CN109576317B - 酶法制备r-3-氨基丁酸的方法 - Google Patents

酶法制备r-3-氨基丁酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种酶法制备R‑3‑氨基丁酸的方法。具体地，本发明提供了一种高效、高立体选择性的R‑3‑氨基丁酸制备方法。该方法利用来自大肠杆菌、具有立体异构催化活性的天冬氨酸酶，将丁烯酸高效地转化为R‑3‑氨基丁酸，反应仅24h后转化率高达≥98％，ee值≥99.9％，极大地提高转化效率，缩短反应时间，降低生产成本。本发明方法具有收率高、转化率高、成本低、生产周期短、工艺简单、易于放大、适合进行大生产等诸多优点。

Description

酶法制备R-3-氨基丁酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及酶法制备R-3-氨基丁酸的方法。
背景技术
度鲁特韦(Dolutegravir)是葛兰素史克旗下抗HIV新药，2013年FDA批准其上市并承认了这种药物的突破性。R-3-氨基丁酸是生产度鲁特韦的重要中间体，目前现有的制备方法主要有化学合成法和酶催化法。
化学合成法，如Tetrahedron:Asymmetry 18(2007)1554-1566报道了由甲醛为原料，经Horner–Wadsworth–Emmons反应得到2-丁烯酸叔丁酯，再经加成，催化氢化，可得到R-3-氨基丁酸叔丁酯，最后水解得到R-3-氨基丁酸。但是此反应需要-78℃低温，反应条件苛刻，操作困难。
Figure BDA0001424102880000011
又如CN104370755公开了由乙酰乙酸乙酯为原料，与乙酰胺缩合，经不对称氢化，再经水解得到R-3-氨基丁酸的方法，但是此方法需要用到昂贵的不对称氢化催化剂，生产成本较高，重金属污染，不利用工业化大生产。
Figure BDA0001424102880000012
酶催化法，如ChemCatChem 2016,8,1226-1232报道的以消旋的3-氨基丁酸叔丁基酯为原料，经来源于南极假丝酵母的脂肪酶A(CLA-A)立体选择性催化得到R型3-丁酰胺基丁酸叔丁酯，再经CAL-A催化水解得到R-3-氨基丁酸。但是此方法转化率低，未反应原料浪费。
Figure BDA0001424102880000013
另有，ChemCatChem,2014,6,965-968中报道了来源于芽孢杆菌YM55-1的天冬氨酸酶突变体BSASP-C6催化丁烯酸制备R-3-氨基丁酸的方法，但是此方法中，反应100个小时的转化率仅为60％，反应时间长，转化率低；且随着反应时间的增加，产物的ee值降低。
因此，本领域迫切需要开发环境友好、高效、高立体选择性的R-3-氨基丁酸制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、高立体选择性的R-3-氨基丁酸制备方法，所述方法能够显著提高R-3-氨基丁酸的ee值、转化率，缩短反应时间。
本发明的第一方面，提供了一种生产R-3-氨基丁酸的方法，所述方法包括步骤：
(1)在反应体系中，以丁烯酸为底物，在天冬氨酸酶催化下，进行反应式I所示的立体异构催化反应，从而形成R-3-氨基丁酸；
Figure BDA0001424102880000021
反应式I
(2)任选地从所述步骤(1)的反应后的反应体系中分离出R-3-氨基丁酸；
其中，所述天冬氨酸酶来自大肠杆菌。
在另一优选例中，所述天冬氨酸酶为野生型或突变体。
在另一优选例中，所述R-3-氨基丁酸的ee值≥99.5％，较佳地≥99.7％，更佳地≥99.8％，最佳地≥99.9％。
在另一优选例中，所述反应的转化率≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，又更佳地≥99％，最佳地100％。
在另一优选例中，所述突变体在对应于野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列中存在选自下组的氨基酸突变：第204位苏氨酸(T)、第338位蛋氨酸(M)、第341位赖氨酸(K)、第343位天冬酰胺(N)、或其组合。
在另一优选例中，所述突变体中的突变选自下组：T204C、M338I、K341M、N343C、或其组合。
在另一优选例中，所述野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
在另一优选例中，所述天冬氨酸酶选自下组：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示的多肽；
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示的多肽；或
(c)将SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a)或(b)所述多肽功能的由SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述天冬氨酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:3所示的序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。
在另一优选例中，所述天冬氨酸酶为选自下组的形式：静息细胞、菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液、或其组合。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述天冬氨酸酶的浓度为0.5-5U/ml。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述丁烯酸的浓度为100mM-1000mM。
在另一优选例中，所述反应体系中，还存在铵源。
在另一优选例中，所述铵源选自下组：氨水、NH4 +盐(如NH4Cl)、或其组合
在另一优选例中，所述铵源与丁烯酸的摩尔比为1:1-1:3。
在另一优选例中，步骤(a)中，反应体系的pH为7.0-9.5，较佳地，7.5-9.0，更佳地，8.0-8.5；
在另一优选例中，步骤(a)中，反应温度20-60℃，较佳地，30-50℃，更佳地，35-45℃
在另一优选例中，步骤(a)中，反应时间0.5h-72h，较佳地，2h-48h，更佳地，4h-24h。
本发明的第二方面，提供了一种天冬氨酸酶的用途，用于制备一制剂，所述制剂用于催化以下立体异构催化反应：
Figure BDA0001424102880000031
反应式I
其中，所述天冬氨酸酶来自大肠杆菌。
本发明的第三方面，提供了一种R-3-氨基丁酸生产菌株，所述菌株表达多肽，所述多肽为外源的来自大肠杆菌的天冬氨酸酶，并用于催化以下立体异构催化反应：
Figure BDA0001424102880000032
反应式I。
在另一优选例中，所述天冬氨酸酶为野生型或突变体。
在另一优选例中，所述突变体在对应于野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列中存在选自下组的氨基酸突变：第204位苏氨酸(T)、第338位蛋氨酸(M)、第341位赖氨酸(K)、第343位天冬酰胺(N)、或其组合。
在另一优选例中，所述的突变选自下组：T204C、M338I、K341M、N343C、或其组合。
在另一优选例中，所述生产菌株是细菌。优选地，所述生产菌株是大肠杆菌。更优选地，所述生产菌株是E.coli BL21(DE3)。
本发明的第四方面，提供了一种生产R-3-氨基丁酸的方法，所述方法包括步骤：
1)采用生产条件培养本发明第三方面所述的生产菌株，从而得到R-3-氨基丁酸；
2)任选地，从1)的培养体系中分离获得R-3-氨基丁酸。
本发明的第五方面，提供了一种具有立体异构催化活性的天冬氨酸酶，所述天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中，所述天冬氨酸酶为选自下组的形式：菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液、或其组合。
本发明的第六方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第五方面所述的天冬氨酸酶。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:3所示多肽的多核苷酸。
(b)序列如SEQ ID NO.:4所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:4所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)，且编码SEQ ID NO.:3所示多肽的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地发现一种高效、高立体选择性的R-3-氨基丁酸制备方法。该方法利用来自大肠杆菌、具有立体异构催化活性的天冬氨酸酶，高效、高立体选择性地将丁烯酸转化为R-3-氨基丁酸。尤其是本发明的突变型天冬氨酸酶具有非常优异的高立体选择性和高转化率，从而极大地提高转化效率，缩短反应时间，降低生产成本。实验表明，反应仅24h后转化率高达≥98％，ee值≥99.9％。本发明方法具有收率高、转化率高、成本低、生产周期短、工艺简单、易于放大、适合进行大生产等诸多优点。在此基础上完成了本发明。
术语
ee值
如本文所用，“ee值”或“对映体过量”用来表征手性分子中一个对映异构体相对于另一个对映异构体的过量值，通常用百分数表示。
天冬氨酸酶
本文所用的术语“酶”、“多肽”、“天冬氨酸酶”、“本发明多肽”、“本发明天冬氨酸酶”或“AspA”具有相同的意义，在本文可以互换使用，均是指来自大肠杆菌，具有立体异构催化丁烯酸产生R-3-氨基丁酸活性的蛋白。优选地，所述的本发明多肽指本发明第一方面中所限定的酶。
天冬氨酸酶是脱氨基酶的一种，为可逆地催化L-天冬氨酸脱氨基生成延胡索酸反应的裂解酶，EC 4.3.1.1，广泛存在于细菌、酵母中，高等植物(例如豆类的芽或叶等)中也含有低浓度的天冬氨酸酶，在高等动物中则无此酶。
本发明中，来自大肠杆菌的天冬氨酸酶，定义为AspA。
本发明中，芽孢杆菌中天冬氨酸酶定义为AspB，突变体为BSASP-C6。
基于现有技术的知识，本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。
在具体的实施方式中，本发明的天冬氨酸酶是野生型或突变体。
在优选的实施方式中，所述突变体在对应于野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列中存在选自下组的氨基酸突变：第204位苏氨酸(T)、第338位蛋氨酸(M)、第341位赖氨酸(K)、第343位天冬酰胺(N)、或其组合。
在另一优选例中，所述的突变选自下组：T204C、M338I、K341M、N343C、或其组合。
在另一优选例中，所述野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
在另一优选例中，所述天冬氨酸酶选自下组：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示的多肽；
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示的多肽；或
(c)将SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a)或(b)所述多肽功能的由SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述天冬氨酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:3所示的序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。
在另一优选例中，所述天冬氨酸酶为选自下组的形式：菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液、或其组合。
在具体的实施方式中，所述天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示，编码该多肽的核酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
在具体的实施方式中，所述天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示，编码该多肽的核酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
在本发明中，所述天冬氨酸酶包括与氨基酸序列SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:3所示的多肽相比，有至多20个、较佳地至多10个，又佳地至多8个，再佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的突变体。这些保守性变异的突变体可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。
表A
初始残基 代表性的取代残基 优选的取代残基
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是80％以上，优选90％以上，更优选95％-98％，最优选99％以上。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
生产R-3-氨基丁酸的方法
本发明提供一种高效、高立体选择性的R-3-氨基丁酸制备方法。本发明的方法如本发明第一方面所述，利用来自大肠杆菌、具有立体异构催化活性的天冬氨酸酶，高效、高立体选择性地将丁烯酸转化为R-3-氨基丁酸，极大地提高转化效率，缩短反应时间，降低生产成本。
在优选的实施方式中，所述生产R-3-氨基丁酸的方法包括步骤：
(1)在反应体系中，以丁烯酸为底物，在天冬氨酸酶催化下，进行反应式I所示的立体异构催化反应，从而形成R-3-氨基丁酸；
Figure BDA0001424102880000071
反应式I
(2)任选地从所述步骤(1)的反应后的反应体系中分离出R-3-氨基丁酸；
其中，所述天冬氨酸酶来自大肠杆菌。
在另一优选例中，所述R-3-氨基丁酸的ee值≥99.5％，较佳地≥99.7％，更佳地≥99.8％，最佳地≥99.9％。
在另一优选例中，所述反应的转化率≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，又更佳地≥99％，最佳地100％。
在另一优选的实施方式中，所述生产R-3-氨基丁酸方法包括：
1)采用生产条件培养本发明的R-3-氨基丁酸生产菌株，从而得到R-3-氨基丁酸；
2)任选地，从1)的培养体系中分离获得R-3-氨基丁酸。
天冬氨酸酶的用途
本发明人意外地发现本发明的天冬氨酸酶可用于制备一制剂，所述制剂用于催化以下立体异构催化反应：
Figure BDA0001424102880000081
反应式I。
R-3-氨基丁酸生产菌株
本发明人还提供了表达本发明的天冬氨酸酶的工程菌株，所述工程菌株(或其表达的本发明天冬氨酸酶、或其固定化酶)能够将丁烯酸高效、高立体异构地转化为R-3-氨基丁酸，其转化率≥98％，R-3-氨基丁酸的手性ee值≥99.9％。
在另一优选例中，所述生产菌株是细菌。优选地，所述生产菌株是大肠杆菌。更优选地，所述生产菌株是E.coli BL21(DE3)。
本发明的主要优点：
本发明能够将丁烯酸高效、高立体异构地转化为R-3-氨基丁酸，反应仅24h后转化率高达≥98％，ee值≥99.9％，极大地提高转化效率，缩短反应时间，降低生产成本。
本发明的方法转化率高、成本低、收率高、生产周期短、工艺简单、易于放大、适合进行大生产，获得的R-3-氨基丁酸ee值极高。在R-3-氨基丁酸以及以R-3-氨基丁酸为前体的下游产物的生产中具有极大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明所用试剂和原料均市售可得。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。
实施例
实施例1.AspA野生型催化合成R-3-氨基丁酸及检测
1.1AspA野生型酶液的制备
根据AspA野生型的氨基酸序列(SEQ ID NO.:5)，合成编码AspA野生型酶的脱氧核糖核酸序列(SEQ ID NO.:6)，酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。菌种接种TB培养基于37℃，摇床200rpm培养至OD600值达到4.0时，加入IPTG浓度0.1mM诱导，温度调至28℃下继续培养12小时，4℃下离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)重悬细胞，均质破碎，得到AspA野生型酶液。
AspA野生型的氨基酸序列：
CLKQIIGSLKKKVHMSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRTQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIMPAKVNPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ(SEQ ID NO.:5)
AspA野生型核酸编码序列：
TGCCTGAAACAGATCATCGGTTCTCTGAAAAAAAAAGTTCACATGTCTAACAACATCCGTATCGAAGAAGACCTGCTGGGTACCCGTGAAGTTCCGGCTGACGCTTACTACGGTGTTCACACCCTGCGTGCTATCGAAAACTTCTACATCTCTAACAACAAAATCTCTGACATCCCGGAATTCGTTCGTGGTATGGTTATGGTTAAAAAAGCTGCTGCTATGGCTAACAAAGAACTGCAGACCATCCCGAAATCTGTTGCTAACGCTATCATCGCTGCTTGCGACGAAGTTCTGAACAACGGTAAATGCATGGACCAGTTCCCGGTTGACGTTTACCAGGGTGGTGCTGGTACCTCTGTTAACATGAACACCAACGAAGTTCTGGCTAACATCGGTCTGGAACTGATGGGTCACCAGAAAGGTGAATACCAGTACCTGAACCCGAACGACCACGTTAACAAATGCCAGTCTACCAACGACGCTTACCCGACCGGTTTCCGTATCGCTGTTTACTCTTCTCTGATCAAACTGGTTGACGCTATCAACCAGCTGCGTGAAGGTTTCGAACGTAAAGCTGTTGAATTCCAGGACATCCTGAAAATGGGTCGTACCCAGCTGCAGGACGCTGTTCCGATGACCCTGGGTCAGGAATTCCGTGCTTTCTCTATCCTGCTGAAAGAAGAAGTTAAAAACATCCAGCGTACCGCTGAACTGCTGCTGGAAGTTAACCTGGGTGCTACCGCTATCGGTACCGGTCTGAACACCCCGAAAGAATACTCTCCGCTGGCTGTTAAAAAACTGGCTGAAGTTACCGGTTTCCCGTGCGTTCCGGCTGAAGACCTGATCGAAGCTACCTCTGACTGCGGTGCTTACGTTATGGTTCACGGTGCTCTGAAACGTCTGGCTGTTAAAATGTCTAAAATCTGCAACGACCTGCGTCTGCTGTCTTCTGGTCCGCGTGCTGGTCTGAACGAAATCAACCTGCCGGAACTGCAGGCTGGTTCTTCTATCATGCCGGCTAAAGTTAACCCGGTTGTTCCGGAAGTTGTTAACCAGGTTTGCTTCAAAGTTATCGGTAACGACACCACCGTTACCATGGCTGCTGAAGCTGGTCAGCTGCAGCTGAACGTTATGGAACCGGTTATCGGTCAGGCTATGTTCGAATCTGTTCACATCCTGACCAACGCTTGCTACAACCTGCTGGAAAAATGCATCAACGGTATCACCGCTAACAAAGAAGTTTGCGAAGGTTACGTTTACAACTCTATCGGTATCGTTACCTACCTGAACCCGTTCATCGGTCACCACAACGGTGACATCGTTGGTAAAATCTGCGCTGAAACCGGTAAATCTGTTCGTGAAGTTGTTCTGGAACGTGGTCTGCTGACCGAAGCTGAACTGGACGACATCTTCTCTGTTCAGAACCTGATGCACCCGGCTTACAAAGCTAAACGTTACACCGACGAATCTGAACAG(SEQ ID NO.:6)
1.2AspA野生型催化合成R-3-氨基丁酸
100ml反应体系中，37℃下，加入100mM HEPES缓冲液,pH 8.0,终浓度为2mM的MgCl2,300mM丁烯酸,300mM NH4Cl，AspA野生型酶液20ml。
HPLC检测反应进程，反应至24h结束，转化率＜5％。
转化率的计算：转化率也叫物料转化率，数值上等于发酵过程中所消耗的丁烯酸与发酵开始时丁烯酸的总量之比值，常用百分比表示，可以是摩尔比(mol％)，也可以是重量比(wt％)。
实施例2.AspA突变体1催化合成R-3-氨基丁酸及检测
2.1AspA突变体1酶液的制备
AspA突变体1的4个突变位点的氨基酸全部突变(参见表1和表2)。根据AspA突变体1的氨基酸序列(SEQ ID NO.:3)，合成编码AspA突变体1酶的脱氧核糖核酸序列(SEQ IDNO.:4)，酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。菌种接种TB培养基于37℃，摇床200rpm培养至OD600值达到4.0时，加入IPTG浓度0.1mM诱导，温度调至28℃下继续培养12小时，4℃下离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)重悬细胞，均质破碎，得到AspA突变体1酶液。
AspA突变体1的氨基酸序列：
CLKQIIGSLKKKVHMSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRCQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIIPAMVCPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ(SEQ ID NO.:3)
AspA突变体1核酸编码序列：
TGCCTGAAACAAATCATTGGTAGCCTGAAGAAAAAAGTGCACATGAGCAATAACATTCGCATCGAAGAGGATCTGCTGGGTACACGTGAAGTGCCGGCAGATGCCTACTACGGTGTGCATACACTGCGCGCCATCGAAAATTTTTACATCAGCAATAATAAAATCAGCGATATCCCGGAATTCGTGCGCGGCATGGTTATGGTGAAAAAAGCCGCCGCAATGGCCAACAAGGAACTGCAGACCATTCCGAAGAGTGTGGCAAACGCCATTATCGCCGCCTGTGATGAAGTGCTGAACAATGGTAAATGCATGGATCAGTTTCCGGTGGACGTGTATCAAGGCGGCGCCGGTACCAGCGTGAACATGAACACCAATGAGGTGCTGGCCAACATTGGTCTGGAGCTGATGGGTCACCAGAAAGGCGAATACCAGTACCTGAACCCGAACGATCACGTGAACAAGTGTCAGAGCACAAATGACGCATACCCGACAGGCTTTCGTATTGCCGTGTACAGTAGCCTGATCAAGCTGGTGGATGCCATCAATCAGCTGCGTGAAGGCTTCGAGCGTAAGGCCGTTGAATTTCAGGACATCCTGAAAATGGGTCGTTGTCAGCTGCAGGATGCAGTGCCGATGACCCTGGGTCAGGAATTTCGCGCATTCAGCATCCTGTTAAAAGAGGAAGTGAAAAACATCCAGCGTACCGCCGAACTGCTGCTGGAAGTTAACCTGGGTGCCACCGCCATCGGCACAGGCCTGAATACCCCGAAAGAGTATAGCCCGCTGGCCGTTAAAAAACTGGCAGAGGTGACCGGTTTCCCGTGTGTGCCGGCAGAGGATCTGATCGAAGCAACCAGCGATTGCGGTGCTTATGTTATGGTGCATGGTGCCCTGAAACGCCTGGCCGTTAAGATGAGTAAAATCTGTAATGACCTGCGTCTGCTGAGCAGCGGTCCTCGTGCAGGCCTGAACGAGATCAACCTGCCGGAACTGCAGGCCGGCAGTAGCATCATCCCGGCCATGGTTTGCCCTGTGGTGCCGGAGGTGGTGAATCAGGTGTGCTTCAAGGTGATCGGCAATGACACCACCGTGACAATGGCCGCAGAGGCAGGCCAGCTGCAACTGAACGTGATGGAGCCGGTGATTGGCCAGGCCATGTTTGAAAGCGTGCACATCTTAACCAACGCCTGCTACAACCTGCTGGAGAAATGCATCAATGGTATTACCGCCAACAAAGAAGTTTGCGAGGGTTACGTGTACAACAGCATTGGCATCGTGACCTATCTGAATCCGTTTATTGGCCATCACAACGGCGACATTGTGGGCAAGATTTGCGCAGAGACCGGCAAAAGTGTTCGCGAAGTGGTTCTGGAGCGCGGTTTACTGACCGAGGCCGAACTGGATGACATTTTCAGCGTTCAAAATCTGATGCACCCGGCCTACAAAGCCAAACGCTACACAGACGAAAGCGAGCAA(SEQ ID NO.:4)
测定酶活为5.1U/ml。AspA突变体1酶的酶活U定义为：每分钟从丁烯酸催化形成1微摩尔产物R-3-氨基丁酸的酶量为一个酶活单位，即1U。
测定方法：取100ml三角瓶，加入16mL反应液(pH8.0)，反应液中含有300mmol/L丁烯酸，4mmol/L MgCl2，450mmol/L氯化铵，100mmol/L HEPES缓冲液，密闭，将反应液和酶液分别放于42度摇床温育5-10min。向反应液中加入AspA突变体酶液4ml，立即放于42℃200rpm转速的摇床中开始反应。30min后取样1ml，加入1ml乙腈终止反应，离心除去蛋白，上清液用2，4-二硝基氟苯衍生，HPLC分析(根据峰面积计算酶活)。
2.2AspA突变体1催化合成R-3-氨基丁酸
100ml反应体系中，37℃下，加入100mM HEPES缓冲液,pH 8.0,终浓度为2mM的MgCl2,300mM丁烯酸,300mM NH4Cl，AspA突变体1酶液20ml。
HPLC检测反应进程，反应至24h结束，转化率≥98％，ee值为99.9％。
实施例3.AspA突变体2-6催化合成R-3-氨基丁酸及检测
3.1AspA突变体2-12酶液的制备
AspA突变体2-12的具体突变情况如表1和表2中所示，其中AspA突变体2-5为单氨基酸突变，AspA突变体6-8为2个突变位点的氨基酸突变，AspA突变体9-12为3个突变位点的氨基酸发生突变。
根据AspA突变体2-12的氨基酸序列，分别合成编码各AspA突变体酶的脱氧核糖核酸序列，酶液制备方法同实施例2.1。
表1突变氨基酸的位置及改变
位置 野生型 突变体
突变位点1(第204位氨基酸) 苏氨酸(T) 半胱氨酸(C)
突变位点2(第338位氨基酸) 蛋氨酸(M) 异亮氨酸(I)
突变位点3(第341位氨基酸) 赖氨酸(K) 蛋氨酸(M)
突变位点4(第343位氨基酸) 天冬酰胺(N) 半胱氨酸(C)
表2各突变体酶催化合成R-3-氨基丁酸的转化率
突变位点1 突变位点2 突变位点3 突变位点4 转化率
野生型 - - - - *
突变体1 + + + + ****
突变体2 + - - - *
突变体3 - + - - *
突变体4 - - + - *
突变体5 - - - + *
突变体6 + - + - **
突变体7 - + + - **
突变体8 - - + + **
突变体9 + + - + **
突变体10 + - + + ***
突变体11 - + + + ***
突变体12 + + + - ***
注：“+”代表突变，“-”代表未突变；
“*”代表转化率＜10％，“**”代表转化率10％-30％，“***”代表转
化率30％-70％，“****”代表转化率＞70％。
3.2AspA突变体2-12催化合成R-3-氨基丁酸
实验方法同实施例2.2，用AspA突变体2-12酶液分别替换AspA突变体1酶液。
结果如表2所示。实验结果表明，反应24h后，AspA野生型(实施例1)和突变体1(实施例2)和突变体2-12(实施例3)均具有一定的立体选择性(可选择性地催化形成R-3-氨基丁酸)，并且反应时间均明显缩短。此外，就转化率和反应速度而言，突变体1(四位点的突变体)显著优于三位点的突变体(如突变体9-12)，也优于二位点的突变体(如突变体6-8)、单位点突变体(如突变体2-5)和野生型。
对比例1.来源于芽孢杆菌的AspB突变体催化合成R-3-氨基丁酸及检测
1.1芽孢杆菌AspB突变体酶液的制备
参考ChemCatChem,2014,6,965-968中的方法制备AspB突变体酶液，AspB突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示，核酸编码序列如SEQ ID NO.:2所示。
AspB突变体的氨基酸序列：
NTDVRIEKDFLGEKEIPKDAYYGVQTIRATENFPITGYRIHPELIKSLGIVKKSAALANMEVGLLDKEVGQYIVKAADEVIEGKWNDQFIVDPIQGGAGTSINMNANEVIANRALELMGEEKGNYSKISPNSHVNMSQSTNDAFPTATHIAVLSLLNQLIETTKYMQQEFMKKADEFAGVIKMGRCHLQDAVPILLGQEFEAYARVIARDIERIANTRNNLYDINMGATAVGTGLNADPEYISIVTEHLAKFSGHPLRSAQHLVDATQNTDCYTEVSSALKVCMINMSKIANDLRLMASGPRAGLSEIVLPARQPGSSIIPGMVCPVMPEVMNQVAFQVFGNDLTITSASEAGQFELNVMEPVLFFNLIQSISIMTNVFKSFTENCLKGIKANEERMKEYVEKSIGIITAINPHVGYETAAKLAREAYLTGESIRELCIKYGVLTEEQLNEILNPYEMIHPGIAGRK(SEQ ID NO.:1)
AspB突变体核酸编码序列：
AACACCGATGTGCGCATTGAGAAGGACTTCCTGGGTGAAAAGGAAATCCCGAAGGATGCCTATTACGGCGTGCAGACCATCCGTGCCACAGAGAACTTTCCTATCACCGGCTACCGCATCCATCCGGAACTGATTAAGAGCCTGGGCATTGTGAAGAAAAGCGCCGCACTGGCAAACATGGAGGTGGGTCTGCTGGATAAGGAAGTGGGTCAGTACATCGTGAAGGCCGCCGACGAAGTTATTGAAGGTAAGTGGAACGATCAGTTTATCGTGGACCCGATTCAGGGCGGCGCAGGTACAAGCATTAATATGAACGCCAACGAAGTGATCGCAAACCGCGCCCTGGAACTGATGGGTGAGGAAAAGGGCAACTATAGCAAGATCAGCCCGAACAGCCACGTTAACATGAGCCAGAGCACCAATGATGCATTTCCGACCGCAACCCATATTGCCGTGCTGAGTCTGCTGAATCAGCTGATCGAGACCACCAAGTACATGCAGCAGGAGTTTATGAAGAAGGCCGACGAATTCGCCGGCGTTATTAAAATGGGCCGCTGCCATCTGCAAGACGCCGTTCCGATTCTGCTGGGTCAGGAGTTTGAGGCTTATGCTCGTGTGATCGCACGTGACATTGAGCGCATCGCCAATACCCGTAACAACCTGTATGATATCAACATGGGCGCAACCGCCGTTGGCACAGGCCTGAATGCAGACCCGGAGTACATTAGCATCGTTACCGAGCACCTGGCCAAATTTAGCGGTCATCCGCTGCGTAGTGCCCAGCATCTGGTTGATGCCACCCAGAATACAGATTGCTACACCGAGGTGAGCAGTGCCCTGAAAGTGTGCATGATCAATATGAGTAAGATTGCCAACGACCTGCGCTTAATGGCAAGTGGCCCGCGCGCAGGCCTGAGCGAAATTGTTCTGCCTGCACGCCAACCGGGCAGCAGCATCATCCCTGGTATGGTGTGTCCGGTGATGCCGGAAGTGATGAACCAGGTTGCCTTCCAGGTGTTCGGTAACGACCTGACCATCACAAGCGCAAGCGAAGCAGGCCAGTTCGAGTTAAACGTGATGGAACCTGTGCTGTTTTTTAACTTAATTCAGAGCATCAGTATTATGACAAATGTTTTTAAGTCTTTTACCGAAAACTGTCTGAAAGGTATCAAGGCCAACGAGGAACGCATGAAAGAGTATGTGGAAAAAAGCATTGGCATCATCACCGCCATCAACCCGCATGTGGGCTATGAGACAGCCGCCAAACTGGCCCGCGAAGCCTATTTAACCGGCGAGAGTATTCGCGAGCTGTGTATCAAGTACGGCGTGCTGACCGAAGAGCAGCTGAACGAGATCCTGAATCCGTACGAGATGATCCATCCTGGCATTGCAGGTCGCAAA(SEQ ID NO.:2)
测定酶活为3.8U/ml。AspB突变体酶的酶活U定义为：每分钟从丁烯酸催化形成1微摩尔产物R-3-氨基丁酸的酶量为一个酶活单位，即1U。
测定方法：取100ml三角瓶，加入16mL反应液(pH8.5)，反应液中含有300mmol/L丁烯酸，4mmol/L MgCl2，450mmol/L氯化铵，100mmol/L HEPES缓冲液，密闭，将反应液和酶液分别放于42度摇床温育5-10min。向反应液中加入酶液4ml，立即放于42℃200rpm转速的摇床中开始反应。30min后取样1ml，加入1ml乙腈终止反应，离心除去蛋白，上清液用2，4-二硝基氟苯衍生，HPLC分析(根据峰面积计算酶活)。
1.2AspB突变体催化合成R-3-氨基丁酸
100ml反应体系中，37℃下，加入100mM HEPES缓冲液,pH 8.0,终浓度为2mM的MgCl2,300mM丁烯酸,300mM NH4Cl，AspB突变体酶液20ml
HPLC检测反应进程，反应至24h，转化率42％，ee值99.9％，反应至100h，转化率60％，ee值99.7％。
结果表明，与对比例中的方法相比，本发明的方法利用来自大肠杆菌、具有立体异构催化活性的天冬氨酸酶，高效、高立体选择性地将丁烯酸转化为R-3-氨基丁酸，极大地提高转化效率，缩短反应时间，降低生产成本。本发明方法具有收率高、转化率高、成本低、生产周期短、工艺简单、易于放大、适合进行大生产等诸多优点。在此基础上完成了本发明。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海蓝木化工有限公司
<120> 酶法制备R-3-氨基丁酸的方法
<130> P2017-0813
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu Ile
1 5 10 15
Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu Asn
20 25 30
Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser Leu
35 40 45
Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly Leu
50 55 60
Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu Val
65 70 75 80
Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln Gly
85 90 95
Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala Asn
100 105 110
Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys Ile
115 120 125
Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala Phe
130 135 140
Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu Ile
145 150 155 160
Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp Glu
165 170 175
Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Cys His Leu Gln Asp Ala Val
180 185 190
Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile Ala
195 200 205
Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp Ile
210 215 220
Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro Glu
225 230 235 240
Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His Pro
245 250 255
Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp Cys
260 265 270
Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met Ser
275 280 285
Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala Gly
290 295 300
Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile Ile
305 310 315 320
Pro Gly Met Val Cys Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val Ala
325 330 335
Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu Ala
340 345 350
Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn Leu
355 360 365
Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr Glu
370 375 380
Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu Tyr
385 390 395 400
Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val Gly
405 410 415
Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly Glu
420 425 430
Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu Gln
435 440 445
Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Ile His Pro Gly Ile Ala
450 455 460
Gly Arg Lys
465
<210> 2
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacaccgatg tgcgcattga gaaggacttc ctgggtgaaa aggaaatccc gaaggatgcc 60
tattacggcg tgcagaccat ccgtgccaca gagaactttc ctatcaccgg ctaccgcatc 120
catccggaac tgattaagag cctgggcatt gtgaagaaaa gcgccgcact ggcaaacatg 180
gaggtgggtc tgctggataa ggaagtgggt cagtacatcg tgaaggccgc cgacgaagtt 240
attgaaggta agtggaacga tcagtttatc gtggacccga ttcagggcgg cgcaggtaca 300
agcattaata tgaacgccaa cgaagtgatc gcaaaccgcg ccctggaact gatgggtgag 360
gaaaagggca actatagcaa gatcagcccg aacagccacg ttaacatgag ccagagcacc 420
aatgatgcat ttccgaccgc aacccatatt gccgtgctga gtctgctgaa tcagctgatc 480
gagaccacca agtacatgca gcaggagttt atgaagaagg ccgacgaatt cgccggcgtt 540
attaaaatgg gccgctgcca tctgcaagac gccgttccga ttctgctggg tcaggagttt 600
gaggcttatg ctcgtgtgat cgcacgtgac attgagcgca tcgccaatac ccgtaacaac 660
ctgtatgata tcaacatggg cgcaaccgcc gttggcacag gcctgaatgc agacccggag 720
tacattagca tcgttaccga gcacctggcc aaatttagcg gtcatccgct gcgtagtgcc 780
cagcatctgg ttgatgccac ccagaataca gattgctaca ccgaggtgag cagtgccctg 840
aaagtgtgca tgatcaatat gagtaagatt gccaacgacc tgcgcttaat ggcaagtggc 900
ccgcgcgcag gcctgagcga aattgttctg cctgcacgcc aaccgggcag cagcatcatc 960
cctggtatgg tgtgtccggt gatgccggaa gtgatgaacc aggttgcctt ccaggtgttc 1020
ggtaacgacc tgaccatcac aagcgcaagc gaagcaggcc agttcgagtt aaacgtgatg 1080
gaacctgtgc tgttttttaa cttaattcag agcatcagta ttatgacaaa tgtttttaag 1140
tcttttaccg aaaactgtct gaaaggtatc aaggccaacg aggaacgcat gaaagagtat 1200
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gccaaactgg cccgcgaagc ctatttaacc ggcgagagta ttcgcgagct gtgtatcaag 1320
tacggcgtgc tgaccgaaga gcagctgaac gagatcctga atccgtacga gatgatccat 1380
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<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Cys Leu Lys Gln Ile Ile Gly Ser Leu Lys Lys Lys Val His Met Ser
1 5 10 15
Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu Val Pro
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Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu Asn Phe
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50 55 60
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Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys Asp Glu
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100 105 110
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115 120 125
Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu Tyr Gln
130 135 140
Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr Asn Asp
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg Lys Ala
180 185 190
Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Cys Gln Leu Gln Asp
195 200 205
Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ile Leu
210 215 220
Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu Leu Leu
225 230 235 240
Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Thr Pro
245 250 255
Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val Thr Gly
260 265 270
Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser Asp Cys
275 280 285
Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala Val Lys
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435 440 445
Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Thr Glu
450 455 460
Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His Pro Ala
465 470 475 480
Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln
485 490
<210> 4
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
tgcctgaaac aaatcattgg tagcctgaag aaaaaagtgc acatgagcaa taacattcgc 60
atcgaagagg atctgctggg tacacgtgaa gtgccggcag atgcctacta cggtgtgcat 120
acactgcgcg ccatcgaaaa tttttacatc agcaataata aaatcagcga tatcccggaa 180
ttcgtgcgcg gcatggttat ggtgaaaaaa gccgccgcaa tggccaacaa ggaactgcag 240
accattccga agagtgtggc aaacgccatt atcgccgcct gtgatgaagt gctgaacaat 300
ggtaaatgca tggatcagtt tccggtggac gtgtatcaag gcggcgccgg taccagcgtg 360
aacatgaaca ccaatgaggt gctggccaac attggtctgg agctgatggg tcaccagaaa 420
ggcgaatacc agtacctgaa cccgaacgat cacgtgaaca agtgtcagag cacaaatgac 480
gcatacccga caggctttcg tattgccgtg tacagtagcc tgatcaagct ggtggatgcc 540
atcaatcagc tgcgtgaagg cttcgagcgt aaggccgttg aatttcagga catcctgaaa 600
atgggtcgtt gtcagctgca ggatgcagtg ccgatgaccc tgggtcagga atttcgcgca 660
ttcagcatcc tgttaaaaga ggaagtgaaa aacatccagc gtaccgccga actgctgctg 720
gaagttaacc tgggtgccac cgccatcggc acaggcctga ataccccgaa agagtatagc 780
ccgctggccg ttaaaaaact ggcagaggtg accggtttcc cgtgtgtgcc ggcagaggat 840
ctgatcgaag caaccagcga ttgcggtgct tatgttatgg tgcatggtgc cctgaaacgc 900
ctggccgtta agatgagtaa aatctgtaat gacctgcgtc tgctgagcag cggtcctcgt 960
gcaggcctga acgagatcaa cctgccggaa ctgcaggccg gcagtagcat catcccggcc 1020
atggtttgcc ctgtggtgcc ggaggtggtg aatcaggtgt gcttcaaggt gatcggcaat 1080
gacaccaccg tgacaatggc cgcagaggca ggccagctgc aactgaacgt gatggagccg 1140
gtgattggcc aggccatgtt tgaaagcgtg cacatcttaa ccaacgcctg ctacaacctg 1200
ctggagaaat gcatcaatgg tattaccgcc aacaaagaag tttgcgaggg ttacgtgtac 1260
aacagcattg gcatcgtgac ctatctgaat ccgtttattg gccatcacaa cggcgacatt 1320
gtgggcaaga tttgcgcaga gaccggcaaa agtgttcgcg aagtggttct ggagcgcggt 1380
ttactgaccg aggccgaact ggatgacatt ttcagcgttc aaaatctgat gcacccggcc 1440
tacaaagcca aacgctacac agacgaaagc gagcaa 1476
<210> 5
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Cys Leu Lys Gln Ile Ile Gly Ser Leu Lys Lys Lys Val His Met Ser
1 5 10 15
Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu Val Pro
20 25 30
Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu Asn Phe
35 40 45
Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val Arg Gly
50 55 60
Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu Leu Gln
65 70 75 80
Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys Asp Glu
85 90 95
Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp Val Tyr
100 105 110
Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu Val Leu
115 120 125
Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu Tyr Gln
130 135 140
Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr Asn Asp
145 150 155 160
Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu Ile Lys
165 170 175
Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg Lys Ala
180 185 190
Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp
195 200 205
Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ile Leu
210 215 220
Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu Leu Leu
225 230 235 240
Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Thr Pro
245 250 255
Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val Thr Gly
260 265 270
Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser Asp Cys
275 280 285
Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala Val Lys
290 295 300
Met Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg
305 310 315 320
Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly Ser Ser
325 330 335
Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val Asn Gln
340 345 350
Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met Ala Ala
355 360 365
Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile Gly Gln
370 375 380
Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr Asn Leu
385 390 395 400
Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val Cys Glu
405 410 415
Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn Pro Phe
420 425 430
Ile Gly His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala Glu Thr
435 440 445
Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Thr Glu
450 455 460
Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His Pro Ala
465 470 475 480
Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln
485 490
<210> 6
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
tgcctgaaac agatcatcgg ttctctgaaa aaaaaagttc acatgtctaa caacatccgt 60
atcgaagaag acctgctggg tacccgtgaa gttccggctg acgcttacta cggtgttcac 120
accctgcgtg ctatcgaaaa cttctacatc tctaacaaca aaatctctga catcccggaa 180
ttcgttcgtg gtatggttat ggttaaaaaa gctgctgcta tggctaacaa agaactgcag 240
accatcccga aatctgttgc taacgctatc atcgctgctt gcgacgaagt tctgaacaac 300
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aacatgaaca ccaacgaagt tctggctaac atcggtctgg aactgatggg tcaccagaaa 420
ggtgaatacc agtacctgaa cccgaacgac cacgttaaca aatgccagtc taccaacgac 480
gcttacccga ccggtttccg tatcgctgtt tactcttctc tgatcaaact ggttgacgct 540
atcaaccagc tgcgtgaagg tttcgaacgt aaagctgttg aattccagga catcctgaaa 600
atgggtcgta cccagctgca ggacgctgtt ccgatgaccc tgggtcagga attccgtgct 660
ttctctatcc tgctgaaaga agaagttaaa aacatccagc gtaccgctga actgctgctg 720
gaagttaacc tgggtgctac cgctatcggt accggtctga acaccccgaa agaatactct 780
ccgctggctg ttaaaaaact ggctgaagtt accggtttcc cgtgcgttcc ggctgaagac 840
ctgatcgaag ctacctctga ctgcggtgct tacgttatgg ttcacggtgc tctgaaacgt 900
ctggctgtta aaatgtctaa aatctgcaac gacctgcgtc tgctgtcttc tggtccgcgt 960
gctggtctga acgaaatcaa cctgccggaa ctgcaggctg gttcttctat catgccggct 1020
aaagttaacc cggttgttcc ggaagttgtt aaccaggttt gcttcaaagt tatcggtaac 1080
gacaccaccg ttaccatggc tgctgaagct ggtcagctgc agctgaacgt tatggaaccg 1140
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ctggaaaaat gcatcaacgg tatcaccgct aacaaagaag tttgcgaagg ttacgtttac 1260
aactctatcg gtatcgttac ctacctgaac ccgttcatcg gtcaccacaa cggtgacatc 1320
gttggtaaaa tctgcgctga aaccggtaaa tctgttcgtg aagttgttct ggaacgtggt 1380
ctgctgaccg aagctgaact ggacgacatc ttctctgttc agaacctgat gcacccggct 1440
tacaaagcta aacgttacac cgacgaatct gaacag 1476

Claims (15)

1.一种生产R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)在反应体系中，以丁烯酸为底物，在天冬氨酸酶催化下，进行反应式I所示的立体异构催化反应，从而形成R-3-氨基丁酸；
Figure FDA0003921468620000011
(2)任选地从所述步骤(1)的反应后的反应体系中分离出R-3-氨基丁酸；
其中，所述天冬氨酸酶来自大肠杆菌；
所述天冬氨酸酶为突变体，与野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列相比，所述突变体发生如下位点的氨基酸的突变：
T204C、M338I、K341M、N343C的组合；
T204C、K341M的组合；
M338I、K341M的组合；
K341M、N343C的组合；
T204C、M338I、N343C的组合；
T204C、K341M、N343C的组合；
M338I、K341M、N343C的组合；或
T204C、M338I、K341M的组合，所述野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述R-3-氨基丁酸的ee值≥99.5％，和/或所述反应的转化率≥90％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天冬氨酸酶为选自下组的形式：静息细胞、菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液、或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，所述天冬氨酸酶的浓度为0.5-5U/ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，所述丁烯酸的浓度为100mM-1000mM。
6.一种天冬氨酸酶的用途，其特征在于，用于制备一制剂，所述制剂用于催化以下立体异构催化反应：
Figure FDA0003921468620000021
其中，所述天冬氨酸酶来自大肠杆菌；
所述天冬氨酸酶为突变体，与野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列相比，所述突变体发生如下位点的氨基酸的突变：
T204C、M338I、K341M、N343C的组合；
T204C、K341M的组合；
M338I、K341M的组合；
K341M、N343C的组合；
T204C、M338I、N343C的组合；
T204C、K341M、N343C的组合；
M338I、K341M、N343C的组合；或
T204C、M338I、K341M的组合，所述野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
7.一种R-3-氨基丁酸生产菌株，其特征在于，所述菌株表达多肽，所述多肽为外源的来自大肠杆菌的天冬氨酸酶，并用于催化以下立体异构催化反应：
Figure FDA0003921468620000022
所述天冬氨酸酶为突变体，与野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列相比，所述突变体发生如下位点的氨基酸的突变：
T204C、M338I、K341M、N343C的组合；
T204C、K341M的组合；
M338I、K341M的组合；
K341M、N343C的组合；
T204C、M338I、N343C的组合；
T204C、K341M、N343C的组合；
M338I、K341M、N343C的组合；或
T204C、M338I、K341M的组合，所述野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
8.如权利要求7所述的R-3-氨基丁酸生产菌株，其特征在于，所述生产菌株是细菌。
9.如权利要求8所述的R-3-氨基丁酸生产菌株，其特征在于，所述生产菌株是大肠杆菌。
10.如权利要求9所述的R-3-氨基丁酸生产菌株，其特征在于，所述生产菌株是E.coliBL21(DE3)。
11.一种生产R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
1)采用生产条件培养权利要求7-10中任一项所述的生产菌株，从而得到R-3-氨基丁酸；
2)任选地，从1)的培养体系中分离获得R-3-氨基丁酸。
12.一种具有立体异构催化活性的天冬氨酸酶，其特征在于，所述天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
13.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求12所述的天冬氨酸酶。
14.如权利要求13所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:4所示。
15.如权利要求13所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列与SEQ IDNO.:4所示序列的同源性≥95％，且编码SEQ ID NO.:3所示多肽。
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Applicant before: TAIZHOU POLLENIN PHARMACEUTICAL CO.,LTD.

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