CN113584054B

CN113584054B - 编码精氨酸脱亚胺酶的dna分子及其用途

Info

Publication number: CN113584054B
Application number: CN202110718346.5A
Authority: CN
Inventors: 李哲; 余伟; 李佳; 韩烁; 张松; 赵桥
Original assignee: Hebei Yuanda Jiufu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hebei Yuanda Jiufu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113584054A

Abstract

本发明提供了一种编码精氨酸脱亚胺酶的DNA分子，其包含如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种包含本发明所述的DNA分子的表达载体和用于表达精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌。本发明还提供了一种使用本发明的工程菌制备L‑瓜氨酸的方法。本发明提供的基因工程菌具有很高的催化精氨酸生成L‑瓜氨酸的能力，极大地提高了表达效率，从而降低了生产和使用成本。

Description

编码精氨酸脱亚胺酶的DNA分子及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种编码精氨酸脱亚胺酶的DNA分子，本发明还涉及包含该DNA分子的载体以及其用于生产L-瓜氨酸的用途。

背景技术

L-瓜氨酸，又名氨基甲酰鸟氨酸，1914年右贺太郎等从西瓜榨汁中第一次分离得到了瓜氨酸，此后由和田光德确认它是一种氨基酸。瓜氨酸以游离态存在于葫芦科植物的种子中，至今为止，人们已成功地从西瓜榨汁、野西瓜叶、核桃仁、核桃幼苗及种子中分离得到了瓜氨酸。

瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，近年来国外的众多研究表明，瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，作为异体排斥效应指示剂，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎，抗氧化等，应用前景十分广阔。

L-瓜氨酸的主要生产方法有提取法、化学合成法、微生物发酵法、酶转化法。酶法生产L-瓜氨酸具有生产周期短、专一性强、产物纯化容易等优点，其逐渐成为瓜氨酸的主要生产方式。但是在利用工程菌对精氨酸脱亚胺酶进行表达时候，大部分精氨酸脱亚胺酶以没有活性的包涵体形式存在。公开号为CN105018454A的中国专利申请公开了一种大肠杆菌重组表达精氨酸脱亚胺酶的制备方法，主要包括重组表达方法、采用尿素作为变性剂的包涵体复性方法。但是该复性过程增加了酶的成本，降低了产品竞争力。

精氨酸的分子量为174.2，等电点为10.76，属于碱性氨基酸，在水溶液中的pH为10以上，但是目前报道的精氨酸脱亚胺酶的最适合pH为6-7，因此在进行酶促反应时候需要先用浓盐酸将反应液的pH进行调节到6-7的范围内，随着底物精氨酸浓度的提高，盐酸的用量会逐渐增大，最终酶反应液中的离子浓度会很高，容易影响酶的活性甚至造成酶的失活，影响整个酶催化反应。同时由于精氨酸脱亚胺酶属于单一酶，在进行酶催化的时候不需要辅酶的参与，因此利用固定化酶进行酶促反应，提高酶的使用次数，是生产瓜氨酸的主要方向。但是固定化酶要求稳定性较高的酶，因此对耐温度、pH稳定性高，可溶性表达量高，活力高的精氨酸脱亚胺酶的需求越来越迫切。

同时酶的热稳定性对于酶的重复利用也非常关键，热稳定性好的酶具有可以提高反应速率、简化提取纯化工艺、降低成本、提高产品品质、活性稳定、容易储存等优点，因此寻找热稳定性好的酶也一直是生产和科研关注的热点。

公开号为CN104560927A的中国专利申请公开了一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用，所述突变的精氨酸脱亚胺酶在K137A、F198W、V230A、R257L、A260D中的任意一个或多个位点发生突变，突变后的精氨酸脱亚胺酶的活性明显提高，可用于催化L-精氨酸生产L-瓜氨酸，转化率在95％以上。突变的精氨酸脱亚胺酶采用易错PCR体系制备得到。液体酶活达到200000-270000U/L，精氨酸投料量在258g/L的情况下，用浓盐酸调节pH6-7，经过5.5h转化，转化率达到了96.5％，突变后的活性虽然得到了提高，但是当底物浓度大于200g/L时，反应结束后还有底物剩余。

公开号为CN106591271A的中国专利申请公开了一种精氨酸脱亚胺酶突变体，其为酶活性中心附近的甘氨酸突变为脯氨酸的突变体，突变体与野生酶相比其酶活力提高了1.5倍，在40℃下的半衰期提高了5.43倍，解决了精氨酸脱亚胺酶催化瓜氨酸合成时催化能力和温度稳定性低的问题，但是该反应的底物浓度为100g/L，pH为6.0-6.5，转化率为95％，40℃的半衰期为100min左右，不利于酶的长期保藏和使用。

基于此，当前对具有很好的热稳定性、pH稳定性的精氨酸脱亚胺酶仍存在需求。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种编码精氨酸脱亚胺酶的DNA分子。本发明提供的DNA分子经过密码子优化，提高了精氨酸脱亚胺酶的可溶性表达，在大肠杆菌表达后获得的精氨酸脱亚胺酶几乎没有包涵体，同时本发明提供的精氨酸脱亚胺酶具有很好的热稳定性、pH稳定性，同时具有很高的催化精氨酸生成L-瓜氨酸的活力。本发明还提供了一种生产L-瓜氨酸的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一方面，本发明提供了一种编码精氨酸脱亚胺酶(ADI)的DNA分子，其包含如SEQID NO：1所示的核苷酸序列；优选地，所述DNA分子由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成。本发明所述的编码ADI的DNA分子根据铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosastrain3 Re2-7)的精氨酸脱亚胺酶(ADI)的序列信息设计并优化获得的，该精氨酸脱亚胺酶蛋白序列来源于UniProt蛋白质数据库(UniProt Reference Sequence：P00750)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该氨基酸序列共包括418个氨基酸，蛋白分子量为46.4kDa，等电点为5.52。

另一方面，本发明提供了一种包含本发明所述的DNA分子的表达载体；优选地，本发明所述的表达载体为原核生物表达载体；更优选地为pUC或pET系列载体，进一步优选为pET21α表达载体。

再一方面，本发明提供了一种用于表达精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌，所述基因工程菌包含本发明所述的DNA分子，或表达载体。优选地，所述基因工程菌为枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌；更优选地，所述基因工程菌为重组大肠杆菌；进一步优选为重组大肠杆菌BL21。

本发明还提供了本发明所述的编码精氨酸脱亚胺酶的DNA分子、表达载体或基因工程菌在制备L-瓜氨酸中的用途。

本发明的一个具体实施方案给出了本发明所述的用于表达精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)按照大肠杆菌细胞密码子偏好性设计并合成编码精氨酸脱亚胺酶的核苷酸序列，优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

2)将编码精氨酸脱亚胺酶的核苷酸序列构建到pET21a表达载体中，获得ADI-pET21a重组质粒；

3)用ADI-pET21a重组质粒转染大肠杆菌BL21(DE3)；

4)筛选稳定的细胞株。

本发明获得的上述基因工程菌的菌落呈淡黄色，圆形边缘整齐，表面光滑，小凸起。

本发明还提供了一种精氨酸脱亚胺酶的制备方法，所述方法包括使用所述的表达载体，或者所述基因工程菌表达所述精氨酸脱亚胺酶；优选地，所述精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种L-瓜氨酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)诱导本发明所述的基因工程菌中表达，收集菌体并破碎，获得精氨酸脱亚胺酶；和

2)使用所获得的精氨酸脱亚胺酶转化L-精氨酸以获得L-瓜氨酸。

在本发明所述的L-瓜氨酸的制备方法的步骤1)中，所述诱导的条件包括：

a.在37℃，pH为6.8的条件下进行种子培养；

b.在33-34℃下添加诱导剂并进行发酵培养；优选地，所述诱导剂为IPTG或乳糖。

优选地，其中所述种子培养使用的培养基包含：蛋白胨5-15g/L、酵母抽提物1-10g/L和氯化钠5-15g/L；更优选包含：蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L和氯化钠10g/L；

优选地，所述种子培养使用的培养基用氢氧化钠水溶液调节至pH7.0-7.2，并灭菌；更优选地，所述种子培养使用的培养基在接种前加入无菌过滤的终浓度为50-100mg/L的氨苄青霉素钠水溶液；

优选地，所述种子培养使用的培养基在种子瓶中的装液量为20-40ml/250ml种子瓶，在三角瓶或发酵瓶中的装液量为50-100ml/500ml三角瓶或发酵瓶；

优选地，其中所述发酵培养使用的培养基包含：酵母抽提物10-30g/L、氯化钠2-5g/L、氯化铵1-3g/L、磷酸氢二钾0.5-1g/L、磷酸二氢钾0.5-1g/L和七水硫酸镁0.5-1g/L；更优选包含：酵母抽提物15g/L、氯化钠3g/L、氯化铵2g/L、磷酸氢二钾0.75g/L、磷酸二氢钾0.75g/L和七水硫酸镁0.75g/L；

优选地，所述发酵培养使用的培养基用氢氧化钠水溶液调节至pH7.0-7.2，并灭菌；更优选地，所述发酵培养使用的培养基在接种前加入无菌过滤的终浓度为50-100mg/L氨苄青霉素钠水溶液；

进一步优选地，所述发酵培养使用的培养基的装液量为200-500ml/3000ml三角瓶。

根据本发明的一个优选实施方案，所述制备方法使用的培养基如下制备：

种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L和氯化钠10g/L，用30％(w/v)氢氧化钠水溶液调节pH7.0-7.2，灭菌温度121℃，灭菌时间20分钟；接种前加入无菌过滤的氨苄青霉素钠水溶液(终浓度为50-100mg/L)；

发酵培养基：酵母抽提物15g/L、氯化钠3g/L、氯化铵2g/L、磷酸氢二钾0.75g/L、磷酸二氢钾0.75g/L和七水硫酸镁0.75g/L；pH7.0-7.2，灭菌温度121℃，灭菌时间20分钟；装液量200-500ml/3000ml三角瓶。接种前加入无菌过滤的氨苄青霉素钠水溶液(终浓度为50-100mg/L)。

根据本发明的一个具体实施方案，所述诱导基因工程菌的表达包括以下步骤：

将精氨酸脱亚胺酶工程表达菌株在平板上划线培养。挑取单克隆于含有终浓度为50-100mg/L氨苄青霉素钠的种瓶中培养6-8h，37℃，转速为200rpm条件下培养至OD600值为1.0-1.5。将上述种子液转接到装有含有50-100mg/L氨苄青霉素钠3000mL发酵摇瓶中，37℃，200rpm条件下，培养至OD6001.0-1.5，加入终浓度1mM的IPTG诱导，33-34℃，200rpm条件下诱导12h。

在本发明所述的L-瓜氨酸的制备方法的步骤2)中，所述转化的条件包括：菌体或破碎后的菌体的添加量为5-10g/L，底物L-精氨酸浓度为150-250g/L，转化温度为40-50℃，pH值为5.5-7.0；转化时间为5-10h。

本发明还提供了根据所述的方法得到的L-瓜氨酸。与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

1)本发明提供的DNA分子经过优化，避免和降低了影响转录和翻译效率的诸多因素，例如密码子偏好性、mRNA高级结构、GC含量、提前终止序列等，并且本发明提供的DNA分子提高了酶的可溶性表达，几乎没有包涵体。

2)本发明提供的表达精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌极大地提高了表达效率，从而降低了生产和使用成本。

3)本发明提供的精氨酸脱亚胺酶具有很好的热稳定性、pH稳定性，耐高盐浓度，同时具有很高的催化精氨酸生成L-瓜氨酸的活力。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为根据实施例1获得的本发明的工程菌的SDS-PAGE分析，其中1：标准蛋白；2：菌体破碎后离心沉淀；3：破碎上清液；4：Ni柱纯化后的蛋白；

图2为根据本发明的实施例3所示，精氨酸脱亚胺酶(ADI)的温度稳定性试验中，精氨酸脱亚胺酶(ADI)的稳定性随温度变化的图；

图3为根据本发明的实施例3所示，精氨酸脱亚胺酶(ADI)的最适反应温度试验中，精氨酸脱亚胺酶(ADI)的相对酶活随温度变化的图；

图4为根据本发明的实施例3所示，精氨酸脱亚胺酶(ADI)的pH稳定性试验中，精氨酸脱亚胺酶(ADI)的相对酶活随pH变化的图。

图5为根据本发明实施例6所示，精氨酸脱亚胺酶(ADI)的野生型DNA序列工程菌的SDS-PAGE。其中1：标准蛋白；2：菌体破碎后上清；3：菌体破碎后离心沉淀。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1.编码精氨酸脱亚胺酶的核苷酸序列的密码子优化精氨酸脱亚胺酶蛋白序列来源于NCBI数据库。依据铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa strain3 Re2-7)的精氨酸脱亚胺酶(ADI)的蛋白序列信息(SEQ ID NO:2)和大肠杆菌密码子偏好性规律，对基因序列进行密码子优化(SEQ ID N NO:1)，在基因两端设计增加EcoRI和HindIII酶切位点后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行人工合成。

SEQ ID NO:1

ATGATGTCAACCGAAAAAACGAAACTGGGTGTTCATAGCGAAGCTGGCAAACTGCGTAAGGTGATGGTCTGTTCTCCGGGTCTGGCTCATCAGCGTCTGACCCCGAGCAACTGCGACGAACTGCTGTTTGATGACGTTATTTGGGTCAATCAAGCCAAACGCGACCATTTTGATTTCGTGACCAAGATGCGTGAACGCGGCATTGATGTTCTGGAAATGCACAACCTGCTGACCGAAACGATCCAGAATCCGGAAGCTCTGAAATGGATTCTGGACCGTAAGATCACGGCAGATTCGGTTGGCCTGGGTCTGACCTCAGAACTGCGTTCGTGGCTGGAAAGCCTGGAACCGCGTAAACTGGCGGAATATCTGATTGGCGGTGTGGCAGCAGATGACCTGCCGGCAAGCGAAGGCGCTAACATCCTGAAGATGTATCGTGAATACCTGGGTCATAGCTCTTTTCTGCTGCCGCCGCTGCCGAACACGCAGTTCACCCGCGATACCACGTGTTGGATTTATGGCGGTGTTACGCTGAATCCGATGTACTGGCCGGCCCGTCGCCAAGAAACCCTGCTGACCACGGCAATCTACAAGTTCCATCCGGAATTTGCGAACGCCGAATTTGAAATCTGGTACGGCGATCCGGACAAGGATCACGGTAGTTCCACCCTGGAAGGCGGTGATGTTATGCCGATTGGCAATGGTGTGGTTCTGATCGGCATGGGTGAACGTTCATCGCGCCAGGCAATTGGTCAGGTGGCACAATCTCTGTTCGCAAAAGGCGCAGCTGAACGTGTTATCGTCGCAGGTCTGCCGAAGTCTCGCGCGGCCATGCACCTGGACACGGTCTTTAGTTTCTGCGACCGTGATCTGGTGACCGTTTTTCCGGAAGTCGTGAAAGAAATTGTGCCGTTCAGCCTGCGTCCGGATCCGAGCTCTCCGTACGGCATGAACATCCGTCGCGAAGAAAAAACGTTTCTGGAAGTTGTCGCGGAATCCCTGGGTCTGAAAAAGCTGCGTGTGGTTGAAACCGGCGGTAATTCATTCGCAGCTGAACGCGAACAATGGGATGACGGTAACAATGTCGTGTGTCTGGAACCGGGCGTTGTCGTGGGTTATGATCGTAACACCTACACGAATACCCTGCTGCGCAAAGCTGGCGTCGAAGTGATTACCATCAGTGCGTCCGAACTGGGTCGCGGCCGTGGTGGTGGCCATTGTATGACCTGCCCGATTGTGCGTGACCCGATTGATTACTGA

SEQ ID NO:2

MMSTEKTKLGVHSEAGKLRKVMVCSPGLAHQRLTPSNCDELLFDDVIWVNQAKRDHFDFVTKMRERGIDVLEMHNLLTETIQNPEALKWILDRKITADSVGLGLTSELRSWLESLEPRKLAEYLIGGVAADDLPASEGANILKMYREYLGHSSFLLPPLPNTQFTRDTTCWIYGGVTLNPMYWPARRQETLLTTAIYKFHPEFANAEFEIWYGDPDKDHGSSTLEGGDVMPIGNGVVLIGMGERSSRQAIGQVAQSLFAKGAAERVIVAGLPKSRAAMHLDTVFSFCDRDLVTVFPEVVKEIVPFSLRPDPSSPYGMNIRREEKTFLEVVAESLGLKKLRVVETGGNSFAAEREQWDDGNNVVCLEPGVVVGYDRNTYTNTLLRKAGVEVITISASELGRGRGGGHCMTCPIVRDPIDY*

优化后的ADI编码DNA序列与天然ADI编码DNA序列Genbank：CP034908.2的比对，两者的相似度为80.87％。

实施例2.表达精氨酸脱亚胺酶的菌株构建

在SEQ ID NO:1两端设计增加EcoRI和HindIII酶切位点后，送上海生工有限公司进行人工合成，并构建在pET21a质粒上。将质粒通过热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，于37℃过夜培养后，挑选阳性转化子再次测序，测序正确的转化子为基因工程菌。

实施例3.表达精氨酸脱亚胺酶的菌株培养

3.1菌落形态：淡黄色，圆形边缘整齐，表面光滑，小凸起。

3.2培养基：

种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化钠10g/L，用30％(w/v)氢氧化钠水溶液调节pH7.0-7.2，灭菌温度121℃，灭菌时间20分钟；接种前加入无菌过滤的氨苄青霉素钠水溶液(终浓度为75mg/L)。

种子瓶装液量20-40ml/250ml种子瓶，三角瓶或发酵瓶装液量50-100ml/500ml三角瓶或发酵瓶。

发酵培养基：酵母抽提物15g/L、氯化钠3g/L、氯化铵2g/L、磷酸氢二钾0.75g/L、磷酸二氢钾0.75g/L、七水硫酸镁0.75g/L、pH7.0-7.2，灭菌温度121℃，灭菌时间20分钟；装液量200-500ml/3000ml三角瓶；接种前加入无菌过滤的氨苄青霉素钠水溶液(终浓度为75mg/L)。

3.3种子和发酵培养方法

将精氨酸脱亚胺酶工程表达菌株在平板上划线培养。挑取单克隆于含有终浓度为50-100mg/L氨苄青霉素钠的种子瓶中培养6-8h。37℃，转速为200rpm条件下培养至OD600值为1.0-1.5。将上述种子液转接到装有含有50-100mg/L氨苄青霉素钠500mL发酵摇瓶中，37℃，200rpm条件下培养至OD600 1.0-1.5，加入终浓度1mM的IPTG诱导，33-34℃，200rpm条件下诱导12h。

实施例4.表达精氨酸脱亚胺酶的菌株的性质鉴定

4.1酶活检测方法：

实施例3的发酵结束后，发酵液于沉降离心机上4℃、6000r/min离心20min，收集菌体沉淀物，并用缓冲液(20mM磷酸缓冲液，pH5.5)洗涤一次菌体，并且加入10倍缓冲液对菌体进行重悬，利用高压匀浆机对发酵液进行破壁，700bar压力过两次，结束后4℃下12000rpm离心20分钟，收集上清，即为粗酶液。

粗酶液用Ni-NTA蛋白纯化柱进行纯化后，得到纯化后蛋白酶，用SDS-PAGE检验纯化效果，结果如图1所示，用BCA法测定蛋白浓度。

从图1中可以看出经过诱导表达后的精氨酸脱亚胺酶主要集中在上清中，表达量很高，以有活性的可溶性状态存在，破壁后的离心沉淀中几乎没有包涵体，说明经过密码子优化后的精氨酸脱亚胺酶可溶性表达很好。

酶活测定方法：在精氨酸浓度为100g/L的磷酸钠缓冲液(0.2M，pH5.5)，37℃，200rpm条件下，加入粗酶液1mL进行反应10min。反应结束后，沸水浴5min终止反应，离心去除沉淀，取反应液进行液相检测。

4.2酶活定义：

以粗酶液或者纯化后蛋白酶，在pH值5.5、37℃、精氨酸浓度100g/L的条件下，1分钟内、转换1.0μmol L-精氨酸生成为1.0μmol L-瓜氨酸为一个酶活力单位U。

4.3酶的热稳定性测定方法：

将纯化后蛋白酶在25℃～60℃温度下保温不同时间，再按照酶活力检测方法测定样品中的残余酶活，以未经热处理的样品酶活性定义为100％计算相对参与酶活，做温度相对酶活性曲线，结果如图2所示。

从图中可以看出精氨酸脱亚胺酶有很好的热稳定性，在45℃的半衰期达到了120min，在40℃的半衰期更长，具有非常好的开发和应用潜力。专利申请CN106591271A公布的精氨酸脱亚胺酶突变体在40℃时候的半衰期为100min，野生型的半衰期只有18min左右。

4.4酶的最适宜温度：

将纯化后蛋白酶在不同温度下(25～60℃)与底物反应液进行反应，然后按照酶活检测方法测定酶活，以最大酶活为100％，计算其他温度下的相对酶活，结果如图3所示。

从图中可以看出最适反应温度为50℃，但是考虑到酶的稳定性，一般采用40℃进行反应，同时在40℃的条件下进行反应能够抑制其他降解精氨酸的杂酶的活性，减少副反应和杂质的生成。

4.5酶的pH耐受性：

将纯化后酶液在不同pH下(2-11)在37℃下进行孵育，然后按照酶活检测方法测定酶活，以最大酶活为100％，计算其他pH下的相对酶活，结果如图4所示。

从图中可以看出精氨酸脱亚胺酶有很好的pH稳定性，但是在酸性溶液中酶活容易下降，因此需要保藏在中性或者偏碱的溶液中。

实施例5.精氨酸脱亚胺酶的放大生产及转化生产瓜氨酸

精氨酸脱亚胺酶的放大发酵生产在上海保兴生物设备工程有限公司生产的50L发酵罐上进行。

5.1精氨酸脱亚胺酶的放大生产

种子瓶接种到发酵罐后，经过2-4小时的迟滞期，菌体开始进行生长，pH开始缓慢下降，发酵7小时开始自控补加氨水，控制pH＝6.8，随着菌体的不断增长，溶氧逐渐降低，缓慢提升动力条件(通气比由0.5提高到1vvm、转速由300转提高到600转、罐压由0.05MPa提高到0.1MPa)，控制溶氧大于10％。当OD值达到12-18时，发生溶氧突变，DO快速回升，开始按照每小时4-5g/L发酵液体积的补料速率补加甘油。待OD达到60后温度由37℃降低至34℃，同时控制甘油浓度在10g/L以上，加入诱导剂IPTG进行诱导表达，控制溶氧在10％-30％，一般放罐OD为70-110之间，周期35至45小时，发酵结束。

发酵结束后低温离心收集菌体，用缓冲液洗涤收集菌体，菌体浓度控制在5-10g/L，高压匀浆机进行破壁，离心得到粗酶液。

5.2酶转化生产L-瓜氨酸的方法

在1L的四口瓶中建立250mL反应体系，其中加入50g精氨酸，加入纯净水后，用浓盐酸调节pH到5.5，最后加入50mL粗酶液，利用水浴锅控制催化温度40℃，100rpm条件下进行反应，每间隔一小时，取反应液1mL，用纯水溶液稀释50倍，然后经0.45μm微孔滤膜过滤后通过HPLC鉴定溶液中瓜氨酸的含量和精氨酸的残留量。

最终在四个半小时时反应完全，转化率达到了99％。

5.3L-瓜氨酸检测方法

HPLC的液相条件为：色谱柱：C18，4.6*250mm，5μm；柱流速：1.0ml/min；检测波长：205nm；

柱温：25℃；进样体积：20μl。

流动相：13.6g磷酸二氢钾至1000mL量瓶中，加1000mL纯化水溶解后加30mL乙腈，混匀，过滤。

酶活的计算方法：

式中：

W1：瓜氨酸对照品的质量(mg)；

S：瓜氨酸对照品的含量；

A1：反应15min瓜氨酸的面积；

A0：反应5min瓜氨酸的面积；

n：反应液稀释倍数；

V：反应体系终体积；

W2：纯化后液酶中蛋白的重量(g)；

A：瓜氨酸对照品的面积；

m：对照品瓜氨酸的稀释倍数；

175.19：瓜氨酸的分子量；

10：两次取样时间间隔(min)；

1000：uM换算系数。

结果显示粗酶液的酶活为300U/mL，纯化后酶的酶活为10800U/g。

实施例6.表达精氨酸脱亚胺酶菌株的培养

使用如实施例2获得的工程菌，培养方法如下：

A.培养基：

种子培养基：蛋白胨5g/L、酵母抽提物1g/L、氯化钠5g/L，用30％(w/v)氢氧化钠水溶液调节pH7.0，灭菌温度121℃，灭菌时间20分钟；接种前加入无菌过滤的氨苄青霉素钠水溶液，终浓度为50mg/L；

种子瓶装液量20ml/250ml种子瓶；

发酵培养基：酵母抽提物10g/L、氯化钠2g/L、氯化铵1g/L、磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、pH7.0，灭菌温度121℃，灭菌时间20分钟；装液量200/3000ml三角瓶。接种前加入无菌过滤的氨苄青霉素钠水溶液(终浓度为100mg/L)。

B.种子和发酵培养方法：

将精氨酸脱亚胺酶工程表达菌株在平板上划线培养。挑取单克隆于含有终浓度为100mg/L氨苄青霉素钠的种子瓶中培养6h。37℃，转速为200rpm条件下培养至OD600值为1.0。将上述种子液转接到装有含有50mg/L氨苄青霉素钠500mL发酵摇瓶中，37℃，200rpm条件下，培养至OD600 1.0，加入终浓度1mM的IPTG诱导，33℃，200rpm条件下诱导12h。

按照实施例4和5的方法测定酶活，粗酶液的酶活为230U/mL。

实施例7.表达精氨酸脱亚胺酶的菌株的培养

使用如实施例2获得的工程菌，培养方法如下：

A.培养基：

种子培养基：蛋白胨15g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠15g/L，用30％(w/v)氢氧化钠水溶液调节pH7.2，灭菌温度121℃，灭菌时间20分钟；种前加入无菌过滤的氨苄青霉素钠水溶液(终浓度为100mg/L)；

三角瓶装液量100ml/500ml三角瓶或发酵瓶；

发酵培养基：酵母抽提物30g/L、氯化钠5g/L、氯化铵3g/L、磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L、七水硫酸镁1g/L、pH 7.2，灭菌温度121℃，灭菌时间20分钟；装液量500ml/3000ml三角瓶。接种前加入无菌过滤的氨苄青霉素钠水溶液(终浓度为50mg/L)。

B.种子和发酵培养方法

将精氨酸脱亚胺酶工程表达菌株在平板上划线培养。挑取单克隆于含有终浓度为100mg/L氨苄青霉素钠的种子瓶中培养8h。37℃，转速为200rpm条件下培养至OD600值为1.5。将上述种子液转接到装有含有100mg/L氨苄青霉素钠500mL发酵摇瓶中，37℃，200rpm条件下，培养至OD600 1.5，加入终浓度1mM的乳糖诱导，34℃，200rpm条件下诱导12h。

按照实施例4和5的方法测定酶活，粗酶液的酶活为260U/ml。

实施例8.对比例

将在Genbank中CP034908.2序列两端设计增加EcoRI和HindIII酶切位点后，进行人工合成并构建在pET21a质粒上。

将质粒通过热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)，于37℃过夜培养后，挑选阳性转化子再次测序，测序正确的转化子野生型基因工程菌。

将野生型基因工程菌按照实施例3的方法进行培养表达，收集的菌体经过破碎，通过蛋白凝胶电泳SDS-PAGE检测野生型的表达情况，结果如图5所示，其中1：蛋白分子量标样；2：野生型表达上清；3：野生型表达后沉淀(包涵体)。

从图中可以看出野生型的核酸序列在大肠杆菌中的表达主要为包涵体的形式存在，可溶性的表达很低。

按照实施例3的方法对野生型的酶活进行检测，结果如下表所示：

表1

菌株类型	野生型	密码子优化后
			粗酶液酶活	30U/mL	300U/mL
纯化后酶活	6000U/g	10800U/g

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110> 保定九孚生化有限公司

<120> 编码精氨酸脱亚胺酶的DNA分子及其用途

<130> DIC21110033

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgtcaa ccgaaaaaac gaaactgggt gttcatagcg aagctggcaa actgcgtaag 60

gtgatggtct gttctccggg tctggctcat cagcgtctga ccccgagcaa ctgcgacgaa 120

ctgctgtttg atgacgttat ttgggtcaat caagccaaac gcgaccattt tgatttcgtg 180

accaagatgc gtgaacgcgg cattgatgtt ctggaaatgc acaacctgct gaccgaaacg 240

atccagaatc cggaagctct gaaatggatt ctggaccgta agatcacggc agattcggtt 300

ggcctgggtc tgacctcaga actgcgttcg tggctggaaa gcctggaacc gcgtaaactg 360

gcggaatatc tgattggcgg tgtggcagca gatgacctgc cggcaagcga aggcgctaac 420

atcctgaaga tgtatcgtga atacctgggt catagctctt ttctgctgcc gccgctgccg 480

aacacgcagt tcacccgcga taccacgtgt tggatttatg gcggtgttac gctgaatccg 540

atgtactggc cggcccgtcg ccaagaaacc ctgctgacca cggcaatcta caagttccat 600

ccggaatttg cgaacgccga atttgaaatc tggtacggcg atccggacaa ggatcacggt 660

agttccaccc tggaaggcgg tgatgttatg ccgattggca atggtgtggt tctgatcggc 720

atgggtgaac gttcatcgcg ccaggcaatt ggtcaggtgg cacaatctct gttcgcaaaa 780

ggcgcagctg aacgtgttat cgtcgcaggt ctgccgaagt ctcgcgcggc catgcacctg 840

gacacggtct ttagtttctg cgaccgtgat ctggtgaccg tttttccgga agtcgtgaaa 900

gaaattgtgc cgttcagcct gcgtccggat ccgagctctc cgtacggcat gaacatccgt 960

cgcgaagaaa aaacgtttct ggaagttgtc gcggaatccc tgggtctgaa aaagctgcgt 1020

gtggttgaaa ccggcggtaa ttcattcgca gctgaacgcg aacaatggga tgacggtaac 1080

aatgtcgtgt gtctggaacc gggcgttgtc gtgggttatg atcgtaacac ctacacgaat 1140

accctgctgc gcaaagctgg cgtcgaagtg attaccatca gtgcgtccga actgggtcgc 1200

ggccgtggtg gtggccattg tatgacctgc ccgattgtgc gtgacccgat tgattactga 1260

<210> 2

<211> 419

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 2

Met Met Ser Thr Glu Lys Thr Lys Leu Gly Val His Ser Glu Ala Gly

1 5 10 15

Lys Leu Arg Lys Val Met Val Cys Ser Pro Gly Leu Ala His Gln Arg

20 25 30

Leu Thr Pro Ser Asn Cys Asp Glu Leu Leu Phe Asp Asp Val Ile Trp

35 40 45

Val Asn Gln Ala Lys Arg Asp His Phe Asp Phe Val Thr Lys Met Arg

50 55 60

Glu Arg Gly Ile Asp Val Leu Glu Met His Asn Leu Leu Thr Glu Thr

65 70 75 80

Ile Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp Ile Leu Asp Arg Lys Ile Thr

85 90 95

Ala Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu Arg Ser Trp Leu

100 105 110

Glu Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu Ile Gly Gly Val

115 120 125

Ala Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn Ile Leu Lys Met

130 135 140

Tyr Arg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro

145 150 155 160

Asn Thr Gln Phe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp Ile Tyr Gly Gly Val

165 170 175

Thr Leu Asn Pro Met Tyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu

180 185 190

Thr Thr Ala Ile Tyr Lys Phe His Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe

195 200 205

Glu Ile Trp Tyr Gly Asp Pro Asp Lys Asp His Gly Ser Ser Thr Leu

210 215 220

Glu Gly Gly Asp Val Met Pro Ile Gly Asn Gly Val Val Leu Ile Gly

225 230 235 240

Met Gly Glu Arg Ser Ser Arg Gln Ala Ile Gly Gln Val Ala Gln Ser

245 250 255

Leu Phe Ala Lys Gly Ala Ala Glu Arg Val Ile Val Ala Gly Leu Pro

260 265 270

Lys Ser Arg Ala Ala Met His Leu Asp Thr Val Phe Ser Phe Cys Asp

275 280 285

Arg Asp Leu Val Thr Val Phe Pro Glu Val Val Lys Glu Ile Val Pro

290 295 300

Phe Ser Leu Arg Pro Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Gly Met Asn Ile Arg

305 310 315 320

Arg Glu Glu Lys Thr Phe Leu Glu Val Val Ala Glu Ser Leu Gly Leu

325 330 335

Lys Lys Leu Arg Val Val Glu Thr Gly Gly Asn Ser Phe Ala Ala Glu

340 345 350

Arg Glu Gln Trp Asp Asp Gly Asn Asn Val Val Cys Leu Glu Pro Gly

355 360 365

Val Val Val Gly Tyr Asp Arg Asn Thr Tyr Thr Asn Thr Leu Leu Arg

370 375 380

Lys Ala Gly Val Glu Val Ile Thr Ile Ser Ala Ser Glu Leu Gly Arg

385 390 395 400

Gly Arg Gly Gly Gly His Cys Met Thr Cys Pro Ile Val Arg Asp Pro

405 410 415

Ile Asp Tyr

Claims

1.一种编码精氨酸脱亚胺酶(ADI)的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种包含如权利要求1所述的DNA分子的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其中，所述表达载体为原核生物表达载体。

4.如权利要求3所述的表达载体，其中，所述表达载体为pUC或pET系列载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其中，所述表达载体为pET21α表达载体。

6.一种用于表达精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求1所述的DNA分子或如权利要求2所述的表达载体。

7.如权利要求6所述的基因工程菌，其中，所述基因工程菌为枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌。

8.如权利要求7所述的基因工程菌，其中，所述基因工程菌为重组大肠杆菌。

9.如权利要求8所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌为重组大肠杆菌BL21。

10.如权利要求1所述的编码精氨酸脱亚胺酶的DNA分子、如权利要求2所述的表达载体或如权利要求6所述的基因工程菌在制备L-瓜氨酸中的用途。

11.一种精氨酸脱亚胺酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求6所述的基因工程菌表达所述精氨酸脱亚胺酶。

12.如权利要求11所述的制备方法，其中，所述精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

13.一种L-瓜氨酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)诱导如权利要求6所述的基因工程菌表达，收集菌体并破碎，获得精氨酸脱亚胺酶；和

14.如权利要求13所述的方法，其中，在步骤1)中，所述诱导表达的条件包括：

a.在37℃，pH为6.8的条件下进行种子培养；

b.在33-34℃下添加诱导剂并进行发酵培养。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述诱导剂为IPTG或乳糖。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述种子培养使用的培养基包含：蛋白胨5-15g/L、酵母抽提物1-10g/L和氯化钠5-15g/L。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述种子培养使用的培养基包含：蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L和氯化钠10g/L。

18.如权利要求14所述的方法，其中，所述种子培养使用的培养基用氢氧化钠水溶液调节至pH7.0-7.2，并灭菌。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述种子培养使用的培养基在接种前加入无菌过滤的终浓度为50-100mg/L的氨苄青霉素钠水溶液。

20.如权利要求14所述的方法，其中，所述种子培养使用的培养基在种子瓶中的装液量为20-40ml/250ml种子瓶，在三角瓶或发酵瓶中的装液量为50-100ml/500ml三角瓶或发酵瓶。

21.如权利要求14所述的方法，其中所述发酵培养使用的培养基包含：酵母抽提物10-30g/L、氯化钠2-5g/L、氯化铵1-3g/L、磷酸氢二钾0.5-1g/L、磷酸二氢钾0.5-1g/L和七水硫酸镁0.5-1g/L。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述发酵培养使用的培养基包含：酵母抽提物15g/L、氯化钠3g/L、氯化铵2g/L、磷酸氢二钾0.75g/L，磷酸二氢钾0.75g/L和七水硫酸镁0.75g/L。

23.如权利要求14所述的方法，其中，所述发酵培养使用的培养基用氢氧化钠水溶液调节至pH7.0-7.2，并灭菌。

24.如权利要求23所述的方法，其中，所述发酵培养使用的培养基在接种前加入无菌过滤的终浓度为50-100mg/L氨苄青霉素钠水溶液。

25.如权利要求14所述的方法，其中，所述发酵培养使用的培养基的装液量为200-500ml/3000ml三角瓶。

26.根据权利要求13至25中任一项所述的方法，其中在步骤2)中，所述转化的条件包括：菌体或破碎后的菌体的添加量为5-10g/L，底物L-精氨酸浓度为150-250g/L，转化温度为40-50℃，pH值为5.5-7.0；转化时间为5-10h。