CN104136627A - 用于定量受验物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于定量由氨基酸代表的受验物质的方法。该方法包括：使能够转化受验物质并且亦能够使用三磷酸腺苷(ATP)作为底物产生焦磷酸的酶作用于受验物质，并产生焦磷酸的步骤；让丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和定量所产生的丙酮酸的步骤。然后基于所获得的丙酮酸的量确定受验物质的量。根据本发明，可容易并迅速地定量来自于包含大量的各种杂质例如无机磷酸和尿素的生物体的样品中的氨基酸而不受杂质影响。

Description

用于定量受验物质的方法
与相关申请的交叉参考
本申请要求于2012年2月9日在日本专利局提交的日本专利申请号2012-026534和于2012年3月26日在日本专利局提交的日本专利申请号2012-069625的基础上的公约优选权。这些申请的全部公开内容结合到本申请的公开内容中。
技术领域
本发明涉及用于定量焦磷酸的方法，包括允许焦磷酸与丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)反应，和定量作为产物的丙酮酸，其适用于包含三磷酸腺苷(ATP)和无机磷酸的反应系统。本发明还涉及用于定量甲硫氨酸、瓜氨酸或精氨酸的方法，包括允许甲硫氨酸同腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)、瓜氨酸同精氨基琥珀酸合成酶(ASS)或精氨酸同精氨酸脱亚胺酶(ADI)和ASS反应，并通过前述用于定量焦磷酸的方法测量所产生的焦磷酸。
本发明进一步涉及用于测量样品中氨基酸含量的方法，所述方法包括在氨酰-tRNA合成酶(AARS)和(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下使氨基酸反应，并定量产物。
本发明可用于医学领域例如天生代谢异常的筛查、生化领域例如蛋白水解产物分析以及食品和化妆品相关领域例如食品和化妆品的成分分析等等。
背景技术
生物样品包括血液中的氨基酸用作用于检测各种疾病的标记，从医学角度来说强烈需要开发用于定量它们的方法。另外，用于使用酶定量氨基酸的方法具有显示高选择性并允许在温和条件下快速定量的优良特性，因此其被认为是适于在实际医学站点应用于许多样品的方法。特别地，已经知道甲硫氨酸在高胱氨酸尿症患者中以高浓度累积，并且甲硫氨酸用作这些患者的临床普查的重要生物标记。另外，瓜氨酸和精氨酸为尿素循环的代谢产物，用作尿素循环代谢异常包括瓜氨酸尿症或精氨酸酶缺乏症的生物标记。用于定量这些氨基酸的简单且快速的方法也被期望应用于用于检测上述这些疾病的普查。
作为甲硫氨酸的酶定量方法，已知一种使用甲硫氨酸γ裂解酶的定量方法(非专利文献1)，并且已知一种使用功能上修饰的苯丙氨酸脱氢酶的定量方法(专利文献1)对高胱氨酸尿症的普查有效。然而，通过使用甲硫氨酸γ裂解酶的方法，氨也与甲硫氨酸一起被检出。氨通常以20-50 μM的浓度存在于血液中，这是一个等于或高于血液甲硫氨酸浓度的水平。而且，由于血液氨水平还被运动、蛋白摄入等等改变，基于以上方法的血液检验大大受氨影响。而且，除甲硫氨酸外，甲硫氨酸γ裂解酶还显示与含硫氨基酸例如半胱氨酸和高半胱氨酸的反应性。因此，通过该定量方法，难以选择性地定量包含这些含硫氨基酸的样品中的甲硫氨酸。此外，由于功能上修饰的苯丙氨酸脱氢酶还显示与除甲硫氨酸外的其它支链氨基酸的反应性，因此用于除去支链氨基酸的预处理是需要的。
作为用于定量瓜氨酸的方法，已知一种包括使瓜氨酸与丁酮肟反应并检测产物显色的方法(非专利文献2)。然而，由于尿素及其类似化合物也类似瓜氨酸反应，该方法不能用于包含大量尿素的生物样品。而且，其还具有其它问题，例如，需要在酸性和高温条件下孵育的复杂操作，并且由于其为终止反应方法，不能监测瞬时瓜氨酸产生。另外，尚未知任何用于使用酶定量瓜氨酸的方法。
作为用于定量精氨酸的酶方法，已知一种使用精氨酸酶和尿素酶的定量方法(专利文献2)。由于在该定量方法中尿素和氨也与精氨酸一起被检测，该方法不能用于包含它们的生物样品。
作为用于定量焦磷酸的酶方法，存在一种用焦磷酸酶从焦磷酸产生无机磷酸并通过各种检测方法中的任一种定量无机磷酸的方法(I-a)。作为基于该原理的商业产品，PiPer焦磷酸测定试剂盒由Invitrogen出售，EnzChek焦磷酸测定试剂盒由Probe出售。然而，由于该测量方法还测出与焦磷酸一起的无机磷酸，该测量方法不能用于包含无机磷酸作为污染物的样品。另外，作为用于定量焦磷酸的酶方法，还存在用ATP硫酸化酶或PPDK从焦磷酸产生ATP并通过各种检测方法中的任一种定量ATP的方法(I-b) (专利文献3和4)。作为基于该原理的商业产品，PPiLight无机焦磷酸测定试剂盒由Lanza Rockland出售。对于该方法中ATP的检测，使用了利用荧光素酶的发光方法或循环测定方法。然而，由于该原理，该方法不能用于包含ATP作为污染物的样品，并且当通过发光方法进行检测时，随时间流逝发光迅速衰退，因此此测量必须在严格的测量条件下使用昂贵的发光测量装置进行。基于循环测定法的检测可以以高灵敏度进行，但测量变得复杂，例如，监测吸光度以严格计算反应速率是必需的。此外，关于基于以上原理的测量，还已知一种使得能够甚至在包含ATP的样品中测量的改进方法(参考专利文献5)。然而，该方法使用进行ATP移除作为预处理，然后定量焦磷酸的步骤。因此，该方法可用于其中从反应系统除去ATP不引起任何问题的情况，但其不能用于其中需要ATP存在的反应系统。
此外，还已知用次黄嘌呤磷酸核糖转移酶从焦磷酸产生次黄嘌呤并定量次黄嘌呤的方法(I-c) (专利文献6)。此方法中使用的反应底物不包含无机磷酸和ATP，因此该方法使得能够测量焦磷酸而不受这些化合物的存在情况影响。然而，通过此方法，ATP不能响应焦磷酸消耗而再生。
氨酰-tRNA合成酶(AARS)为通过使用一种特定的氨基酸、ATP和tRNA作为底物产生氨酰-tRNA、AMP和焦磷酸的酶。存在与各个构成蛋白质的氨基酸相应的AARS。与各个构成蛋白质的氨基酸相应的AARS后文中用氨基酸名连上“RS”表示。例如，与丙氨酸相应的AARS表示为“AlaRS”，与半胱氨酸相应的AARS表示为“CysRS”。
已知AARS对氨基酸显示非常高的底物特异性。该酶催化的反应由以下的两步反应组成。
[方程式1]
从非专利文献3等知道，如上述反应式所示形成了“(氨酰-AMP)-AARS复合物”，此复合物为刚性的，AARS在不存在tRNA的情况下仍然被捕获在该复合物中，等等。非专利文献3还描述，若将羟胺加入前述复合物中，该复合物分解产生氨基酸异羟肟酸和AMP。
非专利文献4报道了一种用于定量氨基酸的方法，包括加入极小量的tRNA使样品中的部分氨基酸按照前述反应式1和2反应。
专利文献7和8报道了一种用于定量氨基酸的方法，包括仅允许样品中一部分氨基酸类似于前述反应式1的反应反应，而不添加tRNA。
现有技术参考
专利文献
专利文献1：日本专利未实审的公布(Kokai)号2008-86312，用于使用功能上修饰的苯丙氨酸脱氢酶分析生物样品中的L-甲硫氨酸的方法。
专利文献2：日本专利未实审的公布(Kokai)号8-336399，用于检测精氨酸的方法和精氨酸传感器。
专利文献3：日本专利未实审的公布(Kokai)号2009-225784，用于测量焦磷酸的方法。
专利文献4：日本专利未实审的公布(Kokai)号2007-097471，用于测定核苷酸序列的方法和试剂。
专利文献5：日本专利未实审的公布(Kokai)号2006-187251，用于定量焦磷酸的方法。
专利文献6：日本专利未实审的公布(Kokai)号2003-174900，用于定量焦磷酸和核酸的方法及其装置。
专利文献7：日本专利未实审的公布(Kokai)号2011-50357，用于分析氨基酸的方法和生物传感器。
专利文献8：日本专利未实审的公布(Kokai)号2006-166709，用于氨基酸分析的生物传感装置、用于氨基酸分析的生物传感器和用于氨基酸分析的氨酰-tRNA合成酶。
非专利文献
非专利文献1：Research of psychosomatic disorders, Ministry of Health and Welfare （心身障碍研究，卫生福利部），1993，"Research on evaluation method of mass screening system (普查系统评估方法的研究)", 第237-240页(1993)
非专利文献2：Boyde, T.R. & Rahmatullah M. (1980), Optimization of conditions for the colorimetric determination of citrulline, using diacetylmonoxime (使用丁酮肟比色测定瓜氨酸的条件的优化)，Anal. Biochem., 107, 424-431
非专利文献3：Baldwin, A.N. & Berg, P. (1966)，Transfer ribonucleic acid-induced hydrolysis of valyl adenylate bound to isoleucyl ribonucleic acid synthetase (转移核糖核酸诱导的与异亮氨酰核糖核酸合成酶结合的缬氨酰腺苷酸的水解)，J. Biol. Chem., 241, 839-845
非专利文献4：Forbes, C.D., Myung, J., Szewczak, A.A. & Landro, J.A. (2007), A high-throughput competitive scintillation proximity aminoacyl-tRNA synthetase charging assay to measure amino acid concentration (测量氨基酸浓度的高通量竞争性闪烁迫近氨酰-tRNA合成酶负载测定法)，Anal. Biochem., 363, 246-254
发明简述
本发明要达到的目标
生物样品(包括血浆)包含大量的各种各样的污染物，包括无机磷酸和尿素，用于分析它们中所包含的受验物质的方法需要不受这些污染物影响。
通过使用ATP与测量的受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶非常有希望作为用于测量的酶，这是由于其高底物特异性和其基于ATP水解(此为放能反应)的高反应性。基于ATP水解的高反应性具体地描述为反应可不可逆地前进，反应可以以高反应速率前进，可促进甚至由于局部高能的缺点没有ATP水解不能前进的各种反应，等等。而且，由于血液焦磷酸浓度在几μM以下，大大低于以几十至几百μM级存在的氨基酸浓度，焦磷酸产生酶的使用具有这样的优点，即，即使样品被检验目标来源的焦磷酸污染，也几乎不影响氨基酸的定量值。作为使用这样的焦磷酸产生酶用于分析生物样品的前提，定量焦磷酸是必需的，并且用于定量焦磷酸的方法需要满足下列要求：
其可用于包含大量无机磷酸的生物样品。
其可在用于与使用ATP作为底物的焦磷酸产生酶偶联的ATP的存在下进行。
其可从焦磷酸再生ATP，避免酶促反应产物的累积和底物的再生。
然而，还未知任何满足这些要求的用于定量焦磷酸的方法，因此使用前述焦磷酸产生酶测量氨基酸还未实际进行。
已知AARS对氨基酸显示极高的底物特异性，而且其为有希望作为用于定量氨基酸的酶的酶。
非专利文献4的定量方法为这样一种方法，其包括混合样品、ATP、tRNA和作为测量对象的放射性标记氨基酸，然后允许AARS作用于该混合物，将所产生的氨酰-tRNA吸附在小珠上并测量其放射性以定量作为测量对象的氨基酸。在非专利文献4的定量方法中，使用放射性同位素是不可避免的，这是因为该方法计算掺入产物中的标记氨基酸的存在比率。因此，该定量方法仅可在可以处理放射性同位素的环境中使用。而且，该定量方法还需要复杂的过程例如吸附在小珠上和从小珠分离。此外，在该定量方法中，tRNA以高达0.5 mg/ml的高浓度作为最大浓度加入到反应混合物中。然而，如果将该浓度转化为相应于作为测量对象的氨基酸的tRNA摩尔浓度，计算为30 (μg)/60 (μl)/30,000 (g/mol)/20 = 0.8 μM (假定tRNA的分子量为30,000，并且包含等量的与氨基酸相应的20种tRNA)。所获反应产物的摩尔浓度低于前述浓度，并且不使用放射性同位素难以定量如此小量的化合物。因此，在这样的如非专利文献4添加tRNA的方法中，必须检出极小量的反应产物，可以说使用放射性同位素是不可避免的。
专利文献7和8的定量方法为包括仅使氨基酸、ATP和AARS反应(该反应条件后文将被称为“无tRNA添加的条件”)并检测产物的方法。由于在这些定量方法中不使用tRNA，认为前述反应式2的反应不能前进。
在专利文献7和8中，没有讨论如反应式1中提到的(氨酰-AMP)-AARS复合物的存在，但其描述AARS催化下列反应式1'的反应。如果假定反应如反应式1'中所述前进，并且平衡被打破使得反应完全向右前进，可认为焦磷酸以与氨基酸相同的摩尔数产生，并且可通过定量焦磷酸定量氨基酸。然而，这两篇发明专利均未提及不是反应式1的反应而是反应式1'的反应前进这一描述的任何基础。
[方程式2]
(反应式1')氨基酸+ATP氨酰-AMP+焦磷酸
本发明的发明人在如专利文献7和8所述的无tRNA添加的条件下进行了测量。然而，至少通过本发明的发明人所使用的检测方法，不能检测到显著的焦磷酸产生(参考实施例6、11，无羟胺添加的样品)。认为无显著焦磷酸产生的原因为实际发生的反应不是前述反应式1'的反应，而是前述反应式1的反应。在反应式1的反应中，当1摩尔氨基酸反应，消耗1摩尔AARS用于形成复合物。因此，除非AARS以至少比样品中氨基酸高的摩尔浓度加入到系统中，否则理论上不可能产生与样品中氨基酸相同量的焦磷酸。
本发明的发明人在实施例6、11中所使用的反应混合物中的AARS浓度为约9 μM，显著低于氨基酸浓度。而且，专利文献7、8和非专利文献4中未描述AARS以高于作为测量对象的氨基酸的摩尔浓度加入到系统中。在专利文献2中(段落[0024])，定量0-100 μM氨基酸时的AARS浓度为10 μM，因此可以说AARS没有以高于氨基酸的浓度添加。因此，认为以下是合理的：若假定反应式1的反应在专利文献7和8的方法中前进到最大程度，则样品中仅极小部分氨基酸可用于该反应并且产物也小量获得。前述专利文献中没有显示否定上述的任何数据。
如果与样品中的氨基酸相比仅产生极小量的产物，则如专利文献7中所使用的基于荧光方法、传感器电极等这样的高灵敏度的检测系统变得不可避免，并且用广泛使用的检测系统例如基于吸光度方法的那些进行检测变得不可能。而且，甚至当使用高灵敏度检测系统时，可导致各种问题，例如灵敏度降低、测量值变化和背景值提高。
如上所述，使用AARS的已知氨基酸定量方法具有问题，例如，其需要使用放射性同位素的复杂过程，以及仅样品中极小部分氨基酸可反应，因此它们没有被广泛使用。
用于达到本发明目标的手段
本发明的发明人发现，如果焦磷酸与PPDK反应并且所产生的丙酮酸与丙酮酸脱氢酶或丙酮酸氧化酶反应，可实现焦磷酸的定量而不受无机磷酸或ATP存在的影响，并且能够使ATP再生。
他们进一步发现，如果甲硫氨酸与AdoMetS反应，用前述焦磷酸定量系统测量所产生的焦磷酸，则可选择性地定量甲硫氨酸而不用任何预处理，并实现了基于以上的甲硫氨酸定量系统。而且，他们还发现，如果瓜氨酸与ASS反应，用前述焦磷酸定量系统测量所产生的焦磷酸，则可在温和条件下选择性地定量瓜氨酸，并实现了基于以上的瓜氨酸定量系统。此外，他们还发现，如果精氨酸与ADI反应，用前述焦磷酸定量系统测量所产生的焦磷酸，则可选择性定量精氨酸，并实现了基于以上的精氨酸定量系统。
本发明的发明人进一步发现，在无tRNA添加的条件下AARS反应混合物中未观察到显著的焦磷酸产生，但若加入分解(氨酰-AMP)-AARS复合物的试剂，焦磷酸以与样品中氨基酸相等的量产生。因此，他们发现通过使反应混合物中基本上所有量的氨基酸如前述反应式1的复合物分解反应进行反应可以以高灵敏度和小误差定量氨基酸，并完成本发明。
[1] 用于定量受验物质的方法，包括：
允许可通过使用三磷酸腺苷(ATP)作为底物并对受验物质进行转化而产生焦磷酸的酶作用于受验物质以产生焦磷酸的步骤；
允许丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定受验物质的量。
[2] [1]的方法，其中所述受验物质为氨基酸。
[3] 用于定量甲硫氨酸的方法，包括：
允许腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)在ATP的存在下作用于甲硫氨酸以产生腺苷甲硫氨酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，
和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定甲硫氨酸的量。
[4] 用于定量瓜氨酸的方法，包括：
允许精氨基琥珀酸合成酶(ASS)在天冬氨酸和ATP的存在下作用于瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，
和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定瓜氨酸的量。
[5] 用于定量精氨酸的方法，包括：
允许精氨酸脱亚胺酶(ADI)作用于精氨酸以产生氨和瓜氨酸的步骤；
允许ASS作用于所产生的瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，
和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定精氨酸的量。
[6] 用于定量氨基酸的方法，包括：
允许与氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于该氨基酸和ATP以获得焦磷酸的步骤(A)；和
定量步骤(A)中所产生的焦磷酸的步骤(B)，和
其中步骤(B)包括允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；以及
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
基于所获得的丙酮酸的量确定所述氨基酸的量。
[7] [6]的方法，其中所述复合物分解试剂为胺或负碳离子。
[8] [7]的方法，其中所述复合物分解试剂为羟胺、肼或甲胺。
[9] [6]-[8]中任一项的方法，所述方法在不存在tRNA的情况下进行。
[10] [6]-[9]中任一项的方法，所述方法用于定量一个样品中的两种或更多种氨基酸，并且包括步骤：
制备与作为定量对象的各个氨基酸相应的AARS，
制备包含除AARS外的所需组分的反应试剂，
混合反应试剂与样品，
将混合物至少分成与受验氨基酸的种类数相应的部分，和
向所分成的部分中分别加入不同的AARS。
[11] [6]-[10]中任一项的方法，其中AARS得自嗜热生物，并且步骤(A)在50℃或更高的温度下进行。
[12] [1]-[11]中任一项的方法，其中定量丙酮酸的步骤包括：
允许(i)乳酸脱氢酶、(ii)丙酮酸氧化酶、(iii)丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶或(iv)丙酮酸脱羧酶和醛脱氢酶作用于丙酮酸的步骤。
[13] [1]-[12]中任一项的方法，所述方法用于定量样品中的受验物质，其中所述样品可包含ATP或磷酸。
[14] [13]的方法，其中所述样品得自血液。
[15] 用于[3]中定量甲硫氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、AdoMetS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[16] 用于[4]中定量瓜氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[17] 用于[5]中定量精氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、ADI、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[18] 用于[6]中定量氨基酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、AARS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[19] 用于定量氨基酸的方法，包括：
允许与氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于该氨基酸和ATP以获得反应产物的步骤(A)；和
定量步骤(A)中所产生的产物的步骤(B)，和
其中基于所获得的产物的量确定所述氨基酸的量。
本发明还提供以下：
[1] 用于定量焦磷酸的方法，包括：
允许丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于焦磷酸以产生三磷酸腺苷(ATP)、磷酸和丙酮酸的步骤，和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定焦磷酸的量。
[2] [1]的方法，其中定量丙酮酸的步骤包括：
允许(i)乳酸脱氢酶、(ii)丙酮酸氧化酶、(iii)丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶或(iv)丙酮酸脱羧酶和醛脱氢酶作用于丙酮酸的步骤。
[3] [1]的方法，其用于定量样品中焦磷酸，并且其中所述样品可包含ATP或磷酸。
[4] [3]的方法，其中所述样品得自血液。
[5] 用于定量受验物质的方法，包括：
允许可通过使用ATP作为底物并对受验物质进行转化而产生焦磷酸的酶作用于受验物质以产生焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定受验物质的量。
[6] 用于定量甲硫氨酸的方法，包括：
允许腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)在ATP的存在下作用于甲硫氨酸以产生腺苷甲硫氨酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定甲硫氨酸的量。
[7] 用于定量瓜氨酸的方法，包括：
允许精氨基琥珀酸合成酶(ASS)在天冬氨酸和ATP存在情况下作用于瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定瓜氨酸的量。
[8] 用于定量精氨酸的方法，包括：
允许精氨酸脱亚胺酶(ADI)作用于精氨酸以产生氨和瓜氨酸的步骤；
允许ASS作用于所产生的瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定精氨酸的量。
[9] 用于[6]中定量甲硫氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、AdoMetS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[10] 用于[7]中定量瓜氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
[11] 用于[8]中定量精氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、ADI、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
本发明进一步提供以下：
[1] 用于定量氨基酸的方法，包括：
允许与氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于该氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)以获得反应产物的步骤(A)；和
定量步骤(A)中所产生的产物的步骤(B)，和
其中基于所获得的产物的量确定所述氨基酸的量。
[2] [1]的方法，所述方法在不存在tRNA的情况下进行。
[3] [1]或[2]的方法，其中所述复合物分解试剂为胺或负碳离子。
[4] [3]的方法，其中所述复合物分解试剂为羟胺、肼或甲胺。
[5] [1]-[4]中任一项的方法，其中所述产物在步骤(B)中通过测量吸光度定量。
[6] [1]-[5]中任一项的方法，其中在步骤(B)中定量的产物为焦磷酸，并且焦磷酸的定量包括允许丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)作用于焦磷酸的步骤。
[7] [1]-[6]中任一项的方法，所述方法用于定量样品中的氨基酸，并且所述样品得自血液。
[8] [1]-[7]中任一项的方法，所述方法用于定量一个样品中的两种或更多种氨基酸，并且包括步骤：
制备与作为定量对象的各个氨基酸相应的AARS，
制备包含除AARS外的所需组分的反应试剂，
混合反应试剂与样品，
将混合物至少分成与受验氨基酸的种类数相应的部分，和
向所分成的部分中分别加入不同的AARS。
[9] [1]-[8]中任一项的方法，其中AARS得自嗜热生物，并且步骤(A)在50℃或更高的温度下进行。
发明效果
由于本发明用于定量焦磷酸的方法的定量能力不受无机磷酸或ATP存在的影响，所以其可在包含大量污染物的样品例如血液中进行。而且，由于使用了PPDK，因此在与通过使用ATP作为底物产生焦磷酸的酶的偶联系统中，ATP可从焦磷酸再生。根据本发明，反应完成后系统显示用于定量的信号强度仅小量变化，并且该系统使得能够基于吸光度测量定量。因此，所述方法可方便地甚至在缺乏昂贵的专门用途的装置例如发光检测装置的测量条件中进行。
本发明的甲硫氨酸定量方法可针对包含除甲硫氨酸外的氨基酸或氨的样品作为对象进行而无需任何预处理。而且，由于其不是终止反应方法，并且样品中基本上全部的甲硫氨酸可作为相应量的焦磷酸定量，因而能够容易地监测甲硫氨酸随时间的产生。
本发明的瓜氨酸定量方法可针对包含除瓜氨酸外的氨基酸或尿素的样品作为对象进行而无需任何预处理。而且，其不需要高温孵育，使得能够容易地监测瓜氨酸随时间的产生。
本发明的精氨酸定量方法可针对包含除精氨酸和瓜氨酸外的氨基酸、尿素或氨的样品作为对象进行而无需任何预处理。
与非专利文献4中所述的定量方法相比，本发明使用AARS的定量方法显示了下列无法比拟的优势。
-由于它们不使用放射性同位素及对其的检测装置，故其可用普通装置在普通环境中使用。
-它们不需要复杂的过程例如酶促反应后吸附在小珠上和从小珠分离以及反应混合物与样品的混合，因为样品可用于测量。
-鉴于即使除去吸附在小珠上和后续过程所需要的时间，非专利文献4中所述的定量方法也需要2小时用于测量，本发明方法使能够在约10分钟内测量。
与专利文献7和8中所述的定量方法相比，本发明使用AARS的定量方法显示下列无法比拟的优势。
-由于产物以与样品中氨基酸的量相等的量获得，使得能够进行高灵敏度和高精度定量。
-它们使得能够用普通的吸光度测量而不使用任何荧光试剂或传感器电极定量。
-鉴于专利文献7和8中所述的定量方法分别需要40分钟(专利文献7，段落[0075])和55分钟(专利文献8，段落[0024])用于测量，本发明方法使得能够在约10分钟内测量。
附图简述
[图1] 图1为显示使用乳酸脱氢酶的情况下的焦磷酸校正曲线的曲线图(用比色计测量)。
[图2] 图2为显示使用乳酸脱氢酶的情况下的焦磷酸校正曲线的曲线图(用酶标仪测量)。
[图3] 图3为显示使用丙酮酸氧化酶和显色染料的情况下的焦磷酸校正曲线的曲线图。
[图4] 图4为显示使用丙酮酸氧化酶和荧光染料的情况下的焦磷酸校正曲线的曲线图。
[图5] 图5为显示用包含磷酸或ATP的反应混合物建立的焦磷酸校正曲线的曲线图。
[图6] 图6为显示通过向生物样品中加入焦磷酸所进行的试验的结果的曲线图。
[图7] 图7为显示甲硫氨酸校正曲线的曲线图。
[图8] 图8为显示瓜氨酸校正曲线的曲线图。
[图9] 图9为显示精氨酸校正曲线的曲线图。
[图10] 图10显示加入不同浓度的羟胺(0、50、100、200、400、600、800和1000 mM)时Tyr定量反应混合物的吸光度的瞬时变化。曲线图中的数字(25、50、100和150)代表反应混合物中的Tyr浓度(μM)。水平轴代表开始测量后的时间，垂直轴代表吸光度与无Tyr添加的样品所观察到的吸光度相比的差异。结果通过对每个反应混合物制备一个样品并用其进行测量来获得。
[图11] 图11显示从测量开始后20分钟获得的测量值建立的Tyr校正曲线。曲线图中的数字(0、50、100、200、400、600、800和1000)代表用于各个校正曲线的羟胺浓度(mM)。对于包含200、400、600、800和1000 mM羟胺的样品所获得的结果，还绘制了初级近似线。
[图12] 图12显示Tyr浓度与吸光度差异的相关系数的瞬时变化。曲线图中的数字(0、50、100、200、400、600、800和1000)代表羟胺浓度(mM)。
[图13] 图13显示通过使用得自于栖热袍菌属(Thermotoga)的CysRS获得的Cys校正曲线。
[图14] 图14显示通过使用得自于栖热袍菌属的LysRS获得的Lys校正曲线。
[图15] 图15显示通过使用得自于栖热袍菌属的SerRS获得的Ser校正曲线。
[图16] 图16显示通过使用得自于栖热袍菌属的TyrRS获得的Tyr校正曲线。
[图17] 图17显示通过使用得自于栖热菌属(Thermus)的TyrRS获得的Tyr校正曲线。
[图18] 图18显示通过使用钼蓝方法获得的His校正曲线。
[图19] 图19显示通过使用钼蓝方法获得的Pro校正曲线。
[图20] 图20显示通过使用钼蓝方法获得的Trp校正曲线。
[图21] 图21显示通过使用得自于栖热菌属的IleRS并在70℃进行反应获得的Ile校正曲线。
[图22] 图22显示通过使用得自于栖热菌属的MetRS并在70℃进行反应获得的Met校正曲线。
[图23] 图23显示通过使用得自于栖热菌属的TyrRS并在70℃进行反应获得的Tyr校正曲线。
[图24] 图24显示通过使用肼作为复合物分解试剂获得的Tyr校正曲线。
[图25] 图25显示通过使用甲胺作为复合物分解试剂获得的Tyr校正曲线。
用于实施本发明的方式
本发明提供用于定量受验物质的方法，受验物质的典型实例包括氨基酸。本发明方法包括下列步骤：
允许可通过使用三磷酸腺苷(ATP)作为底物并对受验物质进行转化而产生焦磷酸的酶作用于受验物质以产生焦磷酸的步骤；
允许丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤。
此外，在本发明的方法中，受验物质的量基于所获得的丙酮酸的量确定。本发明的方法还具有这样的特征，第一步反应里消耗的ATP在检测焦磷酸的同时再生。
作为通过使用ATP与受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶，已经知道多种不同的酶，并且根据EC分类已注册几十种以上的酶。实例包括，例如，黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶(FAD合成酶)、磷酸核酮糖激酶、链霉素3''-腺苷酰转移酶、生物素-CoA连接酶和乙酰乙酸-CoA连接酶。在本说明书中，通过使用ATP与受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶可通过举例来说明，特别是腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)、精氨基琥珀酸合成酶(ASS)、精氨酸脱亚胺酶(ADI)和氨酰-tRNA合成酶(AARS)，但本领域技术人员将能够理解的是，此说明可适当应用于其它酶的使用。
通过使用ATP与受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶可根据来源、存在位置(细胞膜、细胞质、细胞外等)、底物特异性和反应特异性、活性位点、活性位点的残基等等分类。例如，虽然目前为止尚未知任何不含AARS的生物，但存在不含AdoMetS、ASS或ADI的生物。另外，AdoMetS和ASS与氨基酸的侧链部分反应，AARS与氨基酸的羧基反应。
I. 用于利用特别的焦磷酸定量方法定量氨基酸的方法
根据本发明的一个实施方案，提供了使用特别的用于定量焦磷酸的方法来定量甲硫氨酸的方法、定量瓜氨酸的方法和定量精氨酸的方法。
本发明使用的术语受验物质的“定量(定量化)”意指测量受验物质的量，除非特别指明，并且该量可测量为绝对量，或可测量为样品中的浓度。
[用于定量焦磷酸的方法]
本发明用于定量焦磷酸的方法包括：
允许PPDK在金属离子、AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤(I-A)，和
定量所产生的丙酮酸的步骤(I-B)，和
基于所获得的丙酮酸的量确定焦磷酸的量。
步骤(I-A)可通过用PPDK、金属离子、AMP和PEP孵育样品中的焦磷酸来进行。PPDK催化的反应由下列反应式表示。
[式1]
焦磷酸 + PEP + AMP → 丙酮酸 + ATP + 磷酸
本发明使用的术语“磷酸”指无机磷酸(H3PO4)，除非特别指明。磷酸还可被称为正磷酸。
用于本发明的PPDK不受来源、酶名称、EC编号、生产方法等限制，只要其为显示对前述反应的催化作用的酶。例如，得自丙酸杆菌属(Propionibacterium)或热变形菌属(Thermoproteus)的那些，更特别地，可优选使用得自费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii) (Pf)和附着热变形菌(Thermoproteustenax) (Tt)的那些。Pf-来源的PPDK为充分研究的细菌来源的酶的一种。其优势在于可期望在大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统中大量表达，其可作为与甘油的混合物在4℃稳定贮存，并且甚至反复冻融后不显示活性显著降低。由于Tt为超级嗜热生物，Tt-来源的PPDK在这些方面占优势：可期望其能在常温下纯化，并且甚至在高温时其不变性且可用。更特别地，可优选使用得自费氏丙酸杆菌亚种shermanii NBRC 12426菌株或附着热变形菌 NBRC 100435菌株的酶。
所使用的PPDK的量无特别限制，只要其使得能够进行本发明的焦磷酸定量，并且其可适当地根据样品中包含的焦磷酸的量、使用的装置、PPDK纯度和类型决定。所使用的PPDK的量，就最低量而言，优选0.001 U/ml或更多、更优选0.005 U/ml或更多、还更优选0.01 U/ml或更多。无论如何，就最大量而言，所述量优选10 U/ml或更低、更优选5 U/ml或更低、还更优选1 U/ml或更低。
步骤(I-A)在AMP的存在下进行。存在的AMP浓度，就最小浓度而言，为0.01 mM或更高、更优选0.025 mM或更高、还更优选0.05 mM或更高。此外，无论如何，就最大浓度而言，优选20 mM或更低、更优选10 mM或更低、还更优选5 mM或更低。
步骤(I-A)还在高能磷酸化合物例如PEP的存在下进行。存在的PEP浓度，就最小浓度而言，优选0.01 mM或更高、更优选0.025 mM或更高、还更优选0.05 mM或更高。而且，无论如何，就最大浓度而言，优选20 mM或更低、更优选10 mM或更低、还更优选5 mM或更低。
步骤(I-A)优选在金属离子的存在下进行。所述金属离子可为镁离子、钴离子和锰离子中的任一种，并且优选镁离子。所使用的金属离子的量，就最小量而言，在例如镁离子的情况下，优选AMP浓度的0.1当量或更多、更优选AMP浓度的0.2当量或更多、还更优选AMP浓度的0.4当量或更多。而且，无论如何，就最大量而言，优选10当量或更低、更优选5当量或更低、还更优选2.5当量或更低。最优选的量为磷酸供体的0.5-2当量，例如，1当量。
在步骤(I-B)中，反应系统中的丙酮酸被定量，并且其可通过使用例如乳酸脱氢酶反应定量。乳酸脱氢酶为一种分布在广泛范围的生物中的酶，并且催化下列反应。
[式2]
丙酮酸+ NADH → 乳酸+ NAD+
对于本发明，可使用得自于各种生物的乳酸脱氢酶。例如，得自兔子、猪、牛、家禽、乳酸菌或酵母的多种乳酸脱氢酶已在市场出售，并且可优选使用这些中的任一种。
所使用的乳酸脱氢酶的量无特别限制，只要使得能够进行本发明焦磷酸的定量，并且可适当地根据样品包含的焦磷酸的量、使用的装置、酶纯度和类型决定。所使用的酶量，就最小量而言，优选0.002 U/ml或更多、更优选0.005 U/ml或更多、还更优选0.01 U/ml或更多。此外，无论如何，就最大量而言，优选4 U/ml或更低、更优选2 U/ml或更低、还更优选1 U/ml或更低。
此外，步骤(I-B)还在NADH的存在下进行。NADH浓度的影响比较显著。例如，如果NADH浓度过度低，则吸光度的检测变得困难，如果其过度高，其减少量的测量值的精确度降低。存在的NADH的量，就最小浓度而言，优选0.01 mM或更高、更优选0.02 mM或更高、还更优选0.05 mM或更高。无论如何，就最大浓度而言，优选4 mM或更低、更优选2 mM或更低、还更优选1 mM或更低。
在使用乳酸脱氢酶的系统中，丙酮酸的产量通过测量340 nm处的吸光度测量NADH量的减少来计算，NADH的量随反应前进减少。
使用乳酸脱氢酶的步骤(I-B)可与步骤(I-A)在同一系统中同时前进。尽管反应温度适当地考虑所使用酶的最佳温度等决定，反应可适当地在室温至37℃，例如30℃的温度下进行。尽管反应时间可适当地考虑试验样品中含有的焦磷酸的量等决定，但反应迅速前进，样品中基本上全部量的焦磷酸可在20分钟内，例如约7-13分钟内用于NADH的氧化。若需要，这些步骤可在适当的缓冲液例如20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)中进行。上述系统中的组分浓度可由本领域技术人员适当确定，例如，其可在下列范围内。
MgCl2：0.5-50 mM
PEP：0.05-5 mM
AMP：0.05-5 mM
NADH：0.05-1 mM
PPDK：0.01-1 U/ml
乳酸脱氢酶：0.01-1 U/ml
在使用乳酸脱氢酶反应的实施方案中，可定量至少0-200 μM范围内的焦磷酸。
步骤(I-B)也可在过氧化氢检测系统中通过使用丙酮酸氧化酶催化的反应进行。
丙酮酸氧化酶催化下列反应。
[式3]
丙酮酸 + 磷酸 + O2 + H2O → 乙酰磷酸 + 二氧化碳 + H2O2
可用于本发明的丙酮酸氧化酶无特别限制，可优选使用得自不同类型的生物的那些，例如，得自假单胞菌属(Pseudomonas)的那些。
所使用的丙酮酸氧化酶的量无特别限制，只要使得能够进行本发明的焦磷酸定量，并且可适当地根据样品中包含的焦磷酸的量、使用的装置、酶的纯度和类型决定。所使用的酶量，就最小量而言，优选0.03 U/ml或更多、更优选0.07 U/ml或更多、还更优选0.15 U/ml或更多。无论如何，就最大量而言，优选60 U/ml或更少、更优选30 U/ml或更少、还更优选15 U/ml或更少。
由丙酮酸氧化酶作用所产生的过氧化氢可通过已知的方法，例如通过使用过氧化物酶反应定量。所述过氧化物酶可为任何可用于定量过氧化氢的过氧化物酶，并且其实例包括辣根来源的过氧化物酶。
所使用的过氧化物酶的量无特别限制，只要使得能够进行本发明的焦磷酸定量，并且可适当地根据样品中包含的焦磷酸的量、使用的装置、酶的纯度和类型决定。所使用的酶量，就最小量而言，优选0.03 U/ml或更多、更优选0.07 U/ml或更多、还更优选0.15 U/ml或更多。无论如何，就最大量而言，优选300 U/ml或更少、更优选150 U/ml或更少、还更优选75 U/ml或更少。
另外，作为与过氧化物酶反应的电子受体，可使用可用作所使用的过氧化物酶的底物的任何显色剂或荧光剂。显色剂的实例包括，例如，4-氨基安替比林:苯酚等。伴随辣根来源的过氧化物酶，过氧化氢与前述显色剂如下所示反应，并且作为产物的醌亚胺染料可通过在505 nm处测量吸光值检测。
[式4]
2H2O + 4-氨基安替比林 + 苯酚 → 醌亚胺染料 + 4H2O
此外，与过氧化物酶反应的荧光剂的实例包括10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪(ADHP)等。伴随辣根来源的过氧化物酶，过氧化氢与ADHP反应产生荧光物质试卤灵(resorufin)，并且其可基于590 nm处的荧光(激发，530 nm)检测。本领域技术人员可根据使用的过氧化酶类型适当地选择显色剂和荧光剂例如，4-氨基安替比林和ADHP。此外，检测波长也可由本领域技术人员根据使用的显色剂或荧光剂类型适当地选择。
使用丙酮酸氧化酶的步骤(I-B)也可与步骤(I-A)在同一系统中同时前进。尽管反应温度考虑所使用酶的最佳温度等适当决定，但反应可适当地在室温至37℃，例如30℃的温度下进行。尽管反应时间可考虑试验样品中包含的焦磷酸的量适当决定，但反应迅速前进，样品中基本上全部量的焦磷酸可在20分钟内，例如约7-13分钟内用于产生过氧化氢。若需要，这些步骤可在适当的缓冲液例如20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)中进行。
当所有的步骤在同一系统中通过使用4-氨基安替比林和苯酚进行时，组分的浓度可由本领域技术人员适当地确定，并且例如，其可在下列范围内。
MgCl2：2.5-250 mM
NH4Cl：1-100 mM
PEP：0.05-5 mM
AMP：0.05-5 mM
PPDK：0.01-1 U/ml
4-氨基安替比林：0.1-10 mM
苯酚：0.1-10 mM
丙酮酸氧化酶：0.15-15 U/ml
过氧化物酶：0.15-75 U/ml
在使用4-氨基安替比林和苯酚的实施方案中，可定量至少0-200 μM范围内的焦磷酸。
当所有的步骤在同一系统中通过使用ADHP进行时，组分的浓度可由本领域技术人员适当地确定，并且例如，其可在下列范围内。
MgCl2：0.5-50 mM
NH4Cl：1-100 mM
PEP：0.05-5 mM
AMP：0.05-5 mM
PPDK：0.01-1 U/ml
Na-PO4：0.05-5 mM
ADHP：50 μM
丙酮酸氧化酶：0.15-15 U/ml
过氧化物酶：0.15-75 U/ml
在使用ADHP的实施方案中，可定量至少0-10 μM范围内的焦磷酸。根据此实施方案，可测量痕量的焦磷酸。
步骤(I-B)还可为在这样的系统中进行的步骤，所述系统经构建使得除两种前述酶外丙酮酸还与显色剂例如2,4-二硝基苯肼反应，并测量产物的吸光度。值得推荐的是关注该系统用除丙酮酸外的2-含氧酸可同样显色这一事实。步骤(I-B)还可在经构建使得通过使用丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶检测NADH的减少的系统中进行。此外，其还可为在经构建使得通过使用丙酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶检测NADH产生的系统中进行的步骤。进行这些步骤所需的条件可由本领域技术人员适当地设计。
本发明用于定量焦磷酸的方法可甚至在焦磷酸或ATP的存在下进行。此外，其具有可产生ATP这一优点。作为用于定量焦磷酸的常规方法，存在用焦磷酸酶从焦磷酸产生无机磷酸并通过各种检测方法中的任一种定量无机磷酸的方法(I-a)、用ATP硫酸化酶或PPDK从焦磷酸产生ATP并通过各种检测方法中的任一种定量ATP的方法(I-b)和用次黄嘌呤磷酸核糖转移酶从焦磷酸产生次黄嘌呤并定量次黄嘌呤的方法(I-c)，但它们不具有如上所述的特征。
本发明方法和常规方法的特征在下表中概括给出。
[表1]
  常规方法1-a 常规方法1-b 常规方法1-c 本发明的焦磷酸定量方法
无机磷酸的存在下定量 X O O O
ATP的存在下定量 O X O O
ATP再生 X O X O
O ... 可能的，X ... 不可能的
由于本发明用于定量丙酮酸的方法也可在ATP的存在下进行，因此其可在用于定量受验物质的方法中使用，其中受验物质的定量与通过使用ATP与测量的受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶促反应偶联(两种或更多种酶催化的连续反应，特别地其中一种酶产生的产物用作另一种酶的底物的连续反应)。由于通过使用ATP与测量的受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶显示高度的底物特异性和基于作为放能反应的ATP水解的高反应性，因此非常有希望作为用于测量的酶。所测量的受验物质的实例包括甲硫氨酸、瓜氨酸、精氨酸等等。
在其中测量焦磷酸依赖性的吸光度减少的本发明方法中，还可发生焦磷酸非依赖性的吸光度减少，尽管其可能非常微弱地发生。此非依赖性的吸光度减少的速度与PPDK的添加量成比例。因此，如果向反应混合物中加入的PPDK大大过量，焦磷酸非依赖性的吸光度减少变大，并且可导致误差。因此，根据本发明，PPDK的活性量相对于一起使用的酶(乳酸脱氢酶、稍后描述的AdoMetS等)优选受到抑制。这是因为，如果如上所述抑制PPDK的活性量，则PPDK催化的反应成为反应中的限速步骤，并且前述吸光度降低的影响可被抑制。此外，PPDK为催化可逆反应的酶，因此即使允许反应在焦磷酸存在情况下单独用该酶进行，反应也在焦磷酸完全消耗前达到平衡。然而，在其中允许反应同时在同一系统中进行的本发明实施方案中，该反应与由基本上不可逆催化反应的酶例如乳酸脱氢酶(在存在足够量的NADH的情况下反应基本上完全向生产乳酸前进)和丙酮酸氧化酶(催化不可逆反应)催化的反应偶联，由此焦磷酸可基本上完全转化。而且，稍后描述的AdoMetS、ASS和ADI也为显示强烈的不可逆性的酶，并且认为它们也有助于全部量的底物反应。
从上述观点出发，在其中反应在同一系统进行的本发明方法中，PPDK的量可为，例如乳酸脱氢酶的量的1/20-1/2，优选1/10-1/2，或AdoMetS、ASS或ADI的量的1/10-1/1.5，优选1/5-1/1.5。
[用于定量甲硫氨酸的方法]
本发明用于定量甲硫氨酸的方法包括：
允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤(II-A)；和
定量所产生的丙酮酸的步骤(II-B)，
其中基于所获得的丙酮酸的量确定甲硫氨酸的量，并且焦磷酸通过步骤(II-C)，即允许腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)在ATP的存在下作用于甲硫氨酸以产生腺苷甲硫氨酸和焦磷酸的步骤产生。
步骤(II-C)可通过用腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)和ATP孵育试验样品中的甲硫氨酸进行。AdoMetS催化的反应通过下列反应式表示。
[式5]
甲硫氨酸 + ATP + H2O → 腺苷甲硫氨酸 + 焦磷酸 + 磷酸
本发明使用的术语“甲硫氨酸”指L-甲硫氨酸，除非特别指明。此外，“腺苷甲硫氨酸合成酶”可通常称为“S-腺苷甲硫氨酸合成酶”或“甲硫氨酸腺苷转移酶”。
对于本发明，可使用得自多种不同生物中的任一种的AdoMetS。AdoMetS分布在相当广范围的微生物中。例如，已知得自大肠杆菌和酵母的那些，并且可优选使用这些中的任一种。如果酶得自宿主，则预期可获得大表达量，因此当在作为宿主的大肠杆菌中表达并使用时，可选择得自大肠杆菌的酶。
所使用的AdoMetS的量无特别限制，只要使得能够进行甲硫氨酸的定量，并且其可根据样品中包含的甲硫氨酸的量、使用的装置、酶纯度和类型适当地决定。所使用的酶的量，就最小量而言，优选0.001 U/ml或更多、更优选0.005 U/ml或更多、还更优选0.01 U/ml或更多。此外，无论如何，就最大量而言，优选10 U/ml或更低、更优选5 U/ml或更低、还更优选1 U/ml或更低。
对前述步骤(I-A)和步骤(I-B)的说明分别适用于步骤(II-A)和(II-B)，除非特别说明。
步骤(II-B)可为在构建为使用乳酸脱氢酶的系统或使用丙酮酸氧化酶的系统的系统中进行的步骤。此外，如前述步骤(I-B)，步骤(II-B)可为在经构建使得丙酮酸与显色剂例如2,4-二硝基苯肼反应并测量产物吸光度的系统中进行的步骤，在经构建使得通过使用丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶检测NADH减少的系统中进行的步骤或在经构建使得通过使用丙酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶检测NADH产生的系统中进行的步骤。
步骤(II-A)、步骤(II-B)和步骤(II-C)可在同一系统中同时前进。尽管反应温度考虑所使用酶的最佳温度等等适当决定，但反应可适当地在室温-37℃，例如30℃的温度下适当进行。虽然反应时间可考虑试验样品中所包含的焦磷酸的量等等适当决定，但反应迅速进行，并且基本上样品中全部量的甲硫氨酸可在20分钟内，例如在约7-13分钟内作为相应量的丙酮酸测量。如果需要，这些步骤可在适当的缓冲液例如20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)中进行。
系统中组分的浓度可由本领域技术人员适当确定，并且例如，其可在下列范围内。
MgCl2：0.5-50 mM
ATP：0.1-10 mM
PEP：0.04-4 mM
AMP：0.04-4 mM
NADH：0.025-2.5 mM
PPDK：0.01-1 U/ml
AdoMetS：0.01-1 U/ml
乳酸脱氢酶：0.01-1 U/ml
在使用乳酸脱氢酶反应的实施方案中，可定量至少0-200 μM范围内的甲硫氨酸。
此外，通过本发明方法，可选择性地定量甲硫氨酸，即使样品被除甲硫氨酸外的构成蛋白质的19种氨基酸和氨污染。
[用于定量瓜氨酸的方法]
本发明用于定量瓜氨酸的方法包括：
允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤(III-A)；和
定量所产生的丙酮酸的步骤(III-B)，
其中基于所获得的丙酮酸的量确定瓜氨酸的量，并且焦磷酸通过步骤(III-C)，即，允许精氨基琥珀酸合成酶(ASS)在天冬氨酸(Asp)和ATP的存在下作用于瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤产生。
步骤(III-C)可通过用ASS、ATP等孵育试验样品中的瓜氨酸进行。ASS催化的反应通过下列反应式表示。
[式6]
瓜氨酸 + ATP → 精氨基琥珀酸 + AMP + 焦磷酸
作为ASS，可使用得自不同种生物的那些。ASS分布在相当广范围的微生物中。例如，已知得自大肠杆菌或酵母中的那些，并且可优选使用这些中的任一种。如果酶得自宿主，则预期可获得较大的表达量，因此当其在作为宿主的大肠杆菌中表达并使用时，可选择得自大肠杆菌的酶。
所使用的ASS的量无特别限制，只要使得能够进行瓜氨酸的定量，并且其可根据样品中所包含的瓜氨酸的量、使用的装置、酶的纯度和类型适当决定。所使用的酶的量，就最小量而言，优选0.001 U/ml或更多，更优选0.005 U/ml或更多，还更优选0.01 U/ml或更多。此外，无论如何，就最大浓度而言，优选10 U/ml或更低, 更优选5 U/ml或更低, 还更优选1 U/ml或更低。
前述步骤(I-A)和步骤(I-B)的说明分别适用于步骤(III-A)和步骤(III-B)，除非特别说明。
步骤(III-B)可为在构建为使用乳酸脱氢酶的系统或使用丙酮酸氧化酶的系统的系统中进行的步骤。此外，如同前述步骤(I-B)，步骤(III-B)可为在经构建使得丙酮酸与显色剂例如2,4-二硝基苯肼反应并测量产物的吸光度的系统中进行的步骤、在经构建使得通过使用丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶检测NADH减少的系统中进行的步骤或在经构建使得通过使用丙酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶检测NADH产生的系统中进行的步骤。
步骤(III-A)、步骤(III-B)和步骤(III-C)可在同一系统中同时前进。虽然反应温度考虑所使用酶的最佳温度等等适当决定，但反应可在室温-37℃，例如30℃的温度下适当进行。虽然反应时间可考虑试验样品中所包含的焦磷酸的量等等适当决定，但反应迅速前进，并且基本上样品中全部量的瓜氨酸可在20分钟内、例如约7-13分钟内作为相应量的丙酮酸测量。如果需要，这些步骤可在适当的缓冲液例如20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)中进行。
当反应在同一系统中进行时，AMP在其中涉及ASS的反应中产生，因此添加AMP理论上不是必不可少的，但如果不加入AMP，则可能出现下文所述的影响。如果不加入AMP，则AMP浓度变得低于加入AMP情况下的浓度(其变成在每个时间点与焦磷酸浓度相同的浓度)，因此PPDK反应的反应速率可降低。认为此影响特别是在反应结束前一刻变得更显著。当所有焦磷酸被反应消耗时，不仅焦磷酸浓度，而且AMP浓度也相应降低，并且由于两个底物浓度降低，PPDK反应可变得及其难以前进。这可导致大量未反应的焦磷酸残留。在这样的情况下，定量化的量比正确值低了未反应焦磷酸所对应的量，因此定量值可变得不准确。
系统中组分的浓度可由本领域技术人员适当确定，并且例如，其可在下列范围内。
MgCl2：0.5-50 mM
天冬氨酸：0.2-20 mM
PEP：0.02-2 mM
ATP：0.1-10 mM
AMP：0.025-2.5 mM
NADH：0.025-2.5 mM
PPDK：0.01-1 U/ml
ASS：0.01-1 U/ml
乳酸脱氢酶：0.01-1 U/ml
在使用乳酸脱氢酶反应的实施方案中，可定量至少0-200 μM范围内的瓜氨酸。
通过本发明方法，可在20种构成蛋白质的氨基酸和尿素的污染的存在下选择性地定量瓜氨酸。此外，甚至当试验样品被天冬氨酸污染时，该方法也使得能够选择性地定量瓜氨酸。
[用于定量精氨酸的方法]
本发明用于定量精氨酸的方法包括：
允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤(IV-A)；和
定量所产生的丙酮酸的步骤(IV-B)，
其中基于所获得的丙酮酸的量确定精氨酸的量，并且焦磷酸通过允许精氨酸脱亚胺酶(ADI)作用于精氨酸以产生氨和瓜氨酸的步骤(IV-D)产生；和
允许ASS作用于产生的瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤(IV-C)。
步骤(IV-D)可通过用精氨酸脱亚胺酶(ADI)孵育试验样品中的精氨酸进行。此ADI催化的反应通过下列反应式表示。
[式7]
精氨酸 → 瓜氨酸 + 氨
本发明使用的术语“精氨酸”指L-精氨酸，除非特别指明。
作为用于本发明的ADI，可使用得自不同种生物的那些。例如，已知得自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和乳酸细菌的那些，并且可优选使用这些中的任一种。此外，可制备和使用得自铜绿假单胞菌(认为其包含ADI基因，并且认为其中其基因产物具有生理功能)的ADI。
所使用的ADI的量无特别限制，只要使得能够进行精氨酸的定量，并且其可根据样品中所包含的精氨酸的量、使用的设备、酶的纯度和类型适当决定。所使用的酶的量，就最小量而言，优选0.001 U/ml或更多，更优选0.005 U/ml或更多，还更优选0.01 U/ml或更多。此外，无论如何，就最大浓度而言，优选10 U/ml或更低，更优选5 U/ml或更低，还更优选1 U/ml或更低。
前述步骤(I-A)和步骤(I-B)的说明分别适用于步骤(IV-A)和步骤(IV-B)，除非特别说明。此外，前述步骤(III-C)的说明适用于步骤(IV-C)，除非特别说明。
步骤(IV-B)可为在构建为使用乳酸脱氢酶的系统或使用丙酮酸氧化酶的系统的系统中进行的步骤。此外，如同前述步骤(I-B)，步骤(IV-B)可为在经构建使得丙酮酸与显色剂例如2,4-二硝基苯肼反应并测量产物的吸光度的系统中进行的步骤、在经构建使得通过使用丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶检测NADH减少的系统中进行的步骤或在经构建使得通过使用丙酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶检测NADH产生的系统中进行的步骤。
步骤(IV-A)、步骤(IV-B)、步骤(IV-C)和步骤(IV-D)可在同一系统中同时前进。虽然反应温度考虑所使用酶的最佳温度等等适当决定，但反应可在室温-37℃，例如30℃的温度下适当进行。虽然反应时间可考虑试验样品中包含的焦磷酸的量等等适当确定，但反应迅速前进，并且基本上样品中全部量的精氨酸可在20分钟内、例如约7-13分钟内作为相应量的丙酮酸测量。如果需要，这些步骤可在适当的缓冲液例如20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)中进行。
系统中组分的浓度可由本领域技术人员适当确定，并且例如，其可在下列范围内。
MgCl2：0.5-50 mM
天冬氨酸：0.2-20 mM
PEP：0.02-2 mM
ATP：0.1-10 mM
AMP：0.025-2.5 mM
NADH：0.025-2.5 mM
PPDK：0.01-1 U/ml
ASS：0.01-1 U/ml
ADI：0.01-1 U/ml
乳酸脱氢酶：0.01-1 U/ml
在使用乳酸脱氢酶反应的实施方案中，可定量至少0-200 μM范围内的精氨酸。
通过本发明方法，甚至在非精氨酸的19种构成蛋白质的氨基酸、尿素和氨的污染的存在下可选择性地只定量精氨酸。此外，甚至当试验样品被天冬氨酸污染时，该方法也使得能够选择性地定量精氨酸。
II.使用AARS定量氨基酸的方法
根据本发明另一个实施方案，用于定量氨基酸的方法为包括以下步骤的用于定量氨基酸的方法：允许与氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于该氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)以获得反应产物的步骤(A)；和定量步骤(A)中所产生的产物的步骤(B)，其中基于所获得的产物的量确定氨基酸的量。
可根据本发明定量的氨基酸为存在相应AARS的那些。如果AARS可得，根据本发明可定量任何种类的氨基酸。例如，20种蛋白质构成氨基酸，即L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸，为可根据本发明定量的氨基酸。在本发明中，尽管“L-”在对氨基酸的描述中可省略，考虑与AARS的关系，本领域技术人员可适当地确定某个氨基酸是否限于其L-异构体。此外，在本发明中，氨基酸可用常用的三字母代码表示。
[步骤A]
在本发明前述方法的步骤(A)中，允许与氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于该氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)以获得反应产物。
在本发明中，使用与作为测量对象的氨基酸相应的AARS。若所需的AARS在市场出售，可使用这样的商业化产品。此外，本领域技术人员可通过基因工程技术等等用可得的适当资源适当制备AARS。对于通过基因工程技术制备AARS，可使用本领域技术人员所熟知的用于制备蛋白质的通常方法，并且AARS可通过参考本说明书中提到的实施例中所描述的程序和条件制备。
已经知道，用AARS中得自大肠杆菌的GlnRS、GluRS和ArgRS，前述反应式1的反应可能不前进，除非该酶通过与tRNA结合活化。当使用这些AARS时，步骤(A)中可加入tRNA。tRNA可以不以与作为测量对象的氨基酸一样高的高摩尔浓度添加，并且添加与AARS一样低的低摩尔浓度的tRNA是足够的。用于制备tRNA的方法为本领域技术人员所熟知(例如，日本生化协会编辑的“基础生化实验方法，第4卷，核酸和基因实验”中所述的方法，等)。
当使用tRNA时，认为除与受验氨基酸相应的tRNA外的不同种tRNA、mRNA和rRNA的污染不会产生特别不利的影响，因此使用总RNA提取物将可用于使用上述三种AARS中任一种的情况。
本发明使用的“AARS”不限于特别物种所产生的AARS，除非特别指明。其可为可特异性或选择性地作用于待定量的受验氨基酸并可形成(氨酰-AMP)-AARS复合物的任何AARS。用于AARS的术语“相应的氨基酸”指该AARS特异性或选择性地对其作用的氨基酸。
本发明使用的AARS可为存在于自然界的天然存在的AARS，或可为其基因被修饰的修饰AARS。此外，用于本发明的AARS可为通过在作为宿主的大肠杆菌或其它生物中表达编码AARS的基因获得的重组酶。
可用于本发明的制备AARS的方法无特别限制，并且其可为化学合成的蛋白质或通过基因重组技术制备的重组蛋白。当制备重组蛋白时，前述AARS可通过获得编码该蛋白的基因作为DNA并将其引入适当的表达系统中制备。AARS的典型制备方法包括通过PCR从适当生物物种提取的基因组DNA扩增相应基因，构建由引入该基因的质粒例如pET或pUC组成的载体，然后用该载体转化宿主细菌菌株例如BL21和JM109，并培养转化体。还可适当地使用除上述外的其它已知方法。
对于本发明，使用了(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂。在本发明中，该试剂也可简单地称为“复合物分解试剂”。
本发明使用的术语“(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂”或“复合物分解试剂”指可分解(氨酰-AMP)-AARS复合物以再生游离形式的AARS的试剂，除非特别指明。换言之，可以说复合物分解试剂是一种可通过亲和取代反应切割氨酰-AMP中氨基酸与AMP之间的酯键的化合物，或可使氨酰基易位至非AMP的对象的化合物。其优选不包含tRNA的概念(即，复合物分解试剂(除tRNA外))，特别为胺或负碳离子，并且其更特别的实例为二甲胺、三甲胺、羟胺、肼和甲胺。
用于本发明的复合物分解试剂的一个优选实例为羟胺(NH2OH)。羟胺在本发明中促进下列反应。
[方程式3]
(氨酰-AMP)-AARS复合物+羟胺→氨基酸异羟肟酸+AMP+AARS
在前述反应中，羟胺通过诱导在氨酰-AMP的羧基碳上的亲核反应引起(氨酰-AMP)-AARS复合物分解。
在本发明中，可优选使用可引起与羟胺所引起反应相同的反应并可进入(氨酰-AMP)-AARS复合物的底物口袋的任何亲核试剂作为复合物分解试剂。这样的试剂的实例包括肼(H2NNH2)和甲胺(CH3NH2)。
在步骤(A)中，还使用三磷酸腺苷(ATP)。
步骤(A)的反应产物为例如焦磷酸，并且当如上所述使用羟胺时，产物为氨基酸异羟肟酸。
[步骤B]
在本发明前述方法的步骤(B)中，定量了步骤(A)的任一个产物。
当焦磷酸作为步骤(A)的产物被定量时，各种用于定量焦磷酸的方法可用于本发明。用于测量焦磷酸的方法的一个优选实例为可在进行步骤(A)的同一系统中进行的方法。
可在进行步骤(A)的同一系统中进行的用于定量焦磷酸的方法的实例包括日本专利申请号2012-026534和本说明书的部分I中详细描述的方法，特别是通过使用丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)从焦磷酸产生丙酮酸并定量丙酮酸的方法。由于用于使用PPDK定量丙酮酸的方法也可在ATP的存在下进行，所述方法可与通过使用ATP与测量的受验物质一起作为底物产生焦磷酸的酶(在该情况下特别为AARS)所催化的反应偶联(作为两种或更多种酶催化的连续反应，特别是其中一种酶产生的产物用作另一种酶的底物的连续反应)。此外，AARS显示高度的底物特异性，和基于作为放能反应的ATP水解的高反应性。其中AARS与PPDK偶联的本发明实施方案可享有这些优点。
用于定量丙酮酸的方法的具体实例包括(1) 使丙酮酸与乳酸脱氢酶(LDH)反应(参考实施例6, 8)的方法，和(2) 使丙酮酸与丙酮酸氧化酶和过氧化物酶反应的方法。这些用于定量焦磷酸的方法具有不受无机磷酸或ATP存在的影响并且可从AMP再生ATP作为AARS的底物的特点。PPDK、LDH、丙酮酸氧化酶和过氧化物酶分别催化下面所示的反应。
[方程式4]
PPDK：焦磷酸+磷酸烯醇丙酮酸+AMP→丙酮酸+ATP+无机磷酸
LDH：丙酮酸+NADH→乳酸+NAD+
丙酮酸氧化酶：丙酮酸+磷酸+O2+H2O→乙酰磷酸+二氧化碳+H2O2
过氧化物酶：2H2O2+4-氨基安替比林+苯酚→醌亚胺染料+4H2O
除以上外，用于定量焦磷酸的方法的实例包括通过与焦磷酸酶反应将焦磷酸转化为无机磷酸并通过各种方法中的任一种定量无机磷酸的方法。用于定量无机磷酸的方法的实例包括，例如，钼蓝方法(参考实施例6, 9)。其为分光光度法定量磷酸在酸性条件下与钼酸铵和一种还原剂反应所产生的染料的方法。焦磷酸酶催化下面所示的反应。
[方程式5]
焦磷酸酶：焦磷酸→无机磷酸
除上述外,作为用于定量焦磷酸的方法，已知一种用酶例如ATP硫酸化酶从焦磷酸产生ATP并通过使用荧光素酶等定量ATP的方法。然而，在该焦磷酸定量方法中，由于添加ATP作为AARS的底物，焦磷酸的量可能被高估，并且由于荧光素酶等造成的ATP消耗，AARS催化的反应可能不前进。因此，当这样的用于如上所述基于ATP产生定量焦磷酸的方法用于本发明AARS-偶联系统时，需要特别的考虑。ATP硫酸化酶催化下面所示的反应。
[方程式6]
ATP硫酸化酶：焦磷酸+APS→ATP+硫酸
可在步骤(B)中测量的步骤(A)的反应产物的实例包括(氨酰-AMP)-AARS复合物的分解产物。例如，当羟胺用作复合物分解试剂时，氨基酸异羟肟酸和AMP作为分解产物产生，并且可测量这些中的任一个。AMP的定量可通过使用例如HPLC进行。异羟肟酸可通过例如使其与氯化铁在酸性条件下反应并在540 nm处测量吸光度以分光光度法(photospectrometrically)定量。
[反应条件]
步骤(A)中使用的AARS的量无特别限制，只要使得能够进行本发明的焦磷酸定量，并且可根据样品中包含的焦磷酸的量、使用的装置、PPDK纯度和类型适当决定。当期需在几十分钟内完成反应时，所使用的AARS的量，就最小量而言，优选0.05 mU/ml或更多，更优选0.1 mU/ml或更多，还更优选0.5 mU/ml或更多。当期需反应更迅速前进时，可使用更大量的AARS。此外，无论如何，最大量可从经济观点等出发决定，并且其可为10 U/ml或更低、5 U/ml或更低或1 U/ml或更低。本发明提及的反应系统中的组分浓度为在系统中的终浓度，除非特别指明。
在本发明中，AARS通过使用复合物分解试剂再生。因此，AARS的量可为使得AARS可起酶作用的量，并且可少于待定量的受验氨基酸的量。根据本发明的发明人的研究，在2 μM TyrRS的存在下可定量200 μM Tyr。因此，本发明的方法可用相当小量的不超过μM级别或相对于氨基酸1%或更低的摩尔浓度的AARS进行。
在步骤(A)中，使用复合物分解试剂。当羟胺用作复合物分解试剂(当描述肼在本发明中用作复合物分解试剂时，也意指使用作为盐的肼，同样将适用于使用其它复合物分解试剂)，并且期需在几十分钟内完成反应时，其浓度为，就最小浓度而言，优选5 mM或更高，更优选50 mM或更高，还更优选400 mM或更高。如果反应时间可延长，反应可用较小量的试剂进行。此外，无论如何，最大量可从操作安全、经济等观点出发决定，并且其可为8000 mM或更低、4000 mM或更低或2000 mM或更低。
根据本发明的发明人的研究，证实当肼或甲胺用作复合物分解试剂时，可在反应系统中以其终浓度分别为400 mM或20 mM定量氨基酸。因此，当使用这些复合物分解试剂时，将优选通过以证实有效的浓度的1/100或更多、更特别地1/10或更多的浓度使用它们进行定量。无论如何，最大量可从操作安全、经济等观点出发决定，并且其可为8000 mM或更低、4000 mM或更低或2000 mM或更低。
此外，当选择显示比较高反应性的复合物分解试剂时，认为通过临反应前将其加入反应系统可避免不利效应。同样考虑这点，本领域技术人员将能够容易地设计步骤(A)。根据本发明的发明人的研究，当使用羟胺时，羟胺与其它组分混合后约10分钟未发现任何有问题的影响。
步骤(A)中使用的ATP量可由本领域技术人员考虑其它组分的浓度和反应条件适当决定。由于步骤(A)中通常需要高于待测量氨基酸浓度的ATP浓度，ATP的浓度应为至少5 μM (此为根据本发明可测量的氨基酸浓度的下限)或更高。
当在同一系统中进行步骤(A)和使用丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)的步骤(B)时，理论上认为ATP浓度可低于上文所述的浓度。由此来看，ATP的浓度，就最小量而言，优选0.002 mM或更高，更优选0.02 mM或更高，还更优选0.2 mM或更高。
无论如何，就最大浓度而言，ATP的浓度可为200 mM或更低，优选20 mM或更低，还更优选2 mM或更低。
当步骤(B)作为用于在进行步骤(A)的同一系统中测量焦磷酸的步骤进行，然后用丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)从焦磷酸产生丙酮酸，并且丙酮酸在该步骤中与乳酸脱氢酶(LDH)反应的步骤进行时(被称为“步骤(B1)”)，所使用的PPDK的量无特别限制，只要使得能够进行本发明的焦磷酸定量，并且可根据样品中包含的焦磷酸的量、使用的装置、PPDK纯度和类型适当决定。所使用的PPDK的量，就最小量而言，优选0.001 U/ml或更多，更优选0.005 U/ml或更多，还更优选0.01 U/ml或更多。此外，无论如何，就最大浓度而言，优选10 U/ml或更低，更优选5 U/ml或更低，还更优选1 U/ml或更低。
步骤(B1)在高能磷酸化合物例如PEP的存在下进行。存在的PEP的浓度，就最小浓度而言，优选0.01 mM或更高，更优选0.025 mM或更高，还更优选0.05 mM或更高。此外，无论如何，就最大浓度而言，优选20 mM或更低，更优选10 mM或更低，还更优选5 mM或更低。
步骤(B1)在AMP的存在下进行。存在的AMP的浓度，就最小浓度而言，优选0.01 mM或更高，更优选0.025 mM或更高，还更优选0.05 mM或更高。此外，无论如何，就最大浓度而言，优选20 mM或更低，更优选10 mM或更低，还更优选5 mM或更低。
步骤(B1)优选在金属离子的存在下进行。所述金属离子可为镁离子、钴离子和锰离子中的任一种，并且优选镁离子。所使用的金属离子的量，就例如镁离子情况下的最小浓度而言，优选相对于AMP浓度的0.1当量或更多，更优选0.2当量或更多，还更优选0.4当量或更多。此外，无论如何，就最大浓度而言，优选10当量或更低，更优选5当量或更低，还更优选2.5当量或更低。最优选的浓度为磷酸供体的0.5-2当量，例如，1当量。
步骤(B1)中使用的乳酸脱氢酶的量无特别限制，只要使得能够进行焦磷酸定量，并且其可根据样品中包含的焦磷酸的量、使用的装置、酶的纯度和类型适当决定。所使用的酶的量，就最小量而言，优选0.002 U/ml或更多，更优选0.005 U/ml或更多，还更优选0.01 U/ml或更多。此外，无论如何，就最大浓度而言，优选4 U/ml或更低，更优选2 U/ml或更低，还更优选1 U/ml或更低。
步骤(B1)还在NADH的存在下进行。NADH浓度的影响比较显著，例如如果NADH的浓度过低，难以检测吸光度，如果其过高，NADH浓度降低的测量值的准确度下降。存在的NADH的浓度，就最小浓度而言，优选0.01 mM或更高，更优选0.02 mM或更高，还更优选0.05 mM或更高。无论如何，就最大浓度而言，优选4 mM或更低，更优选2 mM或更低，还更优选1 mM或更低。
在步骤(B1)中，通过在340nm处测量吸光度测量伴随反应前进的NADH量降低，并计算丙酮酸的产生量。
当步骤(B)作为用于测量焦磷酸的步骤(其中焦磷酸通过与焦磷酸酶反应转化为无机磷酸并且通过各种方法中的任一种定量无机磷酸)进行时（被称为“步骤(B2)”），所使用的焦磷酸酶的量无特别限制，只要使得能够进行焦磷酸定量，并且其可根据样品中包含的焦磷酸的量、使用的装置、焦磷酸酶的纯度和类型适当决定。所使用的焦磷酸酶的量，就最小量而言，优选0.151 U/ml或更多，更优选1.5 U/ml或更多，还更优选15 U/ml或更多。此外，无论如何，就最大浓度而言，优选6000 U/ml或更低，更优选600 U/ml或更低，还更优选60 U/ml或更低。作为显色剂，可使用通过以下制备的溶液：将水和浓硫酸混合，将(NH4)6Mo7O24溶解在混合物中，将水和浓硫酸与该溶液混合并将FeSO4溶解在该混合物中(钼蓝方法)。至于显色剂的实例，可参考本说明书的实施例部分。
步骤(A)和(B)的反应温度可考虑所使用的酶的最佳温度等适当设置。当使用本说明中实施例中所示的酶时，这些步骤可适当地在从室温至37℃的温度下进行。同样当步骤(A)和用于使用PPDK测量焦磷酸的步骤(B)在同一系统中同时前进时，反应温度考虑所使用的酶的最佳温度等适当决定，并且其可适当地在室温至37℃，例如30℃的温度下进行。
尽管步骤(A)和(B)的反应时间取决于试验样品中包含的氨基酸的量或所使用的AARS的量，但反应迅速前进，并且反应时间可为40分钟或更短，例如约20分钟或更短。
根据本发明的一个优选实施方案，嗜热生物来源的AARS用作步骤(A)中使用的AARS。嗜热生物的实例包括属于栖热菌属的生物。认为这样的实施方案具有反应可在相对高的温度下进行的优点，并且由于反应在高温下进行，可使用小量的酶。尽管本领域技术人员可根据所使用的AARS适当决定这样的实施方案的反应温度，其为例如50℃或更高，优选60℃或更高，还更优选65℃或更高。所使用的AARS的量可为上述量的1/2或更低，更特别地1/5或更低，还更特别地1/9或更低。
当步骤(A)在相对高的温度下进行时，可优选结合的步骤(B)的实施例为如上文步骤(B2)中所述的钼蓝方法。
III. 本发明用途等
已知甲硫氨酸在高胱氨酸尿症患者中高浓度累积，因此甲硫氨酸用作所述疾病临床普查的重要生物标记。另外，瓜氨酸是体内存在的氨基酸中的一种，并且有助于血流加速、免疫激活等。由于其功效，瓜氨酸广泛用于食物和药物例如补充剂。此外，瓜氨酸还是尿素循环代谢产物之一，被认为是用于检测人体尿素循环代谢异常(包括瓜氨酸尿症)的重要生物标记。此外，精氨酸是一种构成蛋白质的氨基酸，并且是食物和药物中包含的一种重要组分。精氨酸也是尿素循环代谢产物之一，被认为是用于检测人体尿素循环代谢异常(包括精氨酸酶缺乏症)的重要生物标记。为了这些目的，本发明可用于定量受验物质。
本发明用于定量焦磷酸的方法、用于定量甲硫氨酸的方法、用于定量瓜氨酸的方法和用于定量精氨酸的方法使得能够进行精确定量各个受验物质，甚至在得自各种生物来源的污染物的存在下。因此，本发明的方法可适用于生物来源的样品，例如，血液、血清、血浆、尿和汗液。本发明方法特别适于在血液来源的样品中定量。尽管本发明可用用于定量焦磷酸的方法作为例子进行说明，其说明适用于用于定量甲硫氨酸的方法、用于定量瓜氨酸的方法和用于定量精氨酸的方法，除非特别说明。
本发明的方法可用于鉴定或定量比较小量的受验物质。本发明的方法可在具有几十或几百微升体积的系统中进行。当意欲对血液样品进行本发明的方法时，所述血液样品可为血浆、血清或滤纸干血。滤纸干血可为，例如，从新生儿脚跟提取并以足够的量浸渍在采血专用滤纸上的血液，这样的样品特别地可用于新生儿普查。滤纸干血作为对象的方法的具体条件可由本领域技术人员通过参照这样的普查的现有方法的条件适当设计。
本发明还提供用于在定量焦磷酸的方法、定量甲硫氨酸的方法、定量瓜氨酸的方法和定量精氨酸的方法中使用的试剂盒或商业包装。本发明的试剂盒或包装包括包含前述浓度范围内的前述组分的每种或任何组合的单元，优选与其上描述试剂盒使用和指导的材料(盒子、包装、标签、使用说明书等)一起。
通过本发明，提供了用于定量至少甲硫氨酸、瓜氨酸和精氨酸的简单且快速的方法。多种氨基酸浓度的多变量分析由于在用于确定疾病存在或不存在情况以及健康情况的检验和诊断中的用途而受到关注。本发明定量方法还可用于这样的分析。
通过本发明使用AARS的方法，可定量以5-200 μM的浓度存在的氨基酸。
本发明方法可用于定量样品中的氨基酸。所述样品可为任何样品，只要其为可包含作为测量对象的氨基酸的样品，并且所述方法可适用于，例如，生物来源的样品例如血液、血清、血浆、尿和汗液。此外，其还可适用于食物、化妆品、药物等等。
样品可包含两种或更多种氨基酸，并且可根据本发明定量每种氨基酸。当定量一个样品中包含的两种或更多种氨基酸时，根据一个优选的实施方案，本发明的方法包括制备与各个受验氨基酸相应的AARS、制备包含除AARS外其它所需组分的反应试剂、混合反应试剂与样品、将混合物分为至少受验氨基酸类型数目的样品并向分开的样品中分别加入不同的AARS的步骤。
本发明方法使得能够快速和同时定量多种氨基酸。
本发明将参考实施例在下面具体说明。然而，本发明不限于它们。
实施例1
1. 制备酶的实施例
1-1. PPDK表达质粒的构建
构建了用于表达费氏丙酸杆菌亚种shermanii NBRC 12426菌株来源的PPDK (PfPPDK)和附着热变形菌NBRC 100435菌株来源的PPDK (TtPPDK)的质粒。从每个菌株的细胞制备基因组DNA。
PfPPDK基因通过使用上述获得的基因组DNA作为模板和基于获自数据库的PPDK基因序列(SEQ ID NO: 1)设计的引物(SEQ ID NO: 2和3)进行PCR扩增。将扩增产物插入pET-28a中获得用于表达PfPPDK的质粒。TtPPDK基因通过使用上述获得的基因组DNA作为模板和基于获自数据库的PPDK基因序列(SEQ ID NO: 4)设计的引物(SEQ ID NO: 5和6)进行PCR扩增。将扩增产物插入pET-28a中获得用于表达TfPPDK的质粒。
每个表达质粒进行测序以确认核苷酸序列。将这些序列与数据库中发现基因的序列比较，通过使用QuikGene试剂盒校正发生非保守置换的位点的序列，以便可获得与数据库相同序列的翻译产物。
1-2. AdoMetS表达质粒的构建
从大肠杆菌W3110菌株细胞制备基因组DNA。通过使用该DNA作为模板和基于数据中发现的AdoMetS基因序列(SEQ ID NO: 7)设计的引物(SEQ ID NO: 8和9)，进行PCR扩增AdoMetS基因。将扩增产物插入pET-28a中以获得用于表达AdoMetS的质粒。
1-3. ASS表达质粒的构建
通过使用前述的大肠杆菌W3110菌株的基因组DNA作为模板和基于数据库中发现的ASS基因序列(SEQ ID NO: 10)设计的引物(SEQ ID NO: 11和12)，进行PCR扩增ASS基因。将扩增产物插入pET-28a中以获得用于表达ASS的质粒。
1-4. ADI表达质粒的构建
从铜绿假单胞菌PAO1菌株细胞制备基因组DNA。通过使用此DNA作为模板和基于数据库中发现的ADI基因序列(SEQ ID NO: 13)设计的引物(SEQ ID NO: 14和15)，进行PCR扩增ADI基因。将扩增产物插入pET-28a中以获得用于表达ADI的质粒。
1-5. 酶的表达和纯化
用各个表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，并将该菌株用作过表达菌株。
每个表达菌株在37℃摇动培养直至OD600变为0.6-0.8，通过加入终浓度0.5 mM的IPTG诱导表达。诱导表达后，PPDK和ADI表达菌株在30℃培养，AdoMetS和ASS表达菌株在37℃培养，各自摇动培养4小时，然后收集细胞。通过超声破碎细胞，在可溶性部分中获得受验酶。
将每个表达菌株的细胞破碎悬浮液的上清液上样到GE Healthcare生产的Ni Sepharose柱，用20 mM Tris-HCl、50 mM咪唑溶液洗涤，并用20 mM Tris-HCl、500 mM咪唑溶液洗脱，以纯化和收集受验酶。上述酶溶液经受透析或超滤以除去咪唑或若需要，改变缓冲液，然后使用。
当每个纯化的酶溶液与终浓度20%的甘油混合并在-80℃冷藏保存该混合物时，稳定长期储存酶是可能的。
实施例2
2. 定量焦磷酸的实施例
2-1. 用于定量焦磷酸的反应条件的实施例(1)
混合包含焦磷酸的试验样品和具有以下组分的用于定量焦磷酸的反应混合物。将混合物维持在30℃以允许反应前进，并测量340 nm处吸光度的减少。混合物的体积为1 ml或200 μl。吸光度的测量用光程长度1 cm的比色皿和吸光测定计(用于前一体积)或用微孔板和酶标仪(光程长度不固定) (用于后一体积)进行。在附图中显示的曲线图中，用光程长度1 cm的比色皿测量的吸光度用Abs表示，用微孔板测量的吸光度用AU表示。
用于定量焦磷酸的反应混合物：20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)，5 mM MgCl2，0.5 mM PEP，0.5 mM AMP，0.25 mM NADH，0.1 U/ml PPDK和0.5 U/ml乳酸脱氢酶(得自兔肌肉、东方酵母(Oriental Yeast)) (浓度为与试验样品混合后获得的终浓度)。
2-2. 用于定量焦磷酸的反应条件的实施例(2)
混合包含焦磷酸的试验样品和具有以下组分的用于定量焦磷酸的反应混合物。将200 μl体积的混合物维持在30℃以允许反应前进，并用酶标仪测量505 nm处的吸光度增加。
用于定量焦磷酸的反应混合物：20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)，5 mM MgCl2，10 mM NH4Cl，0.5 mM PEP，0.5 mM AMP，0.1 U/ml PPDK，0.5 mM Na-PO4，1 mM 4-氨基安替比林，1 mM苯酚，1.5 U/ml丙酮酸氧化酶(丙酮酸氧化酶来自微生物(诊断试剂级) TOYOBO ENZYMES)和7.5 U/ml过氧化物酶(浓度为与试验样品混合后获得的终浓度)。
2-3. 用于定量焦磷酸的反应条件的实施例(3)
混合包含焦磷酸的试验样品和具有以下组分的用于定量焦磷酸的反应混合物。将200 μl体积的混合物维持在30℃以允许反应前进，并用酶标仪测量590nm处(激发，530 nm)荧光的增加。
用于定量焦磷酸的反应混合物：20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)，5 mM MgCl2，10 mM NH4Cl，0.5 mM PEP，0.5 mM AMP，0.1 U/ml PPDK，0.5 mM Na-PO4，50 μM ADHP，1.5 U/ml丙酮酸氧化酶和7.5 U/ml过氧化物酶(浓度为与试验样品混合后获得的终浓度)
2-4. 制备用于定量焦磷酸的校正曲线的实施例
通过使用不同浓度的焦磷酸标准溶液作为试验样品验证是否可建立校正曲线。
通过使用实施例2-1的反应条件，用光程长度1 cm的比色皿和吸光测定计进行测量。反应在混合后10分钟完成，图1A和1B中所示的校正曲线分别用使用PfPPDK和TtPPDK的系统获得。校正曲线的线性高，因此证明至少0-200 μM范围内的焦磷酸可通过该方法定量。此外，使用PfPPDK和TtPPDK情况的校正曲线的斜度分别为6.0 mM-1·cm-1和6.4 mM-1·cm-1，基本上等于NADH的摩尔吸收系数(6.2 mM-1·cm-1)。因此，证明基本上试验样品中全部量的焦磷酸用于氧化NADH。
当反应通过使用PfPPDK与实施例2-1中描述的反应条件进行并且用微孔板和酶标仪进行测量时，结果在图2中示出。如同使用吸光测定计的情况，获得高度线性的校正曲线，因此证明用这种方法定量焦磷酸也可用酶标仪进行。
当通过使用PfPPDK与实施例2-2中描述的反应条件进行反应和测量时，获得如图3中所示的校正曲线。获得如同实施例2-1的高度线性的校正曲线，因此证明该方法还可用于使用4-氨基安替比林的显色系统。
当通过使用PfPPDK与实施例2-3中描述的反应条件进行反应和测量时，获得如图4中所示的校正曲线。获得焦磷酸浓度在0-10 μM范围内的高度线性的校正曲线，因此证明通过使用荧光染料例如ADHP可以高灵敏度定量甚至低浓度的焦磷酸。
2-5. 磷酸或ATP的存在下的焦磷酸定量
为了验证该定量系统是否也可用于磷酸或ATP存在的情况，验证了通过使用下列三种溶液中的任一种作为试验样品是否可制备焦磷酸的校正曲线。
-不同浓度的焦磷酸标准溶液
-不同浓度的焦磷酸标准溶液和0.3 mM磷酸标准溶液(浓度为与反应混合物混合后获得的终浓度)
-不同浓度的焦磷酸标准溶液和0.3 mM ATP标准溶液(浓度为与反应混合物混合后获得的终浓度)
反应条件为实施例2-1中描述的那些，并且PfPPDK用作PPDK。测量用前述三种样品的每一种进行，并且作为结果，获得图5中所示的校正曲线。对于由于磷酸或ATP的存在而引起的三种条件，未观察到不同浓度焦磷酸的吸光度值或校正曲线的斜度有显著差异。因此，证明该焦磷酸定量系统不受磷酸或ATP存在的影响，并且使得定量能够甚至在它们的存在下进行。
2-6. 添加和收集生物样品中的焦磷酸的实施例
为了验证是否该定量系统还可用于生物样品，验证了通过使用下列两种溶液中的每一种作为试验样品是否可制备焦磷酸的校正曲线。
-不同浓度的焦磷酸标准溶液
-不同浓度的焦磷酸标准溶液和50%的人血浆(浓度为与反应混合物混合后获得的终浓度)
反应条件为实施例2-1中所述的那些，并且PfPPDK用作PPDK。测量用前述两种样品的每一种进行，作为结果，获得如图6中所示的校正曲线。对于由于人血浆的存在而引起的两种条件，未观察到不同浓度焦磷酸的吸光度值或校正曲线的斜度有显著差异。因此，证明该焦磷酸定量系统不受人血浆存在的影响，并且使得定量能够甚至在生物样品中进行。
实施例3
3.定量甲硫氨酸的实施例
3-1. 定量甲硫氨酸的反应条件的实施例
混合包含甲硫氨酸的试验样品和具有下列组分的用于定量甲硫氨酸的反应混合物。将200 μl体积的混合物维持在30℃以允许反应前进，并用酶标仪测量340 nm处的吸光度减少。
用于定量甲硫氨酸的反应混合物：20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)，5 mM MgCl2，1 mM ATP，0.5 mM PEP，0.4 mM AMP，0.25 mM NADH，0.1 U/ml PfPPDK，0.5 U/ml乳酸脱氢酶和0.2 U/ml AdoMetS (浓度为与试验样品混合后的终浓度)。
3-2. 制备用于定量甲硫氨酸的校正曲线的实施例
作为试验样品，使用了与反应混合物混合后产生0-100 μM终浓度的标准甲硫氨酸溶液和标准焦磷酸溶液。样品的甲硫氨酸或焦硫酸终浓度对吸光度差异的绘图结果在图7中示出。用包含甲硫氨酸的样品也获得了高度线性的校正曲线，同包含焦磷酸的样品的情况一样，因此证明用此反应混合物能够进行甲硫氨酸定量。此外，甲硫氨酸校正曲线和焦磷酸校正曲线的斜度基本相同，因此证明反应混合物中基本上全部的甲硫氨酸转化为焦磷酸并用于反应。
3-3. 与各种氨基酸和氨的反应性
作为试验样品，使用了与反应混合物混合后产生200 μM终浓度的各种氨基酸和NH4Cl。作为氨基酸，使用了除甲硫氨酸外的19种构成蛋白质的氨基酸。
作为测量的结果，对于所有样品未观察到任何试验样品依赖性的吸光度变化。该结果证明此定量系统不显示与除甲硫氨酸外的构成蛋白质的氨基酸和氨的反应性，并使得能够进行高度选择性的甲硫氨酸定量。
实施例4
4. 定量瓜氨酸的实施例
4-1. 用于定量瓜氨酸的反应条件的实施例
制备了包含终浓度为20 mM咪唑-HCl (PH 7.0)、5 mM MgCl2、2 mM天冬氨酸、2 mM PEP、1 mM ATP、0.25 mM AMP、0.25 mM NADH、0.1 U/ml PfPPDK、0.5 U/ml乳酸脱氢酶、0.2 U/ml ASS和0-200 μM瓜氨酸的反应混合物。将200 μl体积的该混合物维持在30℃以允许反应前进，并用酶标仪测量340 nm处的吸光度减少。
4-2. 制备用于定量瓜氨酸的校正曲线的实施例
作为试验样品，使用了与反应混合物混合后产生0-200 μM终浓度的标准瓜氨酸溶液和标准焦磷酸溶液。样品的瓜氨酸或焦硫酸终浓度对吸光度差异的绘图结果在图8中示出。用包含瓜氨酸的样品也获得了高度线性的校正曲线，同包含焦磷酸的样品的情况一样，因此证明用此反应混合物能够进行瓜氨酸定量。此外，瓜氨酸校正曲线和焦磷酸校正曲线的斜度基本相同，因此证明反应混合物中基本上全部的瓜氨酸转化为焦磷酸并用于反应。
4-3. 与不同氨基酸和尿素的反应性
作为试验样品，使用了与反应混合物混合后产生200 μM终浓度的不同的氨基酸和尿素。作为氨基酸，使用了除天冬氨酸外的19种构成蛋白质的氨基酸。
作为测量的结果，对于所有样品未观察到任何试验样品依赖性的吸光度变化。该结果证明此定量系统不显示与除瓜氨酸外的构成蛋白质的氨基酸和尿素的反应性，并使得能够进行高度选择性的瓜氨酸定量。
实施例5
5. 定量精氨酸的实施例
5-1. 用于定量精氨酸的反应条件的实施例
制备了包含终浓度为20 mM咪唑-HCl (PH 7.0)、5 mM MgCl2、2 mM 天冬氨酸、2 mM PEP、1 mM ATP、0.25 mM AMP、0.25 mM NADH、0.1 U/ml PfPPDK、0.5 U/ml乳酸脱氢酶、0.2 U/ml ASS、0.2 U/ml ADI和0-200 μM精氨酸的反应混合物。将200 μl体积的混合物维持在30℃以允许反应前进，并用酶标仪测量340 nm处的吸光度减少。
5-2. 制备用于定量精氨酸的校正曲线的实施例
作为试验样品，使用了与反应混合物混合后产生0-200 μM终浓度的标准精氨酸溶液或标准瓜氨酸溶液。样品的精氨酸或瓜氨酸终浓度对吸光度差异的绘图结果在图9中示出。用包含精氨酸的样品也获得了高度线性的校正曲线，同包含瓜氨酸的样品的情况一样，因此证明用此反应混合物能够进行精氨酸定量。此外，精氨酸校正曲线和瓜氨酸校正曲线的斜度差异为约10%，因此证明反应混合物中基本上全部的精氨酸转化为瓜氨酸并用于反应。
5-3. 与不同氨基酸和尿素的反应性
作为试验样品，使用了与反应混合物混合后产生200 μM终浓度的不同氨基酸、氨和尿素。作为氨基酸，使用了除精氨酸和天冬氨酸外的18种构成蛋白质的氨基酸。
作为测量的结果，对于所有样品未观察到任何试验样品依赖性的吸光度变化。该结果证明此定量系统不显示与除精氨酸和瓜氨酸外的构成蛋白质的氨基酸和尿素的反应性，并使得能够进行高度选择性的精氨酸定量。
实施例6
6. AARS表达系统的构建
用于在大肠杆菌中异源表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima) MSB8菌株(NBRC 100826)来源的CysRS、HisRS、LysRS、ProRS、SerRS、TrpRS和TyrRS的表达系统如下构建。
PCR通过使用NBRC提供的海栖热袍菌菌株基因组DNA作为模板和基于数据库中发现的各种AARS基因序列(SEQ ID NO: 16-22)设计的引物(SEQ ID NO: 23-36)进行，以扩增各个基因。将扩增产物各自插入pET-28a中获得用于表达各个AARS的质粒。当设计引物时，对TyrRS基因增加NdeI位点和HindIII位点使得His标签连接在N-端，对其它基因增加NcoI位点和NotI位点使得His标签连接在C-端。
对于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus) HB8菌株来源的IleRS、MetRS和TyrRS (SEQ ID NO: 37-39)在大肠杆菌中的异源表达，使用RIKEN生物资源中心，DNA Bank提供的嗜热栖热菌基因表达质粒组。
7. AARS的表达和纯化
用每个表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，并将该菌株用作过表达菌株。每个表达菌株在37℃摇动培养直至OD600变为0.6-0.8，通过加入终浓度0.5 mM的IPTG诱导表达。诱导表达后，各个菌株在30℃摇动培养4小时，然后收集细胞。通过超声破碎细胞，在可溶性部分中获得受验酶。
将每个表达菌株的细胞破碎悬浮液的上清液上样到GE Healthcare生产的Ni Sepharose柱，用20 mM Tris-HCl、50 mM咪唑溶液洗涤，并用20 mM Tris-HCl、500 mM咪唑溶液洗脱，以纯化和收集受验酶。上述酶溶液经受透析或超滤以除去咪唑或若需要，改变或浓缩缓冲液，然后使用。
8. 用于测量偶联PPDK和LDH的AARS活性的方法
混合包含作为测量对象的氨基酸的试验样品和具有下列组分的用于定量氨基酸的反应混合物。将混合物静置在30℃以允许AARS、PPDK和LDH反应前进，并测量340 nm处的吸光度减少。混合物体积为200 μl体积，将反应混合物置于96孔微孔板的孔中后，用酶标仪测量吸光度。
用于定量氨基酸的反应混合物：20 mM Tris-HCl (pH 7.0)，10 mM MgCl2，10 mM NH4Cl，0.3 mM PEP，0.3 mM NADH，0.2 mM ATP，0.2 mM AMP，70 mU/ml PPDK，50 U/ml LDH和AARS (浓度为与试验样品混合后获得的终浓度)
9. 用于基于钼蓝反应测量AARS活性的方法
混合包含作为测量对象的氨基酸的试验样品和具有下列组分的用于定量氨基酸的反应混合物。将混合物静置在30℃以允许AARS反应前进。混合33 μl体积的混合物、66 μl水和1 μl 300 U/ml酵母焦磷酸酶溶液，并静置在室温20分钟以允许焦磷酸酶反应前进。然后，将反应混合物与具有下列组分的100 μl显色剂溶液A和30 μl显色溶液B混合，接着将混合物静置在室温5分钟，并用酶标仪测量700 nm或900 nm处的吸光度。
用于定量氨基酸的反应混合物：20 mM Tris-HCl (pH 7.0)，5 mM MgCl2，2 mM ATP和AARS (浓度为与试验样品混合后获得的终浓度)。
显色溶液A：通过按3:1的比率混合水和浓硫酸并在混合物中溶解浓度为0.066 g/ml的(NH4)6Mo7O24·4H2O获得的溶液。
显色液B：通过按10000:7的比率混合水和浓硫酸并在混合物中溶解浓度为145 mg/ml的FeSO4·7H2O获得的溶液。
10. 用于在70℃测量AARS活性的方法
混合包含作为测量对象的氨基酸的试验样品和具有下列组分的用于定量氨基酸的反应混合物。将混合物静置在70℃以允许AARS反应前进。混合600 μl体积的混合物、60 μl 1 M 2-巯基乙醇溶液和240 μl下述显色溶液，然后将混合物静置在室温20分钟，并在光程长度1 cm的比色皿中测量580 nm处的吸光度。
用于定量氨基酸的反应混合物：20 mM HEPES-NaOH (pH 8.0)，5 mM MgCl2，0.5 mM ATP和AARS (浓度为与试验样品混合后获得的终浓度)。
显色溶液：通过按6:1的比率混合水和浓硫酸并在混合物中溶解浓度为0.025 g/ml的(NH4)6Mo7O24·4H2O获得的溶液。
11. 添加羟胺的作用的验证
通过使用8中描述的AARS活性测量方法向反应混合物中添加各种浓度的羟胺测量AARS活性。作为AARS，使用栖热袍菌属来源的TyrRS。作为试验样品，使用与试验样品混合后产生0、25、50、100和150 μM终浓度的标准Tyr溶液。羟胺以与试验样品混合后0、50、100、200、400、600、800和1000 mM的终浓度加入到反应混合物中。本实施例和下面的实施例中使用的羟胺为预先通过加入盐酸中和至pH 7.0的羟胺。TyrRS以125 μg/ml (10 mU/ml)的终浓度加入到反应混合物中。混合试验样品与包含Tyr和各种浓度羟胺的反应混合物，然后迅速设置酶标仪，并开始监测340 nm处的吸光度。对于各种羟胺浓度条件的样品组，计算相对于0 mM Tyr样品的吸光度差异并绘图。作为结果，获得如图10中所示的其随时间的变化。
在加入50、100、200、400、600和800 mM羟胺的条件下，观察到Tyr浓度依赖性的吸光度变化，认为这是由偶联的AARS、PPDK和LDH反应导致的。混合样品后这些反应持续5分钟-1小时或更久，其后吸光度差异固定在某个恒定水平。至于使用400 mM或更少羟胺的样品，较高的羟胺浓度产生较短的到吸光度差异固定在恒定水平为止的时间。至于使用超过400 mM羟胺的样品，到吸光度差异固定在恒定水平为止的时间未观察到显著差异。
另一方面，在不添加羟胺的条件下，未观察到认为是由偶联的TyrRS、PPDK和LDH反应导致的吸光度变化。在此条件下，样品吸光度值的差异很小，并且其在由微孔板孔污染或实验误差导致的差异级别内。因此，证明添加羟胺对于通过使用前述检测系统观察TyrRS反应的前进必不可少。
本实施例中使用的不加羟胺的条件基于与专利文献1和2中使用的反应条件相同的原理。尽管使用相似的条件，在上述专利文献中检测到了经由AARS反应的显著的焦磷酸产生，而在本实施例中其不能被检测到。虽然引起这种结果差异的原因尚未知，但可认为其可能部分上由检测方法的差异造成。即，本实施例中检测通过吸光度方法进行，而在前述专利文献中检测通过传感器电极方法或荧光方法进行，并且是否可能检出可通过检测方法的灵敏度差异来区分。无论如何，本实施例的结果证明，至少在使用如本实施例中所用的检测系统的情况下，通过加入羟胺可使经由AARS反应的不添加羟胺不可检测的焦磷酸产生可检测。
通过将图10中所示数据沿指示测量后20分钟所观察到的吸光度差异的垂直轴和指示Tyr浓度的水平轴绘图制备的各种羟胺浓度的校正曲线在图11中示出。对于羟胺浓度200、400、600、800和1000 mM的条件，吸光度差异与Tyr浓度的相关系数分别为0.9952、0.9998、0.9998、0.9988和0.9995。可以说所有的校正曲线均具有高度的线性，并且证明该反应系统使得能够进行高度精确的Tyr定量。
同样制备了测量后除20分钟外的时间点的校正曲线，并计算了相关系数。相关系数沿指示时间的水平轴的绘图结果在图12中示出。对于所有的羟胺浓度，观察到相关系数随时间推移稳定增加的趋势。至于使用400 mM或更少羟胺的样品，较高的羟胺浓度产生较短的到相关系数稳定为止的时间，并且至于使用更高浓度羟胺的样品，未观察到显著差异。因此，这证明了如果系统不受高浓度羟胺的不利影响，则通过加入较高浓度的羟胺，反应可更迅速地完成。
12. 用于通过偶联的PPDK和LDH定量氨基酸的校正曲线的制备
通过使用8中描述的AARS活性测量方法和标准Cys、Lys、Ser和Tyr溶液作为试验样品制备校正曲线。设定前述氨基酸的浓度使得其终浓度在0-200 μM的范围内。羟胺浓度，对于用于Tyr校正曲线的样品为200 mM，或对于用于Cys、Lys和Ser校正曲线的样品为100 mM。将栖热袍菌属来源的CysRS、LysRS、SerRS、TyrRS和栖热菌属来源的TyrRS分别以终浓度0.2 (7 mU/ml)、0.1 (10 mU/ml)、0.2 (8 mU/ml)、0.4 (40 mU/ml)和0.1 mg/m加入到反应混合物中。
当使用栖热袍菌属来源的AARS时，对于这些氨基酸获得图13-16中所示的校正曲线。显示所有的校正曲线具有高度线性。通过这些结果，证明不仅Tyr，而且Cys、Lys和Ser也可通过该定量方法定量。当不添加羟胺时，在所有的反应混合物中未观察到显著的吸光度变化。
对于添加焦磷酸而非前述氨基酸的情况可同样制备校正曲线，但Lys、Ser和Tyr校正曲线的斜度(每mM底物的吸光度变化)为焦磷酸校正曲线斜度的80%或更多。这表明样品中80%或更多的氨基酸用于反应，并产生相同摩尔数的焦磷酸。Cys校正曲线的斜度略小于其它校正曲线的斜度，认为这是由于试验样品中的部分半胱氨酸通过空气氧化转化为胱氨酸，半胱氨酸的真实浓度减少。
此外，当使用栖热菌属来源的TyrRS时，获得如图17所示的校正曲线。获得了高度线性的校正曲线，如同在使用栖热袍菌属来源的TyrRS的情况中一样，证明用除栖热袍菌外的生物来源的AARS使得定量能够进行。
13. 用于基于钼蓝方法定量氨基酸的校正曲线的制备
通过使用9中所描述的AARS活性测量方法和标准His、Pro和Trp溶液作为试验样品制备校正曲线。设定前述氨基酸的浓度使得其终浓度在0-80 μM的范围内。HisRS、ProRS和TrpRS分别以终浓度0.1、0.2和0.1 mg/ml加入到反应混合物中。
对于这些氨基酸获得了如图18-20所示的校正曲线。由于使用了包含接近检测极限的低浓度的氨基酸的样品，相关系数差于结果在图13-16中示出的系统的相关系数，但这些校正曲线显示的线性使得所述曲线可用作校正曲线。因此，证明His、Pro和Trp也可通过该定量方法定量，并且使得能够甚至通过使用除8中所述定量焦磷酸的方法外的方法进行定量。当不添加羟胺时，对于所有的反应混合物未观察到任何显著的吸光度变化。
14. 用于在70℃定量氨基酸的校正曲线的制备
通过使用10中所描述的AARS活性测量方法和标准Ile、Met和Tyr溶液作为试验样品制备校正曲线。作为AARS，使用栖热菌属来源的IleRS、MetRS和TyrRS。这些AARS分别以终浓度0.01、0.08和0.08 mg/ml加入到反应混合物中。设定前述氨基酸的浓度使得其终浓度在0-100 μM的范围内。而且，作为复合物分解试剂，羟胺以终浓度400 mM添加。
对于这些氨基酸获得了如图21-23中所示的校正曲线。该结果显示Ile和Met也可通过该定量方法定量。而且，同时还显示步骤A中的反应温度不限于30℃，而且可设定为高温例如70℃。此外，在栖热菌属来源的TyrRS的情况中，定量能够用比11中所述方法所用的浓度低1级的酶浓度进行，其中反应在30℃下进行。认为嗜热生物来源的AARS具有通过在高温例如70℃下进行反应可减少所使用的酶量这一优点。
15. AARS的底物特异性
对于栖热袍菌属来源的CysRS、HisRS、LysRS、ProRS、SerRS、TrpRS和TyrRS，通过使用9中所述的AARS活性测量方法和所述各种氨基酸的标准溶液作为试验样品验证了焦磷酸产生的存在或不存在。AARS分别以终浓度0.3 (8 mU/ml)、0.1、0.2 (3 mU/ml)、0.2、0.1 (1 mU/ml)、0.1、0.2 (20 mU/ml) mg/ml加入到反应混合物中。制备反应混合物使得Tyr的终浓度为1 mM，并且其它氨基酸的终浓度为5 mM。至于羟胺浓度，对于所有的情况以终浓度1000 mM添加。此外，对于栖热菌属来源的MetRS和TyrRS，通过使用10中所述的AARS活性测量方法和所述各种氨基酸的标准溶液作为试验样品也验证了焦磷酸产生的存在或不存在。制备反应混合物使得氨基酸的终浓度为200 μM。羟胺以终浓度400 mM添加。
包含各个AARS与氨基酸的组合的反应混合物中活性检测到或未检测到在表2中示出。符号+表明检测到活性，-表明未检测到活性。每个AARS仅对一个相应的氨基酸显示活性。从这些结果，显示用使用这些AARS中的任一种的定量系统使得能够进行每个氨基酸种类的高度选择性定量。
[表2]
表2：各种AARS的性质试验
16. 各种复合物分解试剂的作用
通过使用10中所述的AARS活性测量方法并加入肼或甲胺作为复合物分解试剂制备校正曲线。作为AARS，栖热菌属来源的TyrRS以终浓度0.01 mg/ml加入到反应混合物中。调整Tyr浓度以产生0-100 μM的终浓度。此外，肼和甲胺分别以终浓度400 mM和20 mM加入。
对于复合物分解试剂，通过将测量后20分钟观察到的吸光度差异沿垂直轴以及Tyr浓度沿水平轴绘图制备校正曲线。通过使用肼和甲胺制备的校正曲线分别在图24和25中示出。可以说二者作为校正曲线均具有高度线性，并且证明该反应系统使得能够进行氨基酸的高度精确定量。
工业适用性
甲硫氨酸、瓜氨酸和精氨酸构成活体中重要氨基酸种类的一部分，并且为食物和药物中包含的重要成分。甲硫氨酸是一种必需氨基酸，并且已知其具有减少血液胆固醇或组胺和消除活性氧的作用，但其过度给予也导致脂肪肝。已知瓜氨酸有助于促进血流、免疫活化等，并且由于其功效被广泛用于食物和药物例如补充剂。精氨酸是一种半-必需氨基酸，其摄入在成长期是必需的，并且用于食物和药物以改善免疫活性或从疲劳的回复。因此，这些氨基酸定量的使用被考虑用于食物分析、药物和补充剂质量控制、过多症或缺乏的血液检验以及酶传感器。
另外，已知甲硫氨酸在高胱氨酸尿症患者中以高浓度累积，并且甲硫氨酸在临床上用作所述患者的普查的重要生物标记。此外，瓜氨酸和精氨酸为尿素循环中的代谢产物，并且用作尿素循环代谢异常(包括瓜氨酸尿症或精氨酸酶缺乏症)的生物标记。因此，定量这些氨基酸的使用也预期作为用于检测上述这些疾病的简单且方便的普查。
氨基酸分析被用于食物质量控制和各种疾病标记的检测，可以说其为广泛范围的工业领域中所需求的技术。为了对多种氨基酸进行氨基酸分析，目前基本上只有使用用于HPLC等的分析仪器这一种选择。然而，这样的仪器分析需要昂贵和大型的分析仪器，因此难以进行快速的现场分析。此外，当测量不在现场进行，而是委托外部机构分析时，使用这样的委托限于极窄的范围，这是因为样品的分析、运输和贮存需要高成本。
与上述的仪器分析方法不同，本发明的方法为酶定量方法，不需要任何昂贵的专用分析仪器。此外，同样与需要高灵敏度检测系统的常规酶定量方法例如使用放射性同位素或荧光的方法不同，本发明的方法可以说是在广泛范围的环境中简单易行的定量方法。通过进行本发明方法，可快速测量多种氨基酸。例如，通过混合AARS活性测量溶液和试验样品，然后将混合物分开，并将不同种类的AARS与所述混合物的分开部分混合，同时定量多种氨基酸可容易地进行。此外，本说明书的实施例还证明本发明方法可用高通量测量设备例如酶标仪进行。
序列表
SEQ ID NO: 1，PfPPDK基因序列
SEQ ID NO: 2，引物序列
SEQ ID NO: 3，引物序列
SEQ ID NO: 4，TtPPDK基因序列
SEQ ID NO: 5，引物序列
SEQ ID NO: 6，引物序列
SEQ ID NO: 7，AdoMetS基因序列
SEQ ID NO: 8，引物序列
SEQ ID NO: 9，引物序列
SEQ ID NO: 10，ASS基因序列
SEQ ID NO: 11，引物序列
SEQ ID NO: 12，引物序列
SEQ ID NO: 13，ADI基因序列
SEQ ID NO: 14，引物序列
SEQ ID NO: 15，引物序列
SEQ ID NO: 16，栖热袍菌属来源的CysRS
SEQ ID NO: 17，栖热袍菌属来源的HisRS
SEQ ID NO: 18，栖热袍菌属来源的LysRS
SEQ ID NO: 19，栖热袍菌属来源的ProRS
SEQ ID NO: 20，栖热袍菌属来源的SerRS
SEQ ID NO: 21，栖热袍菌属来源的TrpRS
SEQ ID NO: 22，栖热袍菌属来源的TyrRS
SEQ ID NO: 23，引物CysRS F
SEQ ID NO: 24，引物CysRS R
SEQ ID NO: 25，引物HisRS F
SEQ ID NO: 26，引物HisRS R
SEQ ID NO: 27，引物LysRS F
SEQ ID NO: 28，引物LysRS R
SEQ ID NO: 29，引物ProRS F
SEQ ID NO: 30，引物ProRS R
SEQ ID NO: 31，引物SerRS F
SEQ ID NO: 32，引物SerRS R
SEQ ID NO: 33，引物TrpRS F
SEQ ID NO: 34，引物TrpRS R
SEQ ID NO: 35，引物TyrRS F
SEQ ID NO: 36，引物TyrRS R
SEQ ID NO: 37，栖热菌属来源的IleRS
SEQ ID NO: 38，栖热菌属来源的MetRS
SEQ ID NO: 39，栖热菌属来源的TyrRS。

Claims (19)

1. 用于定量受验物质的方法，包括：
允许可通过使用三磷酸腺苷(ATP)作为底物并对受验物质进行转化而产生焦磷酸的酶作用于受验物质以产生焦磷酸的步骤；
允许丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定受验物质的量。
2. 权利要求1的方法，其中所述受验物质为氨基酸。
3. 用于定量甲硫氨酸的方法，包括：
允许腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)在ATP的存在下作用于甲硫氨酸以产生腺苷甲硫氨酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，
和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定甲硫氨酸的量。
4. 用于定量瓜氨酸的方法，包括：
允许精氨基琥珀酸合成酶(ASS)在天冬氨酸和ATP的存在下作用于瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，
和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定瓜氨酸的量。
5. 用于定量精氨酸的方法，包括：
允许精氨酸脱亚胺酶(ADI)作用于精氨酸以产生氨和瓜氨酸的步骤；
允许ASS作用于瓜氨酸以产生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步骤；
允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；和
定量所产生的丙酮酸的步骤，
和
其中基于所获得的丙酮酸的量确定精氨酸的量。
6. 用于定量氨基酸的方法，包括：
允许与所述氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于所述氨基酸和ATP以获得焦磷酸的步骤(A)；和
定量步骤(A)中所产生的焦磷酸的步骤(B)，和
其中步骤(B)包括允许PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所产生的焦磷酸以产生ATP、磷酸和丙酮酸的步骤；以及
定量所产生的丙酮酸的步骤，和
基于所获得的丙酮酸的量确定所述氨基酸的量。
7. 权利要求6的方法，其中所述复合物分解试剂为胺或负碳离子。
8. 权利要求7的方法，其中所述复合物分解试剂为羟胺、肼或甲胺。
9. 权利要求6-8中任一项的方法，所述方法在不存在tRNA的情况下进行。
10. 权利要求6-9中任一项的方法，所述方法用于定量一个样品中的两种或更多种氨基酸，并且包括步骤：
配制与作为定量对象的各个氨基酸相应的AARS，
配制包含除AARS外的所需组分的反应试剂，
混合反应试剂与样品，
将混合物至少分成与受验氨基酸的种类数相应的部分，和
向所分成的部分中分别加入不同的AARS。
11. 权利要求6-10中任一项的方法，其中AARS得自嗜热生物，并且步骤(A)在50℃或更高的温度下进行。
12. 权利要求1-11中任一项的方法，其中定量丙酮酸的步骤包括：
允许(i)乳酸脱氢酶、(ii)丙酮酸氧化酶、(iii)丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶或(iv)丙酮酸脱羧酶和醛脱氢酶作用于丙酮酸的步骤。
13. 权利要求1-12中任一项的方法，所述方法用于定量样品中的受验物质，其中所述样品可包含ATP或磷酸。
14. 权利要求13的方法，其中所述样品得自血液。
15. 用于权利要求3的定量甲硫氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、AdoMetS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
16. 用于权利要求4的定量瓜氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
17. 用于权利要求5的定量精氨酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、ASS、ADI、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
18. 用于权利要求6的定量氨基酸的方法的试剂盒，包含单独的ATP、AARS、AMP、PEP和PPDK或上述物质中的任意两种或更多种物质的混合物。
19. 用于定量氨基酸的方法，包括：
允许与所述氨基酸相应的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS复合物分解试剂的存在下作用于所述氨基酸和ATP以获得反应产物的步骤(A)；和
定量步骤(A)中所产生的产物的步骤(B)，和
其中基于所获得的产物的量确定所述氨基酸的量。
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