CN116334054A - 一种青霉素g酰化酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青霉素G酰化酶突变体SEQ ID NO:3，其能够高效催化底物6‑APA与DHPGM反应生成阿莫西林，合成/水解比值S/H最高达到18.1，在侧链与母核比为1.05：1时，母核6‑APA的转化率达到99.0％以上，该突变体具有较高的热稳定性，有助于提高工业化生产阿莫西林效率。

Description

一种青霉素G酰化酶突变体
技术领域
本发明属于酶催化技术领域，涉及一种青霉素G酰化酶突变体，具体涉及一种用于合成阿莫西林的青霉素G酰化酶突变体。
背景技术
青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase，E.C.3.5.1.11，简称PGA)是用于制备半合成β-内酰胺类抗生素的重要用酶。该酶是可逆反应酶，参与β-内酰胺类抗生素的水解及合成。抗生素工业中利用该酶的水解功能来生产β-内酰胺类抗生素重要母核6-氨基青霉烷酸(6-Amino Penicillinic acid，6-APA，又称6-氨基青霉素酸)和7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-Amino deacetoxy cephalosporanic acid，7-ADCA)；利用其合成功能可催化6-APA、7-ADCA或其他母核与各种D-氨基酸侧链反应生成新的半合成β-内酰胺抗生素(半合成青霉素和头孢霉素)。另外，青霉素G酰化酶在一些手性化合物合成过程中可以用于保护羟基和氨基、拆分手性化合物等。
不同微生物来源的青霉素G酰化酶具有各自的反应特点，其中大肠杆菌和巨大芽孢杆菌来源的PGA水解性能应用报道相对较多，研究焦点大部分集中在其酶活性的提升。发明人在之前的研究例如CN201610097503.4和CN202210270135.4中开发出的一些青霉素G酰化酶突变体具有比较理想的水解活力。
基于大肠杆菌来源的青霉素G酰化酶结构模型中，βF24的氨基酸对酶的合成性能具有关键的作用，因为它位于酰化酶与青霉素G结合的口袋位置，同样有关键作用的还有αR145、αF146(Alkema et al.,Protein Engineering Design&SelAvtion,17(5),473-480,2004)。这些酶模型的构建对于酶性能的改进探索具有一定的促进作用。
酶催化反应实际工艺涉及到多个方面，包括比活力、选择性、底物/产物抑制性、pH、温度、稳定性等。为了应对抗生素原料行业的剧烈竞争，全面改进酶的多方面性能、满足实际工业化生产工艺的各种需求是降低生产成本最有效的手段之一。
虽然发明人在专利文献CN201610097503.4和CN202210270135.4中报道的一些青霉素G酰化酶突变体具有比较理想的水解活力，但实际生产中发现它们比较娇嫩，对于较高温度比较敏感，35℃以上的稳定性较差，酶活力衰减速度较快，这对于催化6-APA反应生产阿莫西林、催化7-ADCA反应生产头孢氨苄是不利影响因素。
发明内容
为了寻找酶活力高、合成性能强、热稳定性好的青霉素G酰化酶，发明人始终专注于对现有技术报道的青霉素G酰化酶的不断改造，以期得到尽可能满足多方面要求的理想酶或其突变体。我们在研究发现，与大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和无色杆菌(Achromobactersp.CCM 4824)来源的野生型青霉素G酰化酶相比，来源于粘节杆菌(Arthrobacterviscosus)的青霉素G酰化酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应于GenBank号L04471.1的95bp-2548bp核酸序列)在催化底物6-APA与DHPGM(D-型对羟基苯甘氨酸甲酯，D-HPGM)反应生成阿莫西林(AMXL)时具有较好的促合成性能，合成/水解比值S/H(目标产物阿莫西林与副产品对羟基苯甘氨酸(D-HPG)的摩尔比)相对较高、水解性能弱，但是酶活力有限，转化率只有45％左右，经分析也与酶的热稳定性偏低有关。
酶热稳定性的增强有利于延长酶催化的反应时间，降低阿莫西林生产成本。于是基于生物信息学，构建酶结构模型，利用有理设计、氨基酸位点定点饱和突变、基因序列随机突变等策略，尝试对青霉素G酰化酶SEQ ID NO:1进行改造。经过多轮高通量筛选，得到了多株合成酶活力和热稳定性都明显提高的突变体。具体地，本发明技术方案如下所述。
一种青霉素G酰化酶突变体，其为选自下述的多肽：
(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；
(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有85％以上、优选90％以上、优选95％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且在35℃以上反应环境中酶活力相比SEQ IDNO:3提高的多肽。
MIRDISVIKSGGGNVIMKMKWLISVIILFVFIFPQNLVFAGEDKNEGVKVVRDNFGVAHLYAKNKKDLYEAYGYVMAKDRLFQLEMFRRGNEGTVSEIFGEDYLSKDEQSRRDGYSNKEIKKMIDGLDRQPRELIAKLAEGISRYVDEALKDPDDKLSKEFHEYQFLPQKWTSTDVVRVYMVSMTYLWIITRELKNAEILAKLEHEYGTEVSRKMFDDLVWKNDPGAPTSIVSEGKPKRESSSQSLQKLSSAVIKASEKVGKERENFVQSSEELGLPLKIGSNAAIVGSEKSATGNALLFSGPQAGAVAPGFLYEVGLHAPGFDMEGSGFIGYPFIMFGANNHFALSATAGDGNVTDIFEEKLNTKNSSQYLYKGKWRDMEKRKESFTVKGDNGEKKTVEKIYYRTVHGPVISRDETNKVAYSKYVSFRGTEAQSMSAYMKANWTKNLKEFENAASEYTMSLNWYYADKKGDIAYYHVGRYPVRNNKIDERIPTPGTGEYEWKGFIPFKENPHVINPKNGYVVNWNNKPSKEWVNGEYSYYWGEDNRVQQYINGMEARGKVTLEDTNEINYTASFAQLRANLFKPLLIDVLDKNKSTNGNFTYLIEKLEEWNNLKEDENKDGYYDAGIAAFFDEWWNNLHDKLFMDELGDFYGITKEITDHRYGASLAYKNISKESTNYKWVNVDQEKIIMESTNEVLAKLQSEKGLKAEKWRMPIKTMTFGEKSLIGIPHGYGSMTQIIEMNRGSENHYIEMTPKGPSGFNITPPGQIGFVKKDGTISDHYNDQLVMFAEWKFKPYLFNKKDIYKAATNVSALNMSK(SEQID NO:3)。
本文中，氨基酸序列为SEQ ID NO:3的青霉素G酰化酶突变体编号为AvPGA25，其为野生青霉素G酰化酶SEQ ID NO:1中第58位的脯氨酸突变为丙氨酸(P58A)、第138位的丙苯胺酸突变为亮氨酸(F138L)、第147位的天冬酰胺突变成天冬氨酸(N147D)、第226位的丝氨酸突变成甘氨酸(S226G)、第305位的缬氨酸突变成丙氨酸(V305A)、第307位的苯丙氨酸突变成丙氨酸(F307A)、第352位的酪氨酸突变成天冬氨酸(Y352D)、第445位的丙氨酸突变成苏氨酸(A445T)、第566位的异亮氨酸突变成苏氨酸(I566T)、第601位的酪氨酸突变成苯丙氨酸(Y601F)、第738位的脯氨酸突变成谷氨酰胺(P738Q)、第783位的天冬氨酸突变成天冬酰胺(D783N)的突变体。
上述酶活力是指催化底物6-氨基青霉烷酸(6-APA)与D-型对羟基苯甘氨酸甲酯(DHPGM)反应生成阿莫西林(AMXL)的酶合成活力。
本发明的另一方面还提供了编码上述青霉素G酰化酶突变体的基因。
例如，编码青霉素G酰化酶突变体SEQ ID NO:3的基因可以是核苷酸序列如SEQIDNO:4所示的多核苷酸、或者核苷酸序列与SEQ ID NO:4有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。
本发明还提供了包含上述编码基因的质粒。例如，上述质粒可以是pET载体例如pET22b、pET24a、pET28a，也可以是pSH质粒等其他常用载体。
本发明的另一方面提供了一种用于表达上述青霉素G酰化酶突变体比如SEQIDNO:3的微生物，其基因组中整合了上述的编码基因比如SEQ ID NO:4，或者是转化了上述质粒的微生物。
上述质粒的转化可以通过常规的化学转化法或者电转化方法转入细胞感受态中。上述基因编辑技术例如选自下组：同源双交换，TALEN系统，CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cpf1系统，CRISPR-Cas12系统，CRISPR-BEST系统，MuGENT(multiplex genome editingbynatural transformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)等。
优选地，上述微生物是增殖速度快、适合于表达外源重组蛋白的微生物，例如选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、大肠杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母。优选微生物是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌BL21(DE3)。
上述青霉素G酰化酶突变体或者上述微生物可以用于生产阿莫西林。例如，采用上述青霉素G酰化酶突变体或者上述微生物催化底物6-APA与DHPGM反应，生成阿莫西林。
上述反应体系优选为pH7.0±0.5、优选pH7.0±0.2、更优选pH7.0±0.1。
反应温度优选为25℃-35℃、优选26℃-32℃、更优选28℃-30℃。
可选地，上述反应体系为磷酸盐缓冲液体系。
相比野生青霉素G酰化酶SEQ ID NO:1，本发明经突变筛选出的青霉素G酰化酶突变体催化6-APA与DHPGM反应生成阿莫西林的合成性能显著提升，合成产物/水解产物值S/H最高达到18.1，提高了2.6倍，在侧链与母核比为1.05:1时，母核6-APA的转化率达到99.0％以上，酶的热稳定性指标半衰期提高了10倍，可以进行工业化应用。
具体实施方式
酶催化底物6-APA反应合成阿莫西林时一般会发生两个副反应，即1)水解活化的酰基供体DHPGM和2)水解生成的阿莫西林，导致酰基供体DHPGM和生成的阿莫西林的减少，进而造成了母核转化率偏低，即合成产物/水解产物(S/H)的比值偏低，而且酶自身的特性对S/H值的影响依然是最重要的。利用蛋白质工程来改善青霉素G酰化酶的合成性能已有报道(Alkema,et al,Protein Eng.,13(12),857-63,2000)。
实验发现，大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和无色杆菌来源的野生型青霉素G酰化酶在催化6-APA与DHPGM反应合成阿莫西林时，水解性能也较强，导致S/H值偏低。相对而言来源于粘节杆菌的野生型青霉素G酰化酶水解性能较低，即酶合成活性明显大于酶水解活性，有利于反应的正向控制。本发明通过提高其合成性能，促进了S/H值提高，从而提高了阿莫西林生成率，降低了阿莫西林生产成本。
在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指野生型的青霉素G酰化酶(GenBank号L04471.1，氨基酸序列为SEQ ID NO:1)。类似地，术语“青霉素G酰化酶突变体”、“突变体青霉素G酰化酶”、“突变青霉素G酰化酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指青霉素G酰化酶氨基酸序列中个别氨基酸残基发生突变后形成的突变体比如SEQ ID NO:3。有时为了表述方便起见，在本文中可以将野生酶与其突变体比如SEQ IDNO:3等统称为“青霉素G酰化酶”。
本文中，术语“酶(比)活力”、“酶活性”或“酶合成活力”尤其是指酶催化底物6-APA和DHPGM合成阿莫西林的合成性能，显然不包括水解DHPGM和/或阿莫西林的水解活性，因为本发明不期望该青霉素G酰化酶水解DHPGM和/或阿莫西林。
本文中，上述所用术语“(酶活力)提高”或“增加”表示相较于参考水平提高至少100％，例如相较于参考水平的至少约1倍、至少约2倍、或至少约3倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约20倍的提高。
所述的“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、插入、化学修饰，优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代，则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知，保守性置换的常见情况包括：芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换；疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换，极性氨基酸Q、N之间的相互置换，碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换，酸性氨基酸D、E之间的相互置换，羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外，A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。示例性的保守取代例如可以根据下表来进行，其中在第二列中属于同一个分区的氨基酸可以相互取代，在优选的情况下第三列中同一行的氨基酸可互相取代：
Figure BDA0004102722010000051
“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。
“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10％，同时保留酶活性和/或保留工程化醛缩酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。
“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中，改良的工程化醛缩酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的醛缩酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的醛缩酶多肽中。插入可以是在多肽的内部，或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
为了进行定点突变，可以基于生物信息学技术对青霉素G酰化酶进行立体模型构建(建模)，推断其酶催化活性中心、底物/产物进出通道、刚性/柔性结构区域等，选定可能的结构影响位点并尝试饱和突变。
本发明采用定点突变结合易错PCR随机突变方法对野生型青霉素G酰化酶SEQIDNO:1进行了多轮突变和高通量筛选，获得了一些酶活力显著提高的突变体，包括突变体SEQ ID NO:3以及氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有高度同源性的其他突变酶，这些酶都属于本发明的保护范围。其中突变体SEQ ID NO:3相对于野生酶发生了P58A、F138L、N147D、S226G、V305A、F307A、Y352D、A445T、I566T、Y601F、P738Q、D783N共12个位点突变。
为简要起见，本文中的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于如下表1中：
表1、氨基酸中英文对照及缩写
Figure BDA0004102722010000061
Figure BDA0004102722010000071
本发明的青霉素G酰化酶突变体SEQ ID NO:3的氨基酸数量有818个，结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达青霉素G酰化酶突变体，可以对这些酶的表达基因进行了密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
上述转化体宿主可以是任何适合表达青霉素G酰化酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂用于生产阿莫西林时，本发明的青霉素G酰化酶突变体可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体、死亡菌体、固定化菌体等。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
5L发酵罐的发酵培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4·3H2O、2.31g/L KH2PO4、5g/L甘油，消泡剂0.5g/L，pH7.0-7.5，每罐的发酵液装液量为2L。
5L发酵罐的补料培养基：60％甘油。
酶合成活力测定方法：
取50mL含有50mM的6-APA和60mM的DHPGM的底物反应液(即pH7.0的0.05M的磷酸钾盐缓冲液溶液)，用盐酸将该底物反应液的pH值调至7.0±0.2，然后再加入青霉素G酰化酶，于28℃反应；分别在开始反应后的第20分钟取样，取样量为30μL，并将样品用50mM的磷酸二氢钾溶液稀释100倍，用HPLC测定阿莫西林生成量。
阿莫西林的HPLC检测条件：Agilent1260，色谱柱C18(4.6×250mm，5μm)；流动相A：流动相B＝97.5：2.5(流动相A：50mM KH2PO4,0.1％三乙胺，pH 5.0；流动相B：乙腈)；流速1.0mL/min；检测波长为210nm。
酶合成活力单位(SU)定义为：28℃，pH7.0条件下，每分钟生成1μmol阿莫西林所需的青霉素G酰化酶量为1SU。
合成/水解(S/H)值测定方法：
在100mL烧杯中加入纯化水50mL，加入0.5g的D-HPGM(D-型对羟基苯甘氨酸甲酯)和0.5g的6-APA，均匀搅拌，控制反应温度25℃；以加入100SU纯酶为零点计时，分别于2min、4min、6min、8min、10min、12min取样；通过高效液相HPLC检测各样品中D-HPG(对羟基苯甘氨酸)和AMXL的微摩尔浓度(μmol/mL)；分别做AMXL和D-HPG的一次线性回归曲线，取得各斜率K1和K2；
合成/水解(S/H)＝K1/K2。
S/H值为：反应产物中阿莫西林(AMXL)的摩尔数与副产品对羟基苯甘氨酸(D-HPG)的摩尔数的比值。
卡那霉素(Kan，50μg/mL)根据质粒所携带抗生素基因按照要求使用。
需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。
实施例1：野生青霉素G酰化酶表达菌株的构建
基于粘节杆菌(Arthrobacter viscosus)来源的野生青霉素G酰化酶的氨基酸序列SEQID NO:1(GenBank号L04471.1的95bp-2548bp的核酸序列对应的氨基酸序列)，委托苏州金唯智生物科技有限公司全基因合成其编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得质粒pET-PGA1。
通过电转化将重组质粒pET-PGA1转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达野生青霉素G酰化酶的重组大肠杆菌AvPGA1。
实施例2：定点饱和突变及反应筛选
2.1定点饱和突变库
以质粒pET-PGA1为模板，利用PCR技术构建针对V305位点(酶结构模型中β亚基第24位)的定点饱和突变库。
设计如下引物对PGA1-5/PGA1-3：
正向引物PGA1-5：
5’-TTCAGTGGACCACAANNKGGTTTTGTTGCTCCTGGATT-3’；
反向引物PGA1-3：
5’-AATCCAGGAGCAACAAAACCMNNTTGTGGTCCACTGAA-3’。
以质粒pET-PGA1为模板，进行PCR扩增，获得约2.4kb的青霉素G酰化酶突变体DNA序列。
50μl PCR反应体系包括：10ng质粒(pET-PGA1)模板，50pmol一对引物PGA1-5和PGA1-3，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(Takara)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。
对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)，DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的定点饱和突变库。
2.2突变体库的高通量筛选
挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下培养5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mMIPTG)，在25℃、400rpm条件下培养12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(50mM的6-APA和60mM的DHPGM，调pH值为7.0)，重悬菌体，在28℃、250rpm条件下反应10-30min，HPLC检测阿莫西林浓度。
2.3选择活力明显提升的菌株，提取质粒，并委托苏州金唯智公司进行核酸测序，将基因组中青霉素G酰化酶相关片段与SEQ ID NO:2进行比对，确定青霉素G酰化酶的氨基酸序列改变情况。挑选酶活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株。筛选结果参见表2。
表2、定点饱和突变体库高通量筛选结果
Figure BDA0004102722010000101
备注：“+”代表活力百分比相对各自出发菌株大于0％小于等于50％；“++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于50％小于等于100％；“+++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于100％小于等于200％；“++++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于200％。
其中，野生酶发生V305A突变后形成的突变体PGA5(对应于突变菌株AvPGA5)的酶合成活力提升幅度较大，将其用于下一轮的易错PCR随机突变筛选。
实施例3：第1轮到第2轮随机突变点文库建立及高通量反应筛选
3.1易错PCR法构建随机突变点库
基于青霉素G酰化酶突变体PGA5的氨基酸序列，按照实施例1的方法构建其表达质粒pET-PGA5、表达青霉素G酰化酶突变体PGA5的重组大肠杆菌AvPGA5。
以质粒pET-PGA5为模板，利用易错PCR技术构建随机突变体文库。
设计如下引物对PGA5-5/PGA5-3：
正向引物PGA5-5：5’-ATGATTCGTGATATAAGTGTTATAA-3’；
反向引物PGA5-3：5’-CTTACTCATATTTAATGCGCTT-3’。
以质粒pET-PGA5为模板，进行PCR扩增，获得约2.4kb的青霉素G酰化酶突变体DNA序列。
50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒(pET-ATA64)模板，50pmol一对引物PGA5-5和PGA5-3，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(Takara)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。
对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)。以质粒pET-PGA5为模板，以约2.0kb的回收产物(随机突变片段)作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kb，25个循环；68℃10min。DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
3.2突变体库的高通量筛选
挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下培养5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mMIPTG)，在25℃、400rpm条件下培养12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(50mM的6-APA和60mM的DHPGM，调pH值为7.0)，重悬菌体，在28℃、250rpm条件下反应10-30min，HPLC检测阿莫西林浓度。
3.2选择活力明显提升的菌株进行核酸测序，确定氨基酸突变位点，且酶活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株。委托苏州金唯智生物科技有限公司对酶活力最高的菌株进行基因组测序比对，确定其氨基酸序列改变情况。筛选结果参见表3。
表3、第1轮和第2轮随机突变体库高通量筛选结果
Figure BDA0004102722010000121
备注：“+”代表活力百分比相对各自出发菌株大于0％小于等于50％；“++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于50％小于等于100％；“+++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于100％小于等于200％。
其中，酶突变体PGA5发生F138L、Y352D、P58A、N147D、A445T突变后形成的突变体PGA13(对应于突变菌株AvPGA13)的酶合成活力提升幅度较大，将其用于下一轮的易错PCR随机突变筛选。
实施例4：第3轮到第5轮随机突变点文库建立及高通量反应筛选
4.1易错PCR法构建随机突变点库
基于青霉素G酰化酶突变体PGA13的氨基酸序列，按照实施例1的方法构建其表达质粒pET-PGA13、表达青霉素G酰化酶突变体PGA13的重组大肠杆菌AvPGA13。
参照实施例3.1的方法，以质粒pET-PGA13为模板，利用易错PCR技术进行随机突变点文库的构建。
4.2突变体库的高通量筛选
挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下培养5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mMIPTG)，在25℃、400rpm条件下培养12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(50mM的6-APA和60mM的DHPGM，调pH值为7.0)，重悬菌体，在28℃、250rpm条件下反应10-30min，HPLC检测阿莫西林浓度。
4.3选择活力明显提升的菌株进行核酸测序，确定氨基酸突变位点，且酶活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株。委托苏州金唯智生物科技有限公司对酶活力最高的菌株进行基因组测序比对，确定其氨基酸序列改变情况。筛选结果参见表4。
表4、第3轮到第5轮随机突变体库高通量筛选结果
Figure BDA0004102722010000131
备注：“+”代表活力百分比相对各自出发菌株大于0％小于等于50％；“++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于50％小于等于100％；“+++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于100％小于等于200％。
其中，酶突变体PGA22(对应于突变菌株AvPGA22)的酶合成活力提升幅度较大，将其用于下一轮的易错PCR随机突变筛选，以期获得酶活力能进一步提升的突变体。
实施例5：第6轮热稳定性高通量反应筛选
5.1易错PCR法构建随机突变点库
基于青霉素G酰化酶突变体PGA22的氨基酸序列，按照实施例1的方法构建其表达质粒pET-PGA22、表达青霉素G酰化酶突变体PGA22的重组大肠杆菌AvPGA22。
参照实施例3.1的方法，以质粒pET-PGA22为模板，利用易错PCR技术进行随机突变点文库的构建。
5.2突变体库的高通量筛选
挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下培养5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mMIPTG)，在25℃、400rpm条件下培养12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液，使用100μl，pH7.0的PBS重悬菌体，55℃热处理30min，每孔加100μL酶反应液(100mM的6-APA和120mM的DHPGM，调pH值为7.0)，重悬菌体，在28℃、250rpm条件下反应10-30min，HPLC检测阿莫西林浓度。
5.3选择活力明显提升的菌株进行核酸测序，确定氨基酸突变位点。委托苏州金唯智生物科技有限公司对酶活力最高的菌株进行基因组测序比对，确定其氨基酸序列改变情况。筛选结果参见表5。
表5、第6轮热稳定性随机突变库高通量筛选结果
Figure BDA0004102722010000141
备注：“+”代表活力百分比相对各自出发菌株大于0％小于等于50％；“++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于50％小于等于100％；“+++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于100％小于等于200％。
经过多轮突变和筛选，得到较高酶合成活力的酶突变体PGA25(对应于突变菌株AvPGA25)，其相对于野生酶发生了12个位点的突变，氨基酸序列是SEQ ID NO:3。
按照实施例1的方法构建表达青霉素G酰化酶突变体PGA25的重组大肠杆菌AvPGA25，对PGA25催化6-APA和DHPGM反应合成阿莫西林的工业化应用可行性做进一步考察。
实施例6：青霉素G酰化酶表达菌株的发酵培养
使用5L发酵罐，分别对菌株AvPGA1、AvPGA22和AvPGA25进行发酵罐培养。挑取单菌落至5mL含有Kan的液体LB培养基中，在37℃、220rpm过夜培养。次日，按照体积浓度为5v/v％的接种量转接至含有100mL液体TB培养基的摇瓶中，37℃、220rpm条件下培养至OD600nm达到6后，作为种子液转接到5L发酵罐。接种后400～800rpm/min、37℃条件下培养，控制溶氧在20～30％范围内。当菌体OD600nm达到20后，加入IPTG诱导青霉素G酰化酶表达，IPTG的终浓度为0.2mM，25-28℃继续培养培养16-24h，离心收集菌体。全发酵过程利用氨水控制pH值为6.8～7.2，控制通气量在2.5～3.5范围内。
发酵结束后，于4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体，冻存备用。
实施例7：酶的提取纯化
分别取AvPGA1、AvPGA22和AvPGA25的冻融菌体，按照1：2(g：mL)比例用裂解缓冲液(pH 8.0，100mM磷酸钠，5％甘油)重悬菌体，超声波脉冲破壁(每个循环为工作15秒，间歇30秒，功率5W)，工作30个循环；也可利用French Pressure细胞压榨机破碎细胞。
细胞破碎液10000rpm离心1h，回收上清液，获得粗酶液，-20℃保存。在4℃条件下进行亲和纯化操作。
量取5mL预处理的亲和载体FP-IDA-Ni2+，装入纯化柱(Φ10×200)中。样品按照1.0BV/h速度过柱。用3-5BV的Washing缓冲液以1.0BV/h流速去除杂蛋白，同时利用蛋白核酸检测仪在280nm条件下检测流出液的蛋白含量，直到Washing缓冲液澄清以及蛋白核酸检测仪的数值不再变化为止，最后在蛋白核酸检测仪280nm的监控下，用约1-2BV的Elution缓冲液以1-2BV/h的速度洗脱目的酶，即得PGA1、PGA22或PGA25的纯酶，纯酶液于4℃保存备用。
实施例8：酶的热稳定性测定
采用在设定温度下的酶活力半衰期作为指标来评价青霉素G酰化酶的稳定性。
酶的半衰期t1/2是指在给定温度下，初始活性降低50％所需的时间。作为酶的热稳定性常用表征参数之一，半衰期t1/2值越大，代表酶热稳定性越好。
取100μl PGA1、PGA22和PGA25纯酶液分别在65℃下间隔10min保温不同时间0、10、20、30、40、50、60min直至120min，之后分别用热处理后的PGA1、PGA22和PGA25纯酶测定酶合成活力，以保温0min的初始活性为100％。结果见表6。
表6：酶半衰期测试结果
Figure BDA0004102722010000161
由表6可知，热疲劳试验条件下，突变酶PGA22和PGA25的热稳定性相比野生酶提高了1倍多，具体原因有待于进一步研究。热稳定性提高能够进一步促进突变酶PGA22和PGA25在阿莫西林合成中的实际应用。
实施例9：纯化的突变酶PGA25合成阿莫西林的应用实验
在100mL反应体系中，分别用野生酶PGA1和突变酶PGA25的纯化酶于30℃催化6-APA和D-HPGM合成阿莫西林。总反应体系包括：250mM的6-APA和262.5mM的D-HPGM的底物(DHPGM与6-APA的摩尔浓度比为1.05:1)，将其pH调至7.0±0.20，1200SU纯酶。
HPLC检测结果显示，反应90min后，PGA25催化反应的6-APA转化率超过99％。而在相同转化的条件下，野生酶PGA1催化6-APA转化率只有45％。经计算，野生酶PGA1的S/H值为5.03；与野生酶相比，突变体PGA25的S/H值为18.1，是野生酶PGA1的3.60倍。
上述实验证明青霉素G酰化酶突变体PGA25酶合成活性和热稳定性明显高于野生酶PGA1，显示了工业化应用潜力。

Claims (10)

1.一种青霉素G酰化酶突变体，其为选自下述的多肽：
(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；
(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上同源性、且在35℃以上反应环境中的酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。
2.如权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述酶活力是指催化底物6-氨基青霉烷酸与D-型对羟基苯甘氨酸甲酯反应生成阿莫西林的酶合成活力。
3.编码如权利要求1或2所述青霉素G酰化酶突变体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码青霉素G酰化酶突变体SEQ ID NO:3的基因是核苷酸序列为SEQ ID NO:4的多核苷酸、或者核苷酸序列与SEQ ID NO:4有90％以上同源性的多核苷酸。
5.包含如权利要求4所述基因的质粒。
6.一种用于表达如权利要求1或2所述青霉素G酰化酶突变体的微生物，其特征在于，基因组中整合了如权利要求4所述的基因，或者转化了如权利要求5所述质粒的微生物。
7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。
8.如权利要求1所述青霉素G酰化酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产阿莫西林中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，采用如权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体或者如权利要求6所述的微生物催化底物6-氨基青霉烷酸与D型对羟基苯甘氨酸甲酯反应，生成阿莫西林。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，反应体系pH7.0±0.5，反应温度25℃-35℃。
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