CN100420755C - 维生素b6的同型酶法测定和h2s检测的改进 - Google Patents

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Abstract

描述了在生物液体中确定吡哆醛5’-磷酸盐(PLP)的酶学方法。本发明的方法可用于评价心血管疾病的危险性。测定可以是一个同型性的测定，使用了PLP可作为同型半胱氨酸酶和相关酶的辅酶的能力，并优选采用分光光度法检测反应的产物。发明也包括了对硫化氢产生的测定敏感性的改良，该测定采用N，N-二烷基对亚苯基二胺检测相对于H2S氧化产物吸光度的荧光。

Description

维生素B6的同型酶法测定和H2S检测的改进
相关申请
本申请是1999年6月28日提交的美国系列号09/340,991的部分继续申请，其内容在此引入作为参考。同时要求了1999年2月1日提交的临时申请系列号60/118,031的优先权。
技术领域
本发明涉及其活性形式是吡哆醛5’-磷酸盐的维生素B6的测定，以及采用荧光对H2S检测的改进。更具体地说，本发明涉及采用同型半胱氨酸酶的脱辅基酶在生物液体中确定磷酸吡哆醛浓度的试剂盒和方法。同时还涉及提高通过检测由H2S与二烷基亚苯基二胺和一种氧化剂反应产生的复合体的荧光的这些测定以及用于同型半胱氨酸测定的敏感性。
背景技术
PCT公开的WO99/05311描述了在生物样品中采用同型半胱氨酸酶进行的高度特异性同型半胱氨酸测定，该酶足以在生物液体水平上对同型半胱氨酸较半胱氨酸具有高度特异性。这使得对这些酶从半胱氨酸和同型半胱氨酸中产生的共同产物，H2S，的检测成为对生物液体中同型半胱氨酸本身的有效测定。产生的H2S可以通过该申请中描述的多种方法进行检测。现在已经发现此测定的敏感性可以通过检测复合体的荧光来提高，该复合体是由带比色剂的硫化氢和N，N-二烷基对亚苯基二胺和一种氧化剂如铁氰化钾形成的。生成物3，7-(双-二烷氨基)酚噻嗪-5氯化物，可以通过吸光度或激发并测定荧光来检测。
这种荧光的检测也可用于在此描述的吡哆醛5’-磷酸的测定。
吡哆醛5’-磷酸盐(PLP)是维生素B6的生物活性形式。PLP是参与氨基酸代谢和脂肪酸代谢的许多基本酶的辅因子，包括蛋氨酸酶和同型半胱氨酸酶。其他以PLP为修饰基团的酶包括糖原磷酸化酶以及所有转氨酶。PLP还参与氨基酸α-碳原子上的脱羧作用、脱氨基作用、消旋作用、氨基转移作用和醛醇裂解作用。这些酶依赖PLP是为了活化，因此PLP是一个重要的代谢因子。PLP来源于维生素B6；维生素B6不能被大多数哺乳动物，包括人类合成。因此，这种维生素一般地大多数从饮食中提供。流行病学研究显示，PLP缺乏是心血管疾病死亡率的最强的营养相关因素。维生素B6缺乏引起诸如皮炎和神经异常等症状。
由于PLP参与了代谢且其缺乏涉及多种疾病状态，在本领域中已知有多种方法可确定维生素B6水平和B6的状态。
采用carlsbergensis酵母(S.uvarum)、屎链球菌和干酪乳杆菌的微生物学测定已经被用来检测血和尿中多种形式的B6。在转变为氰化物复合体，或用荧光团，如还原后的甲基邻氨基苯甲酸缩合后，也可用荧光测定尿4’-吡哆酸和血PLP。4’-吡哆酸也可通过HPLC确定。血浆中PLP的浓度也可以通过确定用酪氨酸脱羧酶的脱辅基酶形式从标记的酪氨酸中形成的放射活性标记的酪胺来检测。血浆中的参考范围是5到30ng/ml(Reynolds，R.D.Fed.Proc.(Abst.No.2185)(1983)42：665)。这种检测的形式也可以American Laboratory ProductsCompany，Ltd.(Windham，New Hampshire 03087)的“ALPCO”试剂盒商购得到。
血转氨酶已被用作维生素B6状态的指示剂。在B6缺乏时，血清中的酶活性是被抑制的。但这些酶的释放反映了细胞的死亡，而且在许多组织中的降解导致了变异。天冬氨酸和丙氨酸转氨酶的红细胞水平可为维生素B6状态提供较好的指示(Briggs，M.主编.人类生物学和医学中的维生素(Vitamins in Human Biology and Medicine)，Boca Raton，FL，CRC Press，Inc.1981)。
在口服(2-5g)L-色氨酸后，检测尿色氨酸代谢物，如黄尿酸，也被用于指示B6状态。黄尿酸盐量在正常水平(25mg/d)之上表明维生素B6缺乏。也可应用蛋氨酸负荷试验(Briggs，M.，前面引/用的书，Brown，M.L.，主编.现代营养学知识(Present Knowledge in Nutrition)，第6版.Washington，D.C.，International Life Sciences Institute-Nutrition Foundation，1990)。在B6缺乏病人负荷3g蛋氨酸后，其24小时尿中通过氨基酸分析检测的胱硫醚对亚磺酸半胱氨酸的比例是升高的。
由于对维生素B6在心血管疾病中作用的认识不断增加，以及公共健康的目标是筛选心血管疾病危险的病人，就非常需要更方便和可靠的分析方法可被用于在病人中检测PLP/维生素B6的水平。这种方法期望能够在降低的PLP/维生素B6浓度使其处于特殊疾病状态危险之中的病人、和降低的PLP/维生素B6浓度是其已存在的疾病状态的可检测到的副产物的病人中提供相当大的医学利益。
可用于本发明的酶以其中存在辅因子用于测定的形式公开以检测例如同型半胱氨酸。Hoffman，R.M.等Netherlands Journal of Medicine(1998)52(增刊)S41和PCT公开WO98/07872。然而，本文描述的测定使用了没有辅因子存在的酶，即以其脱辅基酶形式的酶。
这些分析方法将在其他方法可检测出的症状出现前，通过预测病人对心血管疾病的易患性提供很大的益处。在这点上，通过将这些方法应用于普通人群的广泛筛选，特别是应用于在其它方面怀疑具有易患心血管疾病危险的病人，将获得很大的益处。因此特别重要的是该检测方便应用、简单和经济。本发明提供了这种方法，包括在临床环境中使用的诊断试剂盒。
发明的公开
本发明提供了能够在一个生物液体样品如受试者尿、组织液、血、全血、血清或血浆中检测PLP水平的测定方法。因此本发明的方法可用于评价心血管疾病的危险性。本发明的方法也包括了确定结果的方法，该法不仅可用于确定PLP/B6的方法，也可用于评价作为产物的H2S产生的测定方法，并采用比色剂检测所需的分析物。
在一个方面，本发明涉及一种在一个生物样品中确定PLP量的方法，该法包括将所述样品与需PLP酶的脱辅基酶形式接触，当存在PLP时该需PLP酶可产生一个优选地可由颜色或荧光测定的产物。因此，本发明优选的脱辅基酶是同型半胱氨酸/蛋氨酸α-γ裂解酶，该酶已经被耗竭了正常相伴的PLP。也优选那些从半胱氨酸中产生硫化氢的酶。当这些酶恢复/激活成脱辅基酶形式时，产生可容易地通过比色测定或荧光测定检测到的产物。测定的敏感性通过PLP作为辅因子的功能而极大地增强了；因此可使用高水平的底物，而产生了高水平的产物。在另一方面，本发明涉及一种提高测定中产生的H2S的检测敏感性的方法，如用于产生硫化氢的同型半胱氨酸的测定，该法包括测定硫化氢与二烷基对亚苯基二胺和一种氧化剂，如铁氰化物反应产物的荧光。这种改良在同型半胱氨酸或半胱氨酸本身的测定中特别重要，测定的敏感性被提高了超过100倍。然而，这种方法也可用于PLP的测定，其中因为PLP的辅酶作用的增强效果，敏感性提高就不那么重要。
在其他方面，本发明涉及本发明方法的诊断试剂盒。
图表的简要说明
图1显示了用羟胺处理之前，从阴道滴虫中克隆的同型半胱氨酸α、γ裂解酶的光谱。
图2显示了用羟胺处理之后，从阴道滴虫中克隆的同型半胱氨酸α、γ裂解酶的光谱。
图3显示了采用本发明的比色测定方法确定不同浓度标准的PLP浓度的标准曲线。
图4显示了用荧光检测法代替比色检测法得到的相似结果。
图5显示了采用比色或荧光检测方法获得结果的比较。
图6显示了在三个受试者血浆中采用本发明的方法测定PLP与HPLC测定结果的比较。
图7显示了在不同硫化氢浓度下，比色产物荧光和紫外吸收度的比较。
图8显示了用荧光测定的L-同型半胱氨酸的标准曲线。
图9显示了同型半胱氨酸的曲线，表明在采用荧光的酶法同型半胱氨酸测定中半胱氨酸相对缺少干扰，以及来自刺指血样品的结果。
图10显示了在不同半胱氨酸浓度下，采用荧光测定的半胱氨酸相对缺少干扰。
本发明的实施方式
降低的PLP/维生素水平被认为是心血管疾病的一个危险因素。本发明涉及PLP/维生素B6测定方法，及其试剂，使得在一个生物样品中方便的进行PLP/维生素B6浓度的确定。根据本发明的实施，生物样品中PLP/维生素B6浓度是用需PLP的酶的脱辅基酶形式通过酶学方法确定的，需PLP的酶的脱辅基形式此后称为“脱辅基酶”。在样品中的PLP水平决定着其相应脱辅基酶活性的恢复，因此在给定样品中通过与合适的底物接触检测酶活性，从而确定PLP/维生素B6的浓度。优选的脱辅基酶是蛋氨酸酶/蛋氨酸酶/半胱氨酸酶的那些形式，它们催化这些氨基酸的降解。尽管产物氨和/或转化产物如α-酮丁酸盐或其他产物也可检测，但优选检测产物硫化氢。
关于蛋氨酸酶和同型半胱氨酸酶，1nmol酶相当于172μg酶，相当于大约10单位酶。因为每个亚单位蛋氨酸酶或同型半胱氨酸酶全酶结合1个PLP或每个四聚体结合4个PLP，所以只有4nmols PLP可激活相当于10单位酶的1nmol酶。在10mM同型半胱氨酸或蛋氨酸存在的条件下，采用亚甲基蓝原理检测、从醋酸铅形成硫化铅检测或通过MBTH测定法形成α-酮丁酸盐来检测，10单位酶将分别产生1个OD或10个OD或更多。血清B6水平诱导10-2M同型半胱氨酸或蛋氨酸的催化，放大107。
来自恢复/激活全酶的信号具有足够的强度，使得类似的临床化学诊断是可行的。分光光度法检测是最方便的检测方法。通过“分光光度法检测产物”是指该产物是有色的或具有荧光的。分光光度检测可以用裸眼或采用如分光光度计或荧光计的设备进行。测定也具有足够的敏感性，即一个化学干试法，如使用其上固定了脱辅基酶的测量尺，也可被用来检测血清或尿中的PLP。在本发明的一个优选的实施方案中，同型半胱氨酸酶和蛋氨酸酶的固有PLP通过接触羟胺被小心地去除以生成脱辅基酶，之后可与PLP再结合以恢复活性。例如，这些脱辅基酶可以固定在滤纸上，如在测量尺上，然后脱辅基酶可被血清或尿中的PLP激活。测量尺反应可在过量同型半胱氨酸或半胱氨酸和醋酸铅存在的条件下发生，由于形成硫化铅而使测量尺变黑。在另一个优选的实施方案中，重新组成的全酶重新获得水解同型半胱氨酸的能力，产生与获得的PLP的量直接相关的H2S。
脱辅基酶可通过本领域已知的方法固定在任何固体媒介上，如滤纸或珠子上，适合与样品方便的接触。酶活性的恢复/激活也可在存在合适的全酶底物的情况下发生，导致直接反映样品中PLP量的酶产物生成。
在一个优选的实施方案中，本发明可在无PLP的蛋氨酸/同型半胱氨酸α、γ-裂解酶的情况下，在过量同型半胱氨酸存在下进行。此外，本发明可以采用亚甲基蓝衍生物检测来自同型半胱氨酸或半胱氨酸的H2S；采用MBTH来检测α-酮丁酸盐；使用醋酸铅检测H2S；或使用二甲基亚苯基二胺(PDA)、二乙基PDA、二丙基PDA或二丁基PDA来检测H2S。可以选择的是，本发明可使用乳酸脱氢酶和NADH检测来自过量半胱氨酸的丙酮酸盐；或在过量蛋氨酸、同型半胱氨酸或半胱氨酸存在下检测氨。当固定在滤纸上，本发明也可在上述裂解酶的存在下，用过量同型半胱氨酸或半胱氨酸和醋酸铅进行，以形成硫化铅。
可以认识到的是，存在于生物样品如体液中的PLP总浓度，包括不以游离形式存在而被共价偶联于其他分子的PLP分子。本发明的方法包括在检测之前释放这种PLP的步骤。但应该注意的是，由于本发明的方法学提供了游离PLP水平的准确测定，因此即使仅检测游离的PLP，仍然提供了有价值的信息。在许多应用中，期望这些信息作为快速的初步诊断工具是非常有用的，例如在维生素B6缺乏的初步检测中。
依靠检测的方式，其他样品制备技术是需要的或必须的。例如对于比色测定方法，应处理全血以去除红细胞。还需要进一步的分离。
本发明也涉及含有这些脱辅基酶的诊断试剂盒，特别是采用如来自putida假单胞菌、阴道滴虫和ovalis假单胞菌的蛋氨酸/同型半胱氨酸α、γ-裂解酶或半胱氨酸α、β-裂解酶，对维生素B6的类似诊断测试。这些酶可从天然来源或通过重组方式制备。
本发明的技术方面涉及蛋氨酸酶或同型半胱氨酸酶的分离，其中有充分的PLP去除，以在过量蛋氨酸或同型半胱氨酸存在下，消除任何活性。这种条件可允许nM水平的B6激活酶，并如上所述得到高度放大的信号。因此，酶的作用类似于一个晶体管或开关以从非常小量的维生素B6得到高度放大的信号。
在本发明中实例优选的一个需要PLP的酶是来自细菌putida假单胞菌的L-蛋氨酸-α-去氨基-γ-巯基甲烷裂解酶(蛋氨酸裂解酶)。该酶已经由S.Ito等，生物化学杂志，(1976)79，1263-1272页纯化，并确定分子量为大约170kDa。在S.Ito的研究中，酶从α-γ去除蛋氨酸以形成α-酮丁酸盐，甲硫醇和氨。如果同型半胱氨酸是底物，α-酮丁酸盐，硫化氢和氨就是得到的产物。同型半胱氨酸已经从ovalis假单胞菌中分离，H.Tanaka等，生物化学，(1977)16，100-106页。重组产生这种假单胞菌酶的方法也已经建立(见Y.Tan等，蛋白质表达和纯化，(1977)9，233-245页)，本发明在临床实践中使用重组酶期望能在诊断试剂盒成本和测定重复性方面提供一些优势。Tan等文献中描述了一个克隆的构建，该克隆命名为pAC1-1，含有酶编码序列的单一拷贝。另外一个克隆，命名为pAC1-11，已经被构建，含有前后排列的编码序列的两个拷贝。与pAC-1结构一起，pT7-7质粒用来构建pAC1-11。两个编码序列在一个BamHI位点上连接在一起，第一个基因被连接于NdeI和BamHI，第二个基因被连接于BamHI和另一个BamHI位点。
putida假单胞菌酶的底物特异性也已经被确定。例如，N.Esaki等，酶性方法1987)143，459-465页报道在一个相对的活性级别上，对蛋氨酸的活性指定为100，半胱氨酸为10，同型半胱氨酸为180。因此酶可以与所有三种含硫氨基酸反应。应该注意的是，很明显酶对同型半胱氨酸的活性10倍于半胱氨酸，并不能认为是在一个生物样品中半胱氨酸的浓度是高的-实际上是远远高于同型半胱氨酸的浓度。需PLP酶的合适催化活性可以来自其他假单胞菌菌属，或来自其他细菌，采用本领域常规的筛选方法和测定方法即可识别。
用于本发明实例中的需PLP酶来源的另外一组生物体是毛滴虫寄生虫和相关的原生动物。毛滴虫是泌尿生殖道的重要寄生虫，是耐氧(但仍然是厌氧的)的鞭毛虫原生动物。根据本发明的实例，使用来自阴道滴虫的同型半胱氨酸酶是优选的。
毛滴虫属被认为是使用其巯基代谢能力以在宿主组织中抵抗氧毒性，见K.-W.Thong等，实验寄生虫学(Experimental Parasitology)(1987)63，143-151页和在此引用的页数。虽然发现在毛滴虫种属之间，同型半胱氨酸酶活性(在此称为同型半胱氨酸脱硫酶活性)有相当大的不同，但常规对得到的种属进行筛选以寻找可以接受的酶活性水平。虽然在那些熟悉相关领域的工作人员的技术范围之内，根据酶活性的不同采用或多或少量的酶或酶制剂，很好设计这些测定的变化，但一般来说，优选的用于下述测定的需PLP酶应该具有至少大约1单位/mg纯化蛋白的特异活性。应注意的是，高度纯化和活性的putida假单胞菌酶具有大约20单位/mg的特异活性(1单位酶活性应描述为在标准条件下每分钟转换1微摩尔底物)(见Y.Tan等，见上)。
由上面K.-W.Thong等(1987)报道的“同型半胱氨酸脱硫酶活性”看上去来自在毛滴虫中负责蛋氨酸分解代谢活动的同样的酶，后者被B.C.Lockwood和G.H.Coombs(生化杂志(Biochemical Journal)(1991)279，675-682页)称为蛋氨酸-γ-裂解酶，其中也描述了这个酶的纯化。如上所述，本发明的实例优选来自阴道滴虫的蛋氨酸-γ-裂解酶(一个同型半胱氨酸酶)。
使用重组体阴道滴虫酶也是优选的。根据A.Marcos等，FEMSMicrobiology Letters(1996)135，259-264页的观察，一个有潜力的克隆策略是阴道滴虫基因可没有几个内含子。相应地，应构建一个基因组文库(见D.E.Riley等，分子和生化寄生虫学(Molecular and BiochemicalParasitology)(1992)51，161-164页)，并用对应于putida假单胞菌酶的DNA片断进行筛选，期望能反映一些部分保守的序列。
Lockwood等也列举了其他具有蛋氨酸-γ-裂解酶活性的细菌的报道，包括假单胞菌、梭状芽胞杆菌和气单胞菌属。
期望这些种属是用于本发明实例的同型半胱氨酸酶的来源。期望提供有用的同型半胱氨酸酶的其他生物体是某些海藻(见，例如，D.A.Gage等，自然(1997)387，891-897页)，描述了具有广泛的蛋氨酸相关代谢的种属)、硫细菌、和生活在极端环境条件下的地下微生物或其他微生物(见，例如，R.A.Kerr，科学(1997)276，703-704页和E.Pennist，科学(1997)276，705-706页)。可用作同型半胱氨酸酶类型酶来源的其他微生物实例包括参与牙周疾病的细菌，如能够从半胱氨酸形成挥发性硫化合物的细菌。关于这一点，见S.Persson等，口腔微生物学和免疫学(Oral Microbiology and Immunology)(1990)5(4)，195-201页。
上面参考的PCT公开WO 99/05311也描述了可用于本发明方法中的多种形式同型半胱氨酸酶。这些酶中的一些是从putida假单胞菌和阴道滴虫中分离出的酶的嵌合体形式。在这个公开书中对合适酶的描述在此引用作为参考。
另外，PCT公开书WO 99/05311描述了检测全酶产物的各种方法。例如，描述了测定α-酮丁酸盐或丙酮酸盐的方法(取决于底物是否是同型半胱氨酸还是蛋氨酸或半胱氨酸)。该测定采用了3-甲基-2-苯噻唑啉酮腙(MBTH)以形成可用分光光度法在320nm处检测的反应产物。醋酸铅或其他铅盐也可用于检测和测定从同型半胱氨酸或半胱氨酸中产生的H2S。此外，在反应中产生的氨可采用例如谷氨酸脱氢酶来检测。蛋氨酸为底物而产生的巯基甲烷可通过形成亚甲基蓝及其各种变异体来检测，通过采用N，N-二烷基对亚苯基二胺作为反应试剂在大约500nm处测量光密度来检测。这在Tanaka等，应用生物化学杂志(J.AppliedBiochem)(1980)2；439-444中得到描述。
如上所述，测定作为PLP浓度度量的全酶产物的优选方法是比色法，其中产生的H2S与N，N-二烷基p-亚苯基二胺(包括二甲基、二乙基、二丙基或二丁基形式)反应。这些化合物可通过商业渠道获得。N，N-二烷基亚苯基二胺和H2S的混合物通过用一种氧化剂处理而转换成有色的产物，3，7-(双-二烷氨基)酚噻嗪-5氯化物，该氧化剂诸如由铁氰化钾提供的铁离子。得到的化合物通过在675nm左右的光吸收度来检测。
敏感性的提高是通过检测这种产物的荧光而不是吸收度而获得的。典型地，它经受640nm左右波长的激发，荧光在675nm处读数。当酶用于测定底物，如同型半胱氨酸的存在时，这样的敏感性提高很重要。虽然有帮助，但是在被分析物是辅因子PLP的方式中，敏感性的增加并不太明显，因为测定敏感性可通过增加底物同型半胱氨酸的浓度来提高。下面的实例4显示了在同型半胱氨酸的测定范围内荧光测定法的优越性。
可以认识到的是，本发明的PLP/B6检测方法可以不同的方式进行。一种在固体支持物上提供酶的方式在上面得到描述。但优选的是相似的测定，可按照分光光度检测法呈现简单的读数。
进行PLP测定的诊断试剂盒也包括在本发明中。在一个优选的实施方案中，试剂盒将包括重组体同型半胱氨酸酶形式的脱辅基酶、一个标准的磷酸吡哆醛样品、比色剂—优选N，N-二丁基对亚苯基二胺、一种氧化剂如铁氰化钾和底物同型半胱氨酸。这些试剂以方便的方式包装，优选地为使样品中的磷酸吡哆醛与脱辅基酶有效的结合采用合适的缓冲液，以及为进行测定采用一个测定缓冲液。结合缓冲液优选地在pH4.5-5.5范围内的弱酸，优选大约5-5.2，测定缓冲液优选弱碱性，优选pH7.5-9，更优选pH8.3左右。也包括一个合适的稳定还原剂如二硫代苏糖醇，和一个螯合剂如EDTA。
进行同型半胱氨酸测定的合适试剂盒将包括重组体同型半胱氨酸酶、N，N-二烷基对亚苯基二胺溶液—优选二-正丁基衍生物、一种氧化剂如铁氰化钾、和一种还原剂如二硫代苏糖醇或β-巯基乙醇。还将含有作为校准用基准的同型半胱氨酸或同型胱氨酸。
以上引用的所有文献在此整体引用作为参考，不论以前是否特别地引用。
下面的实例目的是举例说明但不限制本发明。
实例1
脱辅基-同型半胱氨酸酶的制备
1.80ml全-重组体同型半胱氨酸酶(酶(rHCY ase))溶液(3.75mg蛋白/ml 20mM磷酸盐缓冲液，pH7.6)、40μl 100mM的二硫代苏糖醇(DTT)和200μl 100mM的磷酸羟胺被制备成混合物。混合物被旋涡混匀并在4℃孵育过夜。
得到的脱辅基-rHCY酶用45％硫酸铵沉淀并以1200RPM的速度离心10分钟。弃去上清液，沉淀溶解于1ml 20mM的磷酸盐缓冲液(pH7.6)中。1ml这样的溶液装在1.0×10cm G-25凝胶过滤柱上，用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.6)冲洗柱子。收集含蛋白的馏分并发现不含磷酸吡哆醛(PLP)。蛋白的浓度被调整为0.1mg蛋白/ml，含有1.0mg/ml海藻糖。
分析证实每亚单位脱辅基-rHCY酶仅含有0.018±0.002摩尔的PLP(采用同样的测定方法，每亚单位全酶含有0.93±0.10摩尔PLP)。
实例2
磷酸吡哆醛的测定
通过将5μl含有不同浓度PLP的溶液在0.475ml结合缓冲液(10mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液pH5.2、1mM EDTA、0.2mM DTT)中稀释，同按实例1中所描述的方法制备的脱辅基-rHCY酶溶液20μl，在测定缓冲液(200mM磷酸钾缓冲液pH8.3、1mM EDTA、0.2mM DTT)中混合，制作标准曲线。样品充分混匀，并在37℃避光预孵育120分钟。50μl DL同型半胱氨酸溶液(一个浓度)被加入到0.450ml测定缓冲液中混合并加到上述样品中，均匀混合，在37℃避光预孵育20分钟。然后在这个混合物中加入50μl溶解于6M HCl的50mM二-正丁基对-亚苯基二胺，和50μl溶解于测定缓冲液的50mM铁氰化钾，混合，在37℃孵育10分钟。然后在675nm处读取吸光度。如图1显示，吸光度在0-200nM PLP范围内是线性的。
通过用荧光测定来代替675的光学密度测定稍微提高了测定的敏感性。采用同样的方法，但是采用640nm的激发波长和675nm的发射波长来读取结果，可获得图2显示的标准曲线。这些结果的比较在图3中显示。在两种情况下，均得到线性曲线；采用荧光发射光，在100nM浓度时获得110荧光单位的读数；采用吸光度，在675nm处获得的读数为0.25OD(大约)。
实例3
人血浆中PLP的测定
重复实例2的步骤，但用5μl EDTA处理的血浆代替5μl含有PLP的标准溶液。三个受试者的结果在图4中显示。显示了与J.Chromatog(1996)722：295-301中描述的采用HPLC方法测定PLP的结果比较。如在图4中显示，虽然本发明方法获得的绝对值与HPLC方法获得的不同，但它们相互之间处于线性关系。但与采用ALPCO试剂盒的脱辅基酪氨酸羧化酶测定法获得的结果有很好的一致性：
样品       本发明的方法         ALPCO法
1            248nM               223nM
2            62nM                54nM
实例4
用荧光检测法确定同型半胱氨酸
在同型半胱氨酸测定中，通过采用荧光测定获得的发光基团的浓度，同采用吸光度相比，敏感性可提高大约1000倍。因此，采用更敏感的荧光为基础的测定方法可以分析比上述的光吸收度为基础的检测法小大约10到100倍的样品。例如一个来自手指穿刺的血样足以在同型半胱氨酸测定中获得强荧光信号。
与光吸收度为基础的测定法比较，荧光为基础的测定法增加的敏感性在图7中显示。在此图中，X轴代表测定中的硫化氢浓度。在具有不同浓度的同样测定中，荧光信号的曲线较光吸收度信号更陡，表明荧光信号较光吸收度信号更敏感。
当用荧光检测时，任何可提供正确信号的适当试剂均是合适的。例如，如上所述用于光吸收度的比色剂，N，N-二丁基-对亚苯基-二胺(DBPDA)，被用于图7所示的荧光为基础的测定中。一般来说，除用荧光测定进行检测外，用于光吸收度为基础的测定的同样条件可以用于荧光为基础的测定。
采用适合的激发光和发射光波长组合可获得非常强的荧光信号，这可以由本领域中普通技术人员确定。例如，在某些条件下可以使用665nm激发光和690nm发射光，或640nm激发光和675nm发射光。
图8基于荧光检测的同型半胱氨酸标准曲线，与图9还包含有固定量半胱氨酸的同型半胱氨酸样品曲线比较，显示半胱氨酸对同型半胱氨酸的检测有很小的干扰。这些结果与光吸收度为基础的测定是一致的。图10显示了不同浓度半胱氨酸样品的相对缺少干扰。
来源于手指穿刺的小血样在此用来确定同型半胱氨酸的浓度。在图8标准曲线中对应于有合适浓度的样品的荧光读数给出了图8图表结果中显示的浓度。

Claims (9)

1. 脱辅基酶形式的依赖吡哆醛-5’-磷酸盐的同型半胱氨酸酶、蛋氨酸酶或半胱氨酸酶在制备用于生物样品中测定吡哆醛-5’-磷酸盐(PLP)浓度的试剂盒中的用途，该测定方法包括：
a)将所述生物样品或其片断与依赖PLP的同型半胱氨酸酶、蛋氨酸酶或半胱氨酸酶的脱辅基酶形式在有足够底物存在的条件下孵育，以有效的转变成分光光度法可观测到的产物，该产物与样品中PLP的浓度成正比；和
b)用分光光度法检测产物。
2. 如权利要求1所述的用途，其中所述分光光度法检测是通过肉眼进行观测的。
3. 如权利要求1所述的用途，其中检测的产物是硫化氢。
4. 如权利要求3所述的用途，其中所述硫化氢是通过与N，N-二烷基对亚苯基二胺和一种氧化剂反应进行检测的。
5. 如权利要求4所述的用途，其中所述产物是通过荧光检测的。
6. 如权利要求3所述的用途，其中所述硫化氢是通过观察所述硫化氢与铅离子的沉淀进行检测的。
7. 如权利要求1所述的用途，其中脱辅基酶是同型半胱氨酸酶。
8. 测定生物液体中PLP的试剂盒，其包含包装的试剂，所述被包装的试剂包含：
包装的脱辅基酶，其是重组体同型半胱氨酸酶、半胱氨酸酶或蛋氨酸酶；
包装的吡哆醛磷酸；
包装的显色试剂；和
包装的同型半胱氨酸、半胱氨酸或蛋氨酸。
9. 权利要求8的试剂盒，其中所述显色试剂包含N，N-二烷基对亚苯基-二胺和一种氧化剂的溶液。
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