JP4319545B2 - 総システインアッセイ - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条に基づいて、2001年11月20日出願の仮出願60/333532のて優先権を主張する。仮出願の内容は、参考として本明細書に含めるものとする。
本発明は、血液もしくは血漿中の総システインの酵素アッセイに関する。
血漿中の総システイン含量（tCys）は心臓血管疾患の危険度を判断するのに重要なパラメーターであることが明らかになった。危険度の低い心臓血管疾患では、tCysレベルは250-275μMであるのに対して、高危険度は低レベル（<225μM）および高レベル（>300μM）の両方に関連づけられることが報告されている。El-Khairyrら、Circulation (2001) 2544-2549。システイン同族体、ホモシステインのレベル（tHcy）も静脈血栓症の危険度と関連性があり、ホモシステインが高レベルな場合、心筋梗塞が増加する。Marcucciら、M. J. Clin. Pathol. (2001) 116:56-60。システインはアルブミンとともに循環においてホモシステインの共有結合性担体であり、またシステインは細胞取り込みに関してホモシステインの競合物であり、もちろん硫黄転移経路によるホモシステイン代謝物でもあるため、システインおよびホモシステインのレベルは相互に関連していると思われる。Hortinら、J. Clin. Chem. (2001) 47:1121-1124。
硫黄転移経路の欠損のためにホモシステインレベルの高い個体は、総システインレベルが低いことも知られている。人工の1パーセントに原因酵素の欠損があると推断される；同型接合欠損の結果、ホモシステイン尿症となる。tCys/tHcy比は、同型接合体の識別を助けるであろう。Boddieら、Metabolism (1998) 47:207-211。
さらに、総システインレベルは、年齢、総コレステロール濃度、拡張期血圧およびコーヒー消費量と相関するが、ホモシステインレベルとは異なり、喫煙状況、葉酸およびビタミン摂取量、心拍数、ならびに身体活動度とは相関しない。El-Khairyら、Am. J. Clin. Nutr. (1999) 70:1016-1024。tCysおよびtHcyはいずれも腎不全と関連している。Mansoorら、Clin. Chem. (1993) 39:980-985。
総ホモシステインを酵素的に測定する方法はたとえば、2002年10月22日発行の米国特許第6,468,762号、ならびに米国特許第6,066,467号; 第5,998,191号; および第5,985,540号にも記載されており、その開示は、参考として本明細書に含めるものとする。
総システインを測定する別法は、上記の米国特許第6,468,762号にも記載されるが、ここにおいて、アッセイすべき試料は非特異的デスルフラーゼで処理される。システインを直接測定するために、S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（SAHH）およびアデノシンを、非特異的デスルフラーゼを含有する試料に添加するが、ここでSAHHは試料中の全ホモシステインのSAHへの変換を触媒するのに十分な量存在するので、ホモシステインをデスルフラーゼの作用から保護する。したがって、試料中のシステインレベルのみが測定される。
本発明は、既存のものに代わる、酵素に基づく総システインアッセイを与える。2つのアッセイがいずれも利用可能であることによって、総ホモシステインおよび総システインのそれぞれの測定が可能となるのみならず、tCys/tHcy比の測定も可能になる。
本発明は、総ホモシステイン、ならびにホモシステインおよびシステインの濃度の和、の双方を同時に定量する、もしくは別に対照定量することによる、生物学的液体、望ましくは血漿中の総システインの定量に関する。一方の反応容器内で、ホモシステインおよびシステインのいずれにも反応性であってアンモニア、硫化水素、および対応するα-ケトカルボン酸（α-ケトグルタル酸もしくはピルビン酸）を生成する酵素を、さらにもう１つの反応容器内で、ホモシステインのみと上記デスルフラーゼ（リアーゼ）反応を行う酵素を利用して、濃度差から総システインレベルを決定することができる。結果は血漿中2μM〜1,000μMの範囲では直線的である。
したがって、ある態様において、本発明は、生物学的液体における総システイン濃度(tCys)を測定する方法に関するが、ここでこの方法は下記を含んでなる：
a)前記液体の第1の試料を、ホモシステインおよびシステインの両方を基質として利用するデスルフラーゼで処理し、前記デスルフラーゼの少なくとも１つの生成物のレベルを測定してシステイン（tCys）およびホモシステイン（tHcy）の濃度の和を決定すること；
b)前記液体の第2の試料を、ホモシステインを特異的に基質として利用するデスルフラーゼで処理し、少なくとも１つの生成物のレベルを測定してホモシステインの総濃度（tHcy）を決定すること、および
c)ステップb)で得られたtHcyをステップa)で得られたtCysプラスtHcyから差し引いて、総システイン濃度を得ること。
a)前記液体の第1の試料を、ホモシステインおよびシステインの両方を基質として利用するデスルフラーゼで処理し、前記デスルフラーゼの少なくとも１つの生成物のレベルを測定してシステイン（tCys）およびホモシステイン（tHcy）の濃度の和を決定すること；
b)前記液体の第2の試料を、ホモシステインを特異的に基質として利用するデスルフラーゼで処理し、少なくとも１つの生成物のレベルを測定してホモシステインの総濃度（tHcy）を決定すること、および
c)ステップb)で得られたtHcyをステップa)で得られたtCysプラスtHcyから差し引いて、総システイン濃度を得ること。
別の態様において、本発明は、総システイン濃度を定量するためのキットに関するが、ここでこのキットは、適当な容器内に、アッセイを実施するための使用説明書とともに、システインおよびホモシステインの両者を基質として利用するデスルフラーゼ、ホモシステインを特異的に基質として利用するデスルフラーゼ、および状況に応じて、ジスルフィド結合を還元するために有効な還元剤、および状況に応じて、少なくとも１つの生成物を検出するための試薬を含んでなる。
本発明は、生物学的液体において、ホモシステインおよびシステインレベルをともに測定することができるデスルフラーゼ酵素の特異性の特徴を巧く利用している。適当な生物学的液体は、たとえば、尿、脳脊髄液、血液、および血漿もしくは血清を包含する。これらのレベルの重要性に関する文献の多くは血漿もしくは血清に関するものである。アッセイを行う前に、デスルフラーゼの作用を受けやすいように、システインおよびホモシステインをスルフヒドリル型として遊離する目的で、試料を、ジスルフィド結合を還元するために有用な還元剤（たとえばジチオスレイトール）で処理することが通常必要である。
本発明において有用なデスルフラーゼは、ホモシステインを、α-ケトグルタル酸、アンモニアおよび硫化水素に変換し、システインを、ピルビン酸、アンモニアおよび硫化水素に変換することができる。アッセイはこれらの生成物のいずれの測定を組み込んでもよい。しかしながら、両方のアミノ酸の生成物について同一の方法を用いることができるため、アンモニアもしくは硫化水素の測定のほうが好都合であると考えられる。硫化水素の測定が特に好ましいが、それはその測定方法が比較的容易なためである。しかしながら、α-ケトグルタル酸、ピルビン酸およびアンモニアの測定方法は当技術分野でよく知られており、これらの生成物濃度の測定も同様に利用できると考えられる。
生成した硫化水素レベルを簡便に測定する方法の１つは、前記で参考文献として引用された米国特許第6,468,762号に記載されている。簡単に述べると、この方法は、ヘキサシアノ鉄（III）酸カリウムのような酸化剤を含有する第1の発色試薬、およびN,N-ジアルキルフェニレンジアミンを含んでなる第2の発色試薬を包含する。これらの試薬は、生成した硫化水素と反応して、有色の複合体を形成するが、ここでこの複合体は吸光度によって分光学的に測定可能、もしくは複合体の蛍光を利用することによってより高感度に測定可能である。好ましいジアルキルフェニレンジアミンは、N,N-ジプロピルフェニレンジアミン（DPPDA）またはN,N-ジブチルフェニレンジアミン（DBPDA）である。
しかしながら、反応生成物を測定する方法はいずれを使用することもできる。
上記のように、デスルフラーゼの１つは、システインおよびホモシステインをいずれも基質として利用するため、生物学的液体をこのデスルフラーゼで処理する場合、適当な反応時間、たとえば10分または20分後には、デスルフラーゼは生物学的試料中のホモシステインおよびシステインをいずれも上記生成物に変換していることになる。このような酵素は、微生物から適切に調製することができる。一例はPseudomonas putida起源の、組換えによって調製されたデスルフラーゼである。この酵素は、Tanら、Protein Purification & Expression (1997) 9:233-245によって記載される。
ホモシステインに特異的なデスルフラーゼは、本明細書において「ホモシステイナーゼ」と称されるが、この酵素は、基質としてシステインに優先して、基質としてホモシステインに関するデスルフラーゼ活性を有する酵素と定義され、たとえ当該試料のホモシステイン濃度がシステイン濃度の10分の1以下であっても、被験体の血液、尿、組織液、血清、または血漿の試料を前記酵素で処理することによって遊離される硫化水素の総量は、実質的に前記試料中のシステインからではなくホモシステインから生じる。あるいは、ホモシステイナーゼは次のような特徴を有する。すなわち、生物学的液体中のホモシステインおよびシステインの濃度がそれぞれ約5-15μMおよび約100-300μMであるとき、当該液体と接触することで前記ホモシステイナーゼの作用によって生成する硫化水素の少なくとも約90%は、ホモシステインに起因する。さらにその点で、生物学的液体が5μMホモシステインおよび1,000μMシステインを含有する場合、当該液体と接触することで前記ホモシステイナーゼの作用によって生成する硫化水素の少なくとも約90%は、ホモシステインに起因する。このようなホモシステイナーゼ酵素は上記で参照した特許、およびHanら、Protein Expression & Purification (1998) 14:267-274に記載される。
上記のように、生物学的液体は2つの試料に分割され、望ましくは等しく処理される。一般に、デスルフラーゼは、0.01-1,000μg/mlの最終濃度をもたらすのに必要な量を試料に添加する；さらに試薬は、バッファーについては1-100 mM、さらに望ましくは5-50 mM；ジスルフィド結合の還元剤については0.01-100 mM、さらに望ましくは0.1-10 mMの最終濃度をもたらすのに必要な量を添加する。残りの試薬の構成は、アッセイのために選択される検出系によって決まる。
特に好ましいある検出方法において、生成物のレベルは、生成した硫化水素の濃度もしくは量を測定することによって決定される。特に好ましいのは、蛍光を発する特性も有する発色団の形成である。N,N-ジアルキルフェニレンジアミン、好ましくはN,N -ジプロピルフェニレンジアミン (DPPDA)もしくはN,N-ジブチルフェニレンジアミン (DBPDA)との反応によって、光を吸収し、蛍光を発することができる複合体が得られる。この複合体を、次に、たとえばヘキサシアノ鉄（III）酸塩の形をとる鉄（III）イオンのような適当な酸化剤で酸化する。発色した試薬のレベルを通常およそ670-680 nmでの吸光度によって測定することができるが、約665 nmもしくは640 nmの範囲の励起波長、および短波長での対応する測定用放射によって、この複合体の蛍光を測定することができると考えられる。吸光度に対するものとして蛍光検出の使用を下記に説明し、それによってアッセイの感度が高まることを示す。
非特異的デスルフラーゼ含有試料における結果は、tHcyプラスtCysの濃度レベルを与える。ホモシステイナーゼ含有試料の結果は、tHcy濃度を与える。したがって、これらの濃度の差は、この生物学的液体中の総システイン濃度を表す。
下記の実施例は説明のために提示されるが本発明を限定しない。
システインおよびホモシステインの定量。アッセイすべき試料を2つの部分に分ける：一方の部分を非特異的デスルフラーゼで処理し、他方をホモシステイナーゼで処理する。
それぞれの場合について、10-20μlの試料、およびそれに応じて試料総量が1 mlとなる980-990μlの変換バッファーを、37℃にて30分間インキュベートする。変換バッファーは20 mMリン酸カリウム、pH 8.3、150mM NaCl、30μg/ml, 0.2% Triton X-100および1 mM DTTである。
次いで、この試料を10μlの組換えホモシステイナーゼもしくは非特異的デスルフラーゼ（0.275 mg）で処理する。デスルフラーゼは遺伝子組換えによって作製され、Tanら（上記）によって記載された、P. putidaから分離されたものである。ホモシステイナーゼはHanら（上記）によって記載されたものである。いずれの試料も37℃にて10分間インキュベートする。
その後、50μlの色原体（40 mM N,N-ジブチルフェニレンジアミン塩酸塩（6M HCl溶液））を添加して反応を止め、続いて50μl酸化剤（40 mMヘキサシアノ鉄（III）酸塩（20 mMリン酸バッファー、pH 8.3溶液））を添加する。次に、その一部を37℃にて10分間インキュベートし、665 nmの励起波長および690 nmの放射波長を用いた蛍光により、もしくは675 nmでの吸光度により読み取る。
Claims (10)
- 生物学的液体において総システイン濃度（tCys）を測定する方法であって、
a)前記液体の第1の試料を、ホモシステインおよびシステインをいずれも基質として利用する、非特異的デスルフラーゼで処理すること、および前記デスルフラーゼの少なくとも１つの生成物のレベルを測定してシステイン濃度（tCys）およびホモシステイン濃度（tHcy）の和を決定すること；
b)前記生物学的液体の第2の試料を、ホモシステインを特異的に基質として利用する、ホモシステイナーゼで処理すること、および少なくとも１つの生成物のレベルを測定して総ホモシステイン濃度（tHcy）を決定すること；および
c)ステップb)で得られたtHcyをステップa)で得られた（tCys＋tHcy）から差し引いて総システイン濃度を得ること、
を含んでなる方法。 - ステップa)およびステップb)で測定される生成物が硫化水素である、請求項1に記載の方法。
- 酸化剤およびジアルキルフェニレンジアミンで処理することによって硫化水素が測定される、請求項２に記載の方法。
- 前記酸化剤が鉄（III）イオンである、請求項３に記載の方法。
- 前記非特異的デスルフラーゼがPseudomonas putidaから分離可能である、請求項１に記載の方法。
- 前記ホモシステイナーゼがTrichomonas vaginalisから分離可能である、請求項１に記載の方法。
- 前記生物学的液体が血清もしくは血漿である、請求項１に記載の方法。
- 適当な容器内に、システインおよびホモシステインをいずれも基質として利用する非特異的デスルフラーゼ、ならびに、ホモシステインを特異的に基質として利用するホモシステイナーゼを、請求項１に記載の方法を実施するための使用説明書とともに含んでなる、請求項１に記載の方法を用いて総システイン濃度を測定するためのキット。
- ジスルフィド結合を還元するために有効な還元剤をさらに包含する、請求項８に記載のキット。
- 少なくとも１つの生成物を検出するための試薬をさらに包含する、請求項８に記載のキット。
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