JP2870704B2 - ホモシステインアッセイ - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、臨床サンプル中のホモシステインのアッセ
イに関する。
イに関する。
ホモシステインは、メチオニンがシステインへと代謝
される際に生成する中間アミノ酸である。一般に、体内
で生成するホモシステインは、（１）セリンとの縮合に
よるシスタチオンの形成、あるいは（２）メチオニンへ
の変換という二つのルートのうちの一つによって、急速
に代謝され、正常な条件下での生体内のその濃度（およ
びその酸化型ホモシスチンの濃度）は、実際上、無視で
きるものである。
される際に生成する中間アミノ酸である。一般に、体内
で生成するホモシステインは、（１）セリンとの縮合に
よるシスタチオンの形成、あるいは（２）メチオニンへ
の変換という二つのルートのうちの一つによって、急速
に代謝され、正常な条件下での生体内のその濃度（およ
びその酸化型ホモシスチンの濃度）は、実際上、無視で
きるものである。
しかしながら、生物学的サンプル中のホモシステイン
のレベルは、多くの場合、臨床的に重要である。なぜな
らば、ホモシステインはスルフヒドリルアミノ酸を形成
する経路の複雑なセットにおいて重要な部分を果たし、
その蓄積は、これらの経路において生じる種々の障害
（例えば特に先天代謝異常）を表示できるからである。
このように、例えばホモシスチン尿症（尿中におけるホ
モシステインの異常蓄積）は、酵素類、即ちシスタチオ
ンβシンテターゼまたはメチルテトラヒドロ葉酸メチル
トランスフェラーゼ（これはホモシステインのメチル化
によるメチオニンの生成を触媒する）の欠乏に起因する
アミノ酸代謝障害であることが知られている。
のレベルは、多くの場合、臨床的に重要である。なぜな
らば、ホモシステインはスルフヒドリルアミノ酸を形成
する経路の複雑なセットにおいて重要な部分を果たし、
その蓄積は、これらの経路において生じる種々の障害
（例えば特に先天代謝異常）を表示できるからである。
このように、例えばホモシスチン尿症（尿中におけるホ
モシステインの異常蓄積）は、酵素類、即ちシスタチオ
ンβシンテターゼまたはメチルテトラヒドロ葉酸メチル
トランスフェラーゼ（これはホモシステインのメチル化
によるメチオニンの生成を触媒する）の欠乏に起因する
アミノ酸代謝障害であることが知られている。
スルフヒドリルアミノ酸代謝は、葉酸およびビタミン
B12（コバラミン）の代謝と密接に結び付いており、こ
れらは関連する多様なトランスフォーメーションにおい
て、基質または補助因子として作用する。この理由か
ら、ホモシステインの蓄積はまた、コバラミンまたは葉
酸塩に依存する酵素の機能不全、あるいはコバラミンま
たは葉酸塩の代謝に関連する他の障害または疾患の示指
として提案されている。
B12（コバラミン）の代謝と密接に結び付いており、こ
れらは関連する多様なトランスフォーメーションにおい
て、基質または補助因子として作用する。この理由か
ら、ホモシステインの蓄積はまた、コバラミンまたは葉
酸塩に依存する酵素の機能不全、あるいはコバラミンま
たは葉酸塩の代謝に関連する他の障害または疾患の示指
として提案されている。
更に、ホモシステインのメチオニンへの変換は、メチ
ル供与体としてＳ−メチルテトラヒドロ葉酸塩を必要と
する反応を当てにしているので、ホモシステイン代謝も
また、他の障害、特には癌と戦うために投与されたメト
トレキサートのような抗葉酸塩薬による影響を受ける。
従って、ホモシステインのモニタリングは、抗葉酸塩薬
による悪性疾患の処置の管理においても提案されてい
る。
ル供与体としてＳ−メチルテトラヒドロ葉酸塩を必要と
する反応を当てにしているので、ホモシステイン代謝も
また、他の障害、特には癌と戦うために投与されたメト
トレキサートのような抗葉酸塩薬による影響を受ける。
従って、ホモシステインのモニタリングは、抗葉酸塩薬
による悪性疾患の処置の管理においても提案されてい
る。
より最近になって、血液中のホモシステインレベルの
増加が、アテローム性動脈硬化症の発症に関連付けられ
るようになり（Clarke et al.,New Eng.J.Med.324:1149
−1155（1991）参照）、中程度のホモシスチン血症でさ
えも、現在では心臓疾患または脈管疾患の危険因子と考
えられている。従って、ホモシステインの血漿中レベル
または血中レベルの測定もたま、脈管疾患の診断および
処置において重要である。
増加が、アテローム性動脈硬化症の発症に関連付けられ
るようになり（Clarke et al.,New Eng.J.Med.324:1149
−1155（1991）参照）、中程度のホモシスチン血症でさ
えも、現在では心臓疾患または脈管疾患の危険因子と考
えられている。従って、ホモシステインの血漿中レベル
または血中レベルの測定もたま、脈管疾患の診断および
処置において重要である。
ホモシステインに対する抗体を利用できないため、ホ
モシステインを直接に測定する免疫学的方法は利用でき
ないが、臨床サンプル中のホモシステインを測定する他
の多くの方法を提案されている。これらは全てクロマト
グラフィーによる分離を含み、一般的には、次の三つの
原理のうちの一つに基づいている。
モシステインを直接に測定する免疫学的方法は利用でき
ないが、臨床サンプル中のホモシステインを測定する他
の多くの方法を提案されている。これらは全てクロマト
グラフィーによる分離を含み、一般的には、次の三つの
原理のうちの一つに基づいている。
（１）古典的クロマトグラフィーによるアミノ酸分析、 （２）放射性により、または他の手段により標識された
Ｓ−アデノシン補助基質（co−substrate）の存在下で
の、サンプル中のホモシステインと、酵素Ｓアデノシル
−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素との反応、次いで、
形成された生成物（Ｓ−アデノシル−ホモシステイン、
SAH）の分離、および定量。一般的に、クロマトグラフ
ィー分離法（HPLCまたはTLC）および放射性測定法が用
いられる（Refsum et al.,Clin.Chem.31:624−628（198
5）;Kredich et al.,Anal.Biochem 116:503−510（198
1）;Chui,Am.J.Path.90（４）:446−449（1988）;Totan
i et al.,Biochem.Soc.14（６）:1172−９（1988）；お
よびSchimizu et al.,Biotechnol.Appl.Biochem 8:153
−159（1986）参照）、 （３）サンプル中のホモシステインと蛍光団との反応、
次いでHPLC−分離および蛍光分析（Refsum et al.,Cli
n.Chem.35（９）;1921−1927（1989）参照）。
Ｓ−アデノシン補助基質（co−substrate）の存在下で
の、サンプル中のホモシステインと、酵素Ｓアデノシル
−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素との反応、次いで、
形成された生成物（Ｓ−アデノシル−ホモシステイン、
SAH）の分離、および定量。一般的に、クロマトグラフ
ィー分離法（HPLCまたはTLC）および放射性測定法が用
いられる（Refsum et al.,Clin.Chem.31:624−628（198
5）;Kredich et al.,Anal.Biochem 116:503−510（198
1）;Chui,Am.J.Path.90（４）:446−449（1988）;Totan
i et al.,Biochem.Soc.14（６）:1172−９（1988）；お
よびSchimizu et al.,Biotechnol.Appl.Biochem 8:153
−159（1986）参照）、 （３）サンプル中のホモシステインと蛍光団との反応、
次いでHPLC−分離および蛍光分析（Refsum et al.,Cli
n.Chem.35（９）;1921−1927（1989）参照）。
これらの方法は実施するのに時間を要し、また厄介で
あり、全て直接定量を当てにしている。より詳しくは、
クロマトグラフィー分離は、従来技術の方法の共通の態
様であり、高度に特殊で精巧な装置が必要である。
あり、全て直接定量を当てにしている。より詳しくは、
クロマトグラフィー分離は、従来技術の方法の共通の態
様であり、高度に特殊で精巧な装置が必要である。
このような装置の使用は、日常的な臨床研究業務に
は、一般的に充分に許容されず、その結果、このような
プロセスは、典型的な臨床研究室の操作における自動化
には一般的に従わない。
は、一般的に充分に許容されず、その結果、このような
プロセスは、典型的な臨床研究室の操作における自動化
には一般的に従わない。
従って、実施するのに簡単で、特異的で、迅速であ
り、臨床研究室における使用に容易に採用でき、そして
特に、費用および時間のかかるクロマトグラフィー分離
の必要が避けられるような、ホモシステインの改良アッ
セイに対する要望がある。本発明は、このようなアッセ
イを提供しようとするものである。
り、臨床研究室における使用に容易に採用でき、そして
特に、費用および時間のかかるクロマトグラフィー分離
の必要が避けられるような、ホモシステインの改良アッ
セイに対する要望がある。本発明は、このようなアッセ
イを提供しようとするものである。
従って、一つの観点によれば、本発明は、サンプル中
のホモシステインをアッセイする方法を提供する。この
方法は、サンプルを、ホモシステイン交換酵素、例えば
Ｓ−アデノシル−ホモシステイン（SAH）加水分解酵
素、およびこの酵素のための、ホモシステイン以外の少
なくとも１つの基質と接触させる工程、およびクロマト
グラフィーで分離することなく（即ち試薬および反応生
成物を分離することなく）、ホモシステイン補助基質
と、前記の酵素によるホモシステインの酵素変換生成物
とから選択される標識されていないアナライト（analyt
e）を評価する（好ましくは光度測定法で）工程を含ん
でいる。
のホモシステインをアッセイする方法を提供する。この
方法は、サンプルを、ホモシステイン交換酵素、例えば
Ｓ−アデノシル−ホモシステイン（SAH）加水分解酵
素、およびこの酵素のための、ホモシステイン以外の少
なくとも１つの基質と接触させる工程、およびクロマト
グラフィーで分離することなく（即ち試薬および反応生
成物を分離することなく）、ホモシステイン補助基質
と、前記の酵素によるホモシステインの酵素変換生成物
とから選択される標識されていないアナライト（analyt
e）を評価する（好ましくは光度測定法で）工程を含ん
でいる。
サンプルをホモシステイン変換酵素および基質と接触
させた後、アッセイの次の段階を行う前に、少なくとも
30秒間、特に少なくとも５分間インキュベートすること
が好ましい。
させた後、アッセイの次の段階を行う前に、少なくとも
30秒間、特に少なくとも５分間インキュベートすること
が好ましい。
本発明のアッセイに用いられるホモシステイン変換酵
素は、特に好ましくはSAH−加水分解酵素であるが、他
の酵素も使用できる。例えば、ベタイン−ホモシステイ
ンメチル転移酵素、およびホモシステインの変換反応に
関連する他の酵素（例えばGrahamによるTrends Cardiov
asc.Med.1:244−249（1991）に記載されている）が挙げ
られる。
素は、特に好ましくはSAH−加水分解酵素であるが、他
の酵素も使用できる。例えば、ベタイン−ホモシステイ
ンメチル転移酵素、およびホモシステインの変換反応に
関連する他の酵素（例えばGrahamによるTrends Cardiov
asc.Med.1:244−249（1991）に記載されている）が挙げ
られる。
本発明の方法により評価されるホモシステイン補助基
質は、酵素で触媒されるホモシステイン変換反応、例え
ばSAH−加水分解酵素で触媒されるホモシステイン変換
反応において、ホモシステインと反応する化合物であ
る。
質は、酵素で触媒されるホモシステイン変換反応、例え
ばSAH−加水分解酵素で触媒されるホモシステイン変換
反応において、ホモシステインと反応する化合物であ
る。
ここで用いられる『評価（assessing）』なる用語
は、サンプル中に存在するアナライト、例えばホモシス
テイン補助基質の量、またた濃度の絶対値を得るという
意味で、かつ、サンプル中のアナライトのレベルを示指
する指数値、比率値、百分率値、視覚値または他の値を
得るという意味で、定量的測定および定性的測定の両者
を包含することを意図している。評価は直接的でも間接
的でもよく、実際に検出される化学種は、アナライト自
体である必要がないことは勿論であり、例えば、その誘
導体または以下に論じるような何か他の基質であっても
よい。
は、サンプル中に存在するアナライト、例えばホモシス
テイン補助基質の量、またた濃度の絶対値を得るという
意味で、かつ、サンプル中のアナライトのレベルを示指
する指数値、比率値、百分率値、視覚値または他の値を
得るという意味で、定量的測定および定性的測定の両者
を包含することを意図している。評価は直接的でも間接
的でもよく、実際に検出される化学種は、アナライト自
体である必要がないことは勿論であり、例えば、その誘
導体または以下に論じるような何か他の基質であっても
よい。
本発明のアッセイには、アナライトを評価するのため
に、酵素的技術または免疫学的技術の何れもが好都合に
使用される。一つの好ましい酵素的技術において、アナ
ライトを、もう１つの酵素（このアナライトは、このも
う１つの酵素のための基質であり、かつ、補助基質であ
るか、またはアナライトの酵素変換反応の直接的もしく
は間接的反応生成物の何れかである）と接触させ、こに
よって、もう１つの酵素が評価される。好ましい免疫学
的技術において、アナライトは、アナライトともう１つ
のハプテン（例えばポリハプテンまたはアナライトの標
識された類似体）とにより抗体に競合的に結合させるこ
と、および結合したハプテンまたは結合しなかったハプ
テンを評価することを含む操作を用いて評価される。
に、酵素的技術または免疫学的技術の何れもが好都合に
使用される。一つの好ましい酵素的技術において、アナ
ライトを、もう１つの酵素（このアナライトは、このも
う１つの酵素のための基質であり、かつ、補助基質であ
るか、またはアナライトの酵素変換反応の直接的もしく
は間接的反応生成物の何れかである）と接触させ、こに
よって、もう１つの酵素が評価される。好ましい免疫学
的技術において、アナライトは、アナライトともう１つ
のハプテン（例えばポリハプテンまたはアナライトの標
識された類似体）とにより抗体に競合的に結合させるこ
と、および結合したハプテンまたは結合しなかったハプ
テンを評価することを含む操作を用いて評価される。
本発明により用いられる好ましいホモシステイン変換
酵素は、Ｓ−アデノシル−ホモシステイン加水分解酵素
（SAH−加水分解酵素）であり、この酵素は、下記のホ
モシステイン反応（106 M-1の平衡定数Ｋを有する反応
である）を触媒する。
酵素は、Ｓ−アデノシル−ホモシステイン加水分解酵素
（SAH−加水分解酵素）であり、この酵素は、下記のホ
モシステイン反応（106 M-1の平衡定数Ｋを有する反応
である）を触媒する。
アデノシン＋ホモシステインＳ−アデノシル−ホモシ
ステイン（SAH） この反応は、反応条件、反応関与体の濃度等に応じ
て、どちらの方向にも進行しうる。
ステイン（SAH） この反応は、反応条件、反応関与体の濃度等に応じ
て、どちらの方向にも進行しうる。
上記の反応スキームにおいて、アデノシンは、ホモシ
ステイン補助基質である。しかしながら、アデノシンの
類似体または関連化合物のような他の補助基質も、本発
明のアッセイ方法に使用できる。
ステイン補助基質である。しかしながら、アデノシンの
類似体または関連化合物のような他の補助基質も、本発
明のアッセイ方法に使用できる。
本発明のアッセイは、ホモシステインがSAH−加水分
解酵素の阻害剤として作用し、ホモシステインおよびア
デノシンを形成する加水分解反応を抑制し、反応平衡を
SAH合成の方に移行させるという特別の利点を有する。
解酵素の阻害剤として作用し、ホモシステインおよびア
デノシンを形成する加水分解反応を抑制し、反応平衡を
SAH合成の方に移行させるという特別の利点を有する。
このように、サンプル中のホモシステインの量は、SA
H−加水分解酵素によるホモシステイン補助基質（例え
ばアデノシン）の生成または消費、従って反応混合物中
で得られるその濃度に対して、間接的に影響を及ぼす。
本発明においては、反応混合物中で得られるホモシステ
イン補助基質（例えばアデノシン）の濃度または濃度変
化を、サンプル中のホモシステインの初期基質である場
合には、本発明のアッセイは、ホモシステインが直接的
に評価されるよりはむしろ、ホモシステインの酵素触媒
変換反応におけるその補助基質の濃度を測定することに
より、ホモシステインが間接的に評価されるという点
で、従来法と異なっている。このことは、典型的な臨床
研究室の操作には好適であるが、ホモシステインの従来
法によるアッセイには使用できなかった検出方法、例え
ば光学的方法を用いて、本発明によるアッセイを日常的
臨床使用に特に好適化できるという直接的利点を有す
る。
H−加水分解酵素によるホモシステイン補助基質（例え
ばアデノシン）の生成または消費、従って反応混合物中
で得られるその濃度に対して、間接的に影響を及ぼす。
本発明においては、反応混合物中で得られるホモシステ
イン補助基質（例えばアデノシン）の濃度または濃度変
化を、サンプル中のホモシステインの初期基質である場
合には、本発明のアッセイは、ホモシステインが直接的
に評価されるよりはむしろ、ホモシステインの酵素触媒
変換反応におけるその補助基質の濃度を測定することに
より、ホモシステインが間接的に評価されるという点
で、従来法と異なっている。このことは、典型的な臨床
研究室の操作には好適であるが、ホモシステインの従来
法によるアッセイには使用できなかった検出方法、例え
ば光学的方法を用いて、本発明によるアッセイを日常的
臨床使用に特に好適化できるという直接的利点を有す
る。
本発明の好ましいアッセイ方法において、SAH−加水
分解酵素反応はどちらの方向にも使用できる。即ち、も
し試験サンプルをアデノシンおよびSAH−加水分解酵素
と接触させるならば、アデノシンの量は、消費されたホ
モシステインの量と対応する量で消費され、従ってサン
プル中のホモシステインの量は、アデノシン濃度の変化
から測定することができる。アデノシン類似体および／
またはアデノシンを生成する化合物を、アデノシン自体
の代わりに用いることができる。
分解酵素反応はどちらの方向にも使用できる。即ち、も
し試験サンプルをアデノシンおよびSAH−加水分解酵素
と接触させるならば、アデノシンの量は、消費されたホ
モシステインの量と対応する量で消費され、従ってサン
プル中のホモシステインの量は、アデノシン濃度の変化
から測定することができる。アデノシン類似体および／
またはアデノシンを生成する化合物を、アデノシン自体
の代わりに用いることができる。
本発明の他の好ましい態様においては、反対方向の反
応を用いることもできる。試験サンプルを、SAH（一般
的に過剰）およびSAH−加水分解酵素と接触させること
ができる。次いで、SAHの加水分解から、ホモシステイ
ンおよびアデノシンが形成される。試験サンプル中に存
在するどのホモシステインも、この正味反応に逆らい、
従ってダデノシンの生成（その量がモニターされる）を
阻害する。
応を用いることもできる。試験サンプルを、SAH（一般
的に過剰）およびSAH−加水分解酵素と接触させること
ができる。次いで、SAHの加水分解から、ホモシステイ
ンおよびアデノシンが形成される。試験サンプル中に存
在するどのホモシステインも、この正味反応に逆らい、
従ってダデノシンの生成（その量がモニターされる）を
阻害する。
従って、本発明の方法に用いられるSAH−加水分解酵
素基質は、SAHまたはアデノシン、あるいはこられの類
似体および前駆体である。
素基質は、SAHまたはアデノシン、あるいはこられの類
似体および前駆体である。
体内のスルフヒドリルアミノ酸代謝およびトランスメ
チル化反応の経路の複雑な系統には、多くの酵素類が影
響を及ぼす。これらの経路および反応は充分に研究され
ており、また関連する酵素の調節的役割も調査されてい
る。このような酵素の一つ、SAH−加水分解酵素の役割
は、Uelandによる総説、Pharmacological Review 34;22
3−253に論じられている。Trewyn at al.は、J.Bioche
m.Biophys.Met.4:299−307（1981）において、SAH−加
水分解酵素の調節的役割の調査を記述しており、SAH−
加水分解酵素の酵素活性のアッセイを提供している。Ga
rras et al.は、Analytical Biochem.199:112−118（19
91）において、他のホモシステイン反応経路を記述して
おり、特に、メチオニンシンターゼで媒介されるホモシ
ステインの変換についてのアッセイを提供している。前
述したように、Graham（前出）は、更なる酵素媒介ホモ
システイン変換を記述している。これら多様な反応の補
助基質および変換生成物は、特に免疫学的評価手段を採
用する際に、本発明のアッセイのアナライトとして用い
ることができる。
チル化反応の経路の複雑な系統には、多くの酵素類が影
響を及ぼす。これらの経路および反応は充分に研究され
ており、また関連する酵素の調節的役割も調査されてい
る。このような酵素の一つ、SAH−加水分解酵素の役割
は、Uelandによる総説、Pharmacological Review 34;22
3−253に論じられている。Trewyn at al.は、J.Bioche
m.Biophys.Met.4:299−307（1981）において、SAH−加
水分解酵素の調節的役割の調査を記述しており、SAH−
加水分解酵素の酵素活性のアッセイを提供している。Ga
rras et al.は、Analytical Biochem.199:112−118（19
91）において、他のホモシステイン反応経路を記述して
おり、特に、メチオニンシンターゼで媒介されるホモシ
ステインの変換についてのアッセイを提供している。前
述したように、Graham（前出）は、更なる酵素媒介ホモ
システイン変換を記述している。これら多様な反応の補
助基質および変換生成物は、特に免疫学的評価手段を採
用する際に、本発明のアッセイのアナライトとして用い
ることができる。
本発明によりアッセイされる臨床サンプルは、生物学
的液体または組織抽出物から導かれるものであってよ
く、またアッセイに先立ち前処理を施してもよい。しか
しながら、一般的には血漿サンプルまたは尿サンプルが
用いられる。
的液体または組織抽出物から導かれるものであってよ
く、またアッセイに先立ち前処理を施してもよい。しか
しながら、一般的には血漿サンプルまたは尿サンプルが
用いられる。
血漿中または尿中では、存在するホモシステインの相
当の割合は、ジスフィド架橋によりアルブミンのような
循環タンパクに結合していることがあり、また、ホモシ
ステインは、他のジスルフィド誘導体（一般的にはホモ
システイン−システイン結合体）の形態で存在している
こともある。従って、サンプル中に存在する全ホモシス
テインの推定量を得るために、還元剤でサンプルを処理
し、ジスルフィド結合を開裂させてフリーなホモシステ
インを遊離させることが望ましい。
当の割合は、ジスフィド架橋によりアルブミンのような
循環タンパクに結合していることがあり、また、ホモシ
ステインは、他のジスルフィド誘導体（一般的にはホモ
システイン−システイン結合体）の形態で存在している
こともある。従って、サンプル中に存在する全ホモシス
テインの推定量を得るために、還元剤でサンプルを処理
し、ジスルフィド結合を開裂させてフリーなホモシステ
インを遊離させることが望ましい。
ジスルフェド化合物は、チオール類（例えば、ジチオ
トレイトール（DTT）、ジチオエリスリトール（DTE）、
２−メルカプト−エタノール、システイン−チオグリコ
レート、チオグリコール酸、グルタチオンおよび類似の
化合物）により容易に、かつ特異的に還元される。直接
の化学的還元は、水素化硼素類（例えば水素化硼素ナト
リウム）またはアマルガム（例えばナトリウムアマルガ
ム）を用いて達成することができ、あるいは更に専門的
な還元剤、例えばホスフィンまたはホスホロチオエート
も使用できる。ジスルフィドの還元は、JocelynによりM
ethods of Enzymology143:243−256（1987）に概説され
ており、そこには広範囲にわたる好適な還元剤が列挙さ
れている。
トレイトール（DTT）、ジチオエリスリトール（DTE）、
２−メルカプト−エタノール、システイン−チオグリコ
レート、チオグリコール酸、グルタチオンおよび類似の
化合物）により容易に、かつ特異的に還元される。直接
の化学的還元は、水素化硼素類（例えば水素化硼素ナト
リウム）またはアマルガム（例えばナトリウムアマルガ
ム）を用いて達成することができ、あるいは更に専門的
な還元剤、例えばホスフィンまたはホスホロチオエート
も使用できる。ジスルフィドの還元は、JocelynによりM
ethods of Enzymology143:243−256（1987）に概説され
ており、そこには広範囲にわたる好適な還元剤が列挙さ
れている。
アデノシンまたは他のホモシステイン補助基質は、公
知の方法で評価できる。一般に、分光法（例えば比色
法、分光光度法または分光蛍光法）による検出に頼る方
法、および免疫学的方法は、これらの方法が臨床研究室
での使用に特に容易に適合できるので好ましい。酵素反
応に基づく方法、あるいはモノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体との反応に基づく方法は、これらの方
法が簡単かつ迅速であり、実施するのに比較的に安価で
あるので特に好ましい。従って、例えば、アナライトを
分光法で、例えば分光光度法で検出可能な生成物に直接
的または間接的に変換する酵素との反応をモニターする
ことにより、アナライトを評価できる。公的な酵素（こ
れは勿論、ホモシステイン変換酵素の他の基質、特にホ
モシステインと反応してはならない）としては、アデノ
シン脱アミノ酵素（これはアデノシンをイノシンに変換
する）、およびアデノシンキナーゼ（これはアデノシン
およびATPをADPおよびリン酸アデノシンに変換する）が
挙げられる。このような酵素は、他の酵素（これは作用
して、形成された生成物を更なる検出可能な生成物に変
換する）と更に組み合わせることができる。
知の方法で評価できる。一般に、分光法（例えば比色
法、分光光度法または分光蛍光法）による検出に頼る方
法、および免疫学的方法は、これらの方法が臨床研究室
での使用に特に容易に適合できるので好ましい。酵素反
応に基づく方法、あるいはモノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体との反応に基づく方法は、これらの方
法が簡単かつ迅速であり、実施するのに比較的に安価で
あるので特に好ましい。従って、例えば、アナライトを
分光法で、例えば分光光度法で検出可能な生成物に直接
的または間接的に変換する酵素との反応をモニターする
ことにより、アナライトを評価できる。公的な酵素（こ
れは勿論、ホモシステイン変換酵素の他の基質、特にホ
モシステインと反応してはならない）としては、アデノ
シン脱アミノ酵素（これはアデノシンをイノシンに変換
する）、およびアデノシンキナーゼ（これはアデノシン
およびATPをADPおよびリン酸アデノシンに変換する）が
挙げられる。このような酵素は、他の酵素（これは作用
して、形成された生成物を更なる検出可能な生成物に変
換する）と更に組み合わせることができる。
免疫学的方法の例としては、アナライトと、これに特
異的な抗体（これらの抗体は、それ自体が検出可能であ
るか、または例えばサンドイッチアッセイで更に反応さ
せて、検出可能な生成物を形成できる）との反応を伴う
方法が挙げられる。しかしながら、一つの特に魅力的な
免疫学的方法は、蛍光団で標識されたアナライトの類似
体、好ましくは補助基質、例えばフルオレセイン標識ア
デノシンの使用を伴っており、このアナライトおよび未
標識アナライトを、アナライトに対する抗体と接触させ
ることができる。得られた生成物を、偏光励起放射線を
用いる蛍光偏光アッセイに付すると、未標識アナライト
濃度の指示を、蛍光放射線の偏光解消度から導くことが
できる。アデノシン抗体は、商業的に入手することがで
き（例えばPaessel ＆ Lorei GmbH,Frankfurt,Germany
およびSerotech Ltd.,Oxford,United Kingdomから）、
蛍光偏光免疫アッセイ（FPIA）技術は、充分に確立され
ている（例えばUS−Ａ−4420568およびUS−Ａ−459308
9、並びにTDx技術に関するAbbot Laboratoriesによる他
の刊行物参照）。
異的な抗体（これらの抗体は、それ自体が検出可能であ
るか、または例えばサンドイッチアッセイで更に反応さ
せて、検出可能な生成物を形成できる）との反応を伴う
方法が挙げられる。しかしながら、一つの特に魅力的な
免疫学的方法は、蛍光団で標識されたアナライトの類似
体、好ましくは補助基質、例えばフルオレセイン標識ア
デノシンの使用を伴っており、このアナライトおよび未
標識アナライトを、アナライトに対する抗体と接触させ
ることができる。得られた生成物を、偏光励起放射線を
用いる蛍光偏光アッセイに付すると、未標識アナライト
濃度の指示を、蛍光放射線の偏光解消度から導くことが
できる。アデノシン抗体は、商業的に入手することがで
き（例えばPaessel ＆ Lorei GmbH,Frankfurt,Germany
およびSerotech Ltd.,Oxford,United Kingdomから）、
蛍光偏光免疫アッセイ（FPIA）技術は、充分に確立され
ている（例えばUS−Ａ−4420568およびUS−Ａ−459308
9、並びにTDx技術に関するAbbot Laboratoriesによる他
の刊行物参照）。
従って、本発明のアッセイに有用な検出スキームの例
としては、次のスキームが挙げられる。
としては、次のスキームが挙げられる。
競合する化学発光ATP反応と一緒に、例えば下記の反
応と一緒に、 あるいはATP/アデノシンキナーゼに対して競合する蛍
光団標識アデノシンと一緒に、あるいは蛍光偏光測定に
より行われる評価と一緒に。
応と一緒に、 あるいはATP/アデノシンキナーゼに対して競合する蛍
光団標識アデノシンと一緒に、あるいは蛍光偏光測定に
より行われる評価と一緒に。
スキーム（２）および（３）に関し、イノシンおよび
尿酸は、明確なUV吸収特性を有しており、従って動的測
定により、分光光度法でモニターすることができる。
尿酸は、明確なUV吸収特性を有しており、従って動的測
定により、分光光度法でモニターすることができる。
しかしながら、尿酸またはイノシンのUV検出の使用
は、この方法の感度がやや劣り、紫外線および紫外線透
過性サンプル容器を必要とする点で、ある限界を有して
いる。従って、比色検出または電子センサーに頼るのが
更に有利なことがあり、このような方法、特に比色法
は、一般に臨床研究室において好まれる。
は、この方法の感度がやや劣り、紫外線および紫外線透
過性サンプル容器を必要とする点で、ある限界を有して
いる。従って、比色検出または電子センサーに頼るのが
更に有利なことがあり、このような方法、特に比色法
は、一般に臨床研究室において好まれる。
これに関し、スキーム（２）の反応は、アデノシン脱
アミノ酵素により生成したアンモニアを、公知の比色測
定技術を用いて容易に検出できる点で、特に有用であ
る。即ち、例えばサンプル中に生成したサンモニアを反
応させて、着色生成物を形成することができ、その形成
は、分光光度法で検出できる。Methods of Enzymatic A
nalysis（Bergmeyer）Volume 1:1049−1056（1970）に
記載されているこのような方法の一つは、アンモニアと
フェノールとを、次亜塩素酸塩の存在下にアルカリ性条
件で反応させて、着色色素インドフェノールを形成する
ことに頼っている。
アミノ酵素により生成したアンモニアを、公知の比色測
定技術を用いて容易に検出できる点で、特に有用であ
る。即ち、例えばサンプル中に生成したサンモニアを反
応させて、着色生成物を形成することができ、その形成
は、分光光度法で検出できる。Methods of Enzymatic A
nalysis（Bergmeyer）Volume 1:1049−1056（1970）に
記載されているこのような方法の一つは、アンモニアと
フェノールとを、次亜塩素酸塩の存在下にアルカリ性条
件で反応させて、着色色素インドフェノールを形成する
ことに頼っている。
ニトロプルシドナトリウムは、触媒として使用でき
る。例えばフェノールの種々の誘導体を用いるこの方法
の変法も、使用できる。
る。例えばフェノールの種々の誘導体を用いるこの方法
の変法も、使用できる。
着色最終生成物は、サンプル中のアンモニア濃度、従
ってアデノシン濃度に正比例する量で形成される。
ってアデノシン濃度に正比例する量で形成される。
スキーム（３）において、キサンチン酸化酵素反応は
それ自体、例えばレドックス指示薬を用いて酸化／還元
電位を評価することにより、あるいはO2消費、即ち更に
詳しくは、H2O2の形成を例えば電子センサーを用いて測
定することにより、蛍光原体または色原体の検出に適し
ている。この目的のために多くのレドックス指示薬を使
用することができ、溶液中のH2O2およびO2をアッセイす
るための広範囲の方法が文献に記載されている。実際
に、H2O2は臨床アッセイにおいて頻繁に検出されてい
る。
それ自体、例えばレドックス指示薬を用いて酸化／還元
電位を評価することにより、あるいはO2消費、即ち更に
詳しくは、H2O2の形成を例えば電子センサーを用いて測
定することにより、蛍光原体または色原体の検出に適し
ている。この目的のために多くのレドックス指示薬を使
用することができ、溶液中のH2O2およびO2をアッセイす
るための広範囲の方法が文献に記載されている。実際
に、H2O2は臨床アッセイにおいて頻繁に検出されてい
る。
好適なレドックス指示薬としては、メチレンブルー、
2,6−ジクロロフェノール、インドフェノール、およびK
odack Laboratorie ＆ Research Products,Catalog No.
53の表１に列挙されているレドックス指示薬が挙げられ
るが、その他のものも勿論使用できる。パーオキシダー
ゼ活性を有する酵素、例えばホースラディッシュパーオ
キシダーゼを添加して、レドックス反応を促進すること
ができる。
2,6−ジクロロフェノール、インドフェノール、およびK
odack Laboratorie ＆ Research Products,Catalog No.
53の表１に列挙されているレドックス指示薬が挙げられ
るが、その他のものも勿論使用できる。パーオキシダー
ゼ活性を有する酵素、例えばホースラディッシュパーオ
キシダーゼを添加して、レドックス反応を促進すること
ができる。
沈降する色原体を望むならば、MTTテトラゾリウム
を、キサンチン酸化酵素または他の同様の酵素と組み合
わせて用いることができる。沈降する色原体または蛍光
原体の使用により、固定された色または蛍光の読み取り
を得て、ホモシステイン濃度の可視的指示を得ることが
できる。
を、キサンチン酸化酵素または他の同様の酵素と組み合
わせて用いることができる。沈降する色原体または蛍光
原体の使用により、固定された色または蛍光の読み取り
を得て、ホモシステイン濃度の可視的指示を得ることが
できる。
スキーム（４）においては、化学発光ATP反応を用い
てアデノシン濃度が評価される。化学発光に基づくアッ
セイは、達成できる検出限界が低いため、また必要な機
器が比較的簡単なため、大きな可能性を有している。化
学発光反応を用いて、アナライト、例えばATPまたはH2O
2を検出することができ、最も有効であり、かつ最もよ
く知られているこのような反応の一つは、発光飛翔昆虫
の生体発光反応である。
てアデノシン濃度が評価される。化学発光に基づくアッ
セイは、達成できる検出限界が低いため、また必要な機
器が比較的簡単なため、大きな可能性を有している。化
学発光反応を用いて、アナライト、例えばATPまたはH2O
2を検出することができ、最も有効であり、かつ最もよ
く知られているこのような反応の一つは、発光飛翔昆虫
の生体発光反応である。
発光飛翔昆虫シフェリンは、ベンゾチアゾール構造を
有するが、他の生物原からの他の構造有するルシフェリ
ン類も利用できる。分析の目的のためには、ATP、ルシ
フェリンまたはルシフェラーゼは、この反応を用いて直
接にアッセイできるだろう。例えばスキーム（３）に示
すように、H2O2が生成する使用可能な他の化学発光反応
は、ヒドロパーオキシダーゼ触媒を用いるルミノール反
応であり（ルミノールは、５−アミノ−2,3−ジヒドロ
−フタラジン−1,4−ジオンである）、その結果、425nm
で光が発生する。
有するが、他の生物原からの他の構造有するルシフェリ
ン類も利用できる。分析の目的のためには、ATP、ルシ
フェリンまたはルシフェラーゼは、この反応を用いて直
接にアッセイできるだろう。例えばスキーム（３）に示
すように、H2O2が生成する使用可能な他の化学発光反応
は、ヒドロパーオキシダーゼ触媒を用いるルミノール反
応であり（ルミノールは、５−アミノ−2,3−ジヒドロ
−フタラジン−1,4−ジオンである）、その結果、425nm
で光が発生する。
例えばスキーム（３）からの過酸化水素は、パーオキ
シオキサレートとアクリジニウムエステル類（後者は中
性pHの水溶液として）との非酵素的化学発光反応を用い
て評価することもできる。
シオキサレートとアクリジニウムエステル類（後者は中
性pHの水溶液として）との非酵素的化学発光反応を用い
て評価することもできる。
アデノシンキナーゼの基質特異性が比較的広いので、
スキーム（４）における蛍光団で標識されたアデノシン
の使用、および蛍光偏光測定による評価が可能である。
更に、この広い特異性を用いて、前処理として、サンプ
ルにアデノシンキナーゼを、好ましくは還元剤（例えば
DTT）と組み合わせて添加することにより、内在性アデ
ノシン（または他のアデノシンキナーゼヌクレオシド基
質）を償うことができる。
スキーム（４）における蛍光団で標識されたアデノシン
の使用、および蛍光偏光測定による評価が可能である。
更に、この広い特異性を用いて、前処理として、サンプ
ルにアデノシンキナーゼを、好ましくは還元剤（例えば
DTT）と組み合わせて添加することにより、内在性アデ
ノシン（または他のアデノシンキナーゼヌクレオシド基
質）を償うことができる。
本発明の多くの態様において、アナライト（例えばア
デノシン）がサンプル中に既に変化する量で存在してお
り、従ってアッセイにおける可能な誤差源を与えるの
で、サンプルをこのように酵素で前処理することが望ま
しい。バックグランドアナライト含有量は、サンプルの
一部について、ホモシステイン変換酵素（例えばSAH−
加水分解酵素）を用いずにアッセイを行うことによって
償うことができる。しかしながら、このような操作は時
間がかかり、アッセイを更に扱いにくくする。その代わ
りの方法は、内在性アナライトを変換または除去するの
に役立つ剤、例えばバックグランドアデノシンを除去す
るアデノシンキナーゼまたはアデノシン脱アミノ酵素の
ような酵素で前処理することである。前記のように、行
おうとするアッセイに要する時間は不必要に長くなるの
を避けるために、サンプルのこのような処理は、サンプ
ルを還元剤で前処理してホモシステインを遊離化させる
ときに、有利に行うことができる。
デノシン）がサンプル中に既に変化する量で存在してお
り、従ってアッセイにおける可能な誤差源を与えるの
で、サンプルをこのように酵素で前処理することが望ま
しい。バックグランドアナライト含有量は、サンプルの
一部について、ホモシステイン変換酵素（例えばSAH−
加水分解酵素）を用いずにアッセイを行うことによって
償うことができる。しかしながら、このような操作は時
間がかかり、アッセイを更に扱いにくくする。その代わ
りの方法は、内在性アナライトを変換または除去するの
に役立つ剤、例えばバックグランドアデノシンを除去す
るアデノシンキナーゼまたはアデノシン脱アミノ酵素の
ような酵素で前処理することである。前記のように、行
おうとするアッセイに要する時間は不必要に長くなるの
を避けるために、サンプルのこのような処理は、サンプ
ルを還元剤で前処理してホモシステインを遊離化させる
ときに、有利に行うことができる。
アナライトの評価のために分光測定技術または比色定
量技術を用いるほかにも、他の測定技術を使用できる。
その中でも使用可能な最も有用な技術は、粒子凝集技術
および免疫沈降技術である。ポリクローナル抗体を用い
る場合には、直接の粒子凝集反応または直接の免疫沈降
反応を用いてもよいが、SAH−加水分解酵素をホモシス
テイン変換酵素として使用する場合には、これは一般に
好ましくない。しかしながら、沈降阻害技術または粒子
凝集阻害技術を使用できる。これらの技術は、結合に際
して、濁り測定または比濁測定によって検出可能な沈降
物または粒子凝集物を生じる抗体／ハプテンの組み合わ
せの使用を頼りにしている。抗体／ハプテン複合体の形
成が、アナライト、例えばSAHによって阻害される場合
には、沈降物／凝集物の減量からSAH含有量を評価する
ことができる。この反応は、下記のように表すことがで
きる。
量技術を用いるほかにも、他の測定技術を使用できる。
その中でも使用可能な最も有用な技術は、粒子凝集技術
および免疫沈降技術である。ポリクローナル抗体を用い
る場合には、直接の粒子凝集反応または直接の免疫沈降
反応を用いてもよいが、SAH−加水分解酵素をホモシス
テイン変換酵素として使用する場合には、これは一般に
好ましくない。しかしながら、沈降阻害技術または粒子
凝集阻害技術を使用できる。これらの技術は、結合に際
して、濁り測定または比濁測定によって検出可能な沈降
物または粒子凝集物を生じる抗体／ハプテンの組み合わ
せの使用を頼りにしている。抗体／ハプテン複合体の形
成が、アナライト、例えばSAHによって阻害される場合
には、沈降物／凝集物の減量からSAH含有量を評価する
ことができる。この反応は、下記のように表すことがで
きる。
ホモシステイン変換酵素として、SAH−加水分解酵素
を用いて本発明のアッセイを行う場合には、SAH−加水
分解酵素を還元剤の存在下に保存するか、またはこれを
アッセイに使用する前に還元剤で処理することが有利で
ある。そうしないで保存すると、SAH−加水分解酵素が
不活性化されること、およびこの還元剤の使用が保存中
の不活性化を防止するか、またはアッセイに使用する前
に再活性化を生じさせることが見出された。
を用いて本発明のアッセイを行う場合には、SAH−加水
分解酵素を還元剤の存在下に保存するか、またはこれを
アッセイに使用する前に還元剤で処理することが有利で
ある。そうしないで保存すると、SAH−加水分解酵素が
不活性化されること、およびこの還元剤の使用が保存中
の不活性化を防止するか、またはアッセイに使用する前
に再活性化を生じさせることが見出された。
種々の還元剤（例えばDTT、システイン、メルカプト
エタノール、ジチオエリスリトール、水素化硼素ナトリ
ウムなど）を使用できるが、DTTは、例えば約5mMの濃度
において特に適している。DTT自体は低いpHで保存すべ
きなので、アッセイ用キットは、好都合には、低いpH
（例えば約３）ではあるが、低い緩衝能を有するDTT溶
液と、実質的に中性pHであり、好ましくは緩衝されたSA
H−加水分解酵素（これは部分的または完全に不活性で
あってよい）の別個の溶液とを含むことができる。これ
らの溶液を合併すると、酵素を中性pHで再活性化するこ
とができる。この合併は、所望により試験サンプルの存
在下で行うか、またはそのすぐ後で試験サンプルを添加
して行うことができるので、ホモシステインの遊離化を
同時に行うことができる。他の上記の還元剤も同様に、
SAH−加水分解酵素の安定化／活性化のため、およびサ
ンプルを還元してホモシステインを遊離化させるための
両方に使用できる。
エタノール、ジチオエリスリトール、水素化硼素ナトリ
ウムなど）を使用できるが、DTTは、例えば約5mMの濃度
において特に適している。DTT自体は低いpHで保存すべ
きなので、アッセイ用キットは、好都合には、低いpH
（例えば約３）ではあるが、低い緩衝能を有するDTT溶
液と、実質的に中性pHであり、好ましくは緩衝されたSA
H−加水分解酵素（これは部分的または完全に不活性で
あってよい）の別個の溶液とを含むことができる。これ
らの溶液を合併すると、酵素を中性pHで再活性化するこ
とができる。この合併は、所望により試験サンプルの存
在下で行うか、またはそのすぐ後で試験サンプルを添加
して行うことができるので、ホモシステインの遊離化を
同時に行うことができる。他の上記の還元剤も同様に、
SAH−加水分解酵素の安定化／活性化のため、およびサ
ンプルを還元してホモシステインを遊離化させるための
両方に使用できる。
不活性化SAH−加水分解酵素の活性化への還元剤の使
用は、本発明のもう一つの観点を形成する。更に、もう
一つの観点において、本発明は、第１区画内の不活性化
SAH−加水分解酵素と、第２区画内の還元剤、例えば酸
素媒質（例えばpH3）中のDDTとを含むキットを提供す
る。このキットを用いる場合には、SAH−加水分解酵素
は、これをアッセイに使用する直前に、還元剤と混合し
て活性化することができる。
用は、本発明のもう一つの観点を形成する。更に、もう
一つの観点において、本発明は、第１区画内の不活性化
SAH−加水分解酵素と、第２区画内の還元剤、例えば酸
素媒質（例えばpH3）中のDDTとを含むキットを提供す
る。このキットを用いる場合には、SAH−加水分解酵素
は、これをアッセイに使用する直前に、還元剤と混合し
て活性化することができる。
保存中またはアッセイ自体におけるSAH−加水分解酵
素の安定性を向上させるため、他の添加物を有利に使用
できる。これらの添加物としては、NAD+、グルタチオ
ン、多価アルコール類および糖類（例えばイノシトー
ル、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、グ
リセリン、エチレングリコール、蔗糖、ラクチトール
（lactitol）など）、可溶性ポリマー、例えばある種の
デキストラン類、およびタンパク質（例えば担体タンパ
ク質）が挙げられる。
素の安定性を向上させるため、他の添加物を有利に使用
できる。これらの添加物としては、NAD+、グルタチオ
ン、多価アルコール類および糖類（例えばイノシトー
ル、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、グ
リセリン、エチレングリコール、蔗糖、ラクチトール
（lactitol）など）、可溶性ポリマー、例えばある種の
デキストラン類、およびタンパク質（例えば担体タンパ
ク質）が挙げられる。
本発明のアッセイに抗体を用いる場合には、これらの
抗体はポリクローナルであってもよいが、モノクローナ
ルであることが好ましい。所望の抗体が商業的に入手で
きない場合には、これらは標準的な技術により製造でき
る。即ち、例えばJames Goodingにより“Monoclonal an
tibodies,principle and practice",Academic Press,Lo
ndon,1983,Chapter 3に記載されているようにして、動
物において、またはモノクローナルまたはポリクローナ
ルのハイブリドーマにおいて、抗体を産生させることが
できる。モノクローンは、酵素（１つまたは２つ以上）
に対して所望のハプテンと他の基質とを識別するクロー
ン、例えばアデノシンとSAHとを識別するクローンを選
択するために保存しなければならない。アナライト（例
えばSAH）とだけ反応するポリクローナル抗体は、精製
して、交叉反応する抗体、即ちアナライトのほかにも他
の基質と反応する抗体、例えばアデノシンおよびSAHの
両方と反応する抗体を除去すべきである。これは、例え
ばSAHがアナライトである場合には、固定化アデノシン
を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより行う
ことができる。
抗体はポリクローナルであってもよいが、モノクローナ
ルであることが好ましい。所望の抗体が商業的に入手で
きない場合には、これらは標準的な技術により製造でき
る。即ち、例えばJames Goodingにより“Monoclonal an
tibodies,principle and practice",Academic Press,Lo
ndon,1983,Chapter 3に記載されているようにして、動
物において、またはモノクローナルまたはポリクローナ
ルのハイブリドーマにおいて、抗体を産生させることが
できる。モノクローンは、酵素（１つまたは２つ以上）
に対して所望のハプテンと他の基質とを識別するクロー
ン、例えばアデノシンとSAHとを識別するクローンを選
択するために保存しなければならない。アナライト（例
えばSAH）とだけ反応するポリクローナル抗体は、精製
して、交叉反応する抗体、即ちアナライトのほかにも他
の基質と反応する抗体、例えばアデノシンおよびSAHの
両方と反応する抗体を除去すべきである。これは、例え
ばSAHがアナライトである場合には、固定化アデノシン
を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより行う
ことができる。
抗体を製造する際には、ハプテンとしては、アナライ
ト自体、または最も適切な結合領域、例えば酵素反応に
関与する結合領域から離れた領域と考えられるアナライ
トの部分を含む他の分子が用いられる。ハプテンは、好
都合には、マクロ分子、例えばBSAまたはヘモシアニン
と結合される。SAHについては、所望のエピトープは、
チオエーテル橋にあるか、またはその付近にあり、従っ
て、マクロ分子に結合されたSAH自体 を使用できるが、“単純化された”分子、例えば下記式
（Ｉ） （式中、R1およびR2は同一でも異なっていてもよく、水
素原子またはOR4基であり、ここでR4は低級（例えばC
1-6、特にC1-4）脂肪族基、例えばアルキル基、好まし
くはメチル基またはエチル基であるか、あるいはR1とR2
は一緒になって酵素原子を示し、R3はアミン部分または
カルボキシル部分である）で表される化合物の１つ、あ
るいはその塩またはエステル（例えばC1-4アルカノール
とのエステル）を用いて、再びマクロ分子と結合させる
ことが好ましい。
ト自体、または最も適切な結合領域、例えば酵素反応に
関与する結合領域から離れた領域と考えられるアナライ
トの部分を含む他の分子が用いられる。ハプテンは、好
都合には、マクロ分子、例えばBSAまたはヘモシアニン
と結合される。SAHについては、所望のエピトープは、
チオエーテル橋にあるか、またはその付近にあり、従っ
て、マクロ分子に結合されたSAH自体 を使用できるが、“単純化された”分子、例えば下記式
（Ｉ） （式中、R1およびR2は同一でも異なっていてもよく、水
素原子またはOR4基であり、ここでR4は低級（例えばC
1-6、特にC1-4）脂肪族基、例えばアルキル基、好まし
くはメチル基またはエチル基であるか、あるいはR1とR2
は一緒になって酵素原子を示し、R3はアミン部分または
カルボキシル部分である）で表される化合物の１つ、あ
るいはその塩またはエステル（例えばC1-4アルカノール
とのエステル）を用いて、再びマクロ分子と結合させる
ことが好ましい。
従って、ハプテンとして使用できる式Ｉの化合物の例
には、下記のものが含まれる。
には、下記のものが含まれる。
このような“単純化された”構造は、アナライトと標
識された類似体とが、抗体との結合反応に関与する場合
のアッセイに用いられる、上記の標識された類似体にも
採用できる。従って、シグナルを与える部分R*（これ
は、例えば発蛍光団、発色団、放射性ラベル、酵素的ラ
ベル、光学発光性レベル、および免疫アッセイに普通に
用いられる他のラベルから選ぶことができる）をアナラ
イトと結合させて例えばR*−SAHにするか、あるいはエ
ピトープを含有する単純化された分子と結合させて例え
ば にすることができる。
識された類似体とが、抗体との結合反応に関与する場合
のアッセイに用いられる、上記の標識された類似体にも
採用できる。従って、シグナルを与える部分R*（これ
は、例えば発蛍光団、発色団、放射性ラベル、酵素的ラ
ベル、光学発光性レベル、および免疫アッセイに普通に
用いられる他のラベルから選ぶことができる）をアナラ
イトと結合させて例えばR*−SAHにするか、あるいはエ
ピトープを含有する単純化された分子と結合させて例え
ば にすることができる。
このような標識された部分は、所望により、粒子、ポ
リマー、タンパク質または他の物質と結合させうること
は、言うまでもない。
リマー、タンパク質または他の物質と結合させうること
は、言うまでもない。
標識されたフラノース６−チオエーテル類および式Ｉ
の化合物は、新規であり、本発明の更なる観点を形成す
る。
の化合物は、新規であり、本発明の更なる観点を形成す
る。
もう一つの観点からみると、本発明は、式Ｉの化合物
の製造方法を提供する。この方法は、下記の工程： （ａ）式II （式中、R1およびR2は前記定義のとおりであり、各R5は
保護された水酸基であるか、または両方のR5は一緒にな
ってアルキレンジオキシ基、例えば保護されたビスヒド
ロキシ基（例えば−OC（CH3）2O−）である）で表され
る化合物を、式III R6（CH2）3Hal （III） （式中、R6はR3基または保護されたR3基であり、Halは
ハロゲン原子、例えば臭素原子である）で表されるハロ
ゲン化プロピルと反応させ、次いで、所望により保護基
を脱離する工程； （ｂ）（R3がアミノ基である式Ｉの化合物を製造するた
めに）式IIの化合物を、アクリロニトリルと反応させ、
還元し、そして得られたシアノプロピルチオ−エーテル
生成物から保護基を脱離する工程；および （ｃ）R3がカルボキシル基である式Ｉの化合物をエステ
ル化する工程； の少なくとも１つからなる。
の製造方法を提供する。この方法は、下記の工程： （ａ）式II （式中、R1およびR2は前記定義のとおりであり、各R5は
保護された水酸基であるか、または両方のR5は一緒にな
ってアルキレンジオキシ基、例えば保護されたビスヒド
ロキシ基（例えば−OC（CH3）2O−）である）で表され
る化合物を、式III R6（CH2）3Hal （III） （式中、R6はR3基または保護されたR3基であり、Halは
ハロゲン原子、例えば臭素原子である）で表されるハロ
ゲン化プロピルと反応させ、次いで、所望により保護基
を脱離する工程； （ｂ）（R3がアミノ基である式Ｉの化合物を製造するた
めに）式IIの化合物を、アクリロニトリルと反応させ、
還元し、そして得られたシアノプロピルチオ−エーテル
生成物から保護基を脱離する工程；および （ｃ）R3がカルボキシル基である式Ｉの化合物をエステ
ル化する工程； の少なくとも１つからなる。
式IIIの出発化合物は、標準的技術により製造するこ
とができるか、あるいは文献から公知である。式IIの出
発化合物は、対応する１−ヒドロキシメチル−フラノー
スから、シス−ヒドロキシ基の保護、臭素化およびこれ
に続くチオ尿素との置換反応、および加水分解によって
製造できる。１−ヒドロキシメチル−フラノースは、普
通の水酸基保護剤、例えばアセトンとの反応により、シ
ス−ヒドロキシ基を保護することができる。
とができるか、あるいは文献から公知である。式IIの出
発化合物は、対応する１−ヒドロキシメチル−フラノー
スから、シス−ヒドロキシ基の保護、臭素化およびこれ
に続くチオ尿素との置換反応、および加水分解によって
製造できる。１−ヒドロキシメチル−フラノースは、普
通の水酸基保護剤、例えばアセトンとの反応により、シ
ス−ヒドロキシ基を保護することができる。
式Ｉの化合物の製造するための反応スキームの例とし
ては、次のスキームが挙げられる（化合物（１）および
（３）は商業的に入手できる）。
ては、次のスキームが挙げられる（化合物（１）および
（３）は商業的に入手できる）。
反応混合物中の物質（これは場合により反応混合物か
ら沈降させるか、または分離される）によるUV吸収、可
視光線吸収または蛍光は、反応の終点で（シグナルが安
定になった時に）、あるいは１つまたは２つ以上の所定
の時点で測定することができるが、その代わりに、幾つ
かの測定を異なる時点で行う動的測定法を採用すること
もできる。
ら沈降させるか、または分離される）によるUV吸収、可
視光線吸収または蛍光は、反応の終点で（シグナルが安
定になった時に）、あるいは１つまたは２つ以上の所定
の時点で測定することができるが、その代わりに、幾つ
かの測定を異なる時点で行う動的測定法を採用すること
もできる。
本発明のアッセイを実施するには、必要な試薬を反応
混合物に順次に、または同時に添加することができる。
しかしながら、多くの好ましい態様においては、１つま
たは２つ以上の反応を、後続の反応（１つまたは２つ以
上）のための試薬を添加する前に、多少の時間進行させ
ることが有利なことがある。試験サンプルをアデノシン
およびSAH−加水分解酵素と反応させる場合の一例とし
ては、ホモシステインおよびアデノシンからのSAHの形
成を、アデノシン評価操作を開始する前に、多少の時間
行うことが好ましい。
混合物に順次に、または同時に添加することができる。
しかしながら、多くの好ましい態様においては、１つま
たは２つ以上の反応を、後続の反応（１つまたは２つ以
上）のための試薬を添加する前に、多少の時間進行させ
ることが有利なことがある。試験サンプルをアデノシン
およびSAH−加水分解酵素と反応させる場合の一例とし
ては、ホモシステインおよびアデノシンからのSAHの形
成を、アデノシン評価操作を開始する前に、多少の時間
行うことが好ましい。
臨床化学分析において、検量の目的で標準曲線を使用
することは、普通に行われていることである。従って、
本発明の方法を実施するに際しては、臨床上のサンプル
の代わりに、ホモシステイン含有量が既知のサンプルを
用いて、測定すべき応答／シグナルに関する標準曲線を
作成することができ、次いで未知のサンプルのホモシス
テイン含有量を、この標準曲線から外挿により計算する
ことができる。即ち、シグナル形成分子またはレドック
ス電位を正確に定量する必要はない。
することは、普通に行われていることである。従って、
本発明の方法を実施するに際しては、臨床上のサンプル
の代わりに、ホモシステイン含有量が既知のサンプルを
用いて、測定すべき応答／シグナルに関する標準曲線を
作成することができ、次いで未知のサンプルのホモシス
テイン含有量を、この標準曲線から外挿により計算する
ことができる。即ち、シグナル形成分子またはレドック
ス電位を正確に定量する必要はない。
本発明のアッセイ方法は、体液または組織のホモシス
テイン含有量に関連するか、またはこの含有量に現れる
異常状態または異常になる可能性のある状態を診断また
はモニターするのに使用することができる。これらの例
としては、アテローム性動脈硬化症、血液病、ビタミン
欠乏症および／または先天代謝異常が挙げられる。本方
法は、医薬品、例えば抗−葉酸塩薬の効果を評価するた
めにも使用できる。
テイン含有量に関連するか、またはこの含有量に現れる
異常状態または異常になる可能性のある状態を診断また
はモニターするのに使用することができる。これらの例
としては、アテローム性動脈硬化症、血液病、ビタミン
欠乏症および／または先天代謝異常が挙げられる。本方
法は、医薬品、例えば抗−葉酸塩薬の効果を評価するた
めにも使用できる。
他の観点からみると、本発明は、所望によりキットフ
ォーマットとしての、サンプル中のホモシステインのア
ッセイに用いられる分析用製品を提供する。この分析用
製品は、ホモシステイン変換酵素；この酵素のための、
ホモシステイン以外の基質；シグナル形成剤；および所
望により、シグナルの評価手段を含んでいる。
ォーマットとしての、サンプル中のホモシステインのア
ッセイに用いられる分析用製品を提供する。この分析用
製品は、ホモシステイン変換酵素；この酵素のための、
ホモシステイン以外の基質；シグナル形成剤；および所
望により、シグナルの評価手段を含んでいる。
一つの好ましい態様において、この分析用製品は、 ホモシステイン変換酵素、例えば、Ｓ−アデノシル−
ホモシステイン加水分解酵素； この酵素のための、ホモシステイン以外の１種または
数種の基質； ホモシステインの補助基質およびホモシステインの酵
素変換生成物から選ばれるアナライトの検出可能な誘導
体；および 所望により、前記の検出可能な誘導体を分光法または
比色法で評価して、サンプルのホモシステイン含有量の
表示を与える手段を含んでいる。
ホモシステイン加水分解酵素； この酵素のための、ホモシステイン以外の１種または
数種の基質； ホモシステインの補助基質およびホモシステインの酵
素変換生成物から選ばれるアナライトの検出可能な誘導
体；および 所望により、前記の検出可能な誘導体を分光法または
比色法で評価して、サンプルのホモシステイン含有量の
表示を与える手段を含んでいる。
もう一つの態様において、分析用製品は、アデノシ
ン;S−アデノルシル−ホモシステイン加水分解酵素；ア
デノシン変換酵素；所望により、このアデノシン変換酵
素の補助基質；および前記の補助基質からの、または前
記のアデノシン変換酵素によるアデノシンの酵素変換生
成物からの、光度法で検出可能な応答を生成させる手段
を含んでいる。即ち、例えば、アデノシン変換酵素はア
デノシンキナーゼであってよく、生成手段はATP、ルシ
フェリンおよびルシフェラーゼを含みうる。あるいは、
アデノシン変換酵素はアデノシン脱アミノ酵素であって
よく、変換手段はヌクレオシドホスホリラーゼ、キサン
チン酸化酵素およびパーオキシダーゼを含みうる。
ン;S−アデノルシル−ホモシステイン加水分解酵素；ア
デノシン変換酵素；所望により、このアデノシン変換酵
素の補助基質；および前記の補助基質からの、または前
記のアデノシン変換酵素によるアデノシンの酵素変換生
成物からの、光度法で検出可能な応答を生成させる手段
を含んでいる。即ち、例えば、アデノシン変換酵素はア
デノシンキナーゼであってよく、生成手段はATP、ルシ
フェリンおよびルシフェラーゼを含みうる。あるいは、
アデノシン変換酵素はアデノシン脱アミノ酵素であって
よく、変換手段はヌクレオシドホスホリラーゼ、キサン
チン酸化酵素およびパーオキシダーゼを含みうる。
更にもう一つの観点において、本キットは、アデノシ
ン;S−アデノシル−ホモシステイン；所望によりマトリ
ックスに結合させた抗−Ｓ−アデノシン−ホモシステイ
ン抗体；この抗体のためのポリハプテン；および所望に
より、抗体：ポリハプテン複合体の凝集または沈降を光
度法で評価するための手段を含んでいる。この態様にお
いて、ポリハプテンは好都合には、例えば下記式 で表されるペンダント残基を残す複数のフラノース６−
チオエーテルが結合しているバックボーンポリマーによ
って供給することができる。
ン;S−アデノシル−ホモシステイン；所望によりマトリ
ックスに結合させた抗−Ｓ−アデノシン−ホモシステイ
ン抗体；この抗体のためのポリハプテン；および所望に
より、抗体：ポリハプテン複合体の凝集または沈降を光
度法で評価するための手段を含んでいる。この態様にお
いて、ポリハプテンは好都合には、例えば下記式 で表されるペンダント残基を残す複数のフラノース６−
チオエーテルが結合しているバックボーンポリマーによ
って供給することができる。
これらは、例えば、式Ｉのカルボン酸（あるいはその
無水物または酸ハライド）と、複数のペンダントアミン
を有するポリマー（例えばポリリジン）とを反応させる
か、あるいは式Ｉのアミンと、複数のペンダントカルボ
キシル基を有するポリマーとを反応させることによって
製造できる。
無水物または酸ハライド）と、複数のペンダントアミン
を有するポリマー（例えばポリリジン）とを反応させる
か、あるいは式Ｉのアミンと、複数のペンダントカルボ
キシル基を有するポリマーとを反応させることによって
製造できる。
本キットにおいて、全てのまたは幾つかの試薬は、反
応混合物の反応を進行させるためのフォーマット／マト
リックスであってもよいように、乾燥形態で存在するこ
とができる。同様に、本キットは、前記のように、検出
可能なアナライトまたは誘導体の評価手段として、比較
的安価な分光装置または比色装置、例えば検出可能なア
ナライトなどに特徴的な波長で光強度を検出するのに供
される光源と検出器との配置、あるいはもっと単純な比
色検量チャートを含むことができる。
応混合物の反応を進行させるためのフォーマット／マト
リックスであってもよいように、乾燥形態で存在するこ
とができる。同様に、本キットは、前記のように、検出
可能なアナライトまたは誘導体の評価手段として、比較
的安価な分光装置または比色装置、例えば検出可能なア
ナライトなどに特徴的な波長で光強度を検出するのに供
される光源と検出器との配置、あるいはもっと単純な比
色検量チャートを含むことができる。
本発明を下記の非限定的実施例により更に説明する。
実施例19のアッセイは、特に好ましい。
実施例19のアッセイは、特に好ましい。
実施例１ サンプル（検量のためのホモシステイン水溶液、臨床
アッセイのための血漿または尿）を、還元剤（例えば10
mMジチオトレイトール）によって前処理した。このサン
プルを、ウサギIgG5mg/ml、アデノシン脱アミノ酵素20m
U/ml、ヌクレオシドホスホリラーゼ20mU/ml、キサンチ
ンオキシダーゼ20mU/ml、ホースラディッシュパーオキ
シダーゼ500mU/ml、ジチオトレイトール10mmol/l、リン
酸ナトリウム100mmol/l、pH7.40に調節、およびｓ−ア
デノシル−１−ホモシステイン加水分解酵素100mUから
なる37℃の溶液に、好ましくは10-6〜10-5mol/lの範囲
のホモシステイン最終濃度となるまで加えた。同時に、
または次に、しかし好ましくは、サンプル中のアデノシ
ンを変換させるために10分間のインキュベートの後、ア
デノシンを最終濃度5.10-6mol/lとなるまで加えた。UV
吸収を10分間測定し、292nmにて動的モード（kinetic m
ode）で反応を測定し、ΔA/Δｔを計算した。
アッセイのための血漿または尿）を、還元剤（例えば10
mMジチオトレイトール）によって前処理した。このサン
プルを、ウサギIgG5mg/ml、アデノシン脱アミノ酵素20m
U/ml、ヌクレオシドホスホリラーゼ20mU/ml、キサンチ
ンオキシダーゼ20mU/ml、ホースラディッシュパーオキ
シダーゼ500mU/ml、ジチオトレイトール10mmol/l、リン
酸ナトリウム100mmol/l、pH7.40に調節、およびｓ−ア
デノシル−１−ホモシステイン加水分解酵素100mUから
なる37℃の溶液に、好ましくは10-6〜10-5mol/lの範囲
のホモシステイン最終濃度となるまで加えた。同時に、
または次に、しかし好ましくは、サンプル中のアデノシ
ンを変換させるために10分間のインキュベートの後、ア
デノシンを最終濃度5.10-6mol/lとなるまで加えた。UV
吸収を10分間測定し、292nmにて動的モード（kinetic m
ode）で反応を測定し、ΔA/Δｔを計算した。
臨床テストのためには、ホモシステイン濃度は、既知
標準試料を用いて作成した標準曲線に内挿することによ
って計算することができる。
標準試料を用いて作成した標準曲線に内挿することによ
って計算することができる。
実施例２ （実施例１についての）サンプルを、還元剤（例えば
10mMジチオトレイトール）によって前処理した。このサ
ンプルを、ウサギIgG5mol/l、アデノシン脱アミノ酵素2
0mU/ml、キサンチンオキシダーゼ20mg/ml、ヌクレオシ
ドホスホリラーゼ20mU/ml、ホースラディッシュパーオ
キシダーゼ500mU/ml、ジチオトレイトール10mmol/l、リ
ン酸ナトリウム100mmol/l、pH7.40に調節、およびｓ−
アデノシル−１−ホモシステイン加水分解酵素20mUから
なる溶液に、好ましくは10-6〜10-5mol/lの範囲のホモ
システイン最終濃度となるまで加えた。次いで、好まし
くは、サンプル中のアデノシンに転換を起させるために
10分間のインキュベートの後、ｓ−アデノシル−１−ホ
モシステインを最終濃度5.10-5mol/lとなるまで加え、U
V吸収を10分間測定した。292nmでの動的モードで、ΔA/
Δｔを計算した。
10mMジチオトレイトール）によって前処理した。このサ
ンプルを、ウサギIgG5mol/l、アデノシン脱アミノ酵素2
0mU/ml、キサンチンオキシダーゼ20mg/ml、ヌクレオシ
ドホスホリラーゼ20mU/ml、ホースラディッシュパーオ
キシダーゼ500mU/ml、ジチオトレイトール10mmol/l、リ
ン酸ナトリウム100mmol/l、pH7.40に調節、およびｓ−
アデノシル−１−ホモシステイン加水分解酵素20mUから
なる溶液に、好ましくは10-6〜10-5mol/lの範囲のホモ
システイン最終濃度となるまで加えた。次いで、好まし
くは、サンプル中のアデノシンに転換を起させるために
10分間のインキュベートの後、ｓ−アデノシル−１−ホ
モシステインを最終濃度5.10-5mol/lとなるまで加え、U
V吸収を10分間測定した。292nmでの動的モードで、ΔA/
Δｔを計算した。
臨床テストのためには、ホモシステイン濃度は、既知
標準試料を用いて作成した標準曲線に内挿することによ
って計算することができる。
標準試料を用いて作成した標準曲線に内挿することによ
って計算することができる。
実施例３ アッセイ緩衝液： 0.1Mリン酸塩緩衝液pH7.4:1mg/mlのウサギIgGおよび1
0mmol/lのチジオトレイトールを含む。
0mmol/lのチジオトレイトールを含む。
アッセイの手順： 150μｌのアッセイ緩衝液に、3mUのｓ−アデノシル−
１−ホモシステイン加水分解酵素と、サンプル（好まし
くは実施例１および２で説明されたように前処理され
た）とを加えた。アッセイ緩衝液に溶解したアデノシン
を、最終濃度2.5×10-5mol/lとなるまで加えることによ
り、酵素反応を開始した。10分間のインキュベートの
後、アデノシン脱アミノ酵素20mU、ヌクレオシドホスホ
リラーゼ20mU、キサンチンオキシダーゼ20mUおよびホー
スラディッシュパーオキシダーゼ375mUを含むアッセイ
緩衝液の溶液750μｌを加えた。292nmでのUV吸収を５分
間測定した。ΔA/Δｔを計算した。これと平行して、ｓ
−アデノシル−１−ホモシステイン加水分解酵素を加え
ることなくアッセイを再度行う。２つのΔA/Δｔ値の差
を決定し、既知標準試料を用いて作成した標準曲線に内
挿することによってホモシステイン濃度を計算する。
１−ホモシステイン加水分解酵素と、サンプル（好まし
くは実施例１および２で説明されたように前処理され
た）とを加えた。アッセイ緩衝液に溶解したアデノシン
を、最終濃度2.5×10-5mol/lとなるまで加えることによ
り、酵素反応を開始した。10分間のインキュベートの
後、アデノシン脱アミノ酵素20mU、ヌクレオシドホスホ
リラーゼ20mU、キサンチンオキシダーゼ20mUおよびホー
スラディッシュパーオキシダーゼ375mUを含むアッセイ
緩衝液の溶液750μｌを加えた。292nmでのUV吸収を５分
間測定した。ΔA/Δｔを計算した。これと平行して、ｓ
−アデノシル−１−ホモシステイン加水分解酵素を加え
ることなくアッセイを再度行う。２つのΔA/Δｔ値の差
を決定し、既知標準試料を用いて作成した標準曲線に内
挿することによってホモシステイン濃度を計算する。
実施例４ 最初のインキュベーションまで、実施例３で説明され
たように、アッセイ手順を行う。次いで、10分間のイン
キュベーションの後、フルオレセイン標識アデノシンお
よびモノクローナル抗−アデノシン抗体とを含むアッセ
イ溶液を添加する。残存するアデノシンおよびフルオレ
セイン標識アデノシンは、抗体への結合を競争する。抗
体に結合した標識アデノシンの量を、従来の蛍光偏光技
術によってアッセイし、標準曲線に内挿することによっ
てホモシステイン濃度を計算する。
たように、アッセイ手順を行う。次いで、10分間のイン
キュベーションの後、フルオレセイン標識アデノシンお
よびモノクローナル抗−アデノシン抗体とを含むアッセ
イ溶液を添加する。残存するアデノシンおよびフルオレ
セイン標識アデノシンは、抗体への結合を競争する。抗
体に結合した標識アデノシンの量を、従来の蛍光偏光技
術によってアッセイし、標準曲線に内挿することによっ
てホモシステイン濃度を計算する。
実施例５ アッセイ緩衝液： 0.1Mリン酸塩緩衝液pH7.4:1mg/mlのウサギIgGおよび1
0mmol/lのジチオトレイトールを含む。
0mmol/lのジチオトレイトールを含む。
SAH−加水分解酵素溶液： 40mU/mlのｓ−アデノシル−１−ホモシステイン加水
分解酵素をアッセイ緩衝液に溶解する。
分解酵素をアッセイ緩衝液に溶解する。
アデノシン溶液： ５×10-8mol/mlのアデノシンをアッセイ緩衝液に溶解
する。
する。
アデノシン脱アミノ酵素溶液： アッセイ緩衝液に溶解した200mU/mlのアデノシン脱ア
ミノ酵素。
ミノ酵素。
フェノール／ニトロプルシド溶液： 水中の10mg/mlのフェノールおよび50μg/mlのニトロ
プルシドナトリウム。
プルシドナトリウム。
次亜塩素酸塩溶液： 11mmol/lのNaOCIを125mM NaOHに溶解する。
アッセイ手順： 1.75μｌのアデノシン溶液および75μｌのSAH−加水分
解酵素溶液を、サンプル（好ましくは実施例１〜４で説
明された方法で前処理された）と混合し、37℃で10分間
保持する。
解酵素溶液を、サンプル（好ましくは実施例１〜４で説
明された方法で前処理された）と混合し、37℃で10分間
保持する。
2.100μｌのアデノシン脱アミノ酵素溶液を加え、混合
物を37℃で５分間保持する。
物を37℃で５分間保持する。
3.750μｌのフェノール／ニトロプルシド溶液と、750μ
ｌの次亜塩素酸塩溶液を加える。37℃で30分間保持した
後、628nmで吸光度を測定する。これと平行して、SAH−
加水分解酵素を加えないで再度アッセイを行う。２つの
628nmで吸光度値の差を決定し、この差を、既知標準試
料を用いて作成した標準曲線に内挿することによってホ
モシステイン濃度を計算する。
ｌの次亜塩素酸塩溶液を加える。37℃で30分間保持した
後、628nmで吸光度を測定する。これと平行して、SAH−
加水分解酵素を加えないで再度アッセイを行う。２つの
628nmで吸光度値の差を決定し、この差を、既知標準試
料を用いて作成した標準曲線に内挿することによってホ
モシステイン濃度を計算する。
実施例６ 蛍光団標識SAHの形成 ジメチルホルムアミド中のSAH10mmol/l溶液を調製
し、次いで100mmol/lリン酸塩緩衝液pH＝7.5で1:10に希
釈する。この溶液に、フルオレセインイソチオシアネー
トを、最終濃度1mmol/lとなるまで加える。室温で60分
間のインキュベートの後、SAH−フルオレセイン結合体
を、25mM酢酸アンモニウム（pH7.0）およびメタノール
の濃度勾配混合物を用いた260nmでのChromasil C−18カ
ラムによるHPLCで精製する。
し、次いで100mmol/lリン酸塩緩衝液pH＝7.5で1:10に希
釈する。この溶液に、フルオレセインイソチオシアネー
トを、最終濃度1mmol/lとなるまで加える。室温で60分
間のインキュベートの後、SAH−フルオレセイン結合体
を、25mM酢酸アンモニウム（pH7.0）およびメタノール
の濃度勾配混合物を用いた260nmでのChromasil C−18カ
ラムによるHPLCで精製する。
実施例７ 抗−SAH−抗体の形成 ａ）抗原の形成:125mmol/l NaClを含んだ、25mmol/lリ
ン酸塩緩衝液pH＝7.4中のSAH1mmol/l溶液に、ウシ血清
アルブミンを、最終濃度5mg/lとなるまで加える。この
混合物に、ビス（スルホスクシニミジル）スベレート
を、最終濃度1mmol/lとなるまで加え、混合物を放置し
て60分間反応させる。（この結合反応においてpHを低く
保持して、ホモシステインアミン官能基におけるより
も、アデノシルアミンにおける結合を刺激する）。溶液
のタンパク質性フラクション（BSAとSAHとの間の結合体
をも含む）を、溶離液としてリン酸塩緩衝生理食塩水を
用いたPharmacia Superose12カラムによるサイズ排除ク
ロマトグラフィーにより単離する。
ン酸塩緩衝液pH＝7.4中のSAH1mmol/l溶液に、ウシ血清
アルブミンを、最終濃度5mg/lとなるまで加える。この
混合物に、ビス（スルホスクシニミジル）スベレート
を、最終濃度1mmol/lとなるまで加え、混合物を放置し
て60分間反応させる。（この結合反応においてpHを低く
保持して、ホモシステインアミン官能基におけるより
も、アデノシルアミンにおける結合を刺激する）。溶液
のタンパク質性フラクション（BSAとSAHとの間の結合体
をも含む）を、溶離液としてリン酸塩緩衝生理食塩水を
用いたPharmacia Superose12カラムによるサイズ排除ク
ロマトグラフィーにより単離する。
ｂ）ハイブリドーマの形成： 上述の抗原を用い、James W.Goodingが“Monoclonal
antibodies:Principle and Practice",Academic Press,
ロンドン,1983,第３章で説明している手順により、ハイ
ブリドーマを形成する。
antibodies:Principle and Practice",Academic Press,
ロンドン,1983,第３章で説明している手順により、ハイ
ブリドーマを形成する。
ｃ）ハイブリドーマの選択： （ｉ）抗−SAH−抗体を産生するハイブリドーマを、以
下のようにして同定する：ハイブリドーマの上澄液のIg
G含有量を、従来のELISA技術で測定する。次いで、キュ
ベット中で、上澄液を、50mmol/lリン酸塩、120mmol/l
NaCl、pH＝7.4、および0.1mg/mlのウサギIgGからなる緩
衝液と、最終濃度が0.1μmol/lマウスIgGとなるまで混
合する。上記実施例６に従って形成されたフルオレセイ
ン標識SAHを、最終濃度0.02μmol/lとなるまで加える。
10分間のインキュベーションの後、蛍光偏光ユニットを
備えた分光蛍光光度計を用いて、偏光度を次のようにし
て測定する。
下のようにして同定する：ハイブリドーマの上澄液のIg
G含有量を、従来のELISA技術で測定する。次いで、キュ
ベット中で、上澄液を、50mmol/lリン酸塩、120mmol/l
NaCl、pH＝7.4、および0.1mg/mlのウサギIgGからなる緩
衝液と、最終濃度が0.1μmol/lマウスIgGとなるまで混
合する。上記実施例６に従って形成されたフルオレセイ
ン標識SAHを、最終濃度0.02μmol/lとなるまで加える。
10分間のインキュベーションの後、蛍光偏光ユニットを
備えた分光蛍光光度計を用いて、偏光度を次のようにし
て測定する。
Ａ＝入射光の水平偏光面が、発光のフィルトレーション
のために用いられるフィルタの偏光面と直交である場合
の蛍光強度と、 Ｂ＝入射光の水平偏向面が、発光のフィルトレーション
のために用いられるフィルタの偏向面と垂直である場合
の蛍光強度とを測定し、 かつ、494nmの励起波長を用いて517nmの発光を検出す
る。
のために用いられるフィルタの偏光面と直交である場合
の蛍光強度と、 Ｂ＝入射光の水平偏向面が、発光のフィルトレーション
のために用いられるフィルタの偏向面と垂直である場合
の蛍光強度とを測定し、 かつ、494nmの励起波長を用いて517nmの発光を検出す
る。
偏光度は、以下のように計算される。
（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ） 低い偏光度は、モノクローナルマウス抗体がSAHに結
合していないことを示す。
合していないことを示す。
（ii）（ｉ）に従って選択されたハイブリドーマから、
アデノシンおよび／またはホモシステインに対して反応
性の抗体を産生するハイブリドーマを以下のようにして
同定する：ハイブリドーマ上澄液からのモノクローナル
抗体−SAH−抗体を、下記実施例９で説明されるように
マイクロタイターウェルの表面にコートする。25mmol/l
リン酸塩、120mmol/l NaClおよび1mg/lのウサギIgGを含
むpH＝7.4の緩衝液中の炭素−14標識アデノシン（また
は炭素−14標識ホモシステイン）、Amersham Ltd、英国
から入手、をマイクロタイターウェルに加える。60分間
のインキュベートの後、同様の緩衝液（勿論アデノシン
またはホモシステインを含まない）で３回洗浄する。ウ
ェルに保持された高い放射活性は、ハイブリドーマがア
デノシン（またはホモシステイン）それ自身に結合する
抗体を産生したことを示す。これら抗体はアッセイに用
いない。
アデノシンおよび／またはホモシステインに対して反応
性の抗体を産生するハイブリドーマを以下のようにして
同定する：ハイブリドーマ上澄液からのモノクローナル
抗体−SAH−抗体を、下記実施例９で説明されるように
マイクロタイターウェルの表面にコートする。25mmol/l
リン酸塩、120mmol/l NaClおよび1mg/lのウサギIgGを含
むpH＝7.4の緩衝液中の炭素−14標識アデノシン（また
は炭素−14標識ホモシステイン）、Amersham Ltd、英国
から入手、をマイクロタイターウェルに加える。60分間
のインキュベートの後、同様の緩衝液（勿論アデノシン
またはホモシステインを含まない）で３回洗浄する。ウ
ェルに保持された高い放射活性は、ハイブリドーマがア
デノシン（またはホモシステイン）それ自身に結合する
抗体を産生したことを示す。これら抗体はアッセイに用
いない。
（iii）モノクローナルIgGの産生：上記（ｉ）に従って
SAHに結合するが、上記（ii）に従ってアデノシンまた
はホモシステインには結合しない抗体を、モノクローナ
ルIgGの産生のために選択する。選択されたハイブリド
ーマを、従来の技術に従って、マウスでの腹水の産生、
あるいは試験管内での細胞培養物の産生に用いる。更
に、モノクローナル抗体を、従来の技術に従って、腹水
または細胞培養物から単離する。James W.Gooding“Mon
oclonal antibodies:Princeple and practice",Academi
c press,London,1983を参照せよ。
SAHに結合するが、上記（ii）に従ってアデノシンまた
はホモシステインには結合しない抗体を、モノクローナ
ルIgGの産生のために選択する。選択されたハイブリド
ーマを、従来の技術に従って、マウスでの腹水の産生、
あるいは試験管内での細胞培養物の産生に用いる。更
に、モノクローナル抗体を、従来の技術に従って、腹水
または細胞培養物から単離する。James W.Gooding“Mon
oclonal antibodies:Princeple and practice",Academi
c press,London,1983を参照せよ。
実施例８ Ｌ−ホモシステインの蛍光偏光イムノアッセイ 酵素溶液:50mmol/lリン酸塩緩衝液pH＝7.4: 0.2mg/ml
のウサギIgG、120mmol/lのNacl、10mmol/lのジチオトレ
イトール、10U/lのＳ−アデノシル−１−ホモシステイ
ン−加水分解酵素および0.1mmol/lアデノシンを含む。
のウサギIgG、120mmol/lのNacl、10mmol/lのジチオトレ
イトール、10U/lのＳ−アデノシル−１−ホモシステイ
ン−加水分解酵素および0.1mmol/lアデノシンを含む。
フルオレセイン−標識SAH溶液：実施例６に従って形成
されたフルオレセイン結合SAHを、125mmol/lのNaClおよ
び0.2mg/mlのウサギIgGを含む50mmolリン酸塩緩衝液pH
＝7.4に、最終濃度１μmol/lとなるまで解する。
されたフルオレセイン結合SAHを、125mmol/lのNaClおよ
び0.2mg/mlのウサギIgGを含む50mmolリン酸塩緩衝液pH
＝7.4に、最終濃度１μmol/lとなるまで解する。
アッセイ溶液:125mmol/lのNaClおよび0.2mg/mlのウサギ
IgGを含む50mmol/lリン酸塩緩衝液pH＝7.4に、最終濃度
0.1μmol/lとなるように溶解した、例えば実施例７に従
って形成されたモノクローナル抗−SAH抗体（これはア
デノシンと反応しない、好ましくはホモシステインとも
反応しない）。
IgGを含む50mmol/lリン酸塩緩衝液pH＝7.4に、最終濃度
0.1μmol/lとなるように溶解した、例えば実施例７に従
って形成されたモノクローナル抗−SAH抗体（これはア
デノシンと反応しない、好ましくはホモシステインとも
反応しない）。
アッセイ作業：キュベット中に、15μｌの血漿（最初に
既知ホモシステイン含有量のサンプルのシリーズ）を、
100μｌの酵素溶液と混合し、37℃で15分間保持する。1
00μｌのフルオレセイン−標識SAH溶液を加え、次い
で、1.0mlの抗体溶液を加える。蛍光偏光ユニットを備
えた分光蛍光度計を用いて、上記実施例７（ｃ）（ｉ）
で説明されたように、偏光度を測定し、ホモシステイン
濃度に対してプロットする。
既知ホモシステイン含有量のサンプルのシリーズ）を、
100μｌの酵素溶液と混合し、37℃で15分間保持する。1
00μｌのフルオレセイン−標識SAH溶液を加え、次い
で、1.0mlの抗体溶液を加える。蛍光偏光ユニットを備
えた分光蛍光度計を用いて、上記実施例７（ｃ）（ｉ）
で説明されたように、偏光度を測定し、ホモシステイン
濃度に対してプロットする。
実施例６および７の標識ハプテンおよび抗体の代わり
に、実施例11および13または15のそれらを用いてアッセ
イを行うこともできる。
に、実施例11および13または15のそれらを用いてアッセ
イを行うこともできる。
実施例９ マイクロタイター酵素−結合イムノアッセイ （ａ）酵素溶液 実施例８のものを用いる。
（ｂ）パーオキシダーゼ−標識SAH溶液:0.5mgのホース
ラディッシュパーオキシダーゼを、1mlの精製水に溶解
する。0.02mmol/lの過ヨウ素酸ナトリウム溶液200μｌ
を加え、混合物を室温で20分間攪拌し、10mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液pH＝4.4に対して一晩透析する。SAHを、最終
濃度0.1mmol/lとなるまで加え、pHを6.0に調節する。こ
の溶液を室温で４時間攪拌する。水素化硼素ナトリウム
の4mg/ml溶液100μｌを、新たに調製して加え、溶液を
４℃で２時間インキュベートする。パーオキシダーゼお
よびそのSAH結合体を、Superose6（Pharmacia,スウェー
デン）のカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィー
で単離する。
ラディッシュパーオキシダーゼを、1mlの精製水に溶解
する。0.02mmol/lの過ヨウ素酸ナトリウム溶液200μｌ
を加え、混合物を室温で20分間攪拌し、10mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液pH＝4.4に対して一晩透析する。SAHを、最終
濃度0.1mmol/lとなるまで加え、pHを6.0に調節する。こ
の溶液を室温で４時間攪拌する。水素化硼素ナトリウム
の4mg/ml溶液100μｌを、新たに調製して加え、溶液を
４℃で２時間インキュベートする。パーオキシダーゼお
よびそのSAH結合体を、Superose6（Pharmacia,スウェー
デン）のカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィー
で単離する。
（ｃ）マイクロタイターウェルにコートされた抗−SAH
−抗体：マウスIgGに対して免疫されたヒツジから得た
ポリクローナルヒツジIgGを、100mmol/lホウ酸塩緩衝液
pH＝9.0に、最終濃度1mg/mlとなるまで溶解する。この
溶液300μｌを、ポリスチレンマイクロタイタープレー
トの各々のウェルに満たす。37℃で120分間のインキュ
ベートの後、ウェルをリン酸塩緩衝生理食塩水で５回洗
浄する。その後、上記実施例７に従って調製したモノク
ローナルマウスIgG抗SAH−抗体を、リン酸塩緩衝生理食
塩水に、最終濃度50μg/mlとなるまで溶解する。このモ
ノクローナルIgG溶液200μｌを、各々のウェルに加え、
37℃にて120分間インキュベートする。次いで、ウェル
を、0.1mg/mlのウサギIgGを含むリン酸塩緩衝生理食塩
水溶液で５回洗浄する。
−抗体：マウスIgGに対して免疫されたヒツジから得た
ポリクローナルヒツジIgGを、100mmol/lホウ酸塩緩衝液
pH＝9.0に、最終濃度1mg/mlとなるまで溶解する。この
溶液300μｌを、ポリスチレンマイクロタイタープレー
トの各々のウェルに満たす。37℃で120分間のインキュ
ベートの後、ウェルをリン酸塩緩衝生理食塩水で５回洗
浄する。その後、上記実施例７に従って調製したモノク
ローナルマウスIgG抗SAH−抗体を、リン酸塩緩衝生理食
塩水に、最終濃度50μg/mlとなるまで溶解する。このモ
ノクローナルIgG溶液200μｌを、各々のウェルに加え、
37℃にて120分間インキュベートする。次いで、ウェル
を、0.1mg/mlのウサギIgGを含むリン酸塩緩衝生理食塩
水溶液で５回洗浄する。
（ｄ）アッセイ作業:25μｌの血漿（最初に既知ホモシ
ステイン含有量のサンプルのシリーズ）を、50μｌの酵
素溶液と混合し、37℃にて15分間保持する。50μｌのパ
ーオキシダーゼ−標識SAH溶液を加え、次いで混合し、2
50μｌのこの混合物を、上記（ｃ）に従って製造され、
すべてpH7.4に緩衝された抗−SAH−抗体コートマイクロ
タイターウェル中に加える。37℃で60分間のインキュベ
ートの後、0.1mg/mlのウサギIgGを含むリン酸塩緩衝生
理食塩水溶液で３回洗浄する。各々のウェルに、0.015
％の過酸化水素を含む0.1mmol/lクエン酸塩緩衝液pH＝
6.0中のオルト−フェニレンジアミン1mg/ml溶液100μｌ
を加える。10〜30分後、各々のウェルの450nmでの吸光
度を測定する。吸光度をホモシステイン濃度に対してプ
ロットする。
ステイン含有量のサンプルのシリーズ）を、50μｌの酵
素溶液と混合し、37℃にて15分間保持する。50μｌのパ
ーオキシダーゼ−標識SAH溶液を加え、次いで混合し、2
50μｌのこの混合物を、上記（ｃ）に従って製造され、
すべてpH7.4に緩衝された抗−SAH−抗体コートマイクロ
タイターウェル中に加える。37℃で60分間のインキュベ
ートの後、0.1mg/mlのウサギIgGを含むリン酸塩緩衝生
理食塩水溶液で３回洗浄する。各々のウェルに、0.015
％の過酸化水素を含む0.1mmol/lクエン酸塩緩衝液pH＝
6.0中のオルト−フェニレンジアミン1mg/ml溶液100μｌ
を加える。10〜30分後、各々のウェルの450nmでの吸光
度を測定する。吸光度をホモシステイン濃度に対してプ
ロットする。
実施例10 ハプテンの製造 ３−Ｓ−（１−アンヒドロ−Ｄ−リボフラノシル）−チ
オプロピルアミン （ａ）活性化ヒドロキシ−保護メルカプタン （上記スキーム（Ｅ）の化合物（８）） １当量のメチルβ−Ｄ−リボフラノシド（上記化合物
（１）、市販されている）を、５当量のトリメチルシリ
ルメタンスルホネートおよび１当量のボロントリフルオ
ライドエーテル化物の混合物と、Jun et at.（Carb.Re
s.163:247−261（1987））の手順を用いて反応させる。
0.5当量の１−アンヒドロ−Ｄ−リボース生成物（化合
物（２））を、微粉末形態で、小分けにして、新たに蒸
留したアセトン100mlに濃硫酸6.3mlをゆっくり加えて製
造したアセトン／硫酸混合物に、アイスバス中で連続的
に攪拌しながら加える。アイスバスを除き、室温で８時
間反応を継続させる。得られた固体白色結晶塊をクロロ
ホルムに溶解し、水酸化ナトリウム溶液、希塩酸および
最後に水で洗浄し、乾燥し、次いで蒸発乾固（evaporat
in down）させて、１−アンヒドロ−Ｄ−リボース（化
合物（２））の2,3−イソプロピリデン−Ｄ−リボニッ
ク誘導体を得る。１当量のこの化合物および２当量の四
硼化炭素を、乾燥エーテルに溶解し、氷上で冷却する。
絶えず攪拌するとともに氷上で冷却しながら、２当量の
トリフェニルホスフィンをゆっくり加える。アイスバス
を除き、混合物を室温になるまで放置して反応を起こさ
せ、ホウ化水素を円滑に発生させる。反応が完了した
後、過剰の試薬を、メターノルの添加により急冷する。
硼素化誘導体（化合物（６））を、濾過および濾液の蒸
留乾固によって単離する。この硼素化誘導体に、温水に
溶解したチオ尿素（１当量）を加え、精留アルコール
（rectified spirit）で希釈する。混合物を還流し、周
期的によく震盪し、これを硼素化誘導体が溶解した後、
略30分間継続する。反応混合物を氷上で冷却し、濾過に
より固体を得、これをアルカリ水で処理して、有機相中
のヒドロキシ−保護メルカプタン（化合物（７））を製
造する。この化合物を、メタノール中のメトキシドで処
理することにより、活性化形態に変える。次いで、これ
を更に以下のように反応させる。
オプロピルアミン （ａ）活性化ヒドロキシ−保護メルカプタン （上記スキーム（Ｅ）の化合物（８）） １当量のメチルβ−Ｄ−リボフラノシド（上記化合物
（１）、市販されている）を、５当量のトリメチルシリ
ルメタンスルホネートおよび１当量のボロントリフルオ
ライドエーテル化物の混合物と、Jun et at.（Carb.Re
s.163:247−261（1987））の手順を用いて反応させる。
0.5当量の１−アンヒドロ−Ｄ−リボース生成物（化合
物（２））を、微粉末形態で、小分けにして、新たに蒸
留したアセトン100mlに濃硫酸6.3mlをゆっくり加えて製
造したアセトン／硫酸混合物に、アイスバス中で連続的
に攪拌しながら加える。アイスバスを除き、室温で８時
間反応を継続させる。得られた固体白色結晶塊をクロロ
ホルムに溶解し、水酸化ナトリウム溶液、希塩酸および
最後に水で洗浄し、乾燥し、次いで蒸発乾固（evaporat
in down）させて、１−アンヒドロ−Ｄ−リボース（化
合物（２））の2,3−イソプロピリデン−Ｄ−リボニッ
ク誘導体を得る。１当量のこの化合物および２当量の四
硼化炭素を、乾燥エーテルに溶解し、氷上で冷却する。
絶えず攪拌するとともに氷上で冷却しながら、２当量の
トリフェニルホスフィンをゆっくり加える。アイスバス
を除き、混合物を室温になるまで放置して反応を起こさ
せ、ホウ化水素を円滑に発生させる。反応が完了した
後、過剰の試薬を、メターノルの添加により急冷する。
硼素化誘導体（化合物（６））を、濾過および濾液の蒸
留乾固によって単離する。この硼素化誘導体に、温水に
溶解したチオ尿素（１当量）を加え、精留アルコール
（rectified spirit）で希釈する。混合物を還流し、周
期的によく震盪し、これを硼素化誘導体が溶解した後、
略30分間継続する。反応混合物を氷上で冷却し、濾過に
より固体を得、これをアルカリ水で処理して、有機相中
のヒドロキシ−保護メルカプタン（化合物（７））を製
造する。この化合物を、メタノール中のメトキシドで処
理することにより、活性化形態に変える。次いで、これ
を更に以下のように反応させる。
（ｂ）３−Ｓ−（１−アンヒドロ−Ｄ−リボフラノシ
ル）チオプロピルアミン １当量の新たに調製された実施例10（ａ）の化合物
（化合物（８））を、１当量のアクリロニトリと反応さ
せて、チオエーテル（化合物（９））を得る。次いで、
これを乾燥エーテル中のLiAlH4で処理して還元し、遊離
の非保護アミン（化合物（10））を、塩酸水溶液で処理
して単離する。
ル）チオプロピルアミン １当量の新たに調製された実施例10（ａ）の化合物
（化合物（８））を、１当量のアクリロニトリと反応さ
せて、チオエーテル（化合物（９））を得る。次いで、
これを乾燥エーテル中のLiAlH4で処理して還元し、遊離
の非保護アミン（化合物（10））を、塩酸水溶液で処理
して単離する。
R1およびR2が水素以外の対応するアミノプロピルチオ
エーテルは、同様にして、例えば市販の化合物（１）お
よび（３）を出発原料として用いて製造される。
エーテルは、同様にして、例えば市販の化合物（１）お
よび（３）を出発原料として用いて製造される。
実施例11 ハプテンの標識 ジメチルホルムアミド（DMF）中の実施例10の化合物5
0mmol/lの溶液を、0.1mM重炭酸塩溶液（pH9.2）中で1:5
（体積）に希釈する。この溶液に、フルオレセインイソ
チオシアネートを、最終濃度12mmol/lとなるまで加え
る。室温で60分間のインキュンベートの後、実施例10の
化合物のフルオレセイン結合体を、20mM酢酸アンモニウ
ム（pH7.0）およびメタノールの濃度勾配混合物を用い
たKromasil 100Å c−18カラムによるRPCで精製する。
0mmol/lの溶液を、0.1mM重炭酸塩溶液（pH9.2）中で1:5
（体積）に希釈する。この溶液に、フルオレセインイソ
チオシアネートを、最終濃度12mmol/lとなるまで加え
る。室温で60分間のインキュンベートの後、実施例10の
化合物のフルオレセイン結合体を、20mM酢酸アンモニウ
ム（pH7.0）およびメタノールの濃度勾配混合物を用い
たKromasil 100Å c−18カラムによるRPCで精製する。
実施例12 抗原の調製 50mmol/lリン酸塩、125mmol/l NaCl（pH7.4）緩衝液
中の実施例10の化合物1mmol/lの溶液に、ウシ血清アル
ブミン（BSA）を、最終濃度5mg/lとなるまで加える。こ
の混合物に、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレー
トを、最終濃度1.2mmol/lとなるまで加え、混合物を放
置して60分間反応させる。タンパク質性フラクション
（これはハプテン−BSA結合体を含む）を、溶離液とし
てリン酸塩緩衝生理食塩水を用いたPharmacia Superose
12カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーにより単
離する。
中の実施例10の化合物1mmol/lの溶液に、ウシ血清アル
ブミン（BSA）を、最終濃度5mg/lとなるまで加える。こ
の混合物に、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレー
トを、最終濃度1.2mmol/lとなるまで加え、混合物を放
置して60分間反応させる。タンパク質性フラクション
（これはハプテン−BSA結合体を含む）を、溶離液とし
てリン酸塩緩衝生理食塩水を用いたPharmacia Superose
12カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーにより単
離する。
実施例13 抗体の調製 実施例12の抗原を用いて、上記実施例７と同様にして
実施例10の化合物の抗体を調製する。好ましいのはホモ
システインと反応する抗体であるので、SAHと反応しな
い抗体およびアデノシンと反応する抗体は、除かれる。
実施例10の化合物の抗体を調製する。好ましいのはホモ
システインと反応する抗体であるので、SAHと反応しな
い抗体およびアデノシンと反応する抗体は、除かれる。
実施例14 ハプテンの製造 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル３−Ｓ−（１−アンヒ
ドロ−Ｄ−リボフラノシル）チオブタノエート １当量の新たに調製された実施例10（ａ）の化合物
を、１当量の４−ブロモ酪酸エチルと反応させて、エス
テル化合物（11）を得る。これをジオキサン中で、水酸
化ナトリウム水溶液を用いた塩基性加水分解によって遊
離酸に加水分解し、塩酸水溶液を用いた処理によって保
護基を脱離させて、保護されていない遊離酸（化合物
（12））を得る。１当量のこの化合物を、氷冷ジメチル
ホルムアミド中の２当量のＮ−ヒドロキシクスシンイミ
ドと混合し、これに1.2当量のジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを、絶えず攪拌しながら加える。この反応を室
温で18時間継続させた後、混合物を冷却し、氷冷エーテ
ルを加える。沈澱したNHS−エステル（化合物（13））
をDMF/エーテルから再結晶し、乾燥し、次いで乾燥剤上
にて４℃で貯蔵する。
ドロ−Ｄ−リボフラノシル）チオブタノエート １当量の新たに調製された実施例10（ａ）の化合物
を、１当量の４−ブロモ酪酸エチルと反応させて、エス
テル化合物（11）を得る。これをジオキサン中で、水酸
化ナトリウム水溶液を用いた塩基性加水分解によって遊
離酸に加水分解し、塩酸水溶液を用いた処理によって保
護基を脱離させて、保護されていない遊離酸（化合物
（12））を得る。１当量のこの化合物を、氷冷ジメチル
ホルムアミド中の２当量のＮ−ヒドロキシクスシンイミ
ドと混合し、これに1.2当量のジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを、絶えず攪拌しながら加える。この反応を室
温で18時間継続させた後、混合物を冷却し、氷冷エーテ
ルを加える。沈澱したNHS−エステル（化合物（13））
をDMF/エーテルから再結晶し、乾燥し、次いで乾燥剤上
にて４℃で貯蔵する。
R1およびR2が水素以外の対応するNHS−エステルは、
同様にして、例えば市販の化合物（１）および（３）を
出発原料として用いて製造される。
同様にして、例えば市販の化合物（１）および（３）を
出発原料として用いて製造される。
実施例15: ハプテンの標識 DMF中の実施例14の化合物50mmol/l溶液を、0.1M重炭
酸塩緩衝液（pH9.2）中で1:5（容量）に希釈する。この
溶液に、５−アミノアセタミド−フルオレセイン（フル
オレセイニルグリシンアミド）を最終濃度が12mol/lに
なるように加える。常温で60分間インキュベートした
後、３−Ｓ−（１−アンヒドロ−Ｄ−リボフラノシル）
チオブタン酸のフルオレセイン結合体を、Kromasil 100
Å,C−18カラムおよび20mM酢酸アンモニウム（pH7.0）
とメタノールとの濃度勾配混合物を用いるRPCにより精
製する。
酸塩緩衝液（pH9.2）中で1:5（容量）に希釈する。この
溶液に、５−アミノアセタミド−フルオレセイン（フル
オレセイニルグリシンアミド）を最終濃度が12mol/lに
なるように加える。常温で60分間インキュベートした
後、３−Ｓ−（１−アンヒドロ−Ｄ−リボフラノシル）
チオブタン酸のフルオレセイン結合体を、Kromasil 100
Å,C−18カラムおよび20mM酢酸アンモニウム（pH7.0）
とメタノールとの濃度勾配混合物を用いるRPCにより精
製する。
実施例16 抗原の製造 BSAの溶液（50mmol/lリン酸塩、125mmol/l NaCl（pH
7.4）緩衝液中、5mg/lに、実施例14の化合物を最終濃度
が1mmol/lになるように加える。この混合物を60分間反
応させ、BSA−ハプテン結合体を含有しているタンパク
質性フラクションを、Pharmacia Superose12カラム、溶
離剤としてのリン酸塩緩衝塩水を用いるサイズ排除クロ
マトグラフィーにより単離する。
7.4）緩衝液中、5mg/lに、実施例14の化合物を最終濃度
が1mmol/lになるように加える。この混合物を60分間反
応させ、BSA−ハプテン結合体を含有しているタンパク
質性フラクションを、Pharmacia Superose12カラム、溶
離剤としてのリン酸塩緩衝塩水を用いるサイズ排除クロ
マトグラフィーにより単離する。
実施例17 抗体の製造 前記の実施例７と同様にして、実施例12の抗原を用い
て、実施例14の化合物に対する抗体を製造する。SAHと
反応しない抗体およびアデノシンと反応する抗体は、ホ
モシステインと反応する抗体であるので、除くことが好
ましい。
て、実施例14の化合物に対する抗体を製造する。SAHと
反応しない抗体およびアデノシンと反応する抗体は、ホ
モシステインと反応する抗体であるので、除くことが好
ましい。
実施例18 蛍光偏光免疫アッセイ 酵素溶液： 4mg/mlのカゼインを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液
（pH7.4）、120mmol/l NaClおよび10U/l S−アデノシル
−Ｌ−ホモシステイン−加水分解酵素。
（pH7.4）、120mmol/l NaClおよび10U/l S−アデノシル
−Ｌ−ホモシステイン−加水分解酵素。
ジチオトレイトール（DTT）−溶液： ジチオトレイトールを水に溶解して、50mmol/lの濃度
となし、HClでpHを3.0に調整する。
となし、HClでpHを3.0に調整する。
アデノシン−溶液： 50mmol/lリン酸塩緩衝液（pH7.4）中の1.8mmol/lアデ
ノシン。
ノシン。
フルオレセイン−標識SAH溶液： 実施例６により調製した、フルオレセインに結合され
たSAHを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液（pH7.4）。
たSAHを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液（pH7.4）。
抗体溶液： 120mmol/l NaClおよび1mg/mlカゼインを含有する50mm
ol/lリン酸塩緩衝液（pH7.4）に、最終濃度0.1μmol/l
になるように溶解したモノクローナル抗−SAH抗体（例
えば実施例７による）。
ol/lリン酸塩緩衝液（pH7.4）に、最終濃度0.1μmol/l
になるように溶解したモノクローナル抗−SAH抗体（例
えば実施例７による）。
アッセイの実施： 工程1: キュベット中で、15μ１のサンプル、10μｌの酵素溶
液10μｌのアデノシン−溶液を、10μｌの酸性DTT−溶
液と混合し、37℃で15分間保持する。
液10μｌのアデノシン−溶液を、10μｌの酸性DTT−溶
液と混合し、37℃で15分間保持する。
工程2: このキュベットに、100μｌのフルオレセイン−標識S
AH溶液および1.0mlの抗体溶液を加える。蛍光偏光ユニ
ットを備えた分光蛍光計を用いて、前記の実施例７
（ｃ）（ｉ）に記載されたようにして偏光度を測定し、
ホモシステイン濃度に対してプロットする。
AH溶液および1.0mlの抗体溶液を加える。蛍光偏光ユニ
ットを備えた分光蛍光計を用いて、前記の実施例７
（ｃ）（ｉ）に記載されたようにして偏光度を測定し、
ホモシステイン濃度に対してプロットする。
実施例19 蛍光偏光免疫アッセイ 酵素溶液： 1mg/mlのカゼインを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液
（pH7.4）、12mmol/l NaClおよび10U/l S−アデノシル
−Ｌ−ホモシステイン−加水分解酵素。
（pH7.4）、12mmol/l NaClおよび10U/l S−アデノシル
−Ｌ−ホモシステイン−加水分解酵素。
ジチオトレイトール（DTT）−溶液： ジチオトレイトールを水に溶解して、50mmol/lの濃度
となし、HClでpHを3.0に調整する。
となし、HClでpHを3.0に調整する。
フルオレセイン−標識SAH溶液／アデノシン−溶液： 実施例６により調製した、フルオレセインに結合され
たSAH10μmol/lを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液（pH
7.4）および1.8mmol/lアデノシン。
たSAH10μmol/lを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液（pH
7.4）および1.8mmol/lアデノシン。
抗体溶液： 120mmol/l NaClおよび1mg/mlカゼインを含有する50mm
ol/lリン酸塩緩衝液（pH7.4）に、最終濃度0.1μmol/l
になるように溶解したモノクローナル抗−SAH抗体（例
えば実施例７による）。
ol/lリン酸塩緩衝液（pH7.4）に、最終濃度0.1μmol/l
になるように溶解したモノクローナル抗−SAH抗体（例
えば実施例７による）。
アッセイの実施： キュベット中で、10μｌの血漿、100μｌの酵素溶液
および10μｌの標識されたSAH/アデノシン−溶液を、30
μｌの酸性DTT−溶液と混合し、37℃で15分間保持す
る。
および10μｌの標識されたSAH/アデノシン−溶液を、30
μｌの酸性DTT−溶液と混合し、37℃で15分間保持す
る。
インキュベートした後、1.0mlの抗体溶液を加える。
蛍光偏光ユニットを備えた分光蛍光計を用いて、前記の
実施例７（ｃ）（ｉ）に記載されたようにして偏光度を
測定し、ホモシステイン濃度に対してプロットする。
蛍光偏光ユニットを備えた分光蛍光計を用いて、前記の
実施例７（ｃ）（ｉ）に記載されたようにして偏光度を
測定し、ホモシステイン濃度に対してプロットする。
実施例18および19のアッセイは、実施例11および13、
または15および17の標識されたハプテンと抗体とを、実
施例６および７のそれらの代わりに用いて行うこともで
きる。
または15および17の標識されたハプテンと抗体とを、実
施例６および７のそれらの代わりに用いて行うこともで
きる。
実施例20 発光アッセイ アッセイ緩衝液I: 1mg/mlのカゼインを含有する50mM Pipes−緩衝液（pH
6.6）、10mM DTT、0.5mM MgCl2および30mM KCl。
6.6）、10mM DTT、0.5mM MgCl2および30mM KCl。
アッセイ緩衝液II: 40mM Hepes−緩衝液（pH7.75）、4mmol/l EDTA、20mM
塩化マグネシウムおよび0.36mmol/l DTT。
塩化マグネシウムおよび0.36mmol/l DTT。
アッセイ緩衝液III: 1.6μg/mlのルシフェラーゼ（ホタル:Photinus pyral
isから）を含有する40mM Hepes−緩衝液（pH7.75）、70
0μmol/l D−ルシフェリン、20mmol/l塩化マグネシウ
ム、4mmol/l EDTA、0.36mmol/l DTTおよび0.3mmol/l AM
P。
isから）を含有する40mM Hepes−緩衝液（pH7.75）、70
0μmol/l D−ルシフェリン、20mmol/l塩化マグネシウ
ム、4mmol/l EDTA、0.36mmol/l DTTおよび0.3mmol/l AM
P。
アッセイ操作： 130μｌのアッセイ緩衝液Ｉに、3UのＳ−アデノシル
−１−ホモシステイン加水分解酵素を加え、この混合物
に20μｌのサンプルを加え、37℃で15分間インキュベー
トする。次いでアッセイ緩衝液Ｉに溶解したアデノシン
を、最終濃度が５×10-6mol/lとなるように加える。37
℃で５分間インキュベートした後、0.7×10-5mol/lのAT
Pを含むアッセイ緩衝液I 750μｌおよびアデノシンキナ
ーゼ1mUを加え、得られた溶液を更に37℃で５分間イン
キュベートする。この溶液を、アッセイ緩衝液IIで1:10
0（容量）に希釈し、この希釈溶液500μｌを、直ちにア
ッセイ緩衝液III500μｌに加える。アッセイ緩衝液IIお
よびIIIの両方は、常温（21℃）に平衡化した。生じた
発光を光度計において500nmで読み取る。
−１−ホモシステイン加水分解酵素を加え、この混合物
に20μｌのサンプルを加え、37℃で15分間インキュベー
トする。次いでアッセイ緩衝液Ｉに溶解したアデノシン
を、最終濃度が５×10-6mol/lとなるように加える。37
℃で５分間インキュベートした後、0.7×10-5mol/lのAT
Pを含むアッセイ緩衝液I 750μｌおよびアデノシンキナ
ーゼ1mUを加え、得られた溶液を更に37℃で５分間イン
キュベートする。この溶液を、アッセイ緩衝液IIで1:10
0（容量）に希釈し、この希釈溶液500μｌを、直ちにア
ッセイ緩衝液III500μｌに加える。アッセイ緩衝液IIお
よびIIIの両方は、常温（21℃）に平衡化した。生じた
発光を光度計において500nmで読み取る。
これと平行して、Ｓ−アデノシル−ホモシステイン加
水分解酵素を存在していないアッセイを行う。臨床試験
のためには、ホモシステイン濃度は、Ｓ−アデノシル−
１−ホモシステイン加水分解酵素が存在した場合に生じ
た発光と、この酵素が存在しない場合に生じた発光との
差を、標準曲線に外挿することにより計算できる。
水分解酵素を存在していないアッセイを行う。臨床試験
のためには、ホモシステイン濃度は、Ｓ−アデノシル−
１−ホモシステイン加水分解酵素が存在した場合に生じ
た発光と、この酵素が存在しない場合に生じた発光との
差を、標準曲線に外挿することにより計算できる。
実施例21 ポリクローナル抗体の製造 実施例12および16の抗原に対するウサギポリクローナ
ル抗体を、Dako Corporation,Copenhagen,Denmarkによ
り出されたプロトコールに従って産生させる。集めた抗
血清から、同じプロトコールに従ってポリクローナルIg
Gを精製する。ポリクローナル抗体は、これらの抗体
を、アデノシンとホモシステイン残基とが固定化された
Recti−ゲルカラムに通すことにより（pierce Chemical
Company,Belfiumから提供されたゲルおよびプロトコー
ル）、アデノシンおよびホモシステイン残基と反応する
抗体からその場で精製される。SAHと反応しない抗体
も、除かれる。選ばれた抗体は、前記の実施例のアッセ
イに使用することができる。
ル抗体を、Dako Corporation,Copenhagen,Denmarkによ
り出されたプロトコールに従って産生させる。集めた抗
血清から、同じプロトコールに従ってポリクローナルIg
Gを精製する。ポリクローナル抗体は、これらの抗体
を、アデノシンとホモシステイン残基とが固定化された
Recti−ゲルカラムに通すことにより（pierce Chemical
Company,Belfiumから提供されたゲルおよびプロトコー
ル）、アデノシンおよびホモシステイン残基と反応する
抗体からその場で精製される。SAHと反応しない抗体
も、除かれる。選ばれた抗体は、前記の実施例のアッセ
イに使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４５ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４５Ｔ ５４５Ｓ (31)優先権主張番号 ９２０４９２２．０ (32)優先日 1992年３月６日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/34 C12Q 1/48 C12Q 1/66 G01N 33/53 G01N 33/543 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (38)
- 【請求項１】サンプルを、ホモシステイン変換酵素およ
び該酵素のための、ホモシステイン以外の少なくとも１
つの基質と接触させる工程、および、クロマトグラフィ
ーで分離することなく、ホモシステイン補助基質と、該
酵素によるホモシステインの酵素変換によるホモシステ
イン変換生成物と、から選択される標識されていないア
ナライトを評価する工程を含むことを特徴とする、サン
プル中のホモシステインをアッセイする方法。 - 【請求項２】前記サンプルを、前記アナライトに対する
抗体および前記標識されていないアナライト以外の、前
記抗体に対するハプテンと接触させ、該アナライトの評
価を、該抗体に結合しているハプテンまたは結合してい
ないハプテンの何れかの評価により、間接的に行うこと
を特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記ハプテンが、ポリハプテンであること
を特徴とする、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】前記ハプテンが、前記標識されていないア
ナライト中にも存在しているエピトープ構造単位を有す
る標識された分子であることを特徴とする、請求項２に
記載の方法。 - 【請求項５】前記抗体が、モノクローナル抗体であるこ
とを特徴とする、請求項２〜４の何れかに記載の方法。 - 【請求項６】前記抗体が、担体マトリクスに結合した抗
体であることを特徴とする、請求項２〜５の何れかに記
載の方法。 - 【請求項７】前記サンプルを、前記アナライトを転換す
るのに役立つ第２酵素と接触させ、該アナライトの評価
を、該アナライト以外の該第２酵素の基質または該第２
酵素による該アナライトの酵素変換による生成物の何れ
かの評価により、間接的に行うことを特徴とする、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項８】前記アナライトが、前記補助基質の１つで
あることを特徴とする、請求項１〜７の何れかに記載の
方法。 - 【請求項９】前記酵素が、Ｓ−アデノシル−ホモシステ
イン加水分解酵素であり、前記アナライトが、アデノシ
ンであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】前記サンプルを、さらに前記ホモシステ
イン変換酵素以外のアデノシン変換酵素と接触させ、前
記アナライトがアデノシンであり、アデノシンの評価
を、補助基質の評価、または該アデノシン変換酵素によ
るアデノシン変換の反応生成物の評価により間接的に行
うことを特徴とする、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】前記アデノシン変換酵素が、アデノシン
キナーゼであることを特徴とする、請求項10に記載の方
法。 - 【請求項１２】前記アデノシン変換酵素が、アデノシン
脱アミノ酵素であることを特徴とする、請求項10に記載
の方法。 - 【請求項１３】前記アナライトが、前記変換生成物の１
つであることを特徴とする、請求項１〜７の何れかに記
載の方法。 - 【請求項１４】前記酵素が、Ｓ−アデノシル−ホモシス
テイン加水分解酵素でり、前記アナライトが、Ｓ−アデ
ノシリ−ホモシステインであることを特徴とする、請求
項13に記載の方法。 - 【請求項１５】前記サンプルが、ジスルフィド結合開裂
還元剤により前処理された血液、血漿または尿のサンプ
ルであることを特徴とする、請求項１〜14の何れかに記
載の方法。 - 【請求項１６】前記アナライトの評価を、光学測定法で
行うことを特徴とする、請求項１〜15の何れかに記載の
方法。 - 【請求項１７】前記評価を、分光測定法または比色測定
法で行うことを特徴とする、請求項16に記載の方法。 - 【請求項１８】前記評価を、濁度測定または比濁測定で
行うことを特徴とする、請求項16に記載の方法。 - 【請求項１９】前記評価を、蛍光偏光検知で行うことを
特徴とする、請求項16に記載の方法。 - 【請求項２０】前記アナライトの評価を、標識されたＳ
−アデノシル−ホモシステイン上、または標識されたフ
ラノース６−チオエーテル上の、発色団または発蛍光団
の検出により、間接的に行うことを特徴とする、請求項
１〜７、13〜17および19の何れかに記載の方法。 - 【請求項２１】血液、血漿または尿のサンプルを還元剤
で処理し；該サンプルを、アデノシンおよびＳ−アデノ
シル−ホモシステイン加水分解酵素と接触させ；生成し
た混合物をインキュベートし、次いでATPおよびアデノ
シンキナーゼと接触させ、この混合物を少なくとも１分
間インキュベートし；生成した混合物を、ルシフェリン
およびルシフェラーゼと接触させ、発光を検出すること
を特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２２】血液、血漿または尿のサンプルを還元剤
で処理し；該サンプルを、アデノシンおよびＳ−アデノ
シル−ホモシステイン加水分解酵素と接触させ；生成し
た混合物をインキュベートし、次いでアデノシン脱アミ
ノ酵素、ヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチン酸化
酵素およびパーオキシダーゼと接触させ、この混合物の
UV吸収を評価することを特徴とする、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項２３】前記サンプルを、アデノシンおよびＳ−
アデノシル−ホモシステイン加水分解酵素と接触させ；
生成した混合物をインキュベートし、次いで発蛍光団で
標識されたＳ−アデノシル−ホモシステインまたは発蛍
光団で標識されたフラノース６−チオエーテルと接触さ
せ；生成した混合物を、モノクローナル抗−Ｓ−アデノ
シル−ホモシステイン抗体と接触させ；抗体と結合した
発蛍光団標識化合物または抗体と結合しなかった発蛍光
団標識化合物を、蛍光偏光により評価し、これにより、
サンプルの初期ホモシステインレベルの示指を得ること
を特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２４】前記サンプルを、アデノシンおよびＳ−
アデノシル−ホモシステイン加水分解酵素と接触させ；
生成した混合物をインキュベートし、次いで標識された
Ｓ−アデノシル−ホモシステインまたは標識されたフラ
ノース６−チオエーテルと接触させ；生成した混合物
を、担体マトリクスに結合したモノクローナル抗−Ｓ−
アデノシル−ホモシステイン抗体と接触させ；抗体担体
マトリクスを洗浄し；抗体と結合した標識化合物を光学
的に評価し、これにより、サンプルの初期ホモシステイ
ンレベルの示指を得ることを特徴とする、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項２５】前記抗体と結合した標識された化合物の
標識を反応させて、光学的に評価される発色団を発生さ
せることを特徴とする、請求項24に記載の方法。 - 【請求項２６】評価を、抗体：ポリハプテン結合体の沈
降または凝集の評価により行うことを特徴とする、請求
項３に記載の方法。 - 【請求項２７】ホモシステイン変換酵素；この酵素によ
り触媒されるホモシステイン変換反応のための、ホモシ
ステイン以外の基質；シグナル形成剤；および所望によ
り、シグナルの評価手段を含むことを特徴とする、請求
項１に記載の方法によるサンプル中のホモシステインの
アッセイに用いられる分析用キット。 - 【請求項２８】前記ホモシステイン変換酵素として、Ｓ
−アデノシル−ホモシステイン加水分解酵素；前記酵素
のためのシグナル形成基質として、標識されたＳ−アデ
ノシル−ホモシステイン；所望により担体マトリックス
に結合された抗−Ｓ−アデノシル−ホモシステイン抗
体；および所望により、前記シグナル検出手段として、
前記標識されたＳ−アデノシル−ホモシステインまたは
その検出可能な誘導体を光学測定法で評価することによ
り、サンプルのホモシステイン含有量を与える手段を含
むことを特徴とする、請求項27に記載のキット。 - 【請求項２９】前記ホモシステイン変換酵素として、Ｓ
−アデノシル−ホモシステイン加水分解酵素；前記酵素
のための基質として、アデノシン;S−アデノシル−ホモ
システイン加水分解酵素以外のアデノシン変換酵素；所
望により、前記アデノシン変換酵素のためのアデノシン
補助基質；および前記シグナル検出手段として、前記補
助基質から、または前記アデノシン変換酵素によるアデ
ノシンの酵素変換生成物から、光学測定法で検出可能な
応答を生じさせる手段を含むことを特徴とする、請求項
27に記載のキット。 - 【請求項３０】前記アデノシン変換酵素が、アデノシン
キナーゼであり、前記生成手段が、ATP、ルシフェリン
およびルシフェラーゼを含むことを特徴とする、請求項
29に記載のキット。 - 【請求項３１】前記アデノシン変換酵素が、アデノシン
脱アミノ酵素であり、前記生成手段が、ヌクレオシドホ
スホリラーゼ、キサンチン酸化酵素およびパーオキシダ
ーゼを含むことを特徴とする、請求項29に記載のキッ
ト。 - 【請求項３２】前記ホモシステイン変換酵素として、Ｓ
−アデノシル−ホモシステイン加水分解酵素；前記酵素
のための基質として、アデノシン；所望によりマトリッ
クス粒子に結合された抗−Ｓ−アデノシル−ホモシステ
イン抗体；前記抗体のためのポリハプテン；および所望
により、前記シグナル検出手段として、抗体；ポリハプ
テン複合体の凝集または沈降を光学測定法で評価する手
段を含むことを特徴とする、請求項27に記載のキット。 - 【請求項３３】前記ハプテンとして、下記式（Ｉ） （式中、R1およびR2は同一でも異なっていてもよく、水
素原子またはOR4基を意味するか、あるいはR1とR2は一
緒になって酸素原子を意味し、R3はアミノ基またはカル
ボキシル基を意味し、R4はC1-6脂肪族基を意味する）で
表される化合物、あるいはその塩またはエステルが用い
られることを特徴とする、請求項２に記載の方法。 - 【請求項３４】前記ハプテンとして、標識されたフラノ
ース６−チオエーテルが用いられ、その標識された部分
が発色団または発蛍光団または放射性原子を含み、チオ
エーテル部分がトリメチレンチオ部分を含むことを特徴
とする、請求項４に記載の方法。 - 【請求項３５】前記標識されたチオエーテルとして、請
求項33で定義された式Ｉの標識された化合物が用いられ
ることを特徴とする、請求項34に記載の方法。 - 【請求項３６】前記酵素として、還元剤との接触によっ
て活性化される不活性化SAH−加水分解酵素が用いられ
ることを特徴とする、請求項９に記載の方法。 - 【請求項３７】第１区画内の不活性SAH−加水分解酵素
と、第２区画内の還元剤とを含み、前記第１および第２
区画の内容物の混合に際して、活性化SAH−加水分解酵
素が生成されることを特徴とする、請求項27に記載のキ
ット。 - 【請求項３８】前記第２区画が、酸性媒質中のジチオス
レイトールを含むことを特徴とする、請求項37に記載の
キット。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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