SK281517B6

SK281517B6 - Spôsob analýzy homocysteínu a analytická súprava prípravkov na jeho vykonávanie

Info

Publication number: SK281517B6
Application number: SK878-94A
Authority: SK
Inventors: Erling Sundrehagen
Original assignee: Axis Biochemicals As
Priority date: 1992-01-22
Filing date: 1993-01-22
Publication date: 2001-04-09
Also published as: AU676480B2; EP0623174B1; FI943462A0; AU4340893A; CZ287334B6; PT726322E; ES2196116T5; JPH08506478A; JP2870704B2; SK87894A3; DK0726322T3; ATE237696T1; RU2121001C1; ES2196116T3; ES2094524T3; HUT67550A; EP0726322B2; CA2128512C; HU219607B; NO942729L

Abstract

Spôsob stanovenia homocysteínu vo vzorke, napríklad v krvi, plazme alebo v moči, ktorá obsahuje kroky kontaktu uvedenej vzorky s enzýmom, premieňajúcim homocysteín, a aspoň s jedným substrátom zmieneného enzýmu, odlišným od homocysteínu, a stanovenie neoznačenej analyzovanej vzorky, zvolenej z ko-substrátu homocysteínu, a produktov premeny homocysteínu enzýmovou premenou homocysteínu účinkom zmieneného enzýmu, bez nutnosti chromatografického delenia.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka spôsobu analýzy homocysteínu v klinických vzorkách.

Doterajší stav techniky

Homocysteín je aminokyselinou, vznikajúcou ako medziprodukt pri metabolizovani metioninu na cysteín. Všeobecne je homocysteín, vznikajúci v tele, rýchlo metabolizovaný jednou z dvoch možných ciest, (1) kondenzáciou so serínom za vzniku cystatiónu alebo (2) premenou na metionín a jeho koncentrácia (a koncentrácia jeho oxidovanej formy homocysteínu) je v živom organizme za normálnych podmienok skutočne zanedbaná.

Hladiny homocysteínu v biologických vzorkách však môžu byť klinicky významné v mnohých situáciách, pretože homocysteín má významnú úlohu v zložitej sústave metabolických dráh, ktoré zaisťujú metabolizmus sulfhydrylových aminokyselín, jeho nahromadenie potom môže byť známkou rôznych porúch, postihujúcich tieto metabolické dráhy, vrátane najmä vrodených porúch metabolizmu. Napríklad homocysteinúria (abnormálne zvýšenie množstva homocysteínu v moči) je známou poruchou metabolizmu aminokyselín, zapríčinenú deficienciou enzýmu cystation-β-syntetázy alebo metyltransferázy kyseliny metyltetrahydrolistovej (ktorá katalyzuje metylovanie homocysteínu na metionín).

Metabolizmus sulfhydrylových aminokyselín je úzko spojený s metabolizmom kyseliny listovej a vitamínu B_]2(kobalamínu), ktoré sa uplatňujú ako substráty alebo kofaktory rôznych premien sulfhydrylových aminokyselín. Z tohto dôvodu bolo hromadenie homocysteínu navrhnuté ako indikátor zlej funkcie enzýmov, závislých na kobalamíne alebo kyseline listovej, alebo porúch či ochorení, ktoré sa týkajú metabolizmu kobalamínu alebo kyseliny listovej.

Okrem toho, vzhľadom na skutočnosť, že na premenu homocysteínu na metionín dochádza v reakcii, využívajúcej ako donor metylovej skupiny kyselinu S-metyltetrahydrolistovú, môže byť metabolizmus homocysteínu ovplyvňovaný aj liekmi, ktoré pôsobia proti kyseline listovej, ako je metotrexát a ktoré sa podávajú v boji proti iných chorobám, najmä rakovine. Podľa návrhu je preto monitorovanie homocysteínu taktiež využiteľné pri riadení liečby maligných ochorení pomocou látok, pôsobiacich proti kyseline listovej.

Oveľa neskôr boli zvýšené hladiny homocysteínu v krvi dané do vzájomnej súvislosti s vývojom artériosklerózy (pozri Čiarke so spolupracovníkmi, New Engl. J. Med. 324, 1140 až 1155, 1991 ) a teraz je aj mierna homocysteinémia považovaná pri srdcových a cievnych ochoreniach za rizikový faktor. Sledovanie hladiny homocysteínu v plazme alebo v krvi je teda dôležité pre diagnózu a liečenie cievnych ochorení.

Hoci imunologické metódy priameho stanovenia homocysteínu nie sú dostupné, pretože nie sú k dispozícií protilátky voči homocysteínu, bolo navrhnutých veľa iných metód na jeho stanovenie v klinických vzorkách. Všetky tieto metódy vyžadujú chromatografické delenie a všeobecne sú založené na jednom z troch nasledujúcich princípov:

1. klasická chromatografická analýza aminokyselín,

2. reakcia homocysteínu, obsiahnutého vo vzorke, s enzýmom S-adenozyl-L-homocysteínhydrolázou za prítomnosti rádioaktívne alebo inak označeného S-adenozínu ako kosubstrátu, nasledovaná oddelením a kvantifikáciou vznik nutého produktu (S-adenozyl-L-homocysteínu, SAH). Všeobecne sa používa chromatografické delenie (HPLC alebo TLC) a meranie rádioaktivity (pozri Refsum so spolupracovníkmi., Clin. Chem. 31, 624 až 628, 1985; Kredich so spolupracovníkmi., Anál. Biochem. 116, 503 až 510, 1981; Chui, Am. J. Clin. Path. 90(4), 446 až 449, 1988; Totani so spolupracovníkmi, Biochem. Soc. 14(6), 1172 až 1179, 1988; a Schimizu so spolupracovníkmi, Biotechnol. Appl. Biochem. 8,153 až 159, 1986),

3. reakcia homocysteínu, obsiahnutého vo vzorke, s fluoroforom, nasledovaná oddelením pomocou HPLC a fluorometriou (pozri Refsum so spolupracovníkmi, Clin. Chem. 35(9), 1921 až 1927,1989).

Tieto metódy sú časovo náročné a ťažkopádne a všetky sú založené na priamej kvantifikácii. Presnejšie povedané, spoločným rysom týchto metód je chromatografické delenie, vyžadujúce veľmi špecializované a náročné vybavenie.

Používanie takéhoto vybavenia nie je v rutinnej klinickej laboratórnej praxi všeobecne dobre prijímané, a takéto procesy preto nie je možné automatizovať na typické klinické laboratórne postupy.

Podstata vynálezu

Existuje teda potreba zlepšeného spôsobu analýzy homocysteínu, ktorý by bol jednoduchý, špecifický, rýchle uskutočniteľný, ľahko prispôsobiteľný na použitie v klinických laboratóriách a ktorý by sa predovšetkým obišiel bez nákladného a časovo náročného chromatografického delenia. Snahou predkladaného vynálezu je poskytnúť takýto spôsob analýzy.

Jedným aspektom predkladaného vynálezu je teda poskytnutie metódy na analýzu homocysteínu vo vzorke, ktorá zahŕňa kontakt vzorky s enzýmom, premieňajúcim homocysteín, napríklad s S-adenozylhomocysteínhydrolázou (SAH-hydrolázou), ďalej aspoň s jedným substrátom uvedeného enzýmu, odlišným od homocysteínu a stanovenie (najlepšie fotometrickej) neznačenej analyzovanej látky, zvolenej z ko-substrátov homocysteínu a produktov enzymatickej premeny homocysteínu účinkom zmieneného enzýmu, a to bez použitia chromatografického oddelenia (reagencií alebo reakčných produktov).

Po kontakte vzorky s enzýmom, ktorý premieňa homocysteín a so substrátom, je vzorka výhodne inkubovaná aspoň 30 sekúnd, výhodnejšie aspoň 5 minút pred vykonaním nasledujúcich krokov analýzy.

Enzýmom, premieňajúcim homocysteín, použitým v spôsobe analýzy podľa vynálezu, je výhodne zvlášť SAHhydroláza, ale môžu byť využité aj iné enzýmy. Spomenúť možno napríklad betaín-homocysteínmetyltransferázu a iné enzýmy, zúčastňujúce sa premeny homocysteínu (opísané napríklad Grahamom v Trends Cardiovasc. Med. 1, 244 až 249,1991).

Ko-substrátom homocysteínu, stanoveným v postupe podľa vynálezu, je zlúčenina, ktorá s homocysteínom reaguje v enzýmom (napríklad SAH-hydrolázou) katalyzovanej reakcii, premieňajúcej homocysteín.

Výrazom „stanovenie“, ako je tu používaný, je myslené tak kvantitatívne ako aj kvalitatívne zistenie v zmysle získania absolútnej hodnoty, týkajúcej sa množstva alebo koncentrácie analyzovanej látky, napríklad ko-substrátu homocysteínu, prítomnej vo vzorke a taktiež získanie indexu, pomeru, percentuálnej, vizuálnej alebo inej hodnoty, vyjadrujúcej hladinu analyzovanej látky vo vzorke. Stanovenie môže byť priame alebo nepriame a skutočne merané chemické látky nemusia samozrejme byť analytickým činid

SK 281517 Β6 lom samé o sebe, ale môžu byť napríklad jeho derivátom alebo nejakou ďalšou látkou, ako je uvedené ďalej.

Spôsob analýzy podľa vynálezu výhodne používa na určenie analyzovanej látky enzýmové alebo imunologické metódy. V enzýmovej metóde, ktorá je výhodná, sa analyzovaná látka dostáva do styku s ďalším enzýmom, ktorého je substrátom a stanovuje sa buď ko-substrát alebo priamy alebo nepriamy reakčný produkt enzýmovej premeny analyzovanej látky účinkom tohto ďalšieho enzýmu. V imunologickej metóde, ktorá je výhodná sa, analyzovaná látka stanovuje postupom, pri ktorom analyzovaná látka kompetitívne viaže protilátku a ďalší haptén (napríklad polyhaptén alebo označený analóg analyzovanej látky) a stanovuje sa viazaný alebo nenaviazaný haptén.

Enzýmom, premieňajúcim homocysteín, ktorému sa dáva prednosť a používaným podľa vynálezu, je S-adenozylhomocysteínhydroláza (SAH-hydroláza), katalyzujúca reakciu homocysteínu:

adenozín + homocysteín “ S-adenozyl-homocysteín (SAH) v rekcii s rovnovážnou konštantou K = 10⁶. M’¹.

Reakcia môže prebiehať, v závislosti od reakčných podmienok, koncentráciou reagujúcich činidiel a podobne, oboma smermi.

V uvedenej schéme je adenozín ko-substrátom homocysteínu. Iné ko-substráty, ako analógy adenozinu alebo príbuzné zlúčeniny, môžu byť taktiež použité v analytickej metóde podľa vynálezu.

Zvláštnou výhodou spôsobu analýzy podľa vynálezu môže byť skutočnosť, že homocysteín pôsobí ako inhibítor SAH-hydrolázy tlmením hydrolytickej reakcie, v ktorej vzniká homocysteín a adenozín, a posúva tak rovnovážny stav reakcie v prospech syntézy SAH.

Množstvo homocysteínu vo vzorke teda nepriamo ovplyvňuje tvorbu alebo spotrebu ko-substrátu homocysteínu, napríklad adenozinu, v reakcii SAH-hydrolázy, a tým aj jeho výslednú koncentráciu v reakčnej zmesi. V tomto vynáleze môže byť výsledná koncentrácia alebo zmena koncentrácie homocysteínového ko-substrátu v reakčnej zmesi, napríklad adenozinu, využitá ako indikátor počiatočnej koncentrácie homocysteínu vo vzorke. V takomto prípade, keď je analyzovanou látkou ko-substrát, sa spôsob analýzy podľa vynálezu od skôr známych metód líši tým, že homocysteín je skôr než priamym spôsobom stanovovaný nepriamo, meraním koncentrácie svojho ko-substrátu pri enzýmovo katalytickej premene. Výhodou tohto spôsobu je, že detekčné metódy, ktoré vyhovujú typickým klinickým laboratórnym postupom, ale neboli vhodné pre skôr používané spôsoby analýzy homocysteínu, napríklad fotometrické metódy, môžu byť teraz využité, čím sa spôsob analýzy podľa vynálezu stáva zvlášť vhodným na rutinné klinické použitie.

V analytickej metóde podľa vynálezu, ktorej sa dáva prednosť, môže byť reakcia SAH-hydrolázy použitá v oboch smeroch. Ak sa teda testovaná vzorka dostane do styku s adenozínom a SAH-hydrolázou, množstvo spotrebovaného adenozinu zodpovedá množstvu spotrebovaného homocysteínu a pôvodné množstvo homocysteínu vo vzorke tak môže byť stanovené z rozdielu v koncentrácii adenozínu. Namiesto samotného adenozinu môžu byť použité jeho analógy a/alebo zlúčeniny, vytvárajúce adenozín.

V inom uskutočnení podľa vynálezu, ktorému sa dáva prednosť, môže byť použitý opačný smer reakcie. K testovanej vzorke môže byť pridaný SAH (zvyčajne v prebytku) a SAH-hydroláza. Homocysteín a adenozín potom vznikajú hydrolýzou SAH. Akýkoľvek homocysteín, prítomný v testovanej vzorke, bude negatívne ovplyvňovať samotnú reakciu a inhibovať tvorbu adenozinu, ktorého množstvo je sledované.

Substráty SAH-hydrolázy, použité v postupe podľa vynálezu, môžu byť teda SAH alebo adenozín alebo jeho analógy a prekurzory.

V zložitej sústave metabolických dráh sulfhydrylových aminokyselín a transmetylačných reakcií v organizme je zapojených veľa enzýmov. Tieto dráhy a reakcie boli podrobne študované a bola zistená regulačná úloha zúčastnených enzýmov. Úloha jedného z týchto enzýmov, SAHhydrolázy, je diskutovaná Uelandom v prehľadnom článku v Pharmacological Reviews 34, 223 až 253, 1982. Trewyn so spoluautormi opisuje v Biochem. Biophys. Met. 4, 299 až 307, 1981, skúmanie regulačnej úlohy SAH-hydrolázy a poskytuje spôsob analýzy enzýmovej aktivity tohto enzýmu. Garras so spoluautormi opisuje v Anál. Biochem. 199, 112 až 118,1991, inú reakčnú dráhu homocysteínu a najmä stanovuje spôsob analýzy premeny homocysteínu, sprostredkovanú metionínsyntázou. Ako bolo uvedené skôr, Graham (ad str. 4) opisuje ďalšie enzýmovo sprostredkované premeny homocysteínu. Ko-substráty a produkty premeny rôznych týchto reakcií môžu byť použité ako analyzované látky v spôsobe analýzy podľa vynálezu, zvlášť v prípade využitia imunologických prostriedkov stanovenia.

Klinické vzorky, v ktorých sa vykonáva stanovenie podľa vynálezu, môžu vychádzať z ktorejkoľvek biologickej tekutiny alebo tkanivového extraktu a môžu byť pred analýzou upravované. Všeobecne sa však používajú vzorky moču alebo plazmy.

V plazme alebo v moči môže byť významná časť prítomného homocysteínu viazaná disulfidickým mostíkom na cirkulujúce bielkoviny, ako je albumín a homocysteín môže byť prítomný aj vo forme iných disulfidových derivátov (zvyčajne konjugátov homocysteín-cysteín). Pre odhad celkového množstva homocysteínu, prítomného vo vzorke, môže byť žiaduce ovplyvnenie vzorky redukčným činidlom, čim dôjde k rozštiepeniu disulfidových väzieb a uvoľneniu voľného homocysteínu.

Disulfidy je možné ľahko a špecificky redukovať pomocou tiolov (napríklad ditiotreitolu, DDT, ditioerytritolu, DTE, 2-merkaptoetanolu, cysteíntioglykolátu, tioglykolovej kyseliny, glutatiónu a podobných zlúčenín). Priama chemická redukcia môže byť dosiahnutá použitím borohydridov (napríklad borohydridu sodného) alebo amalgámov (napríklad amalgámu sodného), prípadne špeciálnejších reagencií, ako sú fosílny alebo je možné použiť fosforotioláty. Redukciu disulfidov zhŕňa Jocelyn v Methods of Enzymology 143, 243 až 256, 1987, kde uvádza širokú škálu vhodných redukčných činidiel.

Adenozín alebo iné ko-substráty homocysteínu môžu byť stanovené známymi metódami. Metódy všeobecne spočívajú vo fotometrickej (napríklad kolorimetrickej, spektrofotometrickej alebo fluorometrickej) detekcii a prednosť sa dáva imunologickým metódam, ktoré môžu byť zvlášť ľahko upravené na použitie v klinických laboratóriách. Zvláštna prednosť sa dáva metódam, využívajúcim enzýmovú reakciu alebo reakciu s mono- alebo polyklonálnymi protilátkami, pretože sú jednoduché a rýchle a ich uskutočnenie môže byť relatívne menej finančne nákladné. Tak napríklad je možné analyzovanú látku stanoviť monitorovaním jej reakcie s enzýmom, ktorý ju priamo alebo nepriamo premieňa na produkty, ktoré môžu byť detegované fotometrický, napríklad spektrofotometricky. Medzi vhodné enzýmy, ktoré by samozrejme nemali reagovať s inými substrátmi enzýmu, premieňajúceho homocysteín, zvlášť so samotným

SK 281517 Β6 homocysteínom, patrí adenozíndeamináza (premieňajúca adenozín na inozín) a adenozínkináza (ktorá premieňa adenozín a ATP na ADP a fosforylovaný adenozín). Takéto enzýmy môžu byť následne spojené s ďalšími enzýmami, ktoré vzniknuté produkty premenia na ďalšie, detegovateľné produkty.

K príkladom imunologických metód patria metódy, zakladajúce sa na reakcii analyzovanej látky s jej špecifickými protilátkami, ktoré je možné stanoviť buď samotné alebo môžu ďalej reagovať za vzniku detegovateľných produktov, napríklad v „sendvičovom stanovení“. Jedna zvlášť príťažlivá imunologická metóda zahŕňa použitie fluoroforom označeného analógu analyzovanej látky, najlepšie kosubstrátu, napríklad fluoresceínom označeného adenozínu, ktorý sa môže spolu s neznačenou analyzovanou látkou dostať do kontaktu s protilátkou analyzovanej látky. Pokiaľ je výsledný produkt podrobený analýze polarizácie fluorescencie s použitím polarizovaného excitačného žiarenia, môže byť určenie koncentrácie neoznačenej analyzovanej látky odvodené zo stupňa depolarizácie fluorescenčného žiarenia. Protilátky voči adenozínu sú komerčne dostupné, (napríklad od firiem Paessel & Lorei GmbH, Frankfurt, SRN a Serotech Ltd., Oxford, Veľká Británia) a postupy imunoanalýzy polarizácie fluorescencie (FPIA) sú dobre zavedené (pozri napríklad US-A-4420568 a US-A-4593089 a inej publikácie Abbott Laboratories, týkajúce sa ich techniky TDx).

Príklady detekčných schém, použitých v spôsobe analýzy podľa vynálezu teda zahrnujú; protilátka

1) adenozín ---------------------------> detekcia FPIA + adenozín, značený fluoresceínom

2) adenozín ---------------------------> inozín + NH3 adenozíndeamináza

3) adenozín------------	-> inozín	> hypoxantín
adenozín-		purin-
deamináza		nukleozidfosforyláza
θ2_ν yH₂O₂	°²K x	_λη₂ο₂
¹¹¹ > xantín -		-----------> kyselina močová
xantínoxidáza	xantínoxidáza

adenozínkináza

4) adenozín + ATP-------------------------> adenozín-5'-P + ADP spolu s kompetujúcou chemiluminiscenčnou reakciou ATP, napríklad luciferáza

ATP + luciferi n + O2-----------------> oxyluciferln + PP, + AMP a CO2 + svetlo alebo s fluoroforom označeným adenozínom, ktorý kompetuje o ATP/adenozínkinázu, kde sa stanovenie vykonáva meraním polarizácie fluorescencie.

Ako je zrejmé zo schém 2 a 3, inozín a kyselina močová majú zreteľné schopnosti absorpcie UV svetla a môžu teda byť sledované spektrofotometricky, na základe kinetických meraní.

Použitie detekcie kyseliny močovej alebo inozínu v UV svetle však podlieha istým obmedzeniam, ktoré znižujú citlivosť metódy a nevyhnutný je taktiež zdroj UV svetla a zásobník vzoriek, prepúšťajúci UV žiarenie. Môže teda byť výhodnejšie používať kolorimetrickú detekciu alebo elektronické senzory, a takýmto metódam, zvlášť kolorimetrii, sa v klinických laboratóriách zvyčajne dáva prednosť.

V tejto súvislosti je zvlášť užitočná reakcia podľa schémy číslo 2, v ktorej amoniak, vznikajúci použitím adenozíndeaminázy ako katalyzátora, môže byť ľahko detegovaný známymi kolorimetrickými technikami. Vo vzorke vzniknutý amoniak tak môže napríklad ďalej reagovať za vzniku sfarbených produktov, ktorých tvorbu je možné sledovať spektrofotometricky. Jedna z týchto metód, opísaná v Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer), zv. 1, 1049 až 1056,1970, je založená na reakcii amoniaku s fenolom v alkalickom prostredí za prítomnosti chlómanu, v ktorej vzniká farebný indofenol:

NH, + oa ♦

N«2|F.(CtfcN°)

Ako katalyzátor môže byť použitý nitroprussid sodný. Uplatniť sa môžu aj modifikácie tejto metódy, využívajúce napríklad rôzne deriváty fenolu.

Sfarbený konečný produkt vzniká v množstve priamo úmernom koncentrácii amoniaku, a tým aj adenozínu vo vzorke.

Reakcia, katalyzovaná xantínoxidázou podľa schémy 3, je vhodná na detekciu, využívajúc fluorogénov alebo chromogénov, napríklad redoxných indikátorov, stanovenie oxidačné redukčného potenciálu alebo na meranie spotreby O₂, či presnejšie tvorby H₂O₂, napríklad pomocou elektronických senzorov. Na tento účel môže byť použité množstvo redoxných indikátorov a v literatúre, vzťahujúcej sa na stanovenie H₂O₂ a O₂ v roztoku, je opísaný široký výber metód. H₂O₂ je v klinických analýzach detegovaný skutočne veľmi často.

Medzi vhodné indikátory patrí metylénová modrá, 2,6-dichlórfenol, indofenol a rôzne redoxné indikátory, uvedené v tabuľke 1 katalógu č. 53, Kodak Laboratory & Research Products, aj keď samozrejme je možné použiť aj iné. Na uľahčenie priebehu reakcií môžu byť pridané enzýmy s peroxidázovou aktivitou, napríklad peroxidáza z chrenu.

MTT tetrazólium v kombinácii s xantínoxidázou alebo inými podobnými enzýmami môže byť použité v prípade, že je žiaduca prítomnosť precipitujúceho chromogénu. Použitím takéhoto chromogénu alebo fluorogénu je možné získať odčítanie imobilizovaného sfarbenia alebo fluorescencie, umožňujúce vizuálne zistenie koncentrácie homocysteínu.

V schéme 4 je na stanovenie koncentrácie adenozínu použitá chemiluminiscenčná reakcia ATP. Spôsoby analýzy založené na chemiluminiscencii, majú značný potenciál, daný nízkymi dosiahnuteľnými detekčnými limitmi a reaktívnou jednoduchosťou nevyhnutného vybavenia. Chemiluminiscenčné reakcie môžu byť použité na detekciu analyzovaných látok, ako je ATP alebo H₂O₂ a jednou z najúčinnejších a najznámejších takýchto reakcií je bioluminiscenčná reakcia pri svätojánskych muškách luciferáza

ATP + luciferin + O₂---------------—> oxyluciferin + PPj + AMP + CO2 + svetlo

Luciferin svätojánskych mušiek má benzotiazolovú štruktúru, ale dostupné sú aj luciferíny z iných biologických zdrojov, ktoré majú štruktúry odlišné. Na analytické účely môžu byť použitím tejto reakcie ATP luciferin alebo luciferáza priamo stanovované. Inou chemiluminiscenčnou reakciou, ktorú je možné použiť pokiaľ vzniká H₂O₂, ako napríklad v schéme číslo 3, je reakcia luminolu, t. j.

5-amino-2,3-dihydroftalazín-l,4-dionu, s katalyzátorom hydrogenperoxidázy, poskytujúca emisiu svetla pri 425 nm.

Peroxid vodíka, vzniknutý podľa schémy 3, môže byť taktiež stanovený použitím neenzýmových chemiluminiscenčných reakcií peroxioxalátu a akridínových esterov, v prípade esterov vo vodnom roztoku pri neutrálnom pH.

Použitie fluoroforom označeného adenozínu v schéme 4 a stanovenie meraním polarizácie fluorescencie je uskutočniteľné vďaka pomerne širokej substrátovej špecifickej adenozínkinázy. Táto široká špecifičnosť môže byť navyše využitá ku kompenzácii endogénneho adenozínu (alebo iných nukleozidových substrátov adenozínkinázy) pridaním adenozínkinázy najlepšie spolu s redukčným činidlom (napríklad DTT) do vzorky ajeho preinkubáciu.

Takáto enzýmová preinkubácia vzorky je žiaduca, pokiaľ je, ako v mnohých uskutočneniach podľa vynálezu, analyzovaná látka (napríklad adenozín) už vo vzorke prítomná v rôznom množstve a poskytuje tak možný zdroj chyby uskutočňovanej analýzy. Obsah analyzovanej látky, tvoriaci hodnotu pozadia, môže byť kompenzovaný vykonaním analýzy v časti vzorky bez prítomnosti enzýmu, premieňajúceho homocysteín napríklad SAH-hydrolýzy); takýto postup je však časovo náročný a analýza sa stáva ťažkopádnejšia. Inou možnosťou je preinkubácia vzorky s činidlom, slúžiacim na premenu alebo na odstránenie endogénnej analyzovanej látky, napríklad s enzýmom, ako je adenozinkináza alebo adenozíndeamináza, ktoré odstraňujú adenozín, tvoriaci pozadie. Ako už bolo zmienené, na zabránenie časového predĺženia priebehu analýzy môže byť takáto preinkubácia výhodne uskutočnená v čase preinkubácie s reakčným činidlom, uvoľňujúcim homocysteín.

Okrem použitia spektrofotometrických alebo kolorimetrických metód na stanovenie analyzovanej látky môžu byť použité aj iné fotometrické metódy. Medzi najužitočnejšie patrí aglutinácia častíc a imunoprecipitačné metódy. V prípade použitia polyklonálnych protilátok môže byť využitá priama aglutinácia častíc alebo priama imunoprecipitácia, hoci takémuto postupu sa zvyčajne nedáva prednosť, pokiaľ je ako enzým, premieňajúci homocysteín, aplikovaná SAH-hydroláza. Použité však môžu byť metódy, využívajúce inhibíciu precipitácie alebo inhibície aglutinácie častíc. Tie spočívajú v použití protilátky spolu s hapténom, ktorých konjugácia vedie k zrážaniu (precipitácii) zhluku častíc, ktoré môže byť detegované turbidimetrickým alebo nefelometrickým meraním. Pokiaľ je vznik komplexu protilátky a hapténu inhibovaný analyzovanou látkou, napríklad SAH, môže byť obsah tejto látky stanovený na základe redukovania precipitácie a/alebo agregácie. Reakciu je možné znázorniť nasledovne:

protilátka +	haptén ----------	—— —> tvorba komplexu
(zvyčajne via*	(najlepšie	(precipitácia alebo
zaná na častice)	polyhaptén)	agregáda častíc

Pokiaľ je v spôsobe analýzy podľa vynálezu použitá SAH-hydroláza ako enzým, premieňajúci homocysteín, je výhodné buď SAH-hydrolázu skladovať v prítomnosti redukčného činidla alebo ju redukčným činidlom ovplyvniť pred jej použitím na analýzu. Bolo zistené, že skladovanie inak vyvoláva inaktiváciu tohto enzýmu a použitie redukčného činidla buď zabraňuje inaktiváciu počas skladovania alebo reaktivuje enzým pred použitím.

Použité môžu byť rôzne redukčné činidlá (napríklad DTT, cysteín, merkaptoetanol, ditioerytritoi, borohydrid sodný a pod.), zvlášť vhodný je však DTT, napríklad v koncentrácii približne 5 nM. Samotný DTT môže byť uchovávaný pri nízkom pH a súprava prípravkov na vyko nanie analýzy teda výhodne obsahuje roztok DTT s nízkym pH (napríklad asi 3), avšak s nízkou pufŕačnou kapacitou, a oddelený roztok SAH-hydrolázy, ktorá môže byť čiastočne alebo celkom inaktívna s pH v zásade neutrálnym a najmä pufrovaný. Po spojení týchto roztokov sa enzým reaktivuje pri neutrálnom pH. Ak je to žiaduce, môže k tomuto spojeniu dôjsť v prítomnosti testovanej vzorky alebo môže byť vzorka pridaná krátko potom, takže k uvoľneniu homocysteínu dochádza súčasne. Podobne môžu byť na stabilizáciu a/alebo aktiváciu SAH-hydrolázy, rovnako ako na redukciu vzorky na uvoľnenie homocysteínu, použité iné uvedené redukčné činidlá.

Použitie redukčných činidiel na reaktiváciu inaktivovanej SAH-hydrolázy je ďalším aspektom vynálezu. V ďalšom ohľade vynález tiež predkladá sadu, obsahujúcu v prvej časti inaktívnu SAH-hydrolázu a v druhej časti redukčné činidlo, napríklad DTT v kyslom prostredí (o pH napríklad 3). Pri použití tejto sady môže byť SAH-hydroláza zmiešaná s redukčným činidlom, a tým reaktivovaná bezprostredne pred použitím v analýze. Na zvýšenie stability SAH-hydrolázy počas skladovania či samotnej analýzy môžu byť výhodne použité aj ďalšie prídavné látky. Patrí medzi nich NAD+, glutatión, polyhydroxylované alkoholy a cukry (napríklad inositol, sorbitol, xylitol, erytritol, glycerol, etylénglykol, sacharóza, laktitol a podobne), rozpustné polyméry ako niektoré dextrány a bielkoviny (napríklad nosičové bielkoviny).

Pokiaľ sa v spôsobe analýzy podľa vynálezu používajú protilátky, môžu byť polyklonálne, ale prednosť sa dáva monoklonálnym. Pokiaľ potrebné protilátky dosiaľ nie sú komerčne dostupné, môžu byť vyrobené obvyklými technikami. Tak monoklonálne ako aj polyklonálne protilátky môžu byť získané od zvierat alebo z hybridomov, ako opisuje napríklad James Gooding v kapitole 3 knihy „Monoclonal antibodies, principle and practice“, vydanej v Academic Press, London, 1983. Monoklony musia byť triedené na získanie takých klonov, ktoré rozlišujú požadovaný haptén od ďalších substrátov enzýmov, napríklad teda rozlišujú adenozín a SAH. Polyklonálne protilátky, reagujúce len s analyzovanou látkou (napríklad SAH), musia byť vyčistené na odstránenie krížovo reagujúcich protilátok, t. j. takých, ktoré reagujú okrem analyzovanej látky aj s inými substrátmi, napríklad s adenozínom aj so SAH. Čistenie môže byť vykonané afinitnou chromatografiou, napríklad s použitím imobilizovaného adenozínu, ak je analyzovanou látkou SAH.

Pri výrobe protilátok sa ako haptén používa buď samotná analyzovaná látka alebo iné molekuly, ktoré obsahujú tú časť analyzovanej látky, ktorá je považovaná za najvhodnejšiu väzbovú oblasť, napríklad oblasť vzdialenú od takých oblastí, ktoré sa zúčastňujú enzýmovej reakcie. Haptén je výhodne spojený s makromolekulou, ako je BSA (hovädzí sérový albumín) alebo hemokyanín. Epitop požadovaný pre SAH je výhodne v mieste tioéterového mostíka alebo v jeho blízkosti a aj keď je možné použiť samotný SAH,

SK 281517 Β6 naviazaný na makromolekulu, prednosť sa dáva použitiu „zjednodušenej“ molekuly, ako je molekula podľa vzorca (I)

OH OH (I), kde R¹ a R², ktoré môžu byť zhodné alebo odlišné, sú vodíkové atómy alebo skupiny OR⁴, kde R⁴ je nižšia, napríklad Ci-6, výhodne C|.4 alifatická skupina, ako je alkylová skupina, výhodne metylová alebo etylová skupina, alebo R' a R² spoločne predstavujú kyslíkový atóm a R³ je amínová alebo karboxylová skupina, alebo jej soľ alebo ester, napríklad s CMalkoholom, opäť naviazané na makromolekulu.

Ďalej sú uvedené príklady zlúčenín podľa vzorca (I), ktoré môžu byť použité ako haptény

HMCHJjSCH! θ h

Kh h/| h η—Y h OH OH

OH OH a

HOOCÍCH^sCHi _H

RH H/j H N--Y H

OH OH

kde R¹ a R² zodpovedajú uvedenej definícii a každý zvyšok R⁵ je chránenou hydroxylovou skupinou alebo oba zvyšky R⁵ tvoria spolu alkyléndioxyskupinu, t. j. chránenú bishydroxyskupinu, ako je -OC(CH₃)₂O-, s propylhalidom podľa vzorca (III)

R⁶(CH₂)₃Hal, kde R⁶ je skupina R³ alebo chránená skupina R³ a Hal je halogenovaný atóm, napríklad brómu, nasledovaná, ak je to požadované, odstránením ktorýchkoľvek ochranných skupín.

b) (na prípravu zlúčeniny podľa vzorca (I), kde R³ je aminoskupina) reakcia zlúčeniny podľa vzorca (Π) s akrylonitrilom, redukcia získaného kyanopropyltioéterového produktu a odstránenie jeho ochranných skupín a

c) esterifikácia zlúčeniny podľa vzorca (I), kde R³ je karboxylová skupina. Východiskové produkty podľa vzorca (III) môžu byť pripravované štandardnými postupmi alebo sú známe z literatúry. Východiskové produkty podľa vzorca (II) môžu byť pripravené zo zodpovedajúcich 1-hydroxymetylíúranozových zlúčenín ochranou cis-hydroxyskupiny, bromovaním a následnou reakciou s tiomočovinou s hydrolýzou. 1-hydroxymetylfúranózy môžu mať cis-hydroxyskupinu chránenú činidlami bežne používanými na jej ochranu, napríklad acetónom.

Medzi príklady reakčných schém na prípravu zlúčenín podľa vzorca (I) patria nasledujúce (zlúčeniny (1) a (3) sú komerčne dostupné):

Takéto „zjednodušené“ štruktúry môžu byť taktiež zavedené pre označené analógy uvedené a používané v spôsoboch analýzy, v ktorých sa analyzovaná látka a označený analóg zúčastňuje kompetitívnej väzbovej reakcie s protilátkou. Tak môže byť častica R¹, poskytujúca signál, ktorá môže byť zvolená z fluoroforov, chromoforov, rádiových, enzýmových, chemiluminiscenčných a iných označení, všeobecne používaných v imunologických analýzach, pripojená na analyzovanú látku, ako napríklad R -SAH, alebo na zjednodušenú, epitop obsahujúcu molekulu, ako napríklad

R'ch₂ch₂ch₂sgh₂

Takéto označené zlúčeniny môžu byť samozrejme v prípade potreby pripojené aj na častice, polyméry alebo iný materiál.

Označené 6-tioétery íúranózy a zlúčeniny podľa vzorca (I) sú nové a tvoria ďalšiu stránku vynálezu.

Vynález predkladá aj postup prípravy zlúčenín podľa vzorca (I) a tento postup zahrnuje aspoň jeden z nasledujúcich krokov:

a) reakcia zlúčeniny podľa vzorca (II)

2. H.O/OH

οβγ.,ρ^η^ (E) (7)

CHaQfCttaOH

SK 281517 Β6

C₂HsOCO(CHzhS

BrtCH^COOCjHs

(11)

(I) (11) (J) (12)

HOOCfCHj),

1.OH·/ díoxán

2.H*/HjO

OH OH

N-hydroxysukctnimld dteyklohexylkubodHmld dlrrtetylfomafffld

Absorpcia UV svetla, absorpcia viditeľného svetla alebo fluorescencia látok v reakčnej zmesi, zvyčajne vyzrážaných alebo inak z reakčnej zmesi oddelených, môže byť meraná v reakcii typu „konečný bod“ (keď je signál stabilný) alebo v jednom či vo viacerých pevných časových bodoch alebo môže byť použité kinetické meranie, keď je niekoľko meraní uskutočnených v rôznych časových bodoch.

Na vykonanie analýzy podľa vynálezu môžu byť nevyhnutné reagencie do reakčnej zmesi pridané postupne alebo súčasne. V mnohých uskutočneniach, ktoré sú výhodné, je však výhodné, aby jedna či viacej reakcií prebiehali určitý čas pred pridaním reagencií pre nasledujúce reakcie. Napríklad pri reakcii testovanej vzorky s adenozínom a SAH-hydrolázou sa dáva prednosť tomu, aby sa tvorba SAH z adenozínu a homocysteínu uskutočnila nejaký čas pred tým, než bude stanovovaný adenozín.

V klinickej chemickej analytike je bežnou praxou použitie štandardných kriviek na účely kalibrácie. Pri vykonávaní metódy podľa tohto vynálezu teda môžu byť vzorky so známym obsahom homocysteínu použité namiesto klinických vzoriek na zostrojenie štandardných kriviek pre meranú odpoveď a/alebo signál a obsah homocysteínu v neznámych vzorkách môže byť vypočítaný interpoláciou zo štandardných kriviek. Preto nie je potrebná exaktná kvantifikácia molekúl, poskytujúcich signál, alebo redoxných potenciálov.

Metóda analýzy podľa tohto vynálezu môže byť použitá na diagnózu a sledovanie patologických a možných patologických podmienok, ktoré ovplyvňujú obsah homocysteínu v telových tekutinách alebo tkanivách, alebo sa k nemu vzťahujú. Patrí k ním artérioskleróza, krvné ochorenia, nedostatok vitamínov a/alebo vrodené poruchy metabolizmu. Táto metóda môže byť využitá aj na stanovenie účinku farmaceutík, ako sú lieky pôsobiace proti kyseline

V inom ohľade poskytuje vynález voliteľne vo forme sady prípravkov analytický produkt, určený na analýzu homocysteínu vo vzorke, ktorá sa skladá z: enzýmu, premieňajúceho homocysteín; zo substrátu tohto enzýmu, odlišného od homocysteínu; z činidla, poskytujúceho merateľný signál a voliteľne z prostriedkov na stanovenie signálu.

Vo výhodnom uskutočnení, analytický produkt obsahuje: enzým, premieňajúci homocysteín, napríklad S-adenozylhomocysteínhydrolázu; jeden alebo viac substrátov tohto enzýmu, líšiacich sa od homocysteínu; prostriedky na vytvorenie detegovateľného derivátu analyzovaného činidla, vybraného z ko-substrátov homocysteínu a produktov jeho enzýmovej premeny; a voliteľne, prostriedky na spektrometrické alebo kolorimetrické stanovenie uvedeného detegovateľného derivátu na indikáciu obsahu homocysteínu vo vzorke.

V inom uskutočnení produkt obsahuje: adenozín; S-adeno-zínhomocysteínhydrolázu; enzým, premieňajúci adenozín; voliteľne ko-substrát uvedeného enzýmu, premieňajúceho adenozín a prostriedky na vytvorenie fotometrický detegovateľnej odpovede uvedeného ko-substrátu alebo produktu enzýmovej premeny adenozínu zmieneným adenozín-premieňajúcim enzýmom. Enzýmom, premieňajúcim adenozín, môže byť napríklad adenozínkináza a prostriedky na vytvorenie odpovede môžu zahrnovať ATP, luciferín a luciferázu. Alebo môže byť enzýmom, premieňajúcim adenozín, adenozíndeamináza a prostriedky premeny môžu obsahovať nukleozidfosforylázu, xantínoxidázu a peroxidázu.

V ešte ďalšom uskutočnení súprava obsahuje: adenozín; S-adenozylhomocysteín; protilátku proti S-adenozylhomocysteínu, voliteľne viazanú na častice matrixu; polyhaptén uvedenej protilátky; a podľa voľby prostriedku na fotometrické stanovenie aglutinácie alebo precipitácie komplexu protilátka: polyhaptén. V tomto uskutočnení môže byť polyhaptén výhodne tvorený základným reťazcom polyméru, na ktorý je pripojené množstvo 6-tioéterov furanózy, napríklad navešaných zvyškov so vzorcom

OH OH

Tieto látky môžu vznikať napríklad reakciou karbocyklickej kyseliny podľa vzorca (I) (alebo anhydridu alebo kyslého halidu takejto kyseliny) s polymérom, majúcim množstvo navešaných amínov (napríklad s polylyzinom) alebo reakciou amínu podľa vzorca (I) s polymérom, obsahujúcim navešané karboxylové skupiny.

V sade prípravkov môžu byť buď všetky alebo len niektoré reagencie v suchej forme, ako zložka a/alebo matrix na uskutočnenie reakcie danej reakčnej zmesi. Podobne môže súprava, ako bolo naznačené, zahrnovať ako prostriedok na stanovenie detegovateľnej analyzovanej látky alebo derivátu, pomerne finančne menej nákladný spektrometrický alebo kolorimetrický prístroj, napríklad svetelný zdroj a detektor vo vopred nastavenom usporiadaní na detekciu intenzity svetla pri charakteristickej vlnovej dĺžke detegovateľnej analyzovanej látky atď. alebo je potrebná len jednoduchá kolorimetrická kalibračná tabuľka.

Vynález bude teraz opísaný nasledujúcimi príkladmi, ktorými však nie je obmedzený. Zvláštna prednosť sa dáva spôsobu analýzy podľa príkladu 19.

SK 281517 Β6

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Vzorka (vodný roztok homocysteínu na kalibráciu alebo plazma alebo moč na klinickú analýzu) bol ovplyvnený redukčným činidlom (napríklad 10 mmol/1 ditiotrcitolom). Táto vzorka bola pridaná, najlepšie vo výslednej koncentrácii homocysteínu, v rozmedzí 10‘⁶ až 10'⁵ mol/1, k roztoku, obsahujúcemu pri 37 °C 5 mg/ml králičieho IgG, 20 mU/ml adenozíndeaminázy, 20 mU/ml nukleozidfosforylázy, 20 mU/ml xantínoxidázy, 500 mU/ml chrenovej peroxidázy, 10 mmol/1 ditiotreitolu a 100 mmol/1 fosfátu sodného, pH upravené na hodnotu 7,4 a 100 mU S-adenozylL-homocysteinhydrolázy. Adenozín vo výslednej koncentrácii 5 x 10'⁶ mol/1 bol pridaný buď súčasne alebo následne, prednosť sa však dáva jeho pridaniu až po 10 minútach inkubácie, aby bola umožnená premena adenozínu vo vzorke. Absorbancia UV svetla bola meraná v priebehu 10 miηύζ odpoveď bola stanovená kinetickým spôsobom pri 292 nm a potom bol počítaný pomer Δ A / Δ t.

V klinických testoch môže byť koncentrácia homocysteínu počítaná interpoláciou zo štandardnej krivky, získanej s použitím známych štandardov.

Príklad 2

Vzorka (ako v príklade 1) bola ovplyvnená redukčným činidlom (napríklad 10 mmol/1 ditiotreitolom). Táto vzorka, najlepšie s výslednou koncentráciou homocysteínu v rozmedzí 10’⁶ až 10‘⁵ mol/1, bola pridaná k roztoku, obsahujúcemu pri 37 °C 5 mg/ml králičieho IgG, 20 mU/ml adenozíndeaminázy, 20 mU/ml nukleozidfosforylázy, 20 mU/ml xantínoxidázy, 500 mU/ml chrenovej peroxidázy, 10 mmol/1 ditiotreitolu a 100 mmol/1 fosfátu sodného, pH upravené na hodnotu 7,4 a 20 mU S-adenozyl-L-homocysteínhydrolázy. Potom, výhodne po 10 minútach inkubácie, aby mohlo dôjsť k premene adenozínu vo vzorke, bol pridaný S-adenozyl-L-homocysteín vo výslednej koncentrácii 5 x 10⁵ mol/1 a v priebehu 10 minút bola meraná absorpcia UV svetla. S použitím kinetickej metódy bol pri 292 nm počítaný pomer Δ A / Δ t.

V kinetických testoch môže byť koncentrácia homocysteínu počítaná interpoláciou zo štandardnej krivky, získanej s použitím známych štandardov.

Príklad 3

Pufer na analýzu:

0,1 mol/1 fosfátový pufer s pH 7,4, obsahujúci 1 mg/ml králičieho IgG a 10 mmol/1 ditiotreitolu.

Postup analýzy

K 150 μΐ pufra na analýzu bolo pridaných 3 mU S-adenozyl-L-homocysteínhydrolázy a vzorka (výhodne upravená podľa opisu v príklade 1 a 2). Enzýmová reakcia bola štartovaná prídavkom adenozínu, rozpusteného v pufri na analýzu, vo výslednej koncentrácii 2,5 x 10’⁵ mol/I. Po 10 minútach inkubácie bolo pridaných 750 μΐ roztoku pufra na analýzu, ktorý obsahoval 20 mU/ml adenzíndeaminázy, 20 mU/ml nukleozidfosforylázy, 20 mU/ml xantínoxidázy a 375 mU/ml chrenovej peroxidázy. UV absorpcia pri 292 nm bola meraná 5 minút kinetickou metódou a potom bol vypočítaný pomer Δ A / Δ t. Analýza bola paralelne opakovaná bez prídavku S-adenozyl-L-homocysteínhydrolázy. Po určení rozdielu oboch hodnôt pomeru Δ A / Δ t bola koncentrácia homocysteínu vypočítaná interpoláciou zo štandardnej krivky.

Príklad 4

Až do prvej inkubácie bola analýza vykonávaná tak, ako je opísané v príklade 3. Po 10 minútovej inkubácii bol teda pridaný roztok na analýzu, obsahujúci fluoresceínom značený adenozín a monoklonálne protilátky voči adenozínu. Zvyškový adenozín a fluoresceínom označený adenozín kompetovali o väzbu na protilátku. Množstvo označeného adenozínu, viazaného na protilátky, sa stanoví bežnou metódou polarizácie fluorescencie a koncentrácia adenozínu je počítaná interpoláciou zo štandardnej krivky.

Príklad 5

Pufer na analýzu:

Roztok SAH-hydrolázy:

mU/ml S-adenozyl-L-homocysteinhydrolázy je rozpustených v pufri na analýzu.

Roztok adenozínu:

Adenozín je v koncentrácii 5 x 10’⁸ mol/ml rozpustený v pufri na analýzu.

Roztok adenozíndeaminázy:

200 mU/ml adenozíndeaminázy je rozpustených v pufri na analýzu.

Roztok fenol/nitroprussid:

Je tvorený fenolom (10 mg/ml) a nitroprussidom sodným (50 Ng/ml) vo vode.

Roztok chlómanu:

mmol/1 NaOCl je rozpustený v 125 mmol/1 NaOH.

Postup analýzy:

1. 75 μΐ roztoku adenozínu a 75 μΐ roztoku SAH-hydrolázy sa zmieša so vzorkou (najlepšie vopred upraveným podľa opisu v príkladoch 1 až 4) a 10 minút udržuje pri 37 °C.

2. Pridá sa 100 μί roztoku adenozíndeaminázy a zmes je 5 minút inkubovaná pri 37 °C.

3. Pridá sa 750 μί roztoku fenol/nitroprussid a 750 μί roztoku chlómanu. Po 30 minútovej inkubácii pri 37 °C je meraná extinkcia pri 628 nm. Analýza je paralelne opakovaná bez prídavku SAH-hydrolázy. Potom je spočítaný rozdiel medzi týmito dvoma hodnotami extinkcie pri 628 nm a koncentrácia homocysteínu sa vypočíta zo štandardnej krivky, získanej pomocou známych štandardov, interpoláciou tohto rozdielu.

Príklad 6

Príprava fluoroforom označeného SAH

Roztok 10 mmol/1 SAH v dimetylformamide je zriedený v pomere 1:10 pomocou 100 mmol/1 fosfátového pufra s pH 7,5. Do tohto roztoku sa pridá izotiokyanát fluoresceínu vo výslednej koncentrácii 1 mmol/1. Po 60 minútach inkubácie pri laboratórnej teplote sa konjugát SAH-fluoresceín čistí pomocou HPLC na kolóne Chromasil C-18 pri 260 nm s použitím gradientného roztoku 25 mmol/1 octanu amónneho (pH 7,0) a metanolu.

SK 281517 Β6

Príklad 7

Príprava protilátok voči SAH

a) Príprava antigénu

K roztoku, tvorenému 1 mmol/1 SAH vo fosfátovom pufri (25 mmol/1, pH 7,4) a 125 mmol/1 NaCl, je pridaný BSA vo výslednej koncentrácii 5 mg/ml. K tejto zmesi sa pridá bis(sulfosukcinimidyl)suberát vo výslednej koncentrácii 1 mmol/1 a zmes sa ponechá reagovať 60 minút. (pH tejto konjugačnej reakcie je udržované na nízkej hodnote, čo podporuje konjugáciu na amíne adenozylu skôr než na amíne homocysteínu). Bielkovinová frakcia roztoku, ktorá obsahuje aj konjugáty BSA a SAH, je izolovaná gélovou chromatografiou na stĺpci nosiča „Superose 12“ (Pharmacia) s použitím fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku ako eluenta.

b) Príprava hybridomov

S opísaným antigénom sú pripravované hybridómy podľa postupu, opísaného Jamesom W. Goodingom v 3. kapitole knihy „Monoclonal antibodies: Principle and Practice“, Academic Press London, 1983.

c) Výber hybridomov

i) Protilátky voči SAH, vytvárajúce hybridómy, sú identifikované nasledovne: Obsah IgG v supematante hybridomov je meraný bežnou ELISA technikou. Potom je supematant zmiešaný v kyvete s pufrom, obsahujúcim 50 mmol/1 fosfátu a 120 mmol/1 NaCl s pH 7,4, 1 mg/ml králičieho IgG a myšieho IgG vo výslednej koncentrácii 0,1 pmol/l. Fluoresceínom označený SAH, pripravený podľa uvedeného príkladu 6, sa pridá vo výslednej koncentrácii 0,02 pmol/l. Po 10 minútach inkubácie je stupeň polarizácie meraný spektrofluorometrom, vybaveným jednotkou polarizácie fluorescencie, odčítaním

A, t. j. intenzity fluorescencie, keď rovina polarizácie dopadajúceho svetla rovnobežná s polarizačnou rovinou filtra, použitého na filtráciu emitovaného svetla,

B, t. j. intenzity fluorescencie, keď je rovina polarizácie dopadajúceho svetla kolmá na polarizačnú rovinu filtra, použitého na filtráciu emitovaného svetla, a s použitím exitačnej vlnovej dĺžky 494 nm a detekcie emitovaného svetla pri 517 nm.

Stupeň polarizácie je vypočítaný ako (A-B)/(A+B)

Nízky stupeň polarizácie naznačuje, že myšie monoklonálne protilátky neviažu SAH.

ii) Z hybridomov, zvolených podľa (i), sú nasledujúcim spôsobom určené hybridómy, produkujúce protilátky, ktoré reagujú s adenozínom a/alebo homocysteínom: Monoklonálne protilátky voči SAH zo supematantu hybridomov sú fixované na povrch mikrotitračných jamôk tak, ako je opísané ďalej v príklade 9. Do jamôk sa v pufri s pH 7,4, ktorý obsahuje 25 mmol/1 fosfátu, 120 mmol/1 NaCl a králičí IgG (1 mg/ml), pridá uhlíkom ¹⁴C označený adenozín (alebo homocysteín), výrobky britskej firmy Amersham Ltd. Po 60 minútach inkubácie sa jamky trikrát premyjú rovnakým pufrom (avšak bez prídavku adenozínu alebo homocysteínu). Vysoké hodnoty rádioaktivity, zachytenej v jamkách, znamenajú, že hybridómy produkujú protilátky, ktoré sa viažu na adenozín (alebo homocysteín) samovoľne. Takéto protilátky nie sú na analýzu využívané.

iii) Produkcia monoklonálneho IgG: Hybridómy, produkujúce protilátky, ktoré sa viažu na SAH tak, ako bolo opísané v (i) a súčasne sa neviažu na adenozín alebo homocysteín, ako bolo uvedené v (ii), sú vybrané na produkciu monoklonálneho IgG. Vybrané hybridómy sa používajú na tvorbu ascitu u myší alebo na vytvorenie bunkových kultúr in vitro s použitím obvyklých postupov. Bežnými metódami sú ďalej izolované aj monoklonálne protilátky z ascitu alebo z média bunkových kultúr, pozri James W. Gooding „Monoclonal antibodies: Principle and Practice“, Academic Press, London, 1983.

Príklad 8

Imunoanalýza homocysteínu polarizáciou fluorescencie

Enzýmový roztok:

0,1 mol/I fosfátový pufer s pH 7,4, obsahujúci 0,2 mg/ml králičieho IgG, 12,0 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 ditiotreitol,

S-adenozyl-L-homocysteínhydrolázu (10 U/I) a 0,1 mmol/1 adenozínu.

Roztok fluoresceínom označeného SAH

Konjugát SAH s fluoresceínom, pripravený podľa príkladu 6, je rozpustený vo výslednej koncentrácii 1 pmol/l v 50 mmol/1 fosfátového pufra s pH 7,4, obsahujúcim 125 mmol/1 NaCl a 0,2 mg/I králičieho IgG.

Roztok protilátky Monoklonálne protilátky voči SAH (nereagujúce s adenozínom a výhodne ani s homocysteínom), vytvorené napríklad podľa príkladu 7, rozpustené vo výslednej koncentrácii 0,1 pmol/l v 50 mmol/1 fosfátového pufra s pH 7,4, obsahujúcim 125 mmol/1 NaCl a 0,2 mg/ml králičieho IgG.

Uskutočnenie analýzy

V kyvete sa zmieša 15 μΐ plazmy (najskôr zo série vzoriek so známym obsahom homocysteínu) so 100 μΐ enzýmového roztoku a inkubuje sa 15 minút pri 37 °C. Pridá sa 100 μΐ roztoku fluoresceínom označeného SAH a potom 1,0 ml roztoku protilátky. Stupeň polarizácie sa meria, ako bolo opísané v príklade 7 c) i), spektrofluorometrom, ktorý je vybavený jednotkou polarizujúcou fluorescenciu a vynáša sa proti koncentrácii homocysteínu.

Analýza môže byť uskutočnená aj s použitím označených hapténov a protilátok podľa príkladov 11 a 13 alebo 15 a 17, namiesto tých, ktoré opisujú príklady 6 a 7.

Príklad 9

Mikrotitračná enzýmová imunoanalýza

a) Enzýmový roztok je rovnaký ako v príklade 8.

b) Roztok peroxidázou označeného SAH:

0,5 mg chrenovej peroxidázy sa rozpustí v 1 ml prečistenej vody. Pridá sa 200 μΐ roztoku 0,02 mol/1 jodistanu sodného, zmes je miešaná 20 minút pri laboratórnej teplote a cez noc dialyzovaná pomocou 10 mmol/1 pufra octanu sodného s pH 4, 4. Potom je pridaný SAH do výslednej koncentrácie 0,1 mmol/1 a pH je upravené na 6,0. Zmes je 4 hodiny miešaná pri laboratórnej teplote. Pridá sa 100 μΐ čerstvo pripraveného vodného roztoku (4 mg/ml) borohydridu sodného a roztok je inkubovaný 2 hodiny pri 4 °C. Peroxidáza a jej konjugáty so SAH sú izolované gélovou

SK 281517 Β6 chromatografiou na kolóne sorbentu „Superose 6“ (Pharmacia, Švédsko).

c) Protilátky voči S AH, zachytené v mikrotitračných jamkách:

Polyklonálny ovčí IgG, získaný z oviec imunizovaných myším IgG, je rozpustený vo výslednej koncentrácii 1 mg/ml v 100 mmol/1 borátového pufra s pH 9,0. Do každej jamky polystyrénovej mikrotitračnej doštičky je napipetovaných 300 μί tohto roztoku. Po 120 minútach inkubácie pri 37 °C sú jamky päťnásobne premyté fosfátovým pufrovaným fyziologickým roztokom. Potom sú vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku rozpustené monoklonálne myšie protilátky IgG voči SAH vo výslednej koncentrácii 500 μί/ml, vytvorené podľa zmieneného príkladu 7. Do každej jamky sa pridá 200 μί tohto roztoku monoklonálneho IgG a inkubuje sa 120 minút pri 37 °C. Potom sú jamky päťkrát premyté roztokom fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku, ktorý obsahuje 0,1 mg/ml králičieho IgG.

d) Vykonanie analýzy μί vzorky plazmy (najskôr zo série vzoriek so známou koncentráciou adenozínu) sa zmieša s 500 μί enzýmového roztoku a inkubuje sa 15 minút pri 37 °C. Pridá sa 50 μί roztoku peroxidázou zničeného SAH a po premiešaní je na jamku mikrotitračnej doštičky s protilátkou voči SAH, naviazanou podľa bodu c), pridaných 250 μί vzniknutého roztoku, pričom všetky roztoky sú pufŕované na pH 7,4. Po 60 minútach inkubácie pri 37 °C sú jamky trikrát premyté fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom, ktorý obsahuje 0,1 mg/ml králičieho IgG. Do každej jamky jc pridaných 100 μί roztoku (1 mg/ml) ortofenyldiamínu v 0,1 mol/1 citrátovom pufri s pH 6,0, ktorý obsahuje 0,015 % peroxid vodíka. Po 10 až 30 minútach je meraná absorbancia každej jamky pri 450 nm. Hodnoty absorbancie sa vynášajú proti koncentrácii homocystcínu.

Príklad 10

Produkcia hapténu

3-S-(l-anhydro-D-ribofuranosyl)-tiopropylamín

OH OH

a) aktivovaný merkaptán s chránenými hydroxyskupinami (zlúčenina 8 v uvedenej schéme E)

Jeden ekvivalent metyl-C-D-ribofiiranozidu (zmienenej zlúčeniny 1, ktorá je komerčne dostupná) reaguje so zmesou piatich ekvivalentov sulfonátu trimetylsilylmetánu a jedného ekvivalentu eterátu trifluoridu bóru podľa postupu Júna a spoluautorov (Carb. Res. 163, 247 až 261, 1987). Po malých častiach a za stáleho miešania je 0,5 ekvivalentu produktu 1-anhydro-D-ribózy (zlúčeniny 2) vo forme jemného prášku pridaných k zmesi acetónu a kyseliny sírovej, pripravenej pomalým pridaním 6,3 ml koncentrovanej kyseliny sírovej k 100 ml čerstvo destilovaného acetónu v ľadovom kúpeli. Po odstránení ľadového kúpeľa prebieha reakcia 8 hodín pri laboratórnej teplote. Získaná tuhá biela kryštalická látka je rozpustená v chloroforme, premytá vodným hydroxidom sodným, zriedená kyselinou chlorovodíkovou a potom vodou, vysušená a nakoniec odparená za vzniku 2,3-izopropyldién-D-ribozového derivátu 1-anhydro-D-ribózy (zlúčenina 2). Jeden ekvivalent tohto derivátu a dva ekvivalenty tetrabrómmetánu sú rozpustené v sušenom éteri a chladené v ľade. K ním sú za stáleho miešania a chladenia ľadom pridané dva ekvivalenty trifenylfosflnu. Potom je ľadový kúpeľ odstránený a zmes sa ponechá zohriať na laboratórnu teplotu za slabého vývoja bromovodíka vo vznikajúcej reakcii. Po dobehnutí reakcie je prebytok reagenta neutralizovaný prídavkom metanolu. Bromidový derivát (zlúčenina 6) je izolovaná filtráciou a odparením filtrátu. K tomuto derivátu sa pridá jeden ekvivalent tiomočoviny, rozpustenej v horúcej vode a zriedenej rektifikovaným alkoholom. Táto zmes je destilovaná pod spätným chladičom s pravidelne dobre pretrepávaná ešte asi 30 minút po rozpustení bromidového derivátu. Potom je reakčná zmes ochladená v ľade a prefiltrovaná. K tuhej látke je pridaný alkalický vodný roztok, čím v organickej fáze vznikne merkaptán s chránenými hydroxyskupinami. Ten je premenený na aktívnu formu (zlúčenina 8) pôsobením metoxidu v metanole. Aktívna forma potom ďalej reaguje tak, ako je nižšie opísané.

b) 3-S-( 1 -anhydro-D-ribofúranosyl)tiopropylamín

Jeden ekvivalent čerstvo pripravenej zlúčeniny podľa príkladu 10 a), t. j. zlúčeniny 8, reaguje s jedným ekvivalentom akrylonitrilu za vzniku tioéteru (zlúčeniny 9). Ten je potom redukovaný prostredníctvom LÍA1H4 v sušenom éteri a voľný nechránený amín (zlúčenina 10) je izolovaný účinkom kyseliny chlorovodíkovej.

Zodpovedajúce aminopropyltioétery, ktorých R¹ a R²nie sú tvorené vodíkom, sa pripravujú analogicky, napríklad s využitím komerčne dostupných zlúčenín 1 a 3 ako východiskového materiálu.

Prikladll

Označenie hapténu mmol/1 roztok zlúčeniny podľa príkladu 10 v dimetylformamidc (DMF) je v pomere objemov 1 : 5 zriedený 0,1 mol/1 roztokom hydrogénuhličitanu (pH 9,2). Do takto získaného roztoku je pridaný izotiokyanát fluoresceínu s výslednou koncentráciou 12 mmol/1. Po 60 minútach inkubácie pri laboratórnej teplote sa fluoresceínový konjugát so zlúčeninou podľa príkladu 10 čistí chromatografiou na reverznej fáze (RPC) s použitím kolóny Kromasil 100 C=18 a gradientného roztoku 20 mmol/1 acetátu amónneho (pH 7,0) a metanolu.

Príklad 12

Príprava antigénu

K 1 mmol/1 roztoku zlúčeniny podľa príkladu 10 v pufri, zloženom z 50 mmol/1 fosfátu a 125 mmol/1 NaCl s pH 7,4 sa pridá hovädzí sérový albumín (BSA) s výslednou koncentráciou 5 mg/ml. K tejto zmesi je pridaný bis10

SK 281517 Β6

-(sulfosukcínimidyl)-substrát s výslednou koncentráciou

1,2 mmol/1 a zmes je ponechaná reagovať 60 minút. Bielkovinová frakcia, obsahujúca konjugát haptén-BSA je izolovaná gélovou chromatografiou na kolóne sorbentu „Superose 12“ (Pharmacia) s použitím fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku ako eluenta.

Príklad 13

Príprava protilátky

Protilátky voči zlúčenine podľa príkladu 10 sú pripravované analogicky ako v príklade 7 s použitím antigénu, získaného podľa príkladu 12. Protilátky, nereagujúce so S AH a protilátky, ktoré reagujú s adenozínom, sú odstránené, pretože prednosť sa dáva protilátkam reagujúcim s homocysteínom.

Príklad 14

Produkcia hapténu

N-hydroxysukcínimidyl-3 -S-( 1 -anhydro-D-ribofúranosyl)tiobutanoát

Jeden ekvivalent čerstvo pripravenej zlúčeniny podľa príkladu 10 a) reaguje s jedným ekvivalentom efyl-4-brómbutyrátu za vzniku esterovej zlúčeniny 11. Tá je bázickou hydrolýzou vodným hydroxidom sodným v dioxáne hydrolyzovaná na voľnú kyselinu a zbavená ochranných skupín účinkom vodnej kyseliny chlorovodíkovej za vzniku nechránenej voľnej kyseliny (zlúčeniny 12). Jeden ekvivalent tejto látky je zmiešaný s dvoma ekvivalentmi N-hydroxysukcínimidu v ľadovom dimetylformamide a k vzniknutej zmesi je za stáleho miešania pridaných 1,2 ekvivalentov dicyklohexylkarbodiimidu. Reakcia prebieha 18 hodín pri laboratórnej teplote, potom je zmes ochladená a pridá sa ľadovo studený éter. Vyzrážaný NHS-ester (zlúčenina 13) je reloyštalizovaná zo zmesi DMF/éter, vysušený pri 4 °C spolu s prostriedkom, pohlcujúcim vlhkosť.

Zodpovedajúce NHS-estery, ktorých R¹ a R² nie sú tvorené vodíkovým atómom, sa pripravujú obdobne, napríklad s použitím komerčne dostupných zlúčenín 1 a 3 ako východiskových látok.

Príklad 15

Označenie hapténu mmol/1 roztok zlúčeniny podľa príkladu 14 v DMF je zriedený v pomere objemov 1 : 5 mol/1 hydrouhličitanovým pufrom s pH 9,2. K vzniknutému roztoku sa pridá 5-aminoacetamidofluresceín (glycínamid fluoresceínu) s výslednou koncentráciou 12 mmol/1. Po 60 minútach inkubácie pri laboratórnej teplote je fluoresceínový konjugát kyseliny 3-S-(l-anhydro-D-ribofuranosyl)tiobutánovej čistený chromatografiou na reverznej fáze (RPC) s použitím koló ny Kromasil 100 C-18 a gradientného roztoku 20 mmol/1 acetátu amónneho (pH 7,0) a metanolu.

Príklad 16

Príprava antigénu

K roztoku hovädzieho sérového albumínu (BSA, 5 mg/1 v pufri, tvorenom 50 mmol/1 fosfátom a 125 mmol/l NaCl s pH 7,4) sa pridá zlúčenina podľa príkladu 14 s výslednou koncentráciou 1 mmol/1. Zmes sa ponechá reagovať 60 minút a bielkovinová frakcia, obsahujúca konjugát BSAhaptén, je izolovaná gélovou chromatografiou na kolóne sorbentu „Superose 12“ (Pharmacia) s použitím fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku ako eluenta.

Príklad 17

Príprava protilátky

Protilátky proti zlúčenine podľa príkladu 14 sa pripravujú obdobne ako v príklade 7 s použitím antigénu, získaného podľa príkladu 12. Protilátky nereagujúce so SAH a protilátky, ktoré reagujú s adenozínom sú odstránené; výhodné sú protilátky, reagujúce s homocysteínom.

Príklad 18

Imunoanalýza polarizáciou fluorescencie

Enzýmový roztok:

mmol/1 fosfátový pufer s pH 7,4, obsahujúci kazeín (4 mg/ml), 120 mmol/1 NaCl a S-adenozyl-L-homocysteínhydrolázu (10 U/l).

Roztok ditiotreitolu (DTT):

Ditiotreitol je rozpustený vo vode v koncentrácii 50 mmol/1 a pH je pomocou HC1 upravené na hodnotu 3,0.

Roztok adenozínu:

1,8 mmol/1 adenozín v 50 mmol/1 fosfátového pufra s pH

7,4.

Roztok fluoresceínom označeného SAH:

mmol/1 fosfátový pufer s pH 7,4, obsahujúci SAH konjugovaný s fluoresceínom, pripravený podľa príkladu 6.

Roztok protilátky

Monoklonálne protilátky voči SAH (napríklad pripravené podľa príkladu 7), rozpustené v konečnej koncentrácii 0,1 pmol/l v 50 mmol/1 fosfátového pufra s pH 7,4, ktorý obsahuje 120 mmol/1 NaCl a kazeín v koncentrácii 1 mg/ml.

Vykonanie analýzy

Krok 1: V kyvete sa zmieša 15 μΐ vzorky, 10 μΐ enzýmového roztoku a 10 μΐ adenozínu s 10 μΐ okysleného roztoku DTT a výsledná zmes sa ponechá 15 minút stáť pri 37 °C.

Krok 2: Do kyvety sa pridá 100 μΐ roztoku fluoresceínom označeného SAH a 1,0 ml roztoku protilátky. Stupeň polarizácie sa mcrá na spektrofluorometri, vybavenom jednotkou polarizujúcou fluorescenciu tak, ako už bolo opísané v príklade 7 c) i) a vynáša sa proti koncentrácii homocysteínu.

SK 281517 Β6

Príklad 19

Imunoanalýza využívajúca polarizáciu fluorescencie

Enzýmový roztok:

mmol/1 fosfátový pufer s pH 7,4, obsahujúci kazeín (1 mg/ml), 120 mmol/1 NaCI a S-adenozyl-L-homocystcínhydrolázu (10 U/I).

Roztok ditiotreitolu (DTT)

Roztok fluoresceínom označeného SAH:

mmol/1 fosfátový pufer s pH 7,4, obsahujúci 10 pmol/l SAH konjugovaný s fluoresceínom, pripravený podľa príkladu 6 a adenozín v koncentrácii 1,8 mmol/1.

Roztok protilátky

Monoklonálne protilátky proti SAH (napríklad pripravené podľa príkladu 7), rozpustené v konečnej koncentrácii 0,1 pmol/l v 50 mmol/1 fosfátového pufra s pH 7,4, ktorý obsahuje 120 mmol/1 NaCI a kazeín v koncentrácii 1 mg/ml.

Vykonanie analýzy

V kyvete sa zmieša 10 μΐ plazmy, 100 μΐ enzýmového roztoku a 10 μΐ roztoku označeného SAH s adenozínom spolu s 30 μί okysleného roztoku DTT a zmes sa ponechá 15 minút stáť pri 37 °C.

Po inkubácii sa pridá 1,0 ml roztoku protilátky a stupeň polarizácie sa meria na spektrofluorometri, vybavenom jednotkou polarizujúcou fluorescenciu tak, ako už bolo opísané v príklade 7 c) i) a vynáša sa proti koncentrácii homocysteínu.

Analýzy, uvedené v príkladoch 18 a 19, môžu byť vykonané aj s využitím označených hapténov a protilátok podľa príkladov 11 a 13 alebo 15 a 17 namiesto tých, ktoré sú uvedené v príkladoch 6 a 7.

Príklad 20

Luminiscenčná analýza

Pufer na analýzu I:

mmol/1 Pipes pufer s pH 6,6, obsahujúci kazeín v koncentrácii 1 mg/ml, 10 mmol/1 DTT, 0,5 mmol/1 MgCl₂ a 30 mmol/1 KC1.

Pufer na analýzu H:

mmol/1 Hepes pufer s pH 7,75, obsahujúci 4 mmol/1 EDTA, 20 mmol/1 MgCl₂ a 0,36 mmol/1 DTT.

Pufer na analýzu III:

mmol/1 Hepes pufer s pH 7,75, obsahujúci luciferázu z Photinus pyralis (1,6 pg/l), 700 pmol/l D-luciferín, 20 mmol/1 MgCl₂, 4 mmol/1 EDTA, 0,36 mmol/1 DTT a 0,3 mmol/1 AMP.

Postup analýzy:

K 130 μί pufra na analýzu I sa pridajú 3 U jednotky S-adenozyl-L-homocysteínhydrolázy a zmes je doplnená 20 μί vzorky. Po 15 minútach inkubácie pri 37 °C je pridaný adenozín vo výslednej koncentrácii 5 x 10’⁶ mol/1, rozpustený v pufri na analýzu I. Po 5 minútach inkubácie pri 37 °C je pridaných 750 μΐ pufra na analýzu I, ktorý obsa huje 7 x 10“⁶ mol/1 ATP a 1 mU adenozínkinázy. Výsledný roztok je ďalej 5 minút inkubovaný pri 37 °C. Potom je roztok zriedený v pomere objemov 1 : 100 pufrom na analýzu II a 500 μί takto zriedeného roztoku je ihneď pridané k 500 μί pufra na analýzu III. Oba pufŕe na analýzu II aj III musia byť temperované na laboratórnu teplotu 21 °C. Vzniknutá luminiscencia je odčítaná fotometrický pri 550 nm.

Súbežne je vykonávaná analýza bez prítomnosti S-adenozyl-L-homocysteínhydrolázy. Koncentrácia homocysteínu môže byť pre klinické testy počítaná z rozdielu luminiscencie, vzniknutej v prítomnosti a v neprítomnosti S-adenozyl-L-homocysteínhydrolázy, interpoláciou zo štandardnej krivky.

Príklad 21

Príprava polyklonálnych protilátok

Králičie polyklonálne protilátky voči antigénom podľa príkladov 12 a 16 sa získajú podľa protokolu firmy Dáko Corporation, Kodaň, Dánsko. Podľa rovnakého protokolu je zo zhromaždeného antiséra purifikovaný aj polyklonálny IgG. Polyklonálne protilátky sú v takých protilátkach, ktoré samovoľne (per se) reagujú so zvyškami adenozínu a homocysteinu, zbavené prechodom cez kolónu sorbentu Recti-Gel s imobilizovanými adenozínovými a homocysteínovými zvyškami (gél a postup poskytuje Pierce Chemical Company, Belfium). Odstraňujú sa aj protilátky, ktoré so SAH nereagujú. Konečné vybrané protilátky môžu byť použité v analýzach podľa predchádzajúcich príkladov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob analýzy homocysteínu vo vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje krok, pri ktorom sa vzorka privádza do styku s enzýmom, premieňajúcim homocystcín a s aspoň jedným substrátom tohto enzýmu, odlišným od homocysteínu a krok, zahrnujúci stanovenie neoznačenej analyzovanej látky, zvolenej z kosubstrátov homocysteínu a produktov enzýmovej premeny homocysteínu uvedeným enzýmom bez nutnosti ich chromatografického oddelenia.
2. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa vzorka privádza do styku s protilátkou analyzovanej látky a s hapténom tejto protilátky, odlišným od neoznačenej analyzovanej látky, pričom stanovenie analyzovanej látky sa vykonáva nepriamo, stanovením hapténu buď naviazaného alebo nenaviazaného na protilátku.
3. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že hapténom je polyhaptén.
4. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že hapténom je označená molekula, ktorá má epitopickú štruktúrnu jednotku, ktorá sa vyskytuje aj pri neoznačenej analyzovanej látke.
5. Spôsob analýzy homocysteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2až 4, vyznačujúci sa tým, že protilátkou je monoklonálna protilátka.
6. Spôsob analýzy homocysteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2až 5, vyznačujúci sa tým, že protilátkou je protilátka viazaná na matrix nosiča.
7. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa vzorka privádza do styku s druhým enzýmom, slúžiacim na premenu analy

SK 281517 Β6 zovanej látky a stanovenie tejto látky sa vykonáva nepriamo, stanovením buď substrátu druhého enzýmu, odlišného od analyzovanej látky alebo produktu enzýmovej premeny analyzovanej látky účinkom druhého enzýmu.
8. Spôsob analýzy homocysteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 7, vyznačujúci sa tým, že analyzovanou látkou je ko-substrát.
9. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že enzýmom je S-adenozylhomocysteínhydroláza a analyzovanou látkou je adenozín.
10. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa vzorka privádza do styku s enzýmom premieňajúci adenozin, ktorý je odlišný od enzýmu, premieňajúceho homocysteín, analyzovanou látkou je adenozin a stanovenie adenozínu sa vykonáva nepriamo, stanovením ko-substrátu alebo reakčného produktu premeny adenozínu účinkom enzýmu, premieňajúceho adenozín.
11. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že enzýmom premieňajúcim adenozin je adenozínkináza.
12. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že enzýmom premieňajúcim adenozin je adenozíndeamináza.
13. Spôsob analýzy homocysteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 7, vyznačujúci sa tým, Že analyzovanou látkou je produkt premeny.
14. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že enzýmom je S-adenozylhomocysteínhydroláza a analyzovanou látkou je S-adenozylhomocysteín.
15. Spôsob analýzy homocysteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 14, vyznačujúci sa tým, že vzorkou je krv, plazma alebo moč, vopred upravená redukčným činidlom, ktoré uvoľňuje disulfidovú väzbu.
16. Spôsob analýzy homocysteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, v y z n a č u j ú c i sa tým, že stanovenie analyzovanej látky sa vykonáva fotometrický.
17. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že stanovenie sa vykonáva spektrometricky alebo kolorimetricky.
18. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že stanovenie sa vykonáva turbidimetricky alebo nefelometricky.
19. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že stanovenie sa vykonáva s použitím detekčnej metódy polarizácie fluorescencie.
20. Spôsob analýzy homocysteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 7, 13 až 17 a 19, vyznačujúci sa t ý m , že stanovenie analyzovanej látky sa vykonáva nepriamo, detekciou chromofóru alebo fluorofóru na označenom S-adenozylhomocysteíne alebo na označenom 6-tioéteri furanózy.
21. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že vzorka krvi, plazmy alebo moču sa upravuje účinkom redukčného činidla, potom sa privádza do styku s adenozínom a S-adenozylhomocysteínhydrolázou, zmes sa inkubuje a privádza do styku s ATP a adenozínkinázou, zmes sa inkubuje aspoň jednu minútu výsledná zmes sa privádza do styku s luciferínom a luciferázou za vzniku svetla, ktoré sa deteguje.
22. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že vzorka krvi, plazmy alebo moču sa upravuje účinkom redukčného činidla, po tom sa privádza do styku s adenozínom a S-adenozylhomocysteínhydrolázou, zmes sa inkubuje a privádza do styku s adenozínkinázou, nukleozidfosfoiylázou, xantínoxidázou a peroxidázou a stanovuje sa UV absorpcia zmesi.
23. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa vzorka privádza do styku s adenozínom a S-adenozylhomocysteínhydrolázou, zmes sa inkubuje a privádza do styku s S-adenozylhomocysteínom, označeným fluorofórom, alebo so 6-tioéterom furanózy, označeným fluorofórom, a výsledná zmes sa privádza do styku s monoklonálnou protilátkou proti S-adenozylhomocysteínu a fluorofórom označenou zlúčeninou, viažúcou alebo neviažucou protilátku, reakcia sa stanovuje polarizáciou fluorescencie, čo umožňuje indikáciu počiatočnej hladiny homocysteínu vo vzorke.
24. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa vzorka privádza do styku s adenozínom a S-adenozylhomocysteínhydrolázou, zmes sa inkubuje a privádza do styku s označeným

S-adenozylhomocysteínom alebo s označeným 6-tioéterom furanózy, vzniknutá zmes sa privádza do styku s monoklonálnou protilátkou proti S-adenozylhomocysteínu, viazanou na matrix nosiča. Nosič sa premyje a označená zlúčenina, ktorá viaže protilátku, sa stanoví fotometrický, čo umožňuje indikáciu počiatočnej hladiny homocysteínu vo vzorke.
25. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že sa označená zlúčenina, ktorá viaže protilátku, podrobí reakcii vytvárajúcej chromofór, ktorý sa potom stanovuje fotometrický.
26. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že stanovenie sa vykonáva stanovením precipitácie alebo aglutinácie konjugátov protilátka: polyhaptén.
27. Analytická súprava prípravkov na použitie na analýzu homocysteínu vo vzorke postupom podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje: enzým, premieňajúci homocysteín; od homocysteínu odlišný substrát reakcie premeny homocysteínu, ktorú katalyzuje uvedený enzým; činidlo, poskytujúce signál; a prípadne prostriedky na stanovenie signálu.
28. Analytická súprava prípravkov podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že obsahuje ako enzým, premieňajúci homocysteín, S-adenozyíhomocysteínhydrolázu; ako signál poskytujúci substrát enzýmu označený S-adenozylhomocysteín; protilátku proti S-adenozylhomocysteínu, voliteľne viazanú na matrix nosiča; a ako prostriedky na stanovenie signálu, prostriedky na fotometrické stanovenie označeného S-adenozylhomocysteínu alebo jeho detegovateľného derivátu, na umožnenie indikácie obsahu homocysteínu vo vzorke.
29. Analytická súprava prípravkov podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že obsahuje ako enzým, premieňajúci homocysteín, S-adenozylhomocysteínhydrolázu; ako substrát enzýmu adenozin; adenozin premieňajúci enzým, odlišný od S-adenozylhomocysteínhydrolázy; voliteľný ko-substrát adenozínu pre enzým, premieňajúci adenozin; a ako prostriedky na stanovenie signálu, prostriedky na vytvorenie fotometrický detegovateľnej odpovede uvedeným ko-substrátom alebo produktom enzýmovej premeny adenozínu účinkom enzýmu, premieňajúceho adenozin.
30. Analytická súprava prípravkov podľa nároku 29, vyznačujúca sa tým, že enzýmom, premieňajúcim adenozin, je adenozínkináza a že prostriedky na tvorbu signálu, zahŕňajú ATP, luciferín a luciferázu.

SK 281517 Β6
31. Analytická súprava prípravkov podľa nároku 29, vyznačujúca sa tým, že enzýmom, premieňajúcim adenozín, je adenozíndeamináza a že prostriedky na tvorbu signálu zahrnujú nukleozidfosforylázu, xantínoxidázu a peroxidázu.
32. Analytická súprava prípravkov podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že obsahuje: ako enzým, premieňajúci homocysteín, S-adenozylhomocysteínhydrolázu; ako substrát enzýmu adenozín; protilátku voči

S-adenozylhomocysteínu, voliteľne viazanú na častice základnej látky - matrixu; polyhaptén protilátky; a voliteľne, ako prostriedky na stanovenie signálu, prostriedky na fotometrické stanovenie aglutinácie alebo precipitácie komplexov protilátka: polyhaptén.
33. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že ako haptén je použitá zlúčenina podľa vzorca (I) kde R¹ a R², ktoré môžu byť rovnaké alebo rozdielne, označujú vodíkové atómy alebo skupiny OR⁴ alebo R¹ a R²spolu predstavujú atóm kyslíka, R³ predstavuje aminoskupinu alebo karboxylovú skupinu a R⁴ predstavuje Cj^alifótickú skupinu alebo jej soľ alebo ester.
34. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že ako haptén sa použije označený 6-tioéter furanózy, že označená zlúčenina zahŕňa chromofór alebo fluorofór alebo rádioaktívny atóm, a že tioéterová zlúčenina zahrnuje trimetyléntiozlúčeninu.
35. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že ako značený tioéter sa použije označená zlúčenina vzorca (I) podľa nároku 33.
36. Spôsob analýzy homocysteínu podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že ako enzým sa použije inaktivovaná S-adenozylhomocysteínhydroláza, aktivovaná kontaktom s redukčným činidlom.
37. Analytická súprava prípravkov podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že obsahuje v jednej časti súpravy S-adenozylhomocysteínhydrolázu a v druhej časti redukčné činidlo, pomocou ktorých je možné zmiešaním obsahov prvej a druhej časti vytvoriť aktivovanú S-adenozylhomocysteínhydrolázu.
38. Analytická súprava prípravkov podľa nároku 37, vyznačujúca sa tým, že v druhej časti obsahuje ditiotreitol v kyslom prostredí.