CN116590269A - 耐中性环境的海因酶突变体及其应用 - Google Patents

耐中性环境的海因酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海因酶突变体SEQ ID NO:3，其在pH6.5‑7.5中性反应体系中高效催化D‑对羟基苯海因水解为N‑氨甲酰‑D‑对羟基苯甘氨酸，并且可与氨甲酰水解酶组合催化D,L‑对羟基苯海因合成D‑对羟基苯甘氨酸，具有较好的工业应用前景。

Description

耐中性环境的海因酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种海因酶突变体及其在制备N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸和D-对羟基苯甘氨酸中的应用。
背景技术
D-对羟基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine，简写D-HPG)又称左旋对羟基苯甘氨酸，分子式为C8H9NO3，结构式如下：
D-HPG是合成β-内酰胺类半合成广谱抗生素，如阿莫西林、头孢羟氨苄、羟氨苄唑头孢的重要中间体。这类抗生素具有优异的生理功能，诸如抗菌谱广泛，不良作用低，过敏性低，口服效果好，作用时间长等优点。此外，D-HPG也是一些抗菌和抗病毒药物、人工甜味剂的中间体。
D-HPG的合成方法包括化学合成法和生物酶法。化学法可分为苯甲醛法、β-环糊精法、对羟基苯海因法、活泼酰胺基化合物反应法与乙醛酸法等(D,L-对羟基苯甘氨酸的合成研究.应用化工,2003,32(05):46-49)。但是化学合成法具有反应收率低、能耗高、消旋体手性拆分剂价格高等缺点，不符合当下绿色制造的理念。生物酶法是以D,L-对羟基苯海因为原料，D-海因酶和氨甲酰水解酶发挥拆分和水解的催化作用生成D-HPG，具有反应步骤少、催化效率高和环境友好等优点，近年来备受关注(Production of D-p-Hydroxyphenylglycine by N-Carbamoyl-D-aminoAcid Amidohydrolase-OverproducingEscherichia coli Strains.Biotechnol Prog,1999,15(4):603-607.王亚盟,班睿,刘露,申雨.异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达重组枯草芽孢杆菌的构建.微生物学报,2017,57(1):54-65.)。
D-海因酶能选择性地将D-对羟基苯海因水解为N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG)，残留的L-对羟基苯海因在中性或碱性条件下会迅速自发地消旋为D,L-对羟基苯海因，NC-D-HPG在氨甲酰水解酶的作用下生成D-HPG。
生物酶法可分为双菌/双酶法和一菌双酶法，在专利文献CN103993010A、CN110396484A、CN110699396A、CN111621452A、CN112080532A中都有报道。对羟基苯海因在碱性条件下不稳定，会发生自发消旋，因此在酶反应时需要通氮气隔离空气(双酶法合成D-对羟基苯甘氨酸.中国药科大学学报,2001,32(2):155-158)。并且氨甲酰水解酶(DCase)在中性条件下活力高，但在碱性条件下氨甲酰水解酶受到副产物NH4+的抑制导致活性降低(Biotechnol Prog,1999,15(4):603-607)。而海因酶(DHase)在较高pH值(pH值8～9)的稳定性较好，但是在pH值低于8.0时酶失活较快。这两种酶对于不同酸碱度的适应性相互矛盾，为了从原料对羟基苯海因出发制备D-对羟基苯甘氨酸，提高底物的酶转化效率，CN112080532A提供了一种级联酶反应，以D,L-对羟基苯海因为底物，首先加入海因酶，在无氧环境中于pH为9.5～11反应得到中间反应液；将中间反应液进行超滤除杂，然后将N-氨甲酰水解酶加入超滤透过液中，在无氧环境中于pH为7.0～8.5反应至结束，得到D-对羟基苯甘氨酸。该级联反应的缺点也很明显，首先每步反应后都需要进行繁琐的后处理，二是两种酶的酶活力和投料量需要进行实验匹配，必然导致成本上升。综合来看，采用两种酶共表达的一菌双酶法是更理想的选择。
发明内容
为了优化一菌双酶法由对羟基苯海因合成D-对羟基苯甘氨酸的工艺路线，平衡海因酶和氨甲酰水解酶的酸碱度适应性的矛盾，发明人对于改变海因酶的pH偏好性进行了探索，通过大范围筛选和突变技术，终于获得了一些耐受中性反应环境的海因酶突变体。进一步地，在发明人已经获得的高酶活力的氨甲酰水解酶(CN202310044861.9)基础上，将海因酶突变体与氨甲酰水解酶(SEQ ID NO:5)在大肠杆菌中进行共表达，实现了中性pH值条件下D-对羟基苯甘氨酸的细胞催化合成。具体而言，本发明包括如下技术方案。
本发明的第一个方面提供了一种海因酶突变体，其为野生海因酶氨基酸序列SEQID NO:1中发生下述五个以上、优选六个以上位点突变所形成的突变体：Q25L、D45T、D45A、T69A、H124N、L310P、G354R、L394I、P399S，该海因酶突变体具有在pH7.5以下环境中催化D-对羟基苯海因(即D-5-(4-羟苯基)乙内酰脲)水解为N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG)的功能。
优选地，上述的海因酶突变体为野生海因酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生下述五个以上、优选六个以上位点突变所形成的突变体：Q25L、D45T、T69A、H124N、L310P、G354R、L394I、P399S。
MMTKLIKNGTIVTATDIYEADLLIQDGKIAVIGRNLDESGAEVIDATGCYVFPGGIDPHTHLDMPFGGTVTKDDFESGTIAAAFGGTTTIIDFCLTNKGEPLKKAIETWHNKATGKAVIDYGFHLMISEITDDVLEELPKVIEEEGITSFKVFMAYKDVFQADDGTLYRTLVAAKELGALVMVHAENGDVIDYLTKKALEDGHTDPIYHALTRPPELEGEATGRACQLTELAGSQLYVVHVSCAQAVEKIAEARNKGLNVWGETCPQYLVLDQSYLEKPNFEGAKYVWSPPLREKWHQEVLWNALKNGQLQTLGSDQCSFDFKGQKELGRGDFTKIPNGGPIIEDRVSILFSEGVKKGRITLNQFVDIVSTRIAKLFGLFPKKGTIAVGADADLVIFDPTVERVISAETHHMAVDYNPFEGMKVTGEPVSVLCRGEFVVRDKQFVGKPGYGQYVKRAKYGALMADQDVVKMS(SEQ ID NO:1)。
更优选上述海因酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，是野生海因酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生下述六个位点突变所形成的突变体：Q25L、D45T、H124N、G354R、L394I、P399S。
本发明的第二个方面提供了编码上述海因酶突变体的基因。
例如，编码海因酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列可以为SEQID NO:4。
MMTKLIKNGTIVTATDIYEADLLILDGKIAVIGRNLDESGAEVITATGCYVFPGGIDPHTHLDMPFGGTVTKDDFESGTIAAAFGGTTTIIDFCLTNKGEPLKKAIETWHNKATGKAVIDYGFNLMISEITDDVLEELPKVIEEEGITSFKVFMAYKDVFQADDGTLYRTLVAAKELGALVMVHAENGDVIDYLTKKALEDGHTDPIYHALTRPPELEGEATGRACQLTELAGSQLYVVHVSCAQAVEKIAEARNKGLNVWGETCPQYLVLDQSYLEKPNFEGAKYVWSPPLREKWHQEVLWNALKNGQLQTLGSDQCSFDFKGQKELGRGDFTKIPNGGPIIEDRVSILFSERVKKGRITLNQFVDIVSTRIAKLFGLFPKKGTIAVGADADIVIFDSTVERVISAETHHMAVDYNPFEGMKVTGEPVSVLCRGEFVVRDKQFVGKPGYGQYVKRAKYGALMADQDVVKMS(SEQ ID NO:3)。
进一步地，本发明还提供了包含上述基因的质粒，用于在微生物中表达上述海因酶突变体。
上述质粒载体可以选自pET载体、pSH质粒、pRSFDuet质粒或其他载体，所述pET载体例如是pET22b、pET24a、pET28a。
本发明的第三个方面提供了上述海因酶突变体在制备N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG)和/或D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)中的应用。
上述制备NC-D-HPG和/或D-HPG的反应中，反应体系酸碱度可以为中性的pH6.5-7.5。
作为一种优选的应用实施方式，当上述海因酶突变体用于制备D-对羟基苯甘氨酸时，与氨基酸序列为SEQ ID NO:5的氨甲酰水解酶(专利文献CN202310044861.9中报道的氨甲酰水解酶突变体)组合使用，其中氨甲酰水解酶用于将N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG)水解为D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。
MTRQMILAVGQQGPIARAETREQVVVRLLDMLTKAASRGANFIVFPELALTTFFPRWYFTDEAELDSFYETEMPGPVVRPLFEKAAELGIGFNLGYAELVVEGGVKRRFNTSILVDKSGKIVGKYRKIHLPGHKETEAYRDFQHLEKRVFEPGDLGFPVYDVDAAKMGMFICNDRRWPEAWRVMGLRGAEIICGGYNTPTHNPEVPQHDHLTSFHHLLSMQAGSYQNGAWSAAAGKAGMEENCMLLGHSCIVAPTGEIVALTTTLEDEVITAAVDLDRCRELREHIFNFKQHRQPQHYGLIAEL(SEQ ID NO:5)。
优选地，上述海因酶突变体和上述氨甲酰水解酶在微生物中共表达，发酵后的菌体或者粗酶可以直接用作催化剂来水解底物D-对羟基苯海因得到D-对羟基苯甘氨酸，从而避免了两种分离的酶或表达菌株需要预先进行酶活力和投料量匹配的麻烦，相当于“一锅法”由原料D-对羟基苯海因制备最终产物D-对羟基苯甘氨酸。
例如，上述共表达海因酶和氨甲酰水解酶的微生物可以是所述海因酶突变体和所述氨甲酰水解酶共表达质粒的转化子。
上述微生物宿主可以选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。
上述的应用方式中，可以采用共表达所述海因酶突变体和所述氨甲酰水解酶的微生物作为催化剂时，以微生物菌体形式或者其细胞破碎物形式添加于反应体系中，进行全细胞催化。
即，反应体系中以D-对羟基苯海因(D-5-(4-羟苯基)乙内酰脲)为底物原料，用所述海因酶突变体和所述氨甲酰水解酶或者它们的表达微生物催化水解反应，得到D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。
在催化D-对羟基苯海因水解反应时，反应体系pH值为pH6.5-7.5。反应温度为35-45℃，优选40℃。
底物D-对羟基苯海因浓度可以为2-60g/L，优选40g/L。
本发明的另一个方面提供了一种共表达上述海因酶突变体和上述氨甲酰水解酶的质粒。
优选地，上述质粒包含核苷酸序列为SEQ ID NO:4的海因酶突变体编码基因和核苷酸序列为SEQ ID NO:6的氨甲酰水解酶编码基因。
本发明经基因工程突变得到的海因酶突变体比如SEQ ID NO:3改变了普通海因酶不耐受中性环境、中性环境中容易失活或者酶活力显著下降的缺陷。该海因酶突变体SEQID NO:3能够与氨甲酰水解酶SEQ ID NO:5进行组合例如在微生物中共表达，用于在中性反应体系中高效催化D-对羟基苯海因水解生成D-对羟基苯甘氨酸。
附图说明
图1是用于表达野生海因酶的质粒pET-HY-0的结构示意图。
图2是本发明构建的海因酶突变体和氨甲酰水解酶共表达菌株催化D-对羟基苯海因水解反应的HPLC图谱。
具体实施方式
由于D-对羟基苯海因在高pH值的碱性条件下不稳定、会发生自发消旋，为了改变海因酶(DHase)普遍适应高pH值(pH值8～9)的碱性环境、但在中性pH低于8.0时失活较快因而不适合在中性反应体系中催化D-对羟基苯海因水解、生产高光学纯度的手性产物N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG)和D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)，发明人对于文献已报到的各种微生物来源的海因酶进行了筛选后，发现来源于好热地芽孢杆菌(Geobacilluskaustophilus)的海因酶(GenBank登录号为BAD75708.1，氨基酸序列为SEQ ID NO:1)的酸碱度适应范围即pH值范围大于已报到的其他海因酶种类。
实验发现野生海因酶SEQ ID NO:1在pH7.0左右的反应体系中催化D-对羟基苯海因水解时，虽然酶的立体选择性较高，生成的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸光学纯度高，但是催化反应速度很慢，且酶活力下降很快，不适应pH7.0左右的环境。
因此有必要通过突变对其结构进行改造，期望得到耐受中性环境的突变海因酶。
在本文中，术语“野生(型)”、“野生(海因)酶”、“野生型(海因)酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:1的好热地芽孢杆菌来源的海因酶，本文中编号为HY-0。相对应地，术语“突变体”、“突变(海因)酶”、“海因酶突变体”表示相同的意义，都是指对野生海因酶进行氨基酸序列改造后仍保持相同催化反应特点的酶，尤其指酶活力提高和/或酶活力稳定性增强的酶，例如氨基酸序列为SEQ ID NO:3的突变体。为了表述方便起见，在本文中可以将野生型海因酶与其突变体统称为“海因酶”。
本文中，上述所用术语“(酶活力)提高”和/或“(稳定性)增加”表示相较于参考水平提高至少100％，例如相较于参考水平的至少1倍、至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍的提高。
本发明的技术方案描述中，所用术语诸如“A和/或B”、“A并且/或者B”中使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；C(单独)。
所述的术语“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、插入、化学修饰，优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代，则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知，保守性置换的常见情况包括：芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换；疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换，极性氨基酸Q、N之间的相互置换，碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换，酸性氨基酸D、E之间的相互置换，羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外，A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。示例性的保守取代例如可以根据下表来进行，其中在第二列中属于同一个分区的氨基酸可以相互取代，在优选的情况下第三列中同一行的氨基酸可互相取代：
“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。
“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10％，同时保留酶活性和/或保留工程化海因酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。
“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中，改良的工程化海因酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的海因酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的海因酶多肽中。插入可以是在多肽的内部，或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
通过多轮易错PCR随机突变，筛选出一些适应中性环境pH7.0左右的突变体，有效的突变位点包括：Y18H、Q25L、D45T、D45A、T69A、H124N、L135R、L310P、G354R、F380Y、L394I、P399S。其中下述六个位点突变的突变体的酶活力和稳定性是最出色的：Q25L、D45T、T69A、H124N、L310P、G354R、L394I、P399S，该突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
本发明的海因酶突变体的氨基酸序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达海因酶或其突变体，可以对这些酶的表达基因进行密码子优化。
密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
例如，为了在大肠杆菌中表达氨甲酰水解酶，经密码子优化的氨甲酰水解酶SEQID NO:5的编码基因可以是SEQ ID NO:6。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
当应用于合成D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)时，海因酶需要与氨甲酰水解酶组合催化D,L-对羟基苯海因进行级联水解反应。发明人已经在专利文献CN202310044861.9中报道了一种性能优异的氨甲酰水解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.5。
在一种优选的实施方式中，海因酶与氨甲酰水解酶可以在同一个微生物菌株中共表达，无需将两种分离的酶用于上述水解反应时根据反应进程，分先后次序分别加入，省去了将两种酶或者表达细胞按比例添加的麻烦。
上述微生物可以是海因酶表达质粒和氨甲酰水解酶表达质粒的转化体，海因酶突变体编码基因和氨甲酰水解酶编码基因可以分别克隆在不同的质粒上，也可以一起克隆在同一个质粒载体上形成共表达质粒。
转化体宿主可以使任何适合表达海因酶和/或氨甲酰水解酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂时，本发明的海因酶和/或氨甲酰水解酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体、死亡菌体、固定化菌体等。
作为另一种可选的实施方式，可以采用表达上述海因酶和/或氨甲酰水解酶的微生物菌体作为酶催化反应的生物催化剂。微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式，菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，因为当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序委托苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
5L发酵罐的发酵培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/LK2HPO4.3H2O、2.31g/L KH2PO4、5g/L甘油，消泡剂0.5g/L，pH7.0-7.5、每罐的发酵液装液量为2L。
5L发酵罐的补料培养基：60％甘油。
卡那霉素(Kan，50μg/mL)根据质粒所携带抗生素基因按照要求使用。
底物D,L-对羟基苯海因、中间体N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸和产物D-对羟基苯甘氨酸的HPLC检测条件：
上海伍丰LC-100液相色谱仪，Waters Symmetry-C18(250*4.6mm，5μm)，流动相：10mM PBS溶液(PH3.5)：乙腈(90：10)，1.0mL/min，230nm，20ul，柱温30℃。
需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。
实施例1：表达野生海因酶的大肠杆菌工程菌株构建
本文中将Geobacillus kaustophilus来源的海因酶编号为HY-0，根据其氨基酸序列SEQ ID NO:1(GenBank登录号BAD75708.1)，其编码基因序列SEQ ID NO:2，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因合成，并在基因两端设计限制性内切酶位点NdeI、BamHI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET-HY-0，其结构如1所示。
电转法将重组质粒pET-HY-0转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到表达野生海因酶的重组大肠杆菌BL-HY-0。
实施例2：海因酶随机突变库的建立及第1～3轮高通量筛选
1、易错PCR法构建随机突变点库
以质粒pET-HY-0为模板，利用易错PCR技术构建随机突变体文库。
设计如下引物对HY-5/HY-3：
正向引物HY-5：5’-ATGATGACAAAATTGATAAAAAATGG-3’，
反向引物HY-3：5’-TTAGGACATTTTCACCACATC-3’。
以质粒pET-HY-0为模板，进行PCR扩增，获得约1.4kb的海因酶突变体DNA序列。
50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒(pET-HY-0)模板，50pmol一对引物HY-5和HY-3，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(Takara)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。
对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)。以质粒pET-HY-0为模板，以约1.4kb的回收产物(随机突变片段)作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kb，25个循环；68℃10min。DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
2、突变体库的第1轮高通量筛选
挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mMIPTG)，在25℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(20mM D,L-对羟基苯海因，100mM磷酸盐缓冲液，pH值为8.0)重悬菌体，在45℃、250rpm条件下孵育2～5h。反应结束后，取100μL反应液并加入等体积显色剂(10％对二甲氨基苯甲醛(PDAB)溶于6mol/L盐酸中)，阳性菌株显黄色，黄色越深表示酶活力越高，在510nm处检测波长。
选择酶活力明显提升的菌株，提取质粒，并委托苏州金唯智公司进行核酸测序，将基因组中海因酶相关片段与SEQ ID NO:1进行比对，确定氨基酸突变位点，活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株，重复随机突变库建立及以D,L-对羟基苯海因为底物的高通量反应筛选。
3、突变体库的第2轮高通量筛选
参照突变体库的第1轮高通量筛选方法，但将酶反应体系的pH值调节为7.5，并且反应前加入100μL的pH 7.5的100mM磷酸盐缓冲液，在45℃孵育3h后进行反应。其它酶反应条件同第1轮筛选，即每孔为200μL酶反应液(20mM D,L-对羟基苯海因，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.5)重悬菌体，在45℃、250rpm条件下孵育2～5h。
4、突变体库的第3轮高通量筛选
参照突变体库的第1轮高通量筛选方法，但将酶反应的pH值调节为7.0，并且反应前加入100μL的pH7.0的100mM磷酸盐缓冲液，在45℃孵育5h后进行反应。其它酶反应条件同第1轮筛选，即每孔为200μL酶反应液(20mM D,L-对羟基苯海因，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.5)重悬菌体，在45℃、250rpm条件下孵育2～5h。
通过三轮筛选，筛选出一株pH7.0下酶活力最高的菌株BL-HY-16，通过基因测序、氨基酸位点比对，确定海因酶突变体HY-16的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，对应的核酸序列为SEQ ID NO:4。参见表1。
表1、第1～3轮随机突变库高通量筛选结果
表1中，“+”代表活力百分比相对各自出发菌株大于0％小于等于50％；“++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于50％小于等于100％；“+++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于100％小于等于200％；“++++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于200％。
三轮突变结果表明，对于pH中性环境适应性而言，野生酶的下述位点突变是有效的正向突变：Y18H、Q25L、D45T、D45A、T69A、H124N、L135R、L310P、G354R、F380Y、L394I、P399S。其中包含Q25L、D45T、H124N、G354R、L394I、P399S突变的突变酶HY-16在pH7.0反应环境的酶活力最高。
以下实施例重点考察该海因酶突变体HY-16。
实施例3：共表达氨甲酰水解酶和海因酶的大肠杆菌菌株的构建
3.1按照实施例1中描述的方法，构建能在大肠杆菌中表达海因酶突变体HY-16的质粒pET-HY-16。
3.2为了构建能够直接催化是D,L-对羟基苯海因合成D-对羟基苯甘氨酸的工程菌，需要使氨甲酰水解酶和海因酶在菌株中共表达。基于专利文献CN202310044861.9，选用其中性能优异的编号2-C4的氨甲酰水解酶，其在本文中的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
以SEQ ID NO:6序列为基础，在3’端添加片段5’-ACTAGTCCGCGGATCC-3’以便引入SpeI酶切位点，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成并克隆到质粒pET24a的NdeI、BamHI位点，获得质粒pET-SJ。
利用XbaI、BamHI双酶分别切割质粒pET-HY-0和pET-HY-16，获得约1.5kb含有海因酶基因的DNA序列，再将这2个1.5kb的DNA序列分别连接到质粒pET-SJ的SpeI、BamHI位点，获得能同时表达氨甲酰水解酶和海因酶的共表达质粒pET-SJ-HY-0和pET-SJ-HY-16。将质粒pET-SJ-HY-0和pET-SJ-HY-16分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，分别获得共表达氨甲酰水解酶和海因酶的工程菌株BL-SJ-HY-0和BL-SJ-HY-16。菌株BL-SJ-HY-0表达氨甲酰水解酶和野生海因酶HY-0；菌株BL-SJ-HY-16表达氨甲酰水解酶和突变海因酶HY-16。
实施例4：大肠杆菌工程菌的发酵培养
使用5L发酵罐，分别对菌株BL-SJ-HY-0和BL-SJ-HY-16进行发酵培养。从LB平板上挑取单菌落至5mL含有Kan的液体LB培养基中，在37℃、220rpm过夜培养。次日，按照体积浓度为5％的接种量转接至含有100mL液体TB培养基的摇瓶中，37℃、220rpm条件下培养至OD600nm达到6后，作为种子液转接到5L发酵罐中。接种后400～800rpm/min、37℃条件下培养，控制溶氧在20～30％范围内。当菌体OD600nm达到20后，加入IPTG诱导酶表达，IPTG的终浓度为0.2mM，于28-30℃继续培养16-24h。全发酵过程利用氨水控制pH值为6.8～7.2，控制通气量在2.5～3.5范围内。发酵结束后，于4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体，按照0.1g/mL的浓度使用PBS缓冲液进行重悬，然后高压破碎，得到全细胞反应液，2℃冷藏备用。
实施例5：双酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸
1L反应体系包括：0.1M磷酸盐缓冲液(PH7.5)、100mL全细胞反应液、40g/L底物D,L-对羟基苯海因、1mM氯化锰、0.1％(v/v)β-巯基乙醇，全程通入氮气保护，用3M磷酸和1M氢氧化钠溶液控制pH值为7.0左右，在40℃反应48h。反应结束后取样，加入10％盐酸终止反应，过滤后进行HPLC检测。结果显示，在反应48h后，BL-SJ-HY-16全细胞反应液反应体系中D-对羟基苯甘氨酸的生成率超过92％(如图2所示)，而BL-SJ-HY-0全细胞反应液反应体系中D-对羟基苯甘氨酸的生成率只有23％，提示海因酶突变体HY-16在pH值7.0左右催化D,L-对羟基苯海因的酶活力显著高于野生酶HY-0，且HY-16与氨甲酰水解酶能形成较佳的组合用于合成D-对羟基苯甘氨酸，具有工业化应用开发前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种海因酶突变体，其特征在于，其为野生海因酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生下述五个以上位点突变所形成的突变体：Q25L、D45T、D45A、T69A、H124N、L310P、G354R、L394I、P399S，该海因酶突变体具有在pH7.5以下环境中催化D-对羟基苯海因水解为N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸的功能。
2.如权利要求1所述的海因酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，是野生海因酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生下述六个位点突变所形成的突变体：Q25L、D45T、H124N、G354R、L394I、P399S。
3.编码如权利要求1或2所述海因酶突变体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码海因酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
5.如权利要求1或2所述的海因酶突变体在制备N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸和/或D-对羟基苯甘氨酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，当所述海因酶突变体用于制备D-对羟基苯甘氨酸时，与氨基酸序列为SEQ ID NO:5的氨甲酰水解酶组合使用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述海因酶突变体和所述氨甲酰水解酶在微生物中共表达。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，反应体系中以D-对羟基苯海因为底物原料，用所述海因酶突变体和所述氨甲酰水解酶或者它们的表达微生物催化水解反应，得到N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的微生物是所述海因酶突变体和所述氨甲酰水解酶的共表达质粒的转化子。例如，所述的微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。
10.一种共表达如权利要求2所述海因酶突变体和如权利要求6中所述氨甲酰水解酶的质粒。
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