途径是在本文所述的遗传修饰细胞(例如，非天然存在的微生物)中提供的，其中HMD途径包括至少一种外源核酸，所述外源核酸编码以足够量表达以产生HMD的HMD途径酶。这些酶是：1A是3-氧代己二酰-CoA硫解酶；1B是3-氧代己二酰-CoA还原转氨酶；1C是3-羟基己二酰-CoA脱水转氨酶；1D是己二酸半醛还原转氨酶；1E是3-氧代己二酰-CoA/酰基-CoA转移酶；1F是3-氧代己二酰-CoA合酶；1G是3-氧代己二酰-CoA水解酶；1H是3-氧代己二酸盐还原转氨酶；1I是3-羟基己二酸盐脱水转氨酶；1J是5-羧基-2-戊烯酸盐还原转氨酶；1K是己二酰-CoA/酰基-CoA转移酶；1L是己二酰-CoA合酶；1M是己二酰-CoA水解酶；1N是己二酰-CoA还原转氨酶(醛形成)；1O是6-氨基己酸盐转氨酶；1P是6-氨基己酸盐脱氢酶；1Q是6-氨基己酰-CoA/酰基-CoA转移酶；1R是6-氨基己酰-CoA合酶；1S是酰胺水解酶；1T是自发环化；1U是6-氨基己酰-CoA还原酶(醛形成)；1V是HMD转氨酶；并且1W是HMD脱氢酶。

参考图1，在一些实施方案中，非天然存在的微生物具有以下途径中的一种或多种：ABCDNOPQRUVW；ABCDNOPQRT；或ABCDNOPS。包括TA酶以产生己二酸半醛的其它示例性途径包括美国专利第8,377,680号中描述的那些，所述专利通过引用整体并入本文。

图1还显示了通过转移酶或合酶从6-氨基己酸盐生成6-氨基己酰-CoA的途径(图1，步骤Q或R)，随后6-氨基己酰-CoA自发环化形成己内酰胺(图1，步骤T)。在其它实施方案中，6-氨基己酸盐被活化成6-氨基己酰-CoA(图1，步骤Q或R)，随后还原(图1，步骤U)和胺化(图1，步骤V或W)以形成HMD。6-氨基己酸也可以被活化成6-氨基己酰-磷酸盐而不是6-氨基己酰-CoA。6-氨基己酰-磷酸盐可以自发环化形成己内酰胺。在一些实施方案中，6-氨基己酰-磷酸盐可被还原为6-氨基己酸半醛，其随后可转化为HMD，如图1所示。

在一些实施方案中，非天然存在的微生物可产生己二酸盐、6ACA、己内酯、六亚甲基二胺或己内酰胺，如图4-10的途径所示。

在一些实施方案中，非天然存在的微生物可以产生1,6-己二醇。图8举例说明了通过尼龙中间体如6ACA、6-氨基己酰-CoA、6-氨基己酸半醛、己二酸盐、己二酰-CoA和己二酸半醛生成1,6-己二醇的生物合成途径。

在一些实施方案中，非天然存在的微生物还包括编码醛脱氢酶(ALD)或反式烯酰还原酶(TER)或两者的外源表达的核酸。ALD与己二酰-CoA反应生成己二酸半醛，而TER与5-羧基-2-戊烯酰-CoA(CPCoA)反应生成己二酰CoA。

在一些实施方案中，与琥珀酰-CoA或乙酰-CoA或这两种底物相比，ALD酶对己二酰CoA底物具有更高的催化效率和活性。在一些实施方案中，ALD酶如下表4所示。在一些实施方案中，可从本公开的非天然存在的微生物中的编码核酸外源表达的TER酶序列如下表5所示。

在一些实施方案中，可从本公开的非天然存在的微生物中的编码核酸外源表达的TA酶序列如下表6所示。在一些实施方案中，可从非天然存在的微生物中的编码核酸外源表达的TA酶变体序列如下表7所示。

在一些实施方案中，可从本公开的非天然存在的微生物中的编码核酸外源表达的CAR酶序列如下表8所示。在一些实施方案中，可从本公开的非天然存在的微生物中的编码核酸外源表达的CAR变体序列如下表9所示。

在一些实施方案中，可从本公开的非天然存在的微生物中的编码核酸外源表达的CAR酶序列包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列和一个或多个如下表10所示的氨基酸改变。在一些实施方案中，CAR酶可以包含1、2、3、4、5、6、7或8个如下表10所示的氨基酸改变。

在一些实施方案中，可从本公开的非天然存在的微生物中的编码核酸外源表达的TA2酶序列如下表11所示。

本文所述的任何、一些或所有TA、CAR、TA2、TER和/或ALD酶可用于本文所述的任何生物合成途径，只要参考的TA、CAR、TA2、TER和/或ALD酶促转化的底物和产物是所述途径内的中间体。例如，TER可以被取代到本文中对于所提及酶描述的将5-羧基-2-戊烯酰-CoA(也称为2,3-脱氢己二酰-CoA)转化为己二酰-CoA的任何途径中。类似地，ALD可以被取代到本文中对于所提及酶描述的将己二酰-CoA转化为己二酸半醛的任何途径中。另外，TA酶可以被取代到本文中对于所提及酶描述的将己二酸半醛转化为6ACA的任何途径中。再另外，CAR酶可以被取代到本文中对于所提及酶描述的将6ACA转化为6-氨基己酸半醛的任何途径中。另外，TA2酶可以被取代到本文中对于所提及酶描述的将6-氨基己酸盐转化为HMD的任何途径中。因此，TA、CAR、TA2、TER和/或ALD中的任何一种、两种、三种、四种或全部五种的任何组合和/或排列可用于本文所述的生物合成途径中。

可以利用TA、CAR、TA2、TER和/或ALD中的任何、一些或全部的一个示例性途径在图10中通过参考其中利用TA、CAR、TA2、TER和ALD中的所有的一个特定实施方案来表示。在一些实施方案中，使用图10所述的途径生物合成尼龙中间体。在一些实施方案中，图10途径是在本文所述的遗传修饰细胞(例如，非天然存在的微生物)中提供的，其中所述途径包括至少一种外源核酸，所述外源核酸编码以足够量表达以产生6-氨基己酸、6-氨基己酸半醛和六亚甲基二胺的途径酶。

在一些实施方案中，所述途径是如图10所述的HMD途径。HMD途径是在本文所述的遗传修饰细胞(例如，非天然存在的微生物)中提供的，其中HMD途径包括至少一种外源核酸，所述外源核酸编码以足够量表达以产生HMD的HMD途径酶。从琥珀酰-CoA和乙酰-CoA开始，酶被指定为：(A)硫解酶；(B)羟基己二酰-CoA脱氢酶(HBD)；(C)巴豆酸酶；(D)反式烯酰-CoA还原酶(Ter)；(E)6ACA-醛脱氢酶(ALD)；(F)6ACA-转氨酶(TA)；(G)CoA转移酶/CoA连接酶；(H)HMD-醛脱氢酶(ALD)；(I)羧酸还原酶(CAR)，和(J)HMD-转氨酶(TA2)。另外还可以包括编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)的外源核酸。使用CAR酶，所述途径可以省略步骤G和H。不使用CAR，可以省略步骤I。

参照图10并利用本文所述的CAR酶，非天然存在的微生物具有以下HMD途径：ABCDEFIJ，其中步骤I是6ACA到6-氨基己酸盐的CAR转化。上述途径的酶D、E、F和J分别对应于TER、ALD、TA和TA2酶。

如本文所用，术语“非天然存在”当关于微生物或微生物使用时旨在意味着微生物具有至少一个在所提及物种的天然存在的菌株(包括所提及物种的野生型菌株)中通常未发现的遗传改变。遗传改变包括例如引入可表达的编码代谢多肽的核酸的修饰、其它核酸添加、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其它功能性破坏。此类修饰包括例如所提及物种的异源、同源或异源与同源多肽的编码区和其功能片段。另外的修饰包括例如非编码调控区，其中修饰会改变基因或操纵子的表达。示例性代谢多肽包括本文所述的6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径中的酶。

代谢修饰是指自天然存在的状态发生改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可具有对编码代谢多肽的核酸或其功能片段的遗传修饰。本文公开了示例性代谢修饰。

如本文所用，术语“微生物的”、“微生物有机体”或“微生物”已经互换地使用，并且旨在意味着以古菌界、细菌界或真核生物界内所包括的显微细胞形式存在的任何有机体。因此，所述术语欲涵盖具有显微尺寸的原核或真核细胞或有机体，且包括所有种类的细菌、古细菌和真细菌，以及真核微生物，例如酵母和真菌。所述术语还包括可经培养以用于产生生化物质的任何种类的细胞培养物。

如本文所用，术语“CoA”或“辅酶A”旨在意味着有机辅因子或辅基(酶的非蛋白质部分)，其存在为许多酶(脱辅基酶蛋白)形成活性酶系统的活性所必需。辅酶A在某些缩合酶中，在乙酰基或其它酰基转移中，在脂肪酸合成和氧化，在丙酮酸盐氧化中和在其它乙酰化作用中发挥功能。

如本文所用，具有化学式-OOC-(CH2)4-COO-的“己二酸基(adipate)”(参见图1)(IUPAC名称己二酸基(hexanedioate))是己二酸(adipic acid)(IUPAC名称己二酸(hexanedioic acid))的电离形式，并且应该理解，己二酸基和己二酸可以在全文互换使用，以指代其任何中性或电离形式的化合物，包括其任何盐形式。本领域技术人员理解，具体形式将取决于pH值。

如本文所用，具有化学式–OOC-(CH2)5-NH2的“6-氨基己酸基”(参见图1，缩写为6-ACA)是6-氨基己酸(6-aminocaproic acid)(IUPAC名称6-氨基己酸(6-aminohexanoicacid))的电离形式，并且应该理解，6-氨基己酸基和6-氨基己酸可以在全文互换使用，以指代其任何中性或电离形式的化合物，包括其任何盐形式。本领域技术人员理解，具体形式将取决于pH值。

如本文所用，“己内酰胺”(IUPAC名称氮杂环庚烷-2-酮)是6-氨基己酸的内酰胺(参见图1，缩写为CPO)。

如本文所用，“六亚甲基二胺”，也称为1,6-二氨基己烷或1,6-己二胺，具有化学式H2N(CH2)6NH2(参见图1，缩写为HMD)。

如本文所用，“1,6-己二醇”，也称为己-1,6-二醇和六亚甲基二醇，具有化学结构C₆H₁₄O₂(参见图8，缩写为HDO)。

如本文所用，术语“基本上厌氧”当关于培养或生长条件使用时，旨在意味着液体介质中的含氧量小于溶解氧饱和含量的约10％。所述术语还打算包括维持在小于约1％氧气的气氛下的液体或固体介质密封室。

如本文所用，术语“渗透保护剂”在关于培养或生长条件使用时旨在意味着用作渗透剂并帮助本文所述的微生物在渗透胁迫下存活的化合物。渗透保护剂包括例如甜菜碱、氨基酸和糖海藻糖。它们的非限制性实例是甘氨酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基巯基丙酸盐、3-二甲基巯基-2-甲基丙酸盐、哌可酸(pipecolic acid)、二甲基巯基乙酸盐、胆碱、L-肉碱和四氢嘧啶(ectoine)。

如本文所用，术语“生长偶联的”当关于生物化学物质的产生使用时旨在意味着所提及的生物化学物质的生物合成是在微生物的生长阶段期间产生的。在一个特定实施方案中，生长偶联生产可以是强制性的，这意味着所提及的生物化学物质的生物合成是在微生物的生长阶段期间产生的强制性产物。

如本文所用，“代谢修饰”旨在指自天然存在的状态发生改变的生化反应。代谢修饰可以包括例如通过编码参与反应的酶的一个或多个基因的功能破坏来消除生化反应活性。

如本文所用，术语“基因破坏”或其语法等同物旨在意味着使编码的基因产物无活性的遗传改变。遗传改变可以是例如整个基因的缺失，转录或翻译所需的调控序列的缺失，生成截短的基因产物的一部分基因的缺失，或者使编码的基因产物无活性的各种突变策略中的任何一种。一种特别有用的基因破坏方法是完全基因缺失，因为它减少或消除了非天然存在的微生物中遗传逆转的发生。

如本文所用的“外源”旨在意味着所提及的分子或所提及的活性是引入到宿主微生物中。分子可例如通过将编码核酸引入到宿主遗传物质中而引入，例如通过编码核酸整合到宿主染色体中或编码核酸作为非染色体遗传物质(例如质粒)。因此，在关于编码核酸的表达使用时，所述术语是指将编码核酸以可表达形式引入到微生物中。当关于生物合成活性使用时，所述术语是指活性被引入到宿主参考有机体中。来源可为例如同源或异源编码核酸，其在引入到宿主微生物中之后表达所提及的活性。因此，术语“内源”是指所提及的分子或活性是存在于宿主中。类似地，当关于编码核酸的表达使用时，所述术语是指表达微生物内所含的编码核酸。

术语“异源”是指分子、材料或活性是来源于除所提及的物种以外的来源，而“同源”是指分子、材料和或活性是来源于宿主微生物。因此，编码核酸的外源表达可利用异源编码核酸或同源编码核酸或两者。

如本文所用，术语“约”是指所述值的±10％。术语“约”可以表示四舍五入到最接近的有效位。因此，约5％表示4.5％至5.5％。另外，关于一个特定数字的约也包括那个确切的数字。例如，约5％也包括精确的5％。

如本文所用，在6-氨基己酸、1,6-己二醇、己内酯、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的上下文中，术语“生物衍生的”意味着这些化合物在微生物中合成。

应当理解，当微生物中包括一个以上的外源核酸时，外源核酸是指所提及的编码核酸或生物合成活性，如上文或下文举例说明的。应当进一步理解，如本文所公开的，这类外源核酸可以在单独的核酸分子上、多顺反子核酸分子上或其组合上引入宿主微生物中，并且仍然被认为是一个以上的外源核酸。例如，如本文所公开的，微生物可以被改造成表达两种或更多种编码期望的途径酶或蛋白质的外源核酸。在将编码期望活性的两个外源核酸引入宿主微生物的情况下，应当理解，这两个外源核酸可以作为单个核酸引入，例如，在单个质粒上，在单独的质粒上，可以在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中，并且仍然被认为是两个外源核酸。类似地，应当理解，可以以任何期望的组合将两种以上的外源核酸引入宿主有机体，例如，在单个质粒上，在未整合到宿主染色体中的单独质粒上，并且质粒保留为染色体外元件，并且仍然被认为是两种或更多种外源核酸。所提及的外源核酸或生物合成活性的数量是指编码核酸的数量或生物合成活性的数量，而不是引入宿主有机体的单独核酸的数量。

非天然存在的微生物可含有稳定的遗传改变，这是指微生物在培养超过5代后仍不会损失所述改变。一般来说，稳定的遗传改变包括持续超过10代的修饰，特定来说，稳定的修饰将持续超过约25代，且更特定来说，稳定的遗传修饰将持续超过50代，包括无限持续下去。

在基因破坏的情况下，一种特别有用的稳定的遗传改变是基因缺失。使用基因缺失来引入稳定的遗传改变对于降低遗传改变之前回复到表型的可能性特别有用。例如，通过缺失编码催化一组代谢修饰中一种或多种反应的酶的基因，可以实现稳定的生长偶联的生化物质生产。生长偶联的生化物质生产的稳定性可以通过多重缺失进一步增强，显著降低了每种被破坏的活性发生多重补偿性逆转的可能性。

本领域技术人员将了解，对遗传改变(包括本文举例说明的代谢修饰)的描述是关于合适的宿主有机体例如大肠杆菌及其对应的代谢反应，或产生期望遗传物质(例如针对期望代谢途径的基因)的合适来源有机体。然而，鉴于多种有机体的完整基因组测序和基因组学领域中的高度技术水平，本领域技术人员能够容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有其它有机体。举例来说，通过掺入来自除所提及物种以外的物种的相同或类似的编码核酸，本文举例说明的大肠杆菌代谢改变可容易地应用于其它物种。此类遗传改变一般包括例如种间同源物的遗传改变，且特定来说，直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置换。

直系同源物是有垂直家系关系且在不同有机体中负责基本上相同或一致的功能的基因。举例来说，小鼠环氧化物水解酶和人类环氧化物水解酶可被视为环氧化物水解的生物功能的直系同源物。例如，当基因共有足量的序列相似性以指示其是同源的，或通过从共同祖先进化而产生关联时，所述基因有垂直家系关系。如果基因具有三维结构相似性但未必具有序列相似性，或在无法鉴定到一级序列相似性的范围内有足够量表明其是进化自共同祖先，那么这些基因也可被视为直系同源物。直系同源的基因可编码序列相似性为氨基酸序列同一性的约25％到100％的蛋白质。如果编码氨基酸相似性小于25％的蛋白质的基因的三维结构也显示相似性，那么其也可被视为是由垂直家系引起的。丝氨酸蛋白酶家族的成员(包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶)被视为是通过垂直家系从共同祖先产生的。

直系同源物包括经由例如进化而在结构或总体活性上具有分歧的基因或其编码的基因产物。举例来说，在一种物种编码展现两种功能的基因产物的情况下，以及在此类功能分离成第二物种中的不同基因的情况下，这三种基因及其对应产物被视为直系同源物。为了产生生化产物，本领域技术人员将了解可对具有欲引入或破坏的代谢活性的直系同源基因进行选择，以便构建非天然存在的微生物。展现可分离活性的直系同源物的一个实例是不同活性已在两种或更多种物种之间或在单一物种内被分离成不同基因产物。一个特定实例是弹性蛋白酶蛋白水解和纤溶酶原蛋白水解(两种类型的丝氨酸蛋白酶活性)被分离成作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶的不同分子。另一个实例是支原体5’-3’核酸外切酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合物可被视为来自第二物种的核酸外切酶或聚合酶中一者或两者的直系同源物，且反之亦然。

相反，旁系同源物是通过例如复制和随后的进化趋异而产生关联且具有相似或共同、但不完全相同的功能的同源物。旁系同源物可来源于或衍生自例如相同物种或不同物种。举例来说，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可被视为旁系同源物，因为其代表两种共同进化自共同祖先的独特酶，催化独特反应且在相同物种中具有独特功能。旁系同源物是来自相同物种的彼此具有显著序列相似性的蛋白质，表明其是同源的或通过共同进化自共同祖先而产生关联。旁系同源蛋白质家族的分组包括HipA同源物、荧光素酶基因、肽酶等。

非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因可取代不同物种中的所提及的基因功能。取代包括例如能够在起源物种中执行与不同物种中的所提及功能相比基本上相同或类似的功能。虽然一般来说，非直系同源基因置换可被鉴定为在结构上与编码参考功能的已知基因相关，但是结构相关性较小但功能类似的基因及其对应的基因产物在本文中使用时仍然处于所述术语的含义内。功能相似性需要例如非直系同源基因产物的活性位点或结合区域与编码设法取代的功能的基因相比具有至少一些结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物或无关基因。

因此，在鉴定和构建具有6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成能力的非天然存在的微生物的过程中，本领域技术人员将了解，通过对特定物种应用本文提供的教导和指导，代谢修饰的鉴定可包括直系同源物的鉴定和纳入或失活。只要所提及微生物中存在旁系同源物和/或非直系同源基因置换以用于编码催化类似或基本上类似的代谢反应的酶，那么本领域技术人员也可利用这些进化上相关的基因。在基因破坏策略中，进化相关的基因也可以在宿主微生物、旁系同源物或直向同源物中被破坏或缺失，以减少或消除活性，从而确保以破坏为目标的酶活性中的任何功能冗余不会使设计的代谢修饰短路。

直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换可通过本领域技术人员熟知的方法来确定。举例来说，检查两种多肽的核酸或氨基酸序列将会揭示所比较序列之间的序列同一性和相似性。基于此类相似性，如果相似性足够高，那么本领域技术人员可确定蛋白质是通过进化自共同祖先而产生关联。本领域技术人员熟知的算法(例如Align、BLAST、Clustal W等)比较和确定粗略的序列相似性或同一性，并且确定序列中可被指派权重或分数的间隙的存在或意义。此类算法在本领域中也是已知的，且类似地可用于确定核苷酸序列相似性或同一性。足以确定关联性的相似性的参数是基于用于计算统计相似性的熟知方法，或在随机多肽中发现类似匹配的概率和所确定匹配的意义来计算得出。两种或更多种序列的计算机比较在必要时也可由本领域技术人员目测优化。预期相关的基因产物或蛋白质可具有高相似性，例如25％到100％序列同一性。如果扫描足够大小的数据库，那么无关的蛋白质可具有与预期偶然发生的概率基本上相同的同一性(约5％)。5％与24％之间的序列可能代表或可能不代表足以推断所比较序列是相关序列的同源性。可执行鉴于数据集的大小确定此类匹配的意义的其它统计分析，以便确定这些序列的相关性。

使用BLAST算法确定两个或更多个序列的关联性的示例性参数可例如列举如下。简而言之，氨基酸序列比对可以使用BLASTP版本2.2.29+(Jan-14，2014)和以下参数进行：矩阵：0BLOSUM62；空位开放：11；空位延伸：1；x_dropoff：50；预期：10.0；字长：3；过滤器：开。核酸序列比对可以使用BLASTN版本2.0.6(Sept-16-1998)和以下参数进行：匹配：1；错配：-2；空位开放：5；空位延伸：2；x_dropoff：50；预期：10.0；字长：11；过滤器：关。本领域技术人员知悉，为了增加或降低比较的严格度并确定两种或更多种序列的关联性，可对上述参数作哪些修改。

应当理解，本文公开的任何途径，包括附图中描述的途径，可用于产生非天然存在的微生物，其根据需要产生任何途径中间体或产物。如本文所公开的，此类产生中间体的微生物可以与表达下游途径酶的另一种微生物结合使用以产生期望产物。然而，应当理解，可以利用产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径中间体的非天然存在的微生物来生产作为期望产物的中间体。

本文的描述一般是关于代谢反应、反应物或其产物，或特定关于一种或多种编码与所提及的代谢反应、反应物或产物相关或催化所提及的代谢反应、反应物或产物的酶的核酸或基因。除非本文明确说明，否则本领域技术人员将了解提及反应时同样表示提及反应的反应物和产物。类似地，除非本文明确说明，否则提及反应物或产物时同样表示提及反应，且提及任何这些代谢组分时同样表示提及一种或多种编码催化所提及的反应、反应物或产物的酶的基因。同样，鉴于代谢生物化学、酶学和基因组学是熟知领域，本文提及基因或编码核酸也等同于提及对应的所编码酶和其催化的反应，以及反应的反应物和产物。

非天然存在的微生物可通过引入可表达核酸来产生，所述可表达核酸编码参与一种或多种6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径的酶中的一者或多者。取决于为生物合成所选的宿主微生物，可表达用于特定6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径中的一些或所有的核酸。举例来说，如果所选宿主缺乏用于期望生物合成途径的一种或多种酶，那么将用于所缺乏酶的可表达核酸引入到宿主中以进行随后的外源表达。或者，如果所选宿主展现一些途径基因的内源表达，但缺乏其它酶，那么所缺乏的酶需要编码核酸以实现6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成。因此，非天然存在的微生物可通过引入外源酶活性以获得期望的生物合成途径来产生，或者期望的生物合成途径可通过引入一种或多种外源酶活性来获得，所述一种或多种外源酶活性与一种或多种内源酶一起产生期望产物，例如6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇。

取决于所选宿主微生物的6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径成分，非天然存在的微生物将包括至少一种外源表达的6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径编码核酸，以及一种或多种己二酸盐、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成途径的最多所有编码核酸。例如，6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成可在缺乏途径酶的宿主中通过对应编码核酸的外源表达来实现。在缺乏6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径的所有酶的宿主中，可包括所述途径中所有酶的外源表达，但应了解即使宿主含有这些途径酶中的至少一种，也可表达途径的所有酶。

鉴于本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将了解以可表达形式引入的编码核酸的数量至少与选定宿主微生物的6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径缺陷相似。因此，非天然存在的微生物可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个直至所有编码构成6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径的上述酶的核酸。在一些实施方案中，非天然存在的微生物也可包括其它遗传修饰，这些遗传修饰促进或优化6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成或对宿主微生物赋予其它有用的功能。一种这样的其它功能可以包括例如增加6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径前体中的一者或多者的合成，例如己二酸盐合成情况下的琥珀酰-CoA和/或乙酰-CoA，或6-氨基己酸、己内酰胺或HMD合成情况下的己二酰-CoA或己二酸盐，包括本文公开的己二酸盐途径酶，或6-氨基己酸盐合成情况下的丙酮酸盐和琥珀酸半醛、谷氨酸盐、戊二酰-CoA、高赖氨酸或2-氨基-7-oxosubarate，或六亚甲基二胺合成情况下的6-氨基己酸盐、谷氨酸盐、戊二酰-CoA、丙酮酸盐和4-氨基丁醛或2-氨基-7-oxosubarate。

在一些实施方案中，非天然存在的微生物具有至少一个编码转氨酶的外源核酸，所述转氨酶与己二酸半醛反应形成6ACA，并选自包含与SEQ ID NO:1、3、4、5、9、12、13、26、27、30、31、38、50、52、64、74、78、79、81、91、106、108和116中任一者的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约50％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的转氨酶。

在一些实施方案中，非天然存在的微生物具有至少一个编码CAR的外源核酸，所述CAR与6ACA反应形成6-氨基己酸半醛，并选自包含与SEQ IDNO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264中任一者的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约50％的序列同一性的氨基酸序列的CAR。

在一些实施方案中，非天然存在的微生物具有至少一个编码CAR的外源核酸，所述CAR与6ACA反应形成6-氨基己酸半醛，并选自包含与SEQ ID NO:265和267-296中任一者的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少约50％的序列同一性的氨基酸序列的CAR。

一般来说，对宿主微生物进行选择，以便其能产生作为天然产生的分子或作为工程产物的6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径的前体，所述工程产物提供期望前体的从头产生，或增加由宿主微生物天然产生的前体的产生。宿主有机体可经改造以增加前体的产生，如本文所公开。此外，已经过改造以产生期望前体的微生物可用作宿主有机体，且进一步经过改造以表达6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径的酶或蛋白质。

在一些实施方案中，非天然存在的微生物是从含有合成6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的酶促能力的宿主产生。在该具体实施方案中，增加6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径产物的合成或积累可用于例如驱动6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径反应产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇。增加的合成或积累可通过例如编码上述6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径酶中的一者或多者的核酸的过表达来实现。一种或多种6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径酶的过表达可以例如通过一种或多种内源性基因的外源性表达，或通过一种或多种异源基因的外源性表达发生。因此，天然存在的有机体可以容易地生成为非天然存在的微生物，非天然存在的微生物例如，通过过表达至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种，即至多所有编码6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径酶的核酸，产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇。此外，非天然存在的有机体可通过诱发内源基因的突变，从而导致6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径中的酶活性增加来生成。

在尤其有用的实施方案中，利用编码核酸的外源性表达。外源性表达赋予了宿主定制表达和/或调控元件的能力，以及实现由使用者控制的期望表达水平的应用。然而，其它实施方案中也可利用内源性表达，例如通过移除负调控效应分子或当连接于诱导型启动子或其它调控元件时诱导基因的启动子。因此，具有天然存在的诱导型启动子的内源基因可通过提供适当的诱导剂而得到上调，或者内源基因的调控区可经过改造以掺入诱导型调控元件，从而允许在期望时间对内源基因增加的表达进行调控。类似地，可以包括诱导型启动子作为引入非天然存在的微生物中的外源基因的调控元件。

在一些实施方案中，非天然存在的微生物包括一个或多个基因破坏，其中有机体产生6-ACA、己二酸盐和/或HMD。当基因破坏降低将己二酸盐、6-ACA和/或HMD的产生与有机体的生长结合的酶的活性时，破坏发生在编码所述酶的基因中，使得基因破坏对非天然存在的有机体赋予己二酸盐、6-ACA和/或HMD的增加的生产。因此，在一些实施方案中，提供了一种包含一个或多个基因破坏的非天然存在的微生物，所述一个或多个基因破坏发生在编码蛋白质或酶的基因中，其中所述一个或多个基因破坏在微生物中赋予己二酸盐、6-ACA和/或HMD的增加的生产。如本文所公开的，这种有机体包含产生己二酸盐、6-ACA和/或HMD的途径。

应了解，在方法中，所述一种或多种外源核酸中的任一种皆可引入到微生物中以产生非天然存在的微生物。核酸可被引入以便例如对微生物赋予6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径。或者，可引入编码核酸以产生中间微生物，其具有催化一些赋予6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成能力的必需反应的生物合成能力。例如，具有6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径的非天然存在的微生物可以包含至少两种编码期望酶的外源核酸。在己二酸盐生产的情况下，至少两种外源核酸可以编码酶，例如以下酶的组合：琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶和3-羟基酰-CoA脱氢酶、或琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶和3-羟基己二酰-CoA脱水酶、或3-羟基己二酰-CoA和己二酸半醛转氨酶、或3-羟基酰-CoA和己二酰-CoA合成酶等。在己内酰胺生产的情况下，至少两种外源核酸可以编码酶，例如以下酶的组合：CoA依赖性反式烯酰-CoA还原酶和转氨酶、或CoA依赖性反式烯酰-CoA还原酶和酰胺水解酶、或转氨酶和酰胺水解酶。在6-氨基己酸生产的情况下，至少两种外源核酸可以编码酶，例如以下酶的组合：4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸盐(HODH)醛缩酶和2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸盐(OHED)水合酶、或2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸盐(OHED)水合酶和2-氨基庚烷-1,7-二酸盐(2-AHD)脱羧酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶和己二酰-CoA脱氢酶、谷氨酰-CoA转移酶和6-氨基庚二酰-CoA水解酶、或戊二酰-CoAβ-酮硫解酶和3-氨基庚二酸2,3-氨基变位酶。在六亚甲基二胺生产的情况下，至少两种外源核酸可以编码酶，例如以下酶的组合：6-氨基己酸盐激酶和[(6-氨基己酰)氧基]膦酸盐(6-AHOP)氧化还原酶、或6-乙酰氨基己酸盐激酶和[(6-乙酰氨基己酰)氧基]膦酸盐(6-AAHOP)氧化还原酶、6-氨基己酸盐N-乙酰转移酶和6-乙酰氨基己酰-CoA氧化还原酶、3-羟基-6-氨基庚二酰-CoA脱水酶和2-氨基-7-氧代庚酸盐氨基转移酶、或3-氧代庚二酰-CoA连接酶和高赖氨酸脱羧酶。因此，应了解非天然存在的微生物可包括生物合成途径的两种或更多种酶的任何组合。在6ACA、6-氨基己酸半醛或HMD的情况下，参考图10，至少两种外源核酸可以编码酶，例如由步骤10A和10B、10B和10C、10C和10D、10D和10E、10E和10F、10F和10I和/或10I和10J表示的酶的组合，或由步骤10A、10B、10C、10D、10E、10F、10I和/或10J表示的酶中的两者、三者、四者、五者、六者、七者和/或八者的任何组合。

类似地，应当理解，非天然存在的微生物可以视需要包括生物合成途径的三种或更多种酶的任何组合，例如，在己二酸盐生产的情况下，以下酶的组合：琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟基酰基-CoA脱氢酶和3-羟基己二酰-CoA脱水酶；或琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟基酰基-CoA脱氢酶和己二酸半醛还原酶；或琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟基酰基-CoA脱氢酶和己二酰-CoA合成酶；或3-羟基酰基-CoA脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶和己二酰-CoA:乙酰-CoA转移酶等，只要期望生物合成途径的酶的组合导致产生对应的期望产物即可。在6-氨基己酸生产的情况下，至少三种外源核酸可以编码酶，例如以下酶的组合：4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸盐(HODH)醛缩酶、2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸盐(OHED)水合酶和2-氧代庚烷-1,7-二酸盐(2-OHD)脱羧酶，或2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸盐(OHED)水合酶、2-氨基庚-4-烯-1,7-二酸盐(2-AHE)还原酶和2-氨基庚烷-1,7-二酸盐(2-AHD)脱羧酶，或3-羟基己二酰-CoA脱水酶、2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶和己二酰-CoA脱氢酶，或6-氨基-7-羧基庚-2-烯酰-CoA还原酶、6-氨基庚二酰-CoA水解酶和2-氨基庚二酸盐脱羧酶，或戊二酰-CoA β-酮硫解酶、3-胺化氧化还原酶和2-氨基庚二酸盐脱羧酶，或3-氧代己二酰-CoA硫解酶、5-羧基-2-戊烯酸盐还原酶和己二酸盐还原酶。在六亚甲基二胺生产的情况下，至少三种外源核酸可以编码酶，例如以下酶的组合：6-氨基己酸盐激酶、[(6-氨基己酰)氧基]膦酸盐(6-AHOP)氧化还原酶和6-氨基己酸半醛氨基转移酶，或6-氨基己酸盐N-乙酰转移酶、6-乙酰氨基己酸盐激酶和[(6-乙酰氨基己酰)氧基]膦酸盐(6-AAHOP)氧化还原酶，或6-氨基己酸盐N-乙酰转移酶、[(6-乙酰氨基己酰)氧基]膦酸盐(6-AAHOP)酰基转移酶和6-乙酰氨基己酰-CoA氧化还原酶，或3-氧代-6-氨基庚二酰-CoA氧化还原酶、3-羟基-6-氨基庚二酰-CoA脱水酶和高赖氨酸脱羧酶，或2-氧代-4-羟基-7-氨基庚酸盐醛缩酶、2-氧代-7-氨基庚-3-烯酸盐还原酶和高赖氨酸脱羧酶，或6-乙酰氨基己酸还原酶、6-乙酰氨基己醛氨基转移酶和6-乙酰氨基己胺N-乙酰转移酶。在6ACA、6-氨基己酸半醛或HMD的情况下，参考图10，至少三种外源核酸可以编码酶，例如由步骤10A、10B和10C；10B、10C和10D；10C、10D和10E；10D、10E和10F；10E、10F和/或10I；10F、10I和10J表示的酶的组合，或由步骤10A、10B、10C、10D、10E、10F、10I和/或10J表示的酶中的两者、三者、四者、五者、六者、七者和/或八者的任何组合。类似地，非天然存在的微生物可视需要包括如本文所公开的生物合成途径的四种或更多种酶的任何组合，只要期望生物合成途径的酶的组合导致产生对应的期望产物即可。

除了本文所述的6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成外，非天然存在的微生物和方法也可以彼此的各种组合以及与本领域中熟知的其它微生物和方法的各种组合来利用，以便通过其它途径实现产物的生物合成。例如，除了使用6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生产者之外，生产6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的一种替代方法是通过添加另一种能够将己二酸盐、6-氨基己酸或己内酰胺途径中间体转化为6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的微生物。一种此类程序包括例如发酵可产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径中间体的微生物。然后，6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径中间体可用作将6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径中间体转化为6-氨基己酸、己内酰胺或六亚甲基二胺的第二微生物的底物。6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径中间体可直接添加到第二有机体的另一培养物中，或者可例如通过细胞分离从6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径中间体生产者的原始培养物中移除这些微生物，随后可向发酵液中添加第二有机体以便无需中间纯化步骤即可产生最终产物。

在其它实施方案中，非天然存在的微生物和方法可以组装在各种子途径中以便实现例如6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成。在这些实施方案中，期望产物的生物合成途径可分离到不同的微生物中，且不同的微生物可以被共培养以产生最终产物。在这样的生物合成方案中，一种微生物的产物是第二微生物的底物，直到合成最终产物为止。举例来说，6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成可通过构建含有用于将一种途径中间体转化为另一种途径中间体或产物的生物合成途径的微生物来实现。或者，6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇也可通过使用两种有机体在同一容器中共培养或共发酵而以生物合成方法从微生物产生，其中第一微生物产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇中间体，而第二微生物将所述中间体转化为6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇。

鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，对于非天然存在的微生物和方法以及其它微生物、具有子途径的其它非天然存在的微生物的共培养以及本领域公知的用于生产6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的其它化学和/或生物化学程序的组合，存在多种组合和排列。

类似地，本领域技术人员应理解，可以基于用于引入一种或多种基因破坏以增加6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生产的期望特征来选择宿主有机体。因此，应当理解，如果要将遗传修饰引入宿主有机体以破坏基因，可以类似地破坏催化相似但不相同的代谢反应的任何同源物、直向同源物或旁系同源物，以确保期望的代谢反应被充分破坏。因为不同有机体之间的代谢网络存在某些差别，所以本领域技术人员将了解给定有机体中被破坏的实际基因在有机体之间可能有所不同。然而，鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员还将理解，这些方法可应用于任何合适的宿主微生物，以鉴定构建目的物种中的有机体所需的同源代谢改变，所述同源代谢改变将增加6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成。在一个特定的实施方案中，增加的生产将6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成与有机体的生长偶联，并且如果需要并且如本文所公开的，可以将6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生产强制性地与有机体的生长偶联。

6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径酶的编码核酸的来源可包括例如其中经编码的基因产物能催化所提及的反应的任何物种。所述物种包括原核和真核有机体，其包括(但不限于)细菌(包括古细菌和真细菌)和真核生物(包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括人类)。在一些实施方案中，6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径酶的编码核酸的来源如表6、8和11所示。在一些实施方案中，转氨酶的编码核酸的来源如表6所示。在一些实施方案中，转氨酶的编码核酸的来源来自无色杆菌属(Achromobacter)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、柯林斯菌属(Collinsella)、消化链球菌属(Peptostreptococcaceae)、类节杆菌属(Paenarthrobacter)或罗姆布西亚菌属(Romboustsia)。在一些实施方案中，6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径酶的编码核酸的来源是诸如以下的物种：大肠杆菌、大肠杆菌K12株、大肠杆菌C、大肠杆菌W、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、克氏假单胞菌(Pseudomonas knackmussii)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)B13株、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、变形沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)、链霉菌属物种2065、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、铜绿假单胞菌PAO1、富营养化罗尔斯顿菌(Ralstonia eutropha)、富营养化罗尔斯顿菌H16、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、纤细眼虫(Euglenagracilis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、克鲁维梭菌(Clostridium kluyveri)、智人(Homo sapiens)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、不动杆菌属物种ADP1、不动杆菌属物种M-1株、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、巴氏真杆菌(Eubacteriumbarkeri)、不解糖消化链球菌(Peptostreptococcus asaccharolyticus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、肉毒梭菌A3株、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、热醋酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)(热醋酸穆尔氏菌(Moorella thermoaceticum))、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、小家鼠(Mus musculus)、野猪(Susscrofa)、黄杆菌属、金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、永达梭菌(Clostridium ljungdahlii)、一氧化碳消化梭菌(Clostridium carboxydivorans)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、梭菌属物种M62/1、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、家牛(Bos taurus)、带枝动胶菌(Zoogloea ramigera)、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)、嗜热厌氧杆菌属、布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、头寇岱硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)、头寇岱硫化叶菌7、硫矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)、硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、嗜酸嗜热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、海洋热袍菌(Thermotoga maritima)、盐场盐杆菌(Halobacterium salinarum)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、嗜金属嗜碱菌(Alkaliphilus metalliredigenes)、滕冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、克鲁维酵母菌(Saccharomyces kluyveri)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、糖产丁醇丙酮梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)、带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热丙酸厌氧肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、人肠厌气杆菌(Anaerotruncus colihominis)、嗜热需苏打厌氧菌(Natranaerobiusthermophilius)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、闪烁古生球菌DSM4304、死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)、嗜气火棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、嗜气火棒菌IM2株、烟草(Nicotiana tabacum)、胡椒薄荷(Menthe piperita)、火炬松(Pinus taeda)、大麦(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)、浑浊红球菌(Rhodococcus opacus)、杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、日本缓生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、日本缓生根瘤菌USDA110、猪蛔虫(Ascarius suum)、产丁酸细菌L2-50、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、马氏甲烷球菌(Methanosarcina mazei)、马氏甲烷球菌(Methanosarcina mazei)、巴氏甲烷球菌(Methanocarcina barkeri)、詹氏极度嗜热甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、硕大利什曼原虫(Leishmania major)、嗜碱性甲基微生物(Methylomicrobium alcaliphilum)20Z、需盐色盐杆菌(Chromohalobactersalexigens)、闪烁古生球菌(Archaeglubus fulgidus)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、阴道毛滴虫(trichomonas vaginalis)G3、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、拉氏枝动菌(Mycoplana ramose)、藤黄微球菌(Micrococcus luteas)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurians)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、白色念珠菌(Candida albicans)SC5314、双向伯克霍尔德菌(Burkholderia ambifaria)AMMD、猪蛔虫(Ascaris suun)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、瘤状伯克霍尔德菌(Burkholderia phymatum)、白色念珠菌、近端梭菌(Clostridium subterminale)、台湾贪铜菌(Cupriavidus taiwanensis)、泥色黄杆菌(Flavobacterium lutescens)、克鲁维拉钱斯氏酵母(Lachancea kluyveri)、乳杆菌属物种30a、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)、黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、粘毛烟草(Nicotiana glutinosa)、爱荷华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)(物种NRRL 5646)、赖氏假单胞菌(Pseudomonasreinekei)MT1、富营养化罗尔斯顿菌JMP134、耐金属罗尔斯顿菌(Ralstoniametallidurans)、乔氏红球菌(Rhodococcus jostii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、棒状链霉菌(Streptomyces clavuligenus)、嗜酸互养菌(Syntrophus aciditrophicus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)，以及本文公开的或可作为相应基因的来源生物获得的其它示例性物种(见实施例)。然而，因为现在可从超过550种物种获得完整基因组序列(其中超过一半可从例如NCBI的公开数据库获得)，包括395种微生物基因组和多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组，所以对于相关或远亲物种中的一种或多种基因鉴别编码必需的6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成活性的基因是常规工作且在本领域中为人所熟知，包括例如已知基因的同源物、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换，和有机体之间遗传改变的互换。因此，本文参考特定有机体如大肠杆菌描述的能实现6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成的代谢改变可容易地应用于其它微生物，同样包括原核和真核有机体。鉴于本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将知悉在一种有机体中举例说明的代谢改变可同样地应用于其它有机体。

在一些情况下，例如当无关物种中存在6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径时，宿主物种可被赋予6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成，例如通过从无关物种外源表达一种或多种旁系同源物，这会催化类似但不相同的代谢反应替换所提及的反应。因为不同有机体的代谢网络之间存在某些差别，所以本领域技术人员将了解不同有机体之间的实际基因使用可有所不同。然而，鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员还将理解，这些教导和方法可应用于所有的微生物，其中使用对本文举例说明的那些微生物的同源代谢改变，以构建目的物种内的将合成6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的微生物。

宿主微生物可选自以下物种且非天然存在的微生物可在例如细菌、酵母、真菌或各种适用于发酵过程的其它微生物中的任一者中产生。示例性细菌包括选自以下的物种：大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。示例性酵母或真菌包括选自以下的物种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)等。例如，大肠杆菌是尤其有用的宿主有机体，因为其是得到充分表征的适用于遗传工程的微生物。其它尤其有用的宿主有机体包括酵母，例如酿酒酵母。应当理解，任何合适的微生物宿主有机体都可以用于引入代谢和/或遗传修饰以生产期望产物。

用于构建非天然存在的6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生产宿主和测试其表达水平的方法可例如通过本领域中熟知的重组和检测方法来执行。例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory,New York(2001)；和Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)描述了此类方法。

用于产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的途径中所涉及的外源核酸序列可使用本领域中熟知的技术稳定地或暂时地引入宿主细胞中，所述技术包括但不限于缀合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声波转化。对于在大肠杆菌或其它原核细胞中的外源表达，真核核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可编码靶向信号，例如N端线粒体靶向信号或其它靶向信号，必要时所述靶向信号可在转化到原核宿主细胞中之前被移除。举例来说，移除线粒体前导序列会导致在大肠杆菌中的表达有所增加(Hoffmeister等人,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。对于在酵母或其它真核细胞中的外源表达，基因可在细胞溶质中表达而无需添加前导序列，或可通过添加合适的靶向序列(例如适用于宿主细胞的线粒体靶向或分泌信号)而靶向到线粒体或其它细胞器或经靶向用于分泌。因此，应了解为了移除或包括靶向序列而对核酸序列所作的适当修饰可被掺入外源核酸序列中以便赋予期望性质。此外，可使用本领域中熟知的技术对基因进行密码子优化以获得蛋白质的优化表达。

可构建一种或多种表达载体以包括如本文举例说明的一种或多种6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径编码核酸，所述编码核酸可操作地连接到宿主有机体中起作用的表达控制序列。适用于微生物宿主有机体的表达载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体(episome)和人工染色体，包括可用于稳定整合到宿主染色体中的载体和选择序列或标志物。另外，表达载体可包括一种或多种可选择标志基因和适当的表达控制序列。也可包括可选择标志基因，其例如提供抗生素或毒素抗性、补充营养缺陷或供应培养基中没有的关键营养物。表达控制序列可包括本领域中熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当打算共表达两种或更多种外源编码核酸时，这两种核酸皆可插入例如单个表达载体中或单独的表达载体中。对于单个载体表达，编码核酸可操作地连接到一种常用表达控制序列或连接到不同的表达控制序列，例如一种诱导型启动子和一种组成型启动子。代谢或合成途径中所涉及的外源核酸序列的转化可使用本领域中熟知的方法证实。此类方法包括例如核酸分析(例如mRNA的Northern印迹技术或聚合酶链反应(PCR)扩增)，或基因产物表达的免疫印迹技术，或其它用于测试所引入核酸序列或其对应基因产物的表达的合适分析方法。本领域技术人员应了解外源核酸以足以产生期望产物的量表达，且应进一步了解可使用本领域中熟知且如本文所公开的方法优化表达水平以获得充分表达。

一些实施方案是用于生产期望中间体或产物例如己二酸盐、6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的方法。例如，生产己二酸盐的方法可包括培养具有己二酸盐途径的非天然存在的微生物，所述途径包括至少一种编码己二酸盐途径酶的外源核酸，所述外源核酸在足以产生己二酸盐的条件和时段下以足以产生己二酸盐的量表达，所述己二酸盐途径包括琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟基酰基-CoA脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、己二酸半醛还原酶和己二酰-CoA合成酶或磷酸己二酰转移酶/己二酸盐激酶或己二酰-CoA:乙酰-CoA转移酶或己二酰-CoA水解酶。此外，生产己二酸盐的方法可包括培养具有己二酸盐途径的非天然存在的微生物，所述途径包括至少一种编码己二酸盐途径酶的外源核酸，所述外源核酸在足以产生己二酸盐的条件和时段下以足以产生己二酸盐的量表达，所述己二酸盐途径包括琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶、3-氧代己二酰-CoA转移酶、3-氧代己二酸盐还原酶、3-羟基己二酸盐脱水酶和2-烯酸盐还原酶。

此外，生产6-氨基己酸的方法可包括培养具有6-氨基己酸途径的非天然存在的微生物，所述途径包括至少一种编码6-氨基己酸途径酶的外源核酸，所述外源核酸在足以产生6-氨基己酸的条件和时段下以足以产生6-氨基己酸的量表达，所述6-氨基己酸途径包括CoA依赖性反式烯酰-CoA还原酶和转氨酶或6-氨基己酸盐脱氢酶。此外，生产己内酰胺的方法可包括培养具有己内酰胺途径的非天然存在的微生物，所述途径包括至少一种编码己内酰胺途径酶的外源核酸，所述外源核酸在足以产生己内酰胺的条件和时段下以足以产生己内酰胺的量表达，所述己内酰胺途径包括CoA依赖性醛脱氢酶、转氨酶或6-氨基己酸盐脱氢酶和酰胺水解酶。

可使用熟知方法执行用于测试6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生产的合适纯化和/或测定。对于打算测试的每种经工程改造的菌株，可培养合适的复制品，例如一式三份培养物。例如，可监测经工程改造的生产宿主中的产物和副产物形成。可通过例如HPLC(高效液相色谱)、GC-MS(气相色谱-质谱法)和LC-MS(液相色谱-质谱法)或其它合适的分析方法的方法，使用本领域中熟知的常规程序来分析终产物和中间体及其它有机化合物。也可用培养物上清液来测试发酵液中的产物释放情况。副产物和残余葡萄糖可通过HPLC，使用例如针对葡萄糖和醇类的折射率检测器和针对有机酸的UV检测器(Lin等人,Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))，或其它在本领域中熟知的合适测定和检测方法来定量。来自外源DNA序列的单独酶活性也可使用本领域中熟知的方法来测定。

6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇可使用本领域中熟知的各种方法与培养物中的其它组分分离。所述分离方法包括例如萃取程序，以及包括连续液液萃取、渗透蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱和超滤的方法。所有上述方法皆为本领域中所熟知。

可培养本文所述的任何非天然存在的微生物以产生和/或分泌生物合成产物。例如，可以培养6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生产者，用于6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成生产。

为了生产6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇，重组菌株在具有碳源和其它必需营养物的培养基中培养。有时候需要并且可能非常需要在发酵罐中维持厌氧条件以降低全过程的成本。这些条件可例如通过首先用氮气喷射培养基，然后用隔膜和螺纹盖密封烧瓶来获得。对于在厌氧条件下未观察到生长的菌株，可通过在隔膜上打出用于有限通气的小孔来应用微氧或基本上厌氧条件。示例性厌氧条件先前已有描述且为本领域中所熟知。例如，在2011年5月24日发布的美国专利第7,947,483号中描述了示例性的需氧和厌氧条件。发酵可如本文所公开以分批、补料分批或连续方式进行。

必要时，可通过根据需要添加碱(例如NaOH或其它碱)或酸使培养基维持在期望pH下而使培养基的pH维持在期望pH，尤其中性pH，例如约7的pH。生长速率可通过使用分光光度计(600nm)测量光学密度来确定，且葡萄糖摄取速率可通过监测碳源随时间的消耗来确定。

生长培养基可包括例如任何可向非天然存在的微生物供应碳源的碳水化合物源。所述来源包括例如糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉。其它碳水化合物源包括例如再生原料和生物质。可在这些方法中用作原料的生物质的示例性类型包括纤维素类生物质、半纤维素类生物质和木质素原料或所述原料的部分。所述生物质原料含有例如可用作碳源的碳水化合物基质，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将了解除了上文举例说明的那些之外的可再生原料和生物质也可用于培养微生物以生产6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇。

除了可再生原料，例如上文举例说明的那些，6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或乙酰丙酸微生物也可以被修饰以利用作为其碳源的合成气生长。在该特定实施方案中，一种或多种蛋白质或酶在产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的有机体中表达，以提供利用合成气或其它气态碳源的代谢途径。

合成气也称为发生炉煤气，是煤和碳质材料(例如生物质材料，包括农作物和残余物)的主要气化产物。合成气是主要由H2和CO组成的混合物，其可通过气化任何有机原料，包括但不限于煤、煤油、天然气、生物质和有机废物来获得。气化通常在高燃料/氧气比下进行。虽然合成气主要是H2和CO，但合成气也可包括少量的CO2及其它气体。因此合成气提供一种节省成本的气态碳源，例如CO和CO2。

Wood-Ljungdahl途径催化CO和H2转化为乙酰-CoA及其它产物，例如乙酸盐。能利用CO和合成气的有机体一般也具有通过Wood-Ljungdahl途径所包括的酶和转化作用的同一个基础集利用CO2和CO2/H2混合物的能力。微生物依赖于H2将CO2转化为乙酸盐早已被公认，在其之前揭露了CO也可被相同的微生物利用且涉及相同的途径。已显示了许多产乙酸菌在CO2的存在下生长且产生例如乙酸盐的化合物，只要存在氢以便供应必需的还原等价物即可(参见例如Drake,Acetogenesis,第3-60页Chapman and Hall,New York,(1994))。这可由以下等式概括：

2CO2+4H2+n ADP+n Pi→CH3COOH+2H2O+n ATP

因此，具有Wood-Ljungdahl途径的非天然存在的微生物也可以利用CO2和H2混合物来产生乙酰-CoA及其它期望的产物。

Wood-Ljungdahl途径在本领域中是熟知的，由可分成两个分支的12个反应组成：(1)甲基分支和(2)羰基分支。甲基分支将合成气转化为甲基四氢叶酸(甲基-THF)，而羰基分支将甲基-THF转化为乙酰-CoA。甲基分支中的反应依次由以下酶催化：铁氧还蛋白氧化还原酶、甲酸盐脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、亚甲基四氢叶酸环化脱水酶、亚甲基四氢叶酸盐脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。羰基分支中的反应依次由以下酶或蛋白质催化：钴胺素类咕啉/铁硫蛋白、甲基转移酶、一氧化碳脱氢酶、乙酰-CoA合酶、乙酰-CoA合酶二硫化物还原酶和氢化酶，并且这些酶也可称为甲基四氢叶酸:类咕啉蛋白甲基转移酶(例如AcsE)、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白组装蛋白(例如AcsF)、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合酶、一氧化碳脱氢酶和镍蛋白组装蛋白(例如CooC)。遵循本文提供的引入足够数量的编码核酸以产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径的教导和指导，本领域技术人员将理解，同样的工程设计也可以在至少引入编码宿主有机体中不存在的Wood-Ljungdahl酶或蛋白质的核酸方面进行。因此，将一种或多种编码核酸引入微生物，使得修饰的有机体包含完整的Wood-Ljungdahl途径，这将赋予合成气利用能力。

此外，与一氧化碳脱氢酶和/或氢化酶活性偶联的还原(反向)三羧酸循环也可用于将CO、CO2和/或H2转化为乙酰-CoA及其它产物如乙酸盐。能够通过还原性TCA途径固定碳的有机体可以利用以下一种或多种酶：ATP柠檬酸盐裂解酶、柠檬酸盐裂解酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸盐脱氢酶、α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原转氨酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA转移酶、富马酸还原酶、富马酸酶、苹果酸盐脱氢酶、NAD(P)铁氧还蛋白氧化还原酶、一氧化碳脱氢酶和氢化酶。具体而言，通过一氧化碳脱氢酶和氢化酶从CO和/或H2提取的还原等价物被用于通过还原性TCA循环将CO2固定为乙酰-CoA或乙酸盐。乙酸盐可以通过例如乙酰-CoA转移酶、乙酸盐激酶/磷酸转乙酰酶和乙酰-CoA合成酶的酶转化为乙酰-CoA。乙酰-CoA可以通过丙酮酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶和糖异生酶转化为对甲苯甲酸盐、对苯二甲酸盐或(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸盐前体、甘油醛-3-磷酸盐、磷酸烯醇丙酮酸盐和丙酮酸盐。遵循本文提供的引入足够数量的编码核酸以产生对甲苯甲酸盐、对苯二甲酸盐或(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸盐途径的教导和指导，本领域技术人员将理解，同样的工程设计也可以在至少引入编码宿主有机体中不存在的还原性TCA途径酶或蛋白质的核酸方面进行。因此，将一种或多种编码核酸引入微生物，使得修饰的有机体包含完整的还原性TCA途径，这将赋予合成气利用能力。

鉴于本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将了解可产生非天然存在的微生物，其在利用例如碳水化合物的碳源生长时分泌生物合成的化合物。这些化合物包括例如6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇以及6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径中的任何中间代谢物。为了实现期望化合物或中间体的生物合成，需要对期望酶活性中的一者或多者进行工程改造，包括例如包含6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生物合成途径的部分或全部。因此，一些实施方案提供了一种非天然存在的微生物，其在利用碳水化合物生长时生产和/或分泌6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇，并且在利用碳水化合物生长时生产和/或分泌6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径中显示的任何中间代谢物。例如，生产己二酸盐的微生物可以根据需要从例如3-氧代己二酰-CoA、3-羟基己二酰-CoA、5-羧基-2-戊烯酰-CoA或己二酰-CoA的中间体开始合成(见图1)。此外，生产己二酸盐的微生物可以从例如3-氧代己二酰-CoA、3-氧代己二酸盐、3-羟基己二酸盐或己-2-烯二酸盐的中间体开始合成。生产6-氨基己酸的微生物可以从例如己二酸半醛的中间体开始合成。生产己内酰胺的微生物可以根据需要从例如己二酸半醛或6-氨基己酸的中间体开始合成(见图1)。

表4.醛脱氢酶对己二酰-CoA的活性

表5. 5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶

使用如本文举例说明的本领域公知的方法构建非天然存在的微生物，以足够量外源性表达至少一种核酸，所述核酸编码6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇途径酶，以产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇。应当理解，微生物在足以产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的条件下培养。遵循本文提供的教导和指导，非天然存在的微生物可实现6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成，从而产生约0.1-200mM或更高的细胞内浓度。6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的细胞内浓度一般介于约3-150mM之间，尤其介于约5-125mM之间，且更尤其介于约8-100mM之间，包括约10mM、20mM、50mM、80mM或更高。还可以从非天然存在的微生物获得介于这些示例性范围的每一个之间和在其以上的细胞内浓度。

在一些实施方案中，培养条件包括厌氧或基本上厌氧的生长或维持条件。示例性厌氧条件先前已有描述且为本领域中所熟知。本文描述了用于发酵过程的示例性厌氧条件，且其也例如描述于2011年5月24日发布的美国专利第7,947,483号。这些条件中的任一种以及本领域中熟知的其它厌氧条件皆可用于非天然存在的微生物。在这些厌氧条件下，6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生产者可以5-10mM或更高的细胞内浓度以及本文举例说明的所有其它浓度合成6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇。应当理解，尽管上述描述指的是细胞内浓度，但产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的微生物可以在细胞内产生6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇和/或将产物分泌到培养基中。

培养条件可包括例如液体培养程序以及发酵及其它大规模培养程序。如本文所述，生物合成产物的尤其有用的产量可在厌氧或基本上厌氧的培养条件下获得。

如本文所述，一种用于实现6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成的示例性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方案中，非天然存在的微生物可在厌氧或基本上厌氧条件下维持、培养或发酵。简言之，厌氧条件是指没有氧的环境。基本上厌氧条件包括例如培养、分批发酵或连续发酵，使得培养基中的溶解氧浓度保持在饱和的0与10％之间。基本上厌氧条件还包括在维持于小于1％氧的气氛下的密封室内，在液体培养基中或固体琼脂上生长或停止细胞。氧的百分比可通过例如用N2/CO2混合物或其它合适的一种或多种非氧气体喷射培养物来维持。

本文所述的培养条件可以按比例放大并连续增长以用于制造6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇。示例性生长程序包括例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或连续发酵和连续分离。所有这些过程皆为本领域中所熟知。发酵程序尤其适用于商业数量的6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成生产。通常情况下且与不连续培养程序一样，6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的连续和/或接近连续生产将包括在足以保持和/或接近保持指数生长期的生长的营养物和培养基中培养非天然存在的生产6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的有机体。在这些条件下的连续培养可包括例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或以上。此外，连续培养可包括1周、2周、3周、4周或5周或以上且至多几个月。或者，如果适合特定应用，有机体可以培养数小时。应了解连续和/或接近连续培养条件还可包括这些示例性时段之间的所有时间间隔。应进一步了解，微生物的培养时间是足以产生用于期望目的的足量产物的时段。

发酵程序为本领域中所熟知。简言之，用于6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成生产的发酵可例如以下列方式利用：补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或连续发酵和连续分离。分批和连续发酵程序的实例为本领域中所熟知。

除了使用6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生产者连续生产大量6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的上述发酵程序之外，6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇生产者也可例如根据需要同时经历将产物转化为其它化合物的化学合成程序，或者产物可自发酵培养物分离并依次经历化学转化以将产物转化为其它化合物。如本文所述，利用3-氧代己二酸盐的己二酸盐途径中的中间体己-2-烯二酸盐可以例如通过在铂催化剂上的化学氢化转化为己二酸盐。

如本文所述，用于实现6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物合成的示例性生长条件包括将渗透保护剂添加到培养条件中。在某些实施方案中，非天然存在的微生物可如上所述在渗透保护剂的存在下维持、培养或发酵。简而言之，渗透保护剂是指充当渗透剂并帮助本文所述的微生物在渗透胁迫下存活的化合物。渗透保护剂包括但不限于甜菜碱、氨基酸和糖海藻糖。它们的非限制性实例是甘氨酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基巯基丙酸盐、3-二甲基巯基-2-甲基丙酸盐、哌可酸(pipecolic acid)、二甲基巯基乙酸盐、胆碱、L-肉碱和四氢嘧啶(ectoine)。一方面，渗透保护剂是甘氨酸甜菜碱。本领域普通技术人员应理解，适用于保护本文所述的微生物免受渗透胁迫的渗透保护剂的量和类型将取决于所用的微生物。例如，在不同量的6-氨基己酸存在下的大肠杆菌适宜在2mM甘氨酸甜菜碱存在下生长。培养条件中渗透保护剂的量可以例如不超过约0.1mM、不超过约0.5mM、不超过约1.0mM、不超过约1.5mM、不超过约2.0mM、不超过约2.5mM、不超过约3.0mM、不超过约5.0mM、不超过约7.0mM、不超过约10mM、不超过约50mM、不超过约100mM或不超过约500mM。

成功地改造一种途径包括鉴定一组具有足够活性和特异性的合适酶。这需要鉴定一组合适的酶，将它们相应的基因克隆到生产宿主中，优化发酵条件，并分析发酵后的产物形成。为了改造生产宿主以生产6-氨基己酸或己内酰胺，可以在宿主微生物中表达一种或多种外源DNA序列。此外，微生物可以具有功能缺失的内源基因。这些修饰将允许使用可再生原料生产6-氨基己酸盐或己内酰胺。

在一些实施方案中，最小化或甚至消除6-氨基己酸转化为HMD期间环状亚胺或己内酰胺的形成需要在6-氨基己酸的胺基上添加官能团(例如乙酰基、琥珀酰基)以保护其不被环化。这类似于大肠杆菌中L-谷氨酸盐形成鸟氨酸。具体来说，谷氨酸盐首先通过N-乙酰谷氨酸盐合酶转化为N-乙酰-L-谷氨酸盐。然后N-乙酰-L-谷氨酸盐被活化成N-乙酰谷氨酰磷酸盐，其被还原和转氨化形成N-乙酰-L-鸟氨酸。然后通过N-乙酰-L-鸟氨酸脱乙酰化酶从N-乙酰-L-鸟氨酸中除去乙酰基，形成L-鸟氨酸。这样的路线是必要的，因为从谷氨酸盐形成谷氨酸-5-磷酸盐，然后还原成谷氨酸-5-半醛，导致(S)-1-吡咯啉-5-羧酸盐的形成，这是一种由谷氨酸-5-半醛自发形成的环状亚胺。在由6-氨基己酸形成HMD的情况下，步骤可以包括将6-氨基己酸乙酰化成乙酰基-6-氨基己酸，用CoA或磷酸基团活化羧酸基团，还原，胺化和脱乙酰化。

本发明另外提供了包括生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO或本文公开的其它产物的培养基，其中生物衍生产物具有反映大气二氧化碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一个特定实施方案中，培养基可以与具有HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO途径的非天然存在的微生物分离。在另一实施方案中，本发明提供了生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO，其具有反映大气二氧化碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一个特定实施方案中，权利要求61-62的生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO可以具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的Fm值。如本文所公开的，本发明的这些生物衍生产物可以通过本发明的方法生产。

本发明还提供了一种组合物，所述组合物包括生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO以及除生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO之外的化合物。除了生物衍生产物之外的化合物可以是痕量的具有HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO的本发明的非天然存在的微生物的细胞部分。所述组合物可包括例如生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO，或本发明的微生物的细胞裂解物或培养上清液。在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO，其具有反映大气二氧化碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一个特定实施方案中，权利要求61-62的生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO可以具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的Fm值。如本文所公开的，包括本发明的这些生物衍生产物的组合物可以通过本发明的方法生产。

实施例

实施例1.对6-氨基己酸(6ACA)有活性的转氨酶的鉴定

使用基本局部比对搜索工具(BLAST)从宏基因组文库和公共数据库中以生物信息学方式鉴定编码转氨酶的基因(表6)。合成、表达编码每种转氨酶的基因，并使用酶偶联测定评估其对6-氨基己酸(6ACA)和γ-氨基丁酸(GABA)的催化活性。

将编码表6的TA酶候选物的基因克隆到组成型启动子下的低拷贝数载体中，并使用标准技术将构建体转化到大肠杆菌中。转化体在抗生素存在下在LB培养基中于35℃培养过夜，然后在室温下以15,000x g离心细胞。为了制备裂解物，移除上清液，并将表达TA基因的大肠杆菌细胞重悬于含有溶菌酶、核酸酶和10mM DTT的化学裂解溶液中。立即使用裂解物。

转氨酶测定溶液含有0.1M Tris-HCl，pH 8.0；0.3mM 6ACA、0.3mM GABA、0.3mMHMD或20mM Ala；0.1mMγ-酮戊二酸盐；1mM NAD；和50U/mL谷氨酸盐脱氢酶。所述测定通过添加TA裂解物开始，并在室温下进行。相对于不含TA的裂解物，通过在340nm处NADH吸光度的增加来监测活性。线性速率计算为Δabs/min。>100的速率被指定为(++)，1-100之间的速率被指定为(+)，几乎没有活性的速率被指定为(-)。ND＝未确定。

表6显示TA同源物1、3、4、5、9、12、26、27、30、31、38、50、64、74、78、79、81、91、106、108和116对6ACA具有最高的活性水平。

表6.转氨酶候选基因

实施例2.转氨酶同源物的体内测定。

为了在体内测试转氨酶同源物的活性，将编码选定转氨酶的基因转化到大肠杆菌菌株中，所述菌株还包括引入的编码1)3-氧代己二酰-CoA硫解酶(Thl)、2)3-氧代己二酰-CoA脱氢酶(Hbd)、3)3-氧代己二酰-CoA脱水酶(“巴豆酸酶”或Crt)、4)5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶(Ter)和5)醛脱氢酶(Ald)的基因。Thl、Hbd、Crt、Ter、Ald基因在US 8,377,680中有报道(例如，实施例8，其以全文引用的方式并入)。这些基因被引入大肠杆菌菌株中，所述菌株包括产生6-氨基己酸盐(6ACA)所必需的所有途径酶，除了TA酶。

将用于表达TA基因的载体转化到Thl/Hbd/Crt/Ter/Ald大肠杆菌菌株中，并测试转化体的6ACA产生。在基本培养基中给工程化的大肠杆菌细胞喂食2％的葡萄糖，在35℃下孵育18小时后，收获细胞，并通过分析HPLC或标准LC/MS分析方法评估上清液的6ACA产生。如表6所示，编码TA酶的基因在包括Thl、Hbd、Crt、Ter和Ald基因的大肠杆菌中的表达导致这些菌株产生6ACA。

实施例3.转氨酶变体。

通过检查蛋白质的晶体结构来鉴定由SEQ ID NO:1编码的木糖氧化无色杆菌同源物1TA中的突变的氨基酸位置，并在选定的氨基酸位置对编码SEQ ID NO:1的基因进行饱和诱变。如实施例1所述，在裂解物分析中测试所得变体的活性。图2示出TA SEQ ID NO:1的结果。图2显示SEQ ID NO:1的哪些位置对于活性是重要的。

通过在V114、S136、T148、P153、I203、I204、P206、V207、V111、T216、A237、T264、M265和L386的氨基酸位置以及G19、C22、D70、R94、D99、T109、E112、A113、F137、G144、I149、K150、Y154、S178、L186、Q208、L234、T242、A315、K318、R338、G336、L386、V390、A406、S416和A421的密码子处突变编码TA酶(SEQ ID NO:1)的基因来产生变体。突变单独进行和与其它氨基酸位置的突变组合进行。使用简并引物序列和PCR进行氨基酸位置的突变，其中改变的基因序列混合物转化到大肠杆菌中。如实施例1所述，在裂解物分析中测试转化体。在一式三份的裂解物分析中重新测试提供在分析中显示出比野生型对照更高的活性的裂解物的克隆。继续表现出高于野生型活性的克隆然后准备用于它们包含的TA基因的序列分析。

表7和图3提供了在活性克隆的变体TA基因序列中发现的突变。表现出高于野生型活性的变体表示为“+”或“++”，包括TA基因中的单一突变和组合(多重)突变。表7显示多种变体表现出比野生型TA(SEQ ID NO:1)更大的活性，在氨基酸位置V114、S136、T148、P153、I203、I204、P206、V207、V111、T216、A237、T264、M265、L386、G19、C22、D70、R94、D99、T109、E112、A113、F137、G144、I149、K150、Y154、S178、L186、Q208、L234、T242、A315、K318、R338、G336、L386、V390、A406、S416、A421、G17、M21、A50、A76、Y77、Q78、I79、G84、F107、T108、K119、G139、M142、A152、P153、E205、G209、G211、D238、M285、A290、G291、G292、L293、Y297、M353、S387、S388或G392(相对于SEQ ID NO:1鉴定的位置)的突变生成具有比其来源的野生型TA更高的活性的多种变体。

此外，使用20mM丙氨酸代替6ACA或GABA作为底物来分析几种变体。

表7.转氨酶变体

实施例4.对6-氨基己酸(6ACA)有活性的CAR同源物的鉴定

使用基本局部比对搜索工具(BLAST)从宏基因组文库和公共数据库中以生物信息学方式鉴定编码CAR的基因(表8)。合成编码每种CAR的基因，表达，并使用酶偶联测定评估其对6-氨基己酸(6ACA)和己酸盐(GABA)的催化活性。

简而言之，为了评估羧酸还原酶(CAR)候选物和变体，产生了含有携带CAR质粒的整合磷酸泛酰巯基乙胺转移酶菌株的大肠杆菌菌株。将菌株接种到含有羧苄青霉素(100μg/mL)的LB中，并在摇动培养箱中于37℃生长过夜。将过夜培养物稀释到含有羧苄青霉素(100μg/mL)、IPTG(0.5mM)和cumate(0.2mM)的新鲜LB中，并在摇动培养箱中于27℃生长过夜。通过离心收集细胞，并在-20℃下冷冻至分析日。

对于体外裂解物分析，将细胞沉淀解冻并重悬在0.1M Tris-HCl，pH 7.0缓冲液中。测量细胞悬浮液的OD600，并将每个候选物标准化为OD 4。通过离心制备沉淀，然后用含有核酸酶和溶菌酶的化学裂解试剂在室温下裂解沉淀30分钟。该裂解物用于测量CAR活性，并按如下方式进行分析：将等分的粗CAR裂解物、期望的酸底物(己酸盐、6-氨基己酸、丁酸盐和4-氨基丁酸)、1mM ATP、0.3mM NADPH和10mM MgCl₂混合在0.04mL的0.1MTris-HCl，pH7.4缓冲液中。通过荧光或吸光度通过NADPH氧化来监测反应动力学。根据进度曲线确定CAR活动率。

表8显示对应于SEQ ID NO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264的CAR同源物都对6ACA、己酸盐或两者表现出活性。

表8.CAR同源物

活性图例

实施例5.CAR同源物的体内测定。

为了测试体内CAR同源物的活性，将编码选定CAR同源物的基因转化到大肠杆菌菌株中，所述菌株还包括引入的编码1)3-氧代己二酰-CoA硫解酶(Thl)、2)3-氧代己二酰-CoA脱氢酶(Hbd)、3)3-氧代己二酰-CoA脱水酶(“巴豆酸酶”或Crt)、4)5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶(Ter)、5)醛脱氢酶(Ald)、6)6ACA转氨酶(TA)和7)HMD转氨酶(TA2)的基因。Thl、Hbd、Crt、Ter、Ald基因在US 8,377,680中有报道(例如，实施例8，其以全文引用的方式并入)。这些基因被引入大肠杆菌菌株中，所述菌株包括产生HMD所必需的所有途径酶，除了CAR酶。

将用于表达CAR基因的载体转化到Thl/Hbd/Crt/Ter/Ald/TA/TA2大肠杆菌菌株中，并测试转化体的HMD产生。在基本培养基中给工程化的大肠杆菌细胞喂食2％的葡萄糖，在35℃下孵育18小时后，收获细胞，并通过分析HPLC或标准LC/MS分析方法评估上清液的HMD产生。如表8和表9所示，编码CAR酶的基因在包括Thl、Hbd、Crt、Ter、Ald、TA和TA2基因的大肠杆菌中的表达导致这些菌株产生HMD。

实施例6.CAR变体。

通过检查蛋白质的晶体结构来鉴定CAR同源物4(SEQ ID NO:153)和CAR同源物105(SEQ ID NO:254)中的突变的氨基酸位置，并在选定的氨基酸位置对编码SEQ ID NO:153和254的基因进行饱和诱变。如实施例4所述，在裂解物分析中测试所得变体的活性。图11示出对于八种不同的底物，CAR SEQ ID NO:153的结果。

通过在P141、L245、I247、W270、S274、K275、N276、F278、G279、N279插入、A282、A283、S299、I300、N335、S336、M389、G391、G414、G421、M422、F425、G636、D809、I810、L811、A812和F929的氨基酸位置突变编码CAR酶(SEQ ID NO:153和254)的基因来产生变体。突变单独进行和与其它氨基酸位置的突变组合进行。使用简并引物序列和PCR进行氨基酸位置的突变，其中改变的基因序列混合物转化到大肠杆菌中。如实施例4所述，在裂解物分析中测试转化体。在一式三份的裂解物分析中重新测试提供裂解物的克隆，所述裂解物在分析中显示出活性。继续表现出活性的克隆然后准备用于它们包含的CAR基因的序列分析。

表9和图12提供了在活性克隆的变体CAR基因序列中发现的突变。表现出高于野生型活性的变体包括CAR基因中的单一突变和组合(多重)突变。表9显示多种变体表现出比野生型CAR(SEQ ID NO:152)更大的活性，在氨基酸位置P141、L245、I247、W270、S274、K275、N276、F278、G279、N279插入、A282、A283、S299、I300、N335、S336、M389、G391、G414、G421、M422、F425、G636、D809、I810、L811、A812和F929(相对于SEQ ID NO:152鉴定的位置)的突变生成具有比其来源的野生型CAR更高的活性的多种变体。

表9 CAR变体

表10显示同源物4的位置245、247、274、275、276、278、282、283、299、300和389处的突变组合可产生总共165,888种独特组合。组合突变体是对同源物4的N335D的补充。

表10同源物4(SEQ ID NO:153)的CAR变体的组合突变体

实施例7.对6-氨基己酸半醛有活性的TA2转氨酶的鉴定

如实施例1所述，鉴定和测试编码TA2转氨酶的基因。

表11显示具有SEQ ID NO:265和267-296的TA2同源物表现出将6-氨基己酸半醛转化为HMD的活性。

表11.TA2同源物

实施例8.对己二酰-CoA有活性的来自不同微生物来源的醛脱氢酶的筛选

在多个物种的基因组中以生物信息学方式鉴定了来自不同物种的编码醛脱氢酶(ALD)的基因(表4)。合成编码每种醛脱氢酶的基因，在大肠杆菌中表达，并评估ALD活性。

将编码表12的ALD酶候选物的基因克隆到组成型启动子下的低拷贝载体中，并使用标准技术将构建体转化到大肠杆菌中。转化体在抗生素存在下在LB培养基中于35℃培养过夜，然后在室温下以15,000rpm收获细胞。为了制备裂解物，将细胞重悬于含有溶菌酶、核酸酶和10mM DTT的化学裂解溶液中，并在室温下孵育至少30分钟。所得裂解物用于测试醛脱氢酶活性。

将裂解物(5μl)添加到分析混合物中，得到20μL的总体积，最终浓度为0.1M Tris-HCl(pH 7.5)、2.5mM己二酰-CoA(AdCoA)和0.5mM NADH或0.5mM NADPH。

该分析用于从不同物种中筛选ALD酶。一些ALD候选物也使用琥珀酰-CoA(SuCoA)或乙酰-CoA(AcCoA)作为底物进行分析。AdCoA、SuCoA和AcCoA是从商业供应商处获得的。通过在CoA底物的存在下NADH或NADPH荧光的线性下降来监测活性。在表4中，在使用NADH或NADPH时对己二酰-CoA具有显著活性的ALD被指定为阳性(+)，而那些活性很少或没有活性的ALD被指定为减号(-)。

Claims

1.一种工程化羧酸还原酶(CAR)酶，其包含SEQ ID NO:152、153或254的氨基酸的至少一个改变。

2.根据权利要求1所述的工程化CAR，其中所述工程化CAR酶能够：

(a)从6-氨基己酸底物形成6-氨基己酸半醛；

(b)以与野生型CAR相比更高的速率从6-氨基己酸底物形成6-氨基己酸半醛；

(c)与野生型CAR相比对6-氨基己酸底物具有更高的亲和力，或

(d)(a)、(b)和(c)的任何组合。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的工程化CAR，其中所述工程化CAR在选自由以下组成的组的一个或多个残基位置包含一个或多个氨基酸改变：SEQ ID NO:152、153或254的P141、L245、I247、W270、S274、K275、N276、F278、G279、N279插入、A282、A283、S299、I300、N335、S336、M389、G391、G414、G421、M422、F425、G636、D809、I810、L811、A812和F929或其组合。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化CAR，其中所述工程化CAR在选自由以下组成的组的一个或多个残基位置包含一个或多个氨基酸改变：SEQ ID NO:152、153或SEQ IDNO:254的P141、L245、I247、W270、S274、K275、N276、F278、G279、N279插入、A282、A283、S299、I300、N335、S336、M389、G391、G414、G421、M422、F425、G636、D809、I810、L811、A812和F929或其组合，所述氨基酸改变是保守氨基酸取代。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化CAR，其中所述工程化CAR在选自由以下组成的组的一个或多个残基位置包含一个或多个氨基酸改变：SEQ ID NO:152、153或254的P141、L245、I247、W270、S274、K275、N276、F278、G279、N279插入、A282、A283、S299、I300、N335、S336、M389、G391、G414、G421、M422、F425、G636、D809、I810、L811、A812和F929或其组合，所述氨基酸改变是非保守氨基酸取代。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程化CAR，其中工程化蛋白质的所述至少一个氨基酸改变是选自SEQ ID NO:152、153或254的表9的改变及其组合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程化CAR，其中所述氨基酸改变包括SEQ IDNO:152、153或254的氨基酸序列中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的工程化CAR，其中氨基酸位置包括SEQ ID NO:152、153或254的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个氨基酸位置。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化CAR，其中所述工程化CAR包括比SEQ IDNO:152、153或254的CAR的活性高至少20％的活性。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的工程化CAR，其中所述工程化CAR包含选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸改变：N335E；N335D；S274D；S274E；K275D；K275E；S299D；S299E；M389D；M389E；G414D；G414E；G421D；G421E；M422D；M422E；F425D；F425E；N335D和A282P；N335D和A282V；N335D和A283C；N335D、A283C和F929L；N335D、A283C和G636D；N335D和A283G；N335D和F278A；N335D和F278C；N335D和F278S；N335D和F278V；N335D和G279V；N335D和I247M；N335D和I247Q；N335D和I247T；N335D和I247V；N335D和I300C；N335D和I300G；N335D和I300M；N335D和I300M；N335D和I300Y；N335D和K275A；N335D和K275D；N335D和K275D；N335D和K275E；N335D和K275M；N335D和K275N；N335D和K275S；N335D和K275T；N335D和K275V；N335D和K275W；N335D和L245C；N335D和L245G；N335D和L245S；N335D和L245T；N335D和L245V；N335D和M389I；N335D和M389W；N335D和M422D；N335D和N276S；N335D和N279插入；N335D和P141G；N335D和S299D；N335D和S299E；N335D和S391G；N335D和W270M；K275D、N276S、F278S、A283C和N335D；L245V、K275D、N276S、F278S、A283C和N335D；I247M、K275D、N276S、F278A、A283C和N335D；L245V、K275T、N276S、F278S、A283C和N335D；I247M、K275T、N276S、F278S、A283C和N335D；K275D、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；L245T、K275D、N276S、F278A、A283C和N335D；K275N、F278S、A283C、S299D和N335D；I247M、K275N、N276S、F278S、A283C和N335D；K275N、F278S、A283C、I300G和N335D；K275N、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；I247M、K275T、F278S、A283C和N335D；L245V、K275D、N276S、F278A、A283C和N335D；K275N、F278S、A283C、I300G和N335D；K275N、F278A、A283C、S299D和N335D；K275N、N276S、F278A、A283C和N335D；L245V、K275N、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；L245T、K275N、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275N、F278A、S299D和N335D；I247M、K275N、F278A、A283C、I300Y和N335D；I247M、K275N、F278A、A283C和N335D；K275D、N276S、F278A和N335D；K275T、F278A、A283C、S299D和N335D；F278A、A282P和N335D；F278A、A283C和N335D；K275N、S299D和N335D；L245T、S299D和N335D；K275D、S299D和N335D；K275N、F278S和N335D；S299D、M389W和N335D；G279V、S299D和N335D；F278A、S283C和N335D；K275D、N276S和N335D；G279V、S299E和N335D；I247M、S299D和N335D；P141G、A282P和N335D；L245T、A282P和N335D；F278S、A283C和N335D；K275D、S284I、S299D和N335D；I247M、I282P和N335D；I247V、K275D、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；I247V、K275D、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275D、S274A、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275D、S274P、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A282F、A283C、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A282P、A283C、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A283C、S299I、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A283C、I300G、N335D和M389C；K275D、N276S、F278S、A283C、I300G、N335D和M389Y；和K275D、N276S、F278S、A283C、I300G、N335D和M389S。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化CAR，其中所述工程化CAR包含SEQ IDNO:153的氨基酸的至少一个改变，并且其中所述工程化CAR包含选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸改变：K275D、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；I247V、K275D、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；I247V、K275D、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275D、S274A、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275D、S274P、N276S、F278S、A283C、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A282F、A283C、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A282P、A283C、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A283C、S299I、I300G和N335D；K275D、N276S、F278S、A283C、I300G、N335D和M389C；K275D、N276S、F278S、A283C、I300G、N335D和M389Y；和K275D、N276S、F278S、A283C、I300G、N335D和M389S。

12.一种编码根据权利要求1至11中任一项所述的工程化CAR的核酸。

13.根据权利要求12所述的核酸，其中编码所述工程化CAR的核酸序列与启动子可操作地连接。

14.一种载体，其包含根据权利要求13所述的核酸。

15.一种非天然存在的微生物，其包含外源核酸，所述外源核酸编码：

(a)选自权利要求1至11中任一项的工程化CAR；

(b)包含与SEQ ID NO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264中任一者的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的CAR；或

(c)与SEQ ID NO:265和267-296中任一者的至少25、50、75、100、150、200、250、300个或更多个连续氨基酸具有至少50％序列同一性的六亚甲基二胺(HMD)转氨酶(TA2)酶。

16.根据权利要求15所述的非天然存在的微生物，其还包含外源核酸，所述外源核酸编码：

(a)包含SEQ ID NO:1、13或31的氨基酸的至少一个改变的工程化转氨酶(TA)酶；

(b)在选自SEQ ID NO:1的残基V114、S136、T148、P153、I203、I204、P206、V207、V111、T216、A237、T264、M265、L386、G19、C22、D70、R94、D99、T109、E112、A113、F137、G144、I149、K150、Y154、S178、L186、Q208、L234、T242、A315、K318、R338、G336、L386、V390、A406、S416、A421、G17、M21、A50、A76、Y77、Q78、I79、G84、F107、T108、K119、G139、M142、A152、P153、E205、G209、G211、D238、M285、A290、G291、G292、L293、Y297、M353、S387、S388和G392或其组合的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸改变的工程化转氨酶(TA)酶；

(c)包含所述工程化蛋白质的至少一个氨基酸改变的工程化转氨酶(TA)酶，所述氨基酸改变选自SEQ ID NO:1的在表7中所示的改变及其组合；或

(d)包含与SEQ ID NO:1、3、4、5、9、12、13、26、27、30、31、38、50、52、64、74、78、79、81、91、106、108和116中任一者的至少25个或更多个连续氨基酸具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的转氨酶。

17.根据权利要求16所述的工程化TA，其中SEQ ID NO:1的一个或多个残基位置处的一个或多个氨基酸改变或其组合选自保守或非保守氨基酸改变。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述外源核酸是异源的。

19.根据权利要求15至17中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述外源核酸是同源的。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的非天然存在的微生物，其包含具有选自由SEQID NO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264组成的组的氨基酸序列的CAR。

21.根据权利要求15至19中任一项所述的非天然存在的微生物，其包含具有选自由表9中所示的CAR变体1-115组成的组的氨基酸序列的CAR。

22.根据权利要求15至21中任一项所述的非天然存在的微生物，其包含具有选自由SEQID NO:265和267-296组成的组的氨基酸序列的HMD转氨酶(TA2)。

23.根据权利要求16至22中任一项所述的非天然存在的微生物，其包含具有选自由表7中所示的TA变体1-233组成的组的氨基酸序列的工程化转氨酶(TA)。

24.根据权利要求15至23中任一项所述的非天然存在的微生物，其还包含至少一种编码与己二酰-CoA反应形成己二酸半醛的醛脱氢酶(ALD)酶的外源核酸。

25.根据权利要求24所述的非天然存在的微生物，其包含具有选自由SEQ ID NO:141-143和297-370组成的组的氨基酸序列的ALD酶。

26.根据权利要求24至25中任一项所述的非天然存在的微生物，其中与琥珀酰-CoA底物、乙酰-CoA底物或琥珀酰-CoA底物和乙酰-CoA底物两者相比，所述ALD酶对己二酰-CoA底物具有更高的催化效率，和/或与琥珀酰-CoA底物、乙酰-CoA底物或琥珀酰-CoA底物和乙酰-CoA底物两者相比，所述醛脱氢酶对己二酰-CoA底物具有更高的周转数。

27.根据权利要求25至26中任一项所述的非天然存在的微生物，其包含具有以足以产生HMD的量表达的HMD途径酶的六亚甲基二胺(HMD)途径，其中所述HMD途径包含(1)3-氧代己二酰-CoA硫解酶、(2)羟基己二酰-CoA脱氢酶(HBD)、(3)巴豆酸酶、(4)反式烯酰CoA还原酶(TER)、(5)6ACA-醛脱氢酶(6ACA-ALD)、(6)6ACA-转氨酶(TA)、(7)羧酸还原酶(CAR)和(8)HMD-转氨酶(TA2)。

28.根据权利要求27所述的非天然存在的微生物，其还包含编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HMD途径酶的外源核酸。

29.根据权利要求27至28中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种外源核酸，每种外源核酸都编码HMD途径酶。

30.根据权利要求27至28中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含编码所述HMD途径的每种酶的外源核酸。

31.根据权利要求27至30中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。

32.根据权利要求27至31中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厌氧的培养基中。

33.根据权利要求27至32中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物是细菌、酵母或真菌的物种。

34.根据权利要求27至33中任一项所述的非天然存在的微生物，其中与不包含根据权利要求15至26中任一项所述的外源核酸的对照微生物相比，所述非天然存在的微生物能够多产生至少10％的6-氨基己酸半醛、HMD或两者。

35.根据权利要求27至34中任一项所述的非天然存在的微生物，其中与除了不包含根据权利要求15至23中任一项所述的外源核酸以外基本上与所述非天然存在的微生物相同的对照微生物相比，所述非天然存在的微生物将更多的：

(a)己二酸半醛转化为6-氨基己酸，

(b)6-氨基己酸转化为6-氨基己酸半醛，和/或

(c)6-氨基己酸半醛转化为HMD。

36.一种非天然存在的微生物，其包含外源核酸，所述外源核酸编码：

(a)选自权利要求1至11中任一项的工程化CAR，或

(b)包含与SEQ ID NO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264中任一者的至少25个或更多个连续氨基酸具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的CAR。

37.根据权利要求36所述的非天然存在的微生物，其还包含外源核酸，所述外源核酸编码：

38.根据权利要求37所述的工程化TA，其中SEQ ID NO:1的一个或多个残基位置的所述一个或多个氨基酸改变或其组合选自保守或非保守氨基酸改变。

39.根据权利要求36至38中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述外源核酸是异源的。

40.根据权利要求36至38中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述外源核酸是同源的。

41.根据权利要求36至40中任一项所述的非天然存在的微生物，其包含具有选自由SEQID NO:150-165、168-171、173-178、180、183-185、187-188、190-193、195、198-200、202-216、218-219、221-230、232-238、241-244、246-249、251-252和255-264组成的组的氨基酸序列的CAR。

42.根据权利要求36至40中任一项所述的非天然存在的微生物，其包含具有选自由表9中所示的CAR变体1-115组成的组的氨基酸序列的CAR。

43.根据权利要求37至42中任一项所述的非天然存在的微生物，其包含具有选自由表7中所示的TA变体1-233组成的组的氨基酸序列的工程化转氨酶(TA)。

44.根据权利要求36至43中任一项所述的非天然存在的微生物，其包含具有以足以产生HDO的量表达的HDO途径酶的1,6-己二醇(HDO)途径，其中所述HDO途径包含(1)硫解酶、(2)羟基己二酰-CoA脱氢酶(HBD)、(3)巴豆酸酶、(4)反式烯酰CoA还原酶(TER)、(5)6ACA-醛脱氢酶(6ACA-ALD)、(6)6ACA-转氨酶(TA)、(7)羧酸还原酶(CAR)、(8)6-氨基己酸半醛还原酶、(9)6-氨基己醇氨基转移酶或氧化还原酶和(10)6-羟基己醛还原酶。

45.根据权利要求44所述的非天然存在的微生物，其还包含编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HDO途径酶的外源核酸。

46.根据权利要求44至45中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或十一种外源核酸，每种外源核酸都编码HDO途径酶。

47.根据权利要求44至46中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含编码所述HDO途径的每种酶的外源核酸。

48.根据权利要求44至47中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。

49.根据权利要求44至48中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厌氧的培养基中。

50.根据权利要求44至49中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物是细菌、酵母或真菌的物种。

51.根据权利要求44至50中任一项所述的非天然存在的微生物，其中与不包含根据权利要求36至43中任一项所述的外源核酸的对照微生物相比，所述非天然存在的微生物能够多产生至少10％的6-氨基己酸半醛、HDO或两者。

52.根据权利要求44至51中任一项所述的非天然存在的微生物，其中与除了不包含根据权利要求36至43中任一项所述的外源核酸以外基本上与所述非天然存在的微生物相同的对照微生物相比，所述非天然存在的微生物将更多的：

(a)己二酸半醛转化为6-氨基己酸，和/或

(b)6-氨基己酸转化为6-氨基己酸半醛。

53.一种生产六亚甲基二胺(HMD)的方法，其包括在一定条件下培养根据权利要求27至35中任一项所述的非天然存在的微生物足够的一段时间以生产HMD。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述方法还包括将所述HMD与培养物中的其它成分分离。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述分离包括萃取、连续液-液萃取、渗透蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、吸收色谱或超滤。

56.一种生产1,6-己二醇(HDO)的方法，其包括在一定条件下培养根据权利要求43至52中任一项所述的非天然存在的微生物足够的一段时间以生产HMD。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法还包括将所述HMD与培养物中的其它成分分离。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述分离包括萃取、连续液-液萃取、渗透蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、吸收色谱或超滤。

59.一种包含生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO的培养基，其中所述生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO具有反映大气二氧化碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。

60.根据权利要求59所述的培养基，其中所述生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO通过以下各项产生：

(a)根据权利要求15至35中任一项所述的非天然存在的微生物；

(b)根据权利要求36至52中任一项所述的非天然存在的微生物；

(c)根据权利要求53至55中任一项所述的方法；或

(d)根据权利要求56至58中任一项所述的方法。

61.根据权利要求59和61中任一项所述的培养基，其中所述培养基包含：

(a)根据权利要求1至11中任一项所述的工程化CAR；

(b)根据权利要求12至14中任一项所述的核酸；

(c)根据权利要求16至17、37至38和43中任一项所述的工程化转氨酶(TA)酶；

(d)编码根据权利要求16至17、37至38和43中任一项所述的TA酶的核酸；

(e)根据权利要求15所述的工程化六亚甲基二胺(HMD)转氨酶(TA2)酶；

(f)编码根据权利要求15所述的TA2酶的核酸；

(g)根据权利要求24至27中任一项所述的醛脱氢酶(ALD)酶；

(h)编码根据权利要求24至27中任一项所述的ALD酶的核酸；

(i)根据权利要求15至35中任一项所述的非天然存在的微生物；或

(j)根据权利要求36至52中任一项所述的非天然存在的微生物。

62.根据权利要求59至61中任一项所述的培养基，其中所述培养基与产生生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO的非天然存在的微生物分离。

63.生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO，其具有反映大气二氧化碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。

64.根据权利要求63所述的生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO，其通过以下各项产生：

(a)根据权利要求15至35中任一项所述的非天然存在的微生物；

(b)根据权利要求36至52中任一项所述的非天然存在的微生物；

(c)根据权利要求53至55中任一项所述的方法；或

(d)根据权利要求56至58中任一项所述的方法。

65.根据权利要求63至64中任一项所述的生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO，其中所述生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的Fm值。

66.一种组合物，其包含根据权利要求63至65中任一项所述的生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO，以及除所述生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO之外的化合物。

67.根据权利要求66所述的包含生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO的组合物，其中所述组合物还包含根据权利要求15至42中任一项所述的非天然存在的微生物的一部分。

68.根据权利要求66至67中任一项所述的包含生物衍生的HMD、6-氨基己酸半醛和/或HDO的组合物，或其细胞裂解物或培养上清液。