JP2003144195A - 安定なホモシステイン測定用組成物およびこれを用いるホモシステインの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微量濃度のホモシステインを、迅速、簡便か
つ感度よく測定するための安定な測定試薬を提供するこ
と。 【解決手段】 試料に、チオール化合物、細菌由来のホ
モシステインメチルトランスフェラーゼ、およびD-メチ
オニンメチルスルホニウムを作用させて、生じたD-メチ
オニンを測定するための、細菌由来のホモシステインメ
チルトランスフェラーゼおよびD-メチオニンメチルスル
ホニウムを含む、ホモシステイン測定用試薬および／ま
たはキット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、安定なホモシステ
イン測定用組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】メチオニン代謝の中間代謝物の１つであ
るホモシステインは、血管内皮細胞傷害作用を有し、他
の因子とは独立した動脈硬化性疾患の危険因子であるこ
とが報告されている。ホモシステイン代謝酵素の欠損に
より引き起こされる強度の高ホモシステイン血症（ホモ
シスチン尿症）のほかに、遺伝子異常による代謝酵素活
性の低下、腎不全、加齢、喫煙、運動不足などによって
も、中等度の高ホモシステイン血症を呈することが明ら
かになっている(Jacobsen, Clin. Chem., 44:8(B), 199
8)。また、これらの高ホモシステイン血症は、ビタミン
B6・葉酸などの摂取により改善することも報告されてい
る（JAMA 270:693, 1993）。したがって、新生児マスス
クリーニングだけでなく、成人の動脈硬化性疾患の予防
やビタミン欠乏症の発見のためにも、簡便で多数の検体
を処理できる方法が要求されている。

【０００３】血中のホモシステインの大部分（99％）
は、酸化型のジスルフィド化合物（蛋白結合型、ホモシ
スチン、システイン-ホモシステイン結合型など）とし
て存在している（Jacobsen, Clin. Chem., 44:8(B), 19
98）。総ホモシステインは、これら酸化型および還元型
ホモシステインの総量を意味し、通常その測定のために
は、試料をまず還元剤により還元型ホモシステインに変
換する必要がある。

【０００４】ホモシステインの測定には、高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)法および免疫法が主として用いら
れている。前者で用いられるHPLC装置は、臨床検査の現
場では一般的とは言えず、加えてその操作には時間、労
力、費用を必要とする。また、後者は、自動化されてい
るものの（Shipchandler, Clin. Chem., 41, 7, 991-99
4, 1995）、酵素反応によるホモシステインからS-アデ
ノシル-L-ホモシステインへの変換工程と免疫法による
その検出工程との組み合わせにより達成されるため、専
用の装置を必要とする。

【０００５】免疫法による測定方法は、特表平9-512634
号および特開平10-114797号にも提案されている。特表
平9-512634号の方法は、ホモシステインを化学修飾して
抗原性を高めることにより免疫学的に測定する方法であ
り、工程数が多く煩雑である。また、特開平10-114797
号は、ホモシステインを測定する方法を開示している
が、この方法はアルブミンに結合したホモシステインの
みを直接測定する方法であり、総ホモシステイン量を測
定する方法ではない。この方法では、全体の70％程度の
ホモシステインしか測定できない。

【０００６】一方、生化学法による測定方法は、日本特
許第2870704号、米国特許第5998191号、および米国特許
第5885767号に記載されている。日本特許第2870704号の
方法は、還元剤で処理した検体中のホモシステインを、
アデノシンおよびS-アデノシル-L-ホモシステイン加水
分解酵素と接触させ、残存する混合物中のアデノシン量
を評価することを特徴とする。しかし、この方法は、S-
アデノシル-L-ホモシステイン加水分解酵素阻害剤を用
いないので、カイネティックモードによる測定が必要で
ある。さらに、総ホモシステイン測定のために必須の工
程である還元処理に用いられる還元剤の存在下では、生
成する過酸化水素を、通常用いられる酸化系発色剤に導
くことはできないという問題点がある。このため、汎用
の自動分析装置に応用することはできない。しかし、こ
の特許明細書にはこれらの問題を回避する方法は何ら述
べられていない。

【０００７】特表2000-502262号、米国特許第5998191
号、および米国特許第5885767号に記載の方法は、ホモ
システインに、ホモシステインデスルフラーゼ、ホモシ
ステナーゼ、またはメチオニン-γ-リアーゼを作用さ
せ、生成する硫化水素、アンモニア、または2-オキソ酪
酸を検出することを特徴としている。しかし、工程数が
多いこと、硫化水素の検出に有害な重金属である鉛イオ
ンを使用すること、あるいは通常の生体試料ではホモシ
ステインより含量の多い構造類似物質であるシステイン
やメチオニンの影響を受けることなどの問題点を有す
る。

【０００８】このように、従来の方法は、特殊装置を必
要とし、操作が煩雑であり、そして感度・特異性が不十
分であるなどの問題点があった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】そこで、微量濃度のホ
モシステインを、迅速、簡便かつ感度よく測定するため
の安定な測定試薬の開発が望まれている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】そこで、発明者らは、ホ
モシステインにホモシステインメチルトランスフェラー
ゼおよびD-メチオニンメチルスルホニウムを作用させ、
生成したD-メチオニンを検出することにより、ホモシス
テインを定量することができ、その際に細菌由来のホモ
システインメチルトランスフェラーゼを使用することに
よって、測定試薬を安定化できることを見出し、本発明
を完成した。

【００１１】本発明は、細菌由来のホモシステインメチ
ルトランスフェラーゼおよびD-メチオニンメチルスルホ
ニウムを含む、ホモシステイン測定用組成物を提供す
る。

【００１２】好ましい実施態様では、上記組成物は、さ
らにチオール化合物を含む。

【００１３】本発明はまた、試料中のホモシステインを
検出または測定するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還
元処理する工程；（ｂ）還元されたホモシステインに、
細菌由来のホモシステインメチルトランスフェラーゼお
よびD-メチオニンメチルスルホニウムを作用させ、D-メ
チオニンを生じさせる工程；および（ｃ）生成したD-メ
チオニンを、（ｉ）ＳＨ試薬の存在下で酵素的に酸化し
て過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を酸化系
発色剤により発色させることによって、または（ｉｉ）
D-アミノ酸変換酵素を作用させてオキソ酸および／また
はアンモニアを生成させ、生成したオキソ酸および／ま
たはアンモニアを検出または測定することによって、検
出または測定する工程、を含む。

【００１４】好ましい実施態様では、上記工程（ａ）お
よび（ｂ）は同時に行われる。

【００１５】本発明はさらに、チオール化合物、細菌由
来のホモシステインメチルトランスフェラーゼ、D-メチ
オニンメチルスルホニウム、およびD-アミノ酸変換酵素
を含む、ホモシステイン測定用キットを提供する。

【００１６】好ましい実施態様では、上記D-アミノ酸変
換酵素は、D-アミノ酸オキシダーゼである。

【００１７】本発明はまた、細菌由来のホモシステイン
メチルトランスフェラーゼおよびD-メチオニンメチルス
ルホニウムを緩衝液中で混合して調製された、ホモシス
テイン測定試薬を提供する。

【００１８】上記いずれの実施態様においても、上記ホ
モシステインメチルトランスフェラーゼが大腸菌由来で
あることが好ましい。

【００１９】上記いずれの実施態様においても、上記ホ
モシステインメチルトランスフェラーゼが組換え酵素で
あることが好ましい。

【００２０】

【発明の実施の形態】（ホモシステインの測定原理）本
発明は、試料中のホモシステインをチオール化合物で還
元処理し、メチル供与体存在下でメチル転移酵素を作用
させた（第一工程）後、生成するD-アミノ酸誘導体また
はD-アミノ酸類似体を測定する（第二工程）という原理
に基づく。例えば、図１に示すように、第一工程で生成
したD-メチオニンに、第二工程においてD-アミノ酸オキ
シダーゼを作用させた場合には、過酸化水素が生成する
ため、これをＳＨ試薬の存在下で通常用いられる酸化系
発色剤に導き比色定量することができる。また、D-アミ
ノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させた場合に
は、生成するコエンザイムＡをアシルコエンザイムＡシ
ンセターゼ[EC 6.2.1.3]およびアシルコエンザイムＡ酸
化酵素[EC 1.3.3.6]を用いて過酸化水素に導き、これを
同様にして定量することができる。

【００２１】本発明においては、測定試薬として調製し
た際の安定性が優れている点で、メチル転移酵素として
細菌由来のホモシステイン-S-メチルトランスフェラー
ゼ（以下、ＨＣＭＴａｓｅという場合がある）を、メチ
ル供与体としてD-メチオニンメチルスルホニウムととも
に用いて、生成したD-メチオニンを測定する方法を採用
する。

【００２２】なお、本明細書において、ホモシステイン
測定用組成物とは、測定に用いられる成分が、別々にま
たは混合されて含まれているものをいい、測定試薬と
は、該組成物の成分が、緩衝液中で混合されて、即時に
使用可能な形態に調製されているものをいう。

【００２３】（第一工程）第一工程は、試料中の種々の
形態のホモシステインをチオール化合物で還元して還元
型ホモシステインとし、メチル供与体存在下、メチル転
移酵素を作用させる工程である。

【００２４】本発明の測定試薬で測定され得る被検試料
としては、ホモシステインを含むと考えられる試料であ
ればいずれでもよい。また、ホモシステインの存在様式
としては、還元型ホモシステインのみならず、蛋白結合
型、ホモシステイン２量体、ホモシステイン-システイ
ン２量体などジスルフィド結合で他の分子に結合した酸
化型ホモシステインのいずれでもよい。例えば、血清、
血漿、血液、尿、およびそれらの希釈物などが挙げられ
る。

【００２５】本発明で用いられるチオール化合物は特に
限定されず、例えば、ジチオスレイトール、メルカプト
エタノール、N-アセチルシステイン、ジチオエリスリト
ール、チオグリコール酸などが挙げられる。チオール化
合物の濃度は、酸化型ホモシステインを還元型ホモシス
テインに変換できる範囲であればいずれでもよく、好ま
しくはチオール基として0.1mM以上、より好ましくは１m
M以上の濃度であればよい。

【００２６】この原理によれば、メチル転移酵素として
は、D-メチオニンメチルスルホニウムおよびL-ホモシス
テインに作用し、D-メチオニンおよびL-メチオニンの生
成を触媒するものであればどのようなものでもよく、例
えば、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ［EC
2.1.1.10］、5-メチルテトラヒドロ葉酸-ホモシステイ
ンS-メチルトランスフェラーゼ［EC 2.1.1.13］、5-メ
チルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸-ホモシ
ステインS-メチルトランスフェラーゼ［EC 2.1.1.14］
が挙げられる。このうち、本発明においては、ホモシス
テイン-S-メチルトランスフェラーゼ［EC 2.1.1.10］
（ＨＣＭＴａｓｅ）が使用される。ホモシステイン-S-
メチルトランスフェラーゼの系統名は、S-アデノシル-L
-メチオニン：L-ホモシステインS-メチルトランスフェ
ラーゼであり、メチル受容体のL-ホモシステインおよび
メチル供与体のS-アデノシル-L-メチオニンを基質と
し、L-メチオニンおよびS-アデノシル-L-ホモシステイ
ンを産生する酵素である（酵素ハンドブック、朝倉書
店、1982年）。

【００２７】この酵素は、メチル供与体として、S-メチ
ル-L-メチオニン（L-メチオニンメチルスルホニウ
ム）、またはS-アデノシル-D-メチオニンも利用するこ
とが、S.K.Shapiroにより報告されている（Biochim. Bi
ophys. Acta, 29:405-409, 1958）。さらに、同報告に
よれば、放射性同位元素でのラベル実験の結果から、メ
チオニンは、S-アデノシルメチオニンのメチル基がホモ
システインへ転移することにより生成され、S-アデノシ
ルメチオニンのリボースと硫黄原子との結合が開裂する
ためではないことも明らかにされている。したがって、
S-アデノシル-L-メチオニンをメチル供与体とした場合
には、L-メチオニンとS-アデノシル-L-ホモシステイン
が、L-メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体と
した場合には２分子のL-メチオニンが、S-アデノシル-D
-メチオニンをメチル供与体とした場合にはL-メチオニ
ンとS-アデノシル-D-ホモシステインが生成する。いず
れの場合にも、L-メチオニンが生成されるため、これを
測定することによってもホモシステインの定量は可能で
ある。

【００２８】しかしながら、一般的に生体試料中のL-メ
チオニンは、ホモシステインに比べて多量（血漿で3〜5
倍）に含まれるため、上記測定原理によりホモシステイ
ンを定量するためには、あらかじめホモシステインに影
響のない方法でL-メチオニンを消去し、次いでホモシス
テインメチルトランスフェラーゼ反応で生成するL-メチ
オニンを特異的に測定する必要があるなど煩雑な操作が
必要であり、好ましくない。一方、G. Grue-Sorensenら
により、ＨＣＭＴａｓｅは、特異性は低いもののD-メチ
オニンメチルスルホニウムをメチル供与体とし、D-メチ
オニンを生成することが報告されている（J. Chem. So
c. Perkin Trans. I:1091-7 (1984)）。そこで、本発明
においては、この反応を利用し、通常の生体試料中には
ほとんど存在しないD-メチオニンを生成させ、次にこれ
を測定することによりホモシステインを特異的に定量す
る方法を確立した。すなわち、本発明では、メチル供与
体としてD-メチオニンメチルスルホニウムを使用する。

【００２９】本発明で使用されるＨＣＭＴａｓｅは、D-
メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とするも
のであればどのような由来のものでも使用できる。例え
ば、細菌、酵母、ラットなどに由来する酵素が使用でき
る。しかし、実際に測定試薬として利用する場合、用時
調製が必要とされる試薬よりも、調製後の安定性が高い
試薬もしくは予め調製されて提供される試薬のほうが便
利である。そのため、本発明においては、試薬としての
安定性の面で、細菌に由来する酵素が用いられる。好ま
しくは、大腸菌由来の酵素であるが、表１に示すような
大腸菌由来の酵素と相同性のあるBacillus subtilis、C
lostridium acetobutylicum、Mycobacterium leprae、M
ycobacterium tuberculosis、Streptomyces colicolor
などの細菌由来の酵素を用いることもできる。また、Ae
robacter aerogenes、Lactobacillus arabinosus、およ
びT. utilisの抽出物にもＨＣＭＴａｓｅ様活性が確認
されており（J. Bacteriol., 72:730-735 (1956)）、こ
れらの細菌から得られる酵素であってもよい。本明細書
でいう大腸菌とは、Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, 第８版（R.E. Buchanan, N.E. Gibbons
編, The Williams &Wilkins Company, Baltimore, 295
〜296頁, 1974年）に記載されるEscherichiacoliならび
にその変異株および改変体である。

【００３０】

【表１】

【００３１】本発明で用いられるＨＣＭＴａｓｅとして
は、好ましくは、Science, 277:1453-1474 (1997)、Gen
Bank Accession No. NC 000913の塩基配列から推定され
るアミノ酸配列を有する大腸菌由来の酵素が用いられ
る。また、Bacillus subtilis由来の酵素（Nature, 390
(6657):249-256 (1997)、GenBank Accession No. NC 00
0964）、Clostridium acetobutylicum由来の酵素（J. B
acteriol., 183(16):4823-4838 (2001)、GenBank Acces
sion No. NC 003030）、Mycobacterium lepraestrain T
N由来の酵素（Nature, 409(6823):1007-1011 (2001) 、
GenBank Accession No. NC 002677）、Mycobacterium t
uberculosis H37Rv由来の酵素（Nature,393(6685):537-
544 (1998) 、GenBank Accession No. NC 000962）、お
よびStreptomyces colicolor由来の酵素（PIR Accessio
n No. T34650）も使用され得る。そしてＨＣＭＴａｓｅ
活性が消失しない限りは、いくつかのアミノ酸の改変
（例えば、１または２以上のアミノ酸の付加、欠失、ま
たは置換）があってもよい。ＨＣＭＴａｓｅは、例え
ば、大腸菌（例えば、細菌などから取得したＨＣＭＴａ
ｓｅ遺伝子を導入して形質転換した大腸菌株）の培養菌
体内容物から、粗酵素の調製、次いで各種クロマトグラ
フィーによる精製方法など、当業者によく知られている
方法によって得られ得る。

【００３２】本発明で用いられるＨＣＭＴａｓｅ遺伝子
は、前記推定アミノ酸配列に基づいて当業者が通常用い
る方法で得られる。例えば、ＨＣＭＴａｓｅをコードす
る遺伝子またはこれを含む遺伝子の一部またはすべてを
プローブとして使用し、プラークハイブリダイゼーショ
ン、コロニーハイブリダイゼーション、ＰＣＲなどの手
段を行う方法が挙げられる。また、ＨＣＭＴａｓｅの遺
伝子源は、大腸菌に限られず、他の細菌種、例えば、Ae
robacter aerogenesであってもよい。

【００３３】本明細書において、ＨＣＭＴａｓｅ遺伝子
とは、ＨＣＭＴａｓｅの特徴を示すＨＣＭＴａｓｅ活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖またはＤＮ
Ａ配列をいい、上述のように生理活性が変化しない程度
のアミノ酸の改変（例えば、付加、欠失、または置換）
を有するポリペプチドをコードしていてもよい。また、
縮重などにより、同じポリペプチドをコードする配列は
複数種あり得る。さらに、ＨＣＭＴａｓｅ遺伝子は、天
然物由来であっても、全合成または半合成のものであっ
てもよい。

【００３４】得られたＨＣＭＴａｓｅ遺伝子は、例え
ば、大腸菌などの宿主において増殖可能な発現ベクター
に連結され、宿主に導入される。ここで用いられる発現
ベクターは、大腸菌に対して通常用いられるものであれ
ばどのようなものでもよく、例えば、ｃｏｌＥ１、ｐＣ
Ｒ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９などが好適に用いられ
る。

【００３５】ＨＣＭＴａｓｅをコードするＤＮＡを大腸
菌内で大量に発現させるため、あるいは発現量を増加さ
せるために、転写および翻訳を制御するプロモーターを
ベクターのＤＮＡ鎖の５’上流域に、および／またはタ
ーミネーターを３’下流域に組み込んでもよい。このよ
うなプロモーターおよび／またはターミネーターとして
は、ＨＣＭＴａｓｅ遺伝子自体に由来するもの、β-ガ
ラクトシダーゼ遺伝子などの既に知られている遺伝子に
由来するもの、またはそれらを人工的に改良したものが
挙げられる。そのため、発現ベクターとしては、このよ
うな制御配列が組み込まれているものが好適に用いら
れ、例えば、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３（以
上、アマシャム・ファルマシア社製）、ｐＥＴ−３、ｐ
ＥＴ−１１（以上、ストラタジーン社製）などが挙げら
れるが、これらに限定されない。

【００３６】ＨＣＭＴａｓｅを発現させるための宿主と
なり得る微生物としては、どのような微生物でもよい
が、好ましくは細菌、さらに好ましくは大腸菌である。
ＨＣＭＴａｓｅを発現させるための形質転換体の作成
は、遺伝子工学の分野で通常用いられる方法によって行
われ、例えば、塩化ルビジウム法（J. Mol. Biol., 16
6:557, 1983）が挙げられる。このようにして得られた
ＨＣＭＴａｓｅ発現能力が高められた大腸菌の形質転換
体を培養して、ＨＣＭＴａｓｅを得ることができる。

【００３７】このようにして得られたＨＣＭＴａｓｅ
は、上述のように単離・精製されて、チオール化合物お
よびメチル供与体のD-メチオニンメチルスルホニウムと
ともにホモシステイン測定用組成物の成分として使用さ
れ得る。

【００３８】（第二工程）D-メチオニンの定量法は、特
に限定されないが、D-アミノ酸変換酵素を用いて酵素的
に測定する方法が好ましい。より好ましくは、D-アミノ
酸オキシダーゼ[EC 1.4.3.3]が利用される。本発明者ら
は、D-アミノ酸の１つであるD-メチオニンメチルスルホ
ニウムが、意外なことに、ほとんどD-アミノ酸オキシダ
ーゼの基質にならないことを明らかにした。このよう
に、D-アミノ酸変換酵素がD-メチオニンメチルスルホニ
ウムには作用しないか、または作用してもD-メチオニン
に対するよりも反応性が十分に低いものであれば、ＨＣ
ＭＴａｓｅでの反応後に残存しているD-メチオニンメチ
ルスルホニウムを反応系外に除くことなく、生成したD-
メチオニンを測定することができる。D-アミノ酸オキシ
ダーゼ以外にも、同様の性質を有するD-アミノ酸アセチ
ルトランスフェラーゼ[EC 2.3.1.36]、D-アミノ酸脱水
素酵素［EC 1.4.99.1］なども利用できる（図１）。

【００３９】（生成する過酸化水素の測定）図１に示す
ように、D-メチオニンにD-アミノ酸オキシダーゼを作用
させた場合には、過酸化水素が生成するため、パーオキ
シダーゼにより通常の酸化系発色剤を発色させることが
できる。この方法は、臨床化学の分野では一般的に用い
られる既知の方法であるが、第一工程で用いるチオール
化合物の還元作用によりその発色が著しく妨害されるた
め、第二工程では、チオール化合物のブロック剤である
ＳＨ試薬の添加が必須となる。

【００４０】ＳＨ試薬としては、生化学辞典（第3版、
p.182、東京化学同人、1998年）にも記載されるとお
り、エルマン試薬などの酸化剤、p-メクリル安息香酸な
どのメルカプト形成剤、ヨード酢酸、N-エチルマレイミ
ドなどのアルキル化剤が挙げられる。好ましくはアルキ
ル化剤を、さらに好ましくはマレイミド化合物を、もっ
とも好ましくはN-エチルマレイミドを使用することがで
きる。ＳＨ試薬の濃度は、検体の還元処理に用いたチオ
ール化合物のチオール基を酸化系発色剤による定量が妨
害されない程度にブロックできる範囲であればいずれで
もよく、好ましくは0.1mMから100mMの範囲で使用でき
る。より好ましくは１mMから30mMで用いられる。

【００４１】また、D-アミノ酸アセチルトランスフェラ
ーゼを作用させた場合には、生成するコエンザイムＡを
アシルコエンザイムＡシンセターゼ[EC 6.2.1.3]および
アシルコエンザイムＡ酸化酵素[EC 1.3.3.6]を用いて過
酸化水素に導き、これを同様にして定量することができ
る。

【００４２】酸化系発色剤としては、種々のトリンダー
試薬をカップラー試薬と組み合わせて利用できる。この
方法はトリンダー法とも呼ばれ、臨床化学分析の分野で
は一般に用いられており、ここでは詳細に説明しない
が、好ましくはカップラー試薬として4-アミノアンチピ
リンを、トリンダー試薬としてADOS [N-エチル-N-(2-ヒ
ドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン]、DA
OS [N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5
-ジメトキシアニリン]、HDAOS [N-(2-ヒドロキシ-3-ス
ルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン]、MAOS [N-エ
チル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチ
ルアニリン]、TOOS [N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スル
ホプロピル)-3-メチルアニリン]などが用いられる。ま
た、カップラー試薬を必要としない、0-トリジン、0-ジ
アニシジン、DA-67 [10-(カルボシキメチルアミノカル
ボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナト
リウム、和光純薬工業（株）製]、TPM-PS [N,N,N',N',
N'',N''-ヘキサ(3-スルホプロピル)-4,4',4''-トリアミ
ノトリフェニルメタン6ナトリウム塩、同仁化学研究所]
などのロイコ型発色試薬も同様に用いることができる。
特に、DA-67、TPM-PSは、上記トリンダー試薬と比べて
モル吸光係数が大きいため、より感度よく測定すること
ができる。

【００４３】（生成するアンモニアまたは4-メチルチオ
-2-オキソ酪酸の測定）D-アミノ酸オキシダーゼまたはD
-アミノ酸脱水素酵素を作用させた場合には、アンモニ
アおよび4-メチルチオ-2-オキソ酪酸が生成する。これ
らの生成物を測定することによっても定量は可能であ
る。

【００４４】アンモニアは、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（NADH）または還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）もしくはそ
の誘導体（以下、本明細書ではNAD(P)Hという）、2-オ
キソグルタル酸、およびグルタミン酸脱水素酵素（[EC
1.4.1.2]、[EC 1.4.1.3]、または[EC 1.4.1.4]）を作用
させ、NAD(P)Hの減少を340nmの吸光度変化を測定するこ
とによって定量できる。あるいは、NADまたはNADPもし
くはその誘導体（以下、本明細書では、NAD(P)という）
の増加を測定してもよい。NAD(P)Hの誘導体としては、
チオNAD(P)H、3-アセチルピリジンアデニンジヌクレオ
チド（または3-アセチルピリジンジヌクレオチドリン
酸）などが挙げられる。アンモニアの定量には、上記グ
ルタミン酸脱水素酵素以外に、ロイシン脱水素酵素（[E
C 1.4.1.9]）、アラニン脱水素酵素（[EC 1.4.1.1]）、
セリン脱水素酵素（[EC 1.4.1.7]）、バリン脱水素酵素
（[EC1.4.1.8]）、グリシン脱水素酵素（[EC 1.4.1.1
0]）など、NAD(P)Hを補酵素とし、アンモニアを利用し
て還元的アミノ化反応を触媒し得る脱水素酵素であれば
いずれも利用できる。これらの脱水素酵素の補助基質と
しては、アンモニウム塩、2-オキソ酸などが用いられ得
る。2-オキソ酸としては、上記2-オキソグルタル酸以外
に、ピルビン酸、2-オキソ酪酸、2-オキソイソカプロン
酸、2-オキソイソ吉草酸、2-オキソ吉草酸、2-オキソカ
プロン酸、グリオキシル酸、ヒドロキシピルビン酸など
が挙げられる。

【００４５】また、アンモニアは、ネスラー試薬、pH指
示薬、電極法などを利用しても定量可能である。

【００４６】4-メチルチオ-2-オキソ酪酸は、NADH、ア
ンモニア、およびロイシン脱水素酵素[EC 1.4.1.9]を作
用させ、上記アンモニアの場合と同様に、例えば、NADH
の減少を340nmの吸光度変化を測定することによって定
量できる。4-メチルチオ-2-オキソ酪酸がロイシン脱水
素酵素の基質となることは知られている（G. Livesey
ら, Methods in Enzymology, 166:282-288, 1988）。4-
メチルチオ-2-オキソ酪酸の定量には、上記ロイシン脱
水素酵素以外に、乳酸脱水素酵素（[EC 1.1.1.27]）な
ど、4-メチルチオ-2-オキソ酪酸を還元し得る脱水素酵
素であればいずれも利用できる。

【００４７】4-メチルチオ-2-オキソ酪酸またはアンモ
ニアをNAD(P)Hの340nmの吸光度変化によって定量する系
に導くための方法は、還元剤の影響を受けにくいことが
知られており、そのため、ＳＨ試薬を使用する必要がな
い（池田ら，臨床検査, 41,989-993, 1997）。還元剤の
共存下で、NAD(P)H定量系に導いている例としては、血
中クレアチンキナーゼ測定法が挙げられる(臨床化学，1
9:189-208, 1990)。

【００４８】また、D-アミノ酸オキシダーゼによってア
ンモニアまたは4-メチルチオ-2-オキソ酪酸を生成させ
る測定系においては、生成物の１つである過酸化水素を
カタラーゼによって消去して、その影響を除くことも可
能である。

【００４９】（ホモシステイン測定用組成物およびキッ
ト）本発明では、（ａ）ホモシステインを還元するため
のチオール化合物、（ｂ）還元型ホモシステインと反応
させるため（第一工程）のＨＣＭＴａｓｅおよびD-メチ
オニンメチルスルホニウム、ならびに（ｃ）生成したD-
メチオニンを測定するため（第二工程）の(i)ＳＨ試薬
および酸化系発色剤または(ii)NAD(P)Hを補酵素とする
脱水素酵素および該酵素の特性に応じた補助基質または
発色剤を含む、試料中のホモシステインを測定するため
の組成物および／またはキットが提供される。好ましく
は、還元工程と第一工程とを同時に行うために、（ａ）
および（ｂ）が一緒に含まれた組成物、すなわち、チオ
ール化合物、ＨＣＭＴａｓｅ、およびD-メチオニンメチ
ルスルホニウムを含む組成物が提供される。この組成物
は、予め緩衝液中に混合して調製された測定試薬として
提供されてもよい。測定試薬として提供される場合の安
定性の面で、この組成物に含まれるＨＣＭＴａｓｅは、
細菌由来、特に大腸菌由来であることが好ましい。ま
た、上記（ｃ）(ii)を用いる場合は、（ａ）、（ｂ）、
および（ｃ）を一緒に含んでいてもよい。

【００５０】以下、実施例により本発明をさらに説明す
るが、本発明の範囲は以下の実施例によって限定される
ものではない。

【００５１】

【実施例】［実施例１］大腸菌由来の組換えＨＣＭＴａ
ｓｅの調製 （１−１）プローブの合成およびＨＣＭＴａｓｅ遺伝子
の取得 ＨＣＭＴａｓｅ活性を有する酵素をコードする大腸菌の
ＹａｇＤ遺伝子の塩基配列情報（Science 277:1453-147
4 (1997) 、GenBank Accession No. NC 000913）をもと
に、EcoRIおよびPstI認識部位をそれぞれ含む配列番号
１および２に示す合成プライマーを作成した。これらの
プライマー各３nmol（100pmol/μl、30μl）を用い、２
μlの大腸菌ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡをテンプレート
として、緩衝液（KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績株式
会社製；以下、ＫＯＤという）２μl、10×ＫＯＤ緩衝
液10μl、dNTP混合物10μl、DMSO５μl、および蒸留水
５μl）中でＰＣＲを行って、ＨＣＭＴａｓｅ構造遺伝
子を含む0.9kbのＤＮＡを得た。

【００５２】（１−２）ＨＣＭＴａｓｅ遺伝子を含むプ
ラスミドの調製 上記のようにして得られたＨＣＭＴａｓｅ遺伝子を、大
腸菌ＣｏｌＥ１のＤＮＡ複製起点およびアンピシリン耐
性遺伝子を有する大腸菌ベクターｐＵＣ１９のSmaI切断
物に連結し、塩化ルビジウム法（J. Mol. Biol., 166:5
57, 1983）によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入して、Ｈ
ＣＭＴａｓｅ遺伝子を有する組換えプラスミド含む形質
転換体を得た。なお、実施例で用いた制限酵素は、いず
れも宝酒造社より入手した。

【００５３】上記形質転換体中の組換えプラスミドを用
いて、蛍光標識プライマーを用いたジデオキシターミネ
ーター法により、377 Automate Sequencing System（パ
ーキンエルマー社製）により塩基配列を決定した。ＨＣ
ＭＴａｓｅは、９３３塩基の構造遺伝子領域を有し、３
１０個のアミノ酸をコードし、これは上記ＹａｇＤ遺伝
子の塩基配列情報と完全に一致していた。

【００５４】（１−３）ＨＣＭＴａｓｅ遺伝子を含む発
現ベクターおよび形質転換体の作成 上記の組換えプラスミドを、制限酵素EcoRIおよびPstI
で切断してＤＮＡ断片を切り出し、ＨＣＭＴａｓｅのＤ
ＮＡを含む0.9kbのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気
泳動によって精製した。大腸菌ＣｏｌＥ１のＤＮＡ複製
起点およびアンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌発現
ベクターｐＫＫ２３３−３（アマシャム・ファルマシア
社）を、制限酵素EcoRIおよびPstIで切断し、得られた
0.9kbのＤＮＡ断片を連結して、発現ベクターｐＫＨＣ
ＭＴを得た（図２を参照のこと）。

【００５５】得られた発現ベクターｐＫＨＣＭＴを、塩
化ルビジウム法によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入し、
ｔａｃプロモーターからの転写により正しく転写される
ものを選択して、形質転換体ＪＭ１０９−ＨＣＭＴ−９
を得た。

【００５６】（１−４）発現したＨＣＭＴａｓｅの活性
の確認 得られた形質転換体ＪＭ１０９−ＨＣＭＴ−９を、アン
ピシリンを含むＬＢ液体培地（１％酵母エキス、２％バ
クトペプトン、２％グルコース）３ml中、37℃にて約４
時間振盪培養した。このうちの0.3mlを、10mlのLB液体
培地に添加して、37℃にて３時間振盪培養し、イソプロ
ピル-β-D-チオガラクトピラノシド（宝酒造社製；以
下、IPTG）を最終濃度１mMとなるように加えて、さらに
４時間培養した。培養液を、8000rpmにて15分間遠心分
離して菌体を回収し、100mMリン酸ナトリウム緩衝液（p
H7.0）１mlにて１回洗浄した後、菌体の10倍量の可溶化
液（100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、0.1mM Zn
Br₂、100μg/mlリゾチーム）に懸濁した。懸濁液に、超
音波発生装置（トミー精工、UD-200型）を用いて、目盛
１にて10秒間処理を２回行うことによって、菌体を破砕
した。15000rpmにて10分間遠心分離して上清を得、これ
をＨＣＭＴａｓｅ活性測定の試料とした。なお、対照と
して、組換えられていないｐＫＫ２２３−３での大腸菌
ＪＭ１０９株の形質転換体を、同様に処理したものを用
いた。

【００５７】酵素活性の測定を、次のように行った。ま
ず、菌体破砕液（１〜50μl）に、活性測定試薬（35mM
L-ホモシステイン５μl、100mM D-メチオニンスルホニ
ウムブロミド２μl、400mMジチオスレイトール１μl、1
00mMリン酸ナトリウム緩衝液42μl、１Ｍ ZnBr₂ 0.01μ
l）および蒸留水を、全量が100μlになるように加え、3
7℃にて20分間反応させた。シリカゲル薄層に、反応液
の２μlをスポットした後、展開溶媒としてエタノー
ル：25％アンモニア水＝74：26（w/w）を用いて、密閉
容器中で展開した。展開終了後、ニンヒドリン液（0.2
％ニンヒドリンを含むn-ブタノール飽和0.1Mクエン酸緩
衝液）を噴霧して、生成したメチオニンを検出した。組
換え体の菌体破砕液によるメチオニンの生成は、対照の
菌体破砕液と比較して著量であった。

【００５８】（１−５）ＨＣＭＴａｓｅの調製 上記（１−３）で得られたＨＣＭＴａｓｅ高生産組換え
大腸菌を、アンピシリンを含むＬＢ培地（１％酵母エキ
ス、２％バクトペプトン、２％グルコース）200mlに植
菌し、37℃にて15時間予備培養した。培養液を、アンピ
シリンを含むＬＢ培地1.8Lを入れた５L容ジャーファー
メンターに接種し、37℃にて100分間通気攪拌培養し
た。培養液にIPTGを最終濃度１mMとなるように加えて、
さらに４時間培養した。培養液を、8000rpmにて10分間
遠心分離して菌体を回収し、菌体の９倍容の緩衝液（20
mMビストリス−塩酸緩衝液（pH6.9）、0.1mM ZnBr₂）に
菌体を懸濁した。懸濁液に、超音波発生装置（トミー精
工、UD-200型）を用いて超音波処理を行うことによっ
て、菌体を破砕した。破砕後、15000rpmにて10分間遠心
分離して、破砕残渣を取り除き、粗酵素液を得た。

【００５９】得られた粗酵素液に対して30％飽和となる
ように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した
後、30分間放置し、その後14000rpmにて遠心分離した。
得られた上清に、50％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを氷冷下攪拌しながら添加した後、30分間放置し、そ
の後14000rpmにて遠心分離した。得られた沈殿を、緩衝
液（20mMビストリス−塩酸緩衝液（pH6.9）、0.1mM ZnB
r₂）に対して１晩透析した。

【００６０】次いで、透析した粗酵素液を、Q-セファロ
ースFF（ファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグ
ラフィー（吸着：緩衝液Ａ（20mMビストリス−塩酸緩衝
液pH6.9）、溶出：緩衝液Ａ−0.0〜0.9M塩化ナトリウム
グラジエント）により精製した。ＨＣＭＴａｓｅ活性画
分を集め、さらにセファクリルS-100（ファルマシア社
製）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製を行
った。得られた活性画分を、SDS-ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー染色す
ることによって、ＨＣＭＴａｓｅがほぼ単一バンドにま
で精製されたことを確認した。

【００６１】［実施例２］酵母由来の組換えＨＣＭＴａ
ｓｅの調製−１ （２−１）プローブの合成およびＳＡＭ４遺伝子の取得 ＨＣＭＴａｓｅ活性を持つポリペプチドをコードするＳ
ＡＭ４遺伝子の塩基配列情報を、http://genome-www.st
anford.edu/Saccharomyces（Nature 387:7-65(1997) Th
e nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae
chromosome XVI. 、GenBank Accession No. NC 00114
8）より入手し、その配列をもとに、HindIII認識部位を
含む配列番号３および４に示す合成プライマーを作成し
た。これらのプライマー各３nmol（100pmol/μl、30μ
l）を用い、２μlの清酒酵母協会７号の染色体ＤＮＡを
テンプレートとして、緩衝液（ＫＯＤ２μl、10×ＫＯ
Ｄ緩衝液10μl、dNTP混合物10μl、DMSO５μl、および
蒸留水５μl）中でＰＣＲを行って、ＳＡＭ４構造遺伝
子を含む１kbのＤＮＡを得た。

【００６２】（２−２）ＳＡＭ４遺伝子を含むプラスミ
ドの調製 上記のようにして得られたＳＡＭ４遺伝子を、大腸菌Ｃ
ｏｌＥ１のＤＮＡ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝
子を有する大腸菌ベクターｐＵＣ１９のSmaI切断物に連
結し、塩化ルビジウム法によって大腸菌ＪＭ１０９中に
導入して、ＳＡＭ４遺伝子を有する組換えプラスミド含
む形質転換体を得た。

【００６３】上記形質転換体中の組換えプラスミドに組
み込まれた遺伝子について、蛍光標識プライマーを用い
たジデオキシターミネーター法により、377 Automate S
equencing System（パーキンエルマー社製）により塩基
配列を決定した。この遺伝子は、９７８塩基の構造遺伝
子領域を有し、３２５個のアミノ酸をコードし、これは
上記ＳＡＭ４遺伝子の塩基配列情報と完全に一致してい
た。なお、これは、上記（１−２）で得られた大腸菌由
来のＨＣＭＴａｓｅのアミノ酸配列と、約２９％の相同
性を有するものである。

【００６４】（２−３）ＳＡＭ４遺伝子を含む発現ベク
ターおよび形質転換体の作成 上記の組換えプラスミドを、制限酵素HindIIIで切断し
てＤＮＡ断片を切り出し、ＳＡＭ４のＤＮＡを含む１kb
のＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって精製
した。酵母２μｍＤＮＡ複製起点およびＬＥＵ２遺伝子
を有する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（Gene, 8:121 (1
979)）のＡＤＨ１のプロモーターとターミネーターとの
間をHindIIIで切断し、精製された１kbのＤＮＡ断片を
連結して、発現ベクターｐＡＨＣＭＴを得た（図３を参
照のこと）。

【００６５】得られた発現ベクターｐＡＨＣＭＴを、酢
酸リチウム法（J. Bacteriol., 153:163, 1983）によっ
てSaccharomyces cerevisiae TD4（a, his, leu, urs,
trp）に導入し、ＡＤＣ１プロモーターから正しく転写
されるものを選択して、形質転換体ＴＤ４−ＳＡＭ４−
５株を得た。

【００６６】（２−４）ＨＣＭＴａｓｅの調製 上記（２−３）で得られたＨＣＭＴａｓｅ高生産組換え
酵母を、ＳＤ培地（0.67％イーストナイトロジェンベー
ス（除アミノ酸、Difco社より入手）、２％グルコー
ス）50mlに植菌し、30℃にて15時間予備培養し、その培
養液を800mlの同じ培地を入れた２L容ジャーファンメン
ターに接種し、30℃にて15時間通気攪拌培養した。この
培養液を、８Lの同じ培地を入れた10L容ジャーファーメ
ンターに接種し、さらに23時間培養した。次に、培養液
を、3000rpmにて10分間遠心分離して菌体を回収し、菌
体重量と等量の緩衝液（20mMビストリス−塩酸緩衝液
（pH7.0）、0.1mM ZnBr₂）に菌体を懸濁した。ダイノー
ミル（ウィリー・エ・バッコーフェン社製KDL型）を用
いて、菌体を破砕した。破砕後、8000rpmにて10分間遠
心分離して、破砕残渣を取り除き、粗酵素液を得た。

【００６７】得られた粗酵素液に対して50％飽和となる
ように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した
後、30分間放置し、その後14000rpmにて遠心分離した。
得られた上清に、85％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを氷冷下攪拌しながら添加した後、30分間放置し、そ
の後14000rpmにて遠心分離した。得られた沈殿を、緩衝
液（20mMビストリス−塩酸緩衝液（pH6.9）、0.1mM ZnB
r₂）に対して一晩透析した。

【００６８】次いで、透析した粗酵素液を、Q-セファロ
ースFF（ファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグ
ラフィー（吸着：緩衝液Ａ（50mMビストリス−塩酸緩衝
液pH6.9）、溶出：緩衝液Ａ−0.0〜0.6M塩化ナトリウム
グラジエント）により精製した。ＨＣＭＴａｓｅ活性画
分を集め、さらにセファクリルS-100（ファルマシア社
製）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製を行
った。得られた活性画分を、SDS-ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー染色す
ることによって、ＨＣＭＴａｓｅがほぼ単一バンドにま
で精製されたことを確認した。

【００６９】［実施例３］酵母由来の組換えＨＣＭＴａ
ｓｅの調製−２ （３−１）ＨＣＭＴａｓｅ活性を有する酵素をコードす
るＭＨＴ１遺伝子を含む形質転換体の作成 実施例２のＳＡＭ４遺伝子の代わり、（http://genome-
www.stanford.edu/Saccharomyces（Nature 387:7-65 (1
997) The nucleotide sequence of Saccharomyces cere
visiae chromosome XII. 、GenBank Accession No. NC
001144）より得られた酵母のＭＨＴ１遺伝子の配列情報
をもとに、配列番号５および６に示すプライマーを合成
して、実施例２と同様に組換えプラスミドを作成した。
組換えプラスミドに組み込まれた遺伝子は、９７５塩基
の構造遺伝子領域を有し、３２４個のアミノ酸をコード
しており、上記ＭＨＴ１の塩基配列情報と完全に一致し
ていた。なお、これは、上記（１−２）で得られた大腸
菌由来のＨＣＭＴａｓｅのアミノ酸配列と、約３０％の
相同性を有するものである。

【００７０】次いで、実施例２と同様の操作によって発
現ベクターを作成した後、形質転換体ＴＤ４−ＭＨＴ１
−６株を得た。

【００７１】（３−２）ＨＣＭＴａｓｅの調製 上記（３−１）で得られたＨＣＭＴａｓｅ高生産組換え
酵母を、ＳＤ培地（0.67％イーストナイトロジェンベー
ス（除アミノ酸、Difco社より入手）、２％グルコー
ス）50mlに植菌し、30℃にて15時間予備培養し、その培
養液を800mlの同じ培地を入れた２L容ジャーファンメン
ターに接種し、30℃にて15時間通気攪拌培養した。この
培養液を、８Lの同じ培地を入れた10L容ジャーファーメ
ンターに接種し、さらに23時間培養した。次に、培養液
を、3000rpmにて10分間遠心分離して菌体を回収し、菌
体重量と等量の緩衝液（20mMリン酸カリウム緩衝液（pH
6.8））に菌体を懸濁した。ダイノーミル（ウィリー・
エ・バッコーフェン社製KDL型）を用いて、菌体を破砕
した。破砕後、8000rpmにて10分間遠心分離して、破砕
残渣を取り除き、粗酵素液を得た。

【００７２】得られた粗酵素液に対して50％飽和となる
ように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した
後、30分間放置し、その後14000rpmにて遠心分離した。
得られた上清に、70％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを氷冷下攪拌しながら添加した後、一晩放置し、その
後8000rpmにて遠心分離した。得られた沈殿を、緩衝液
（20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8））に対して一晩
透析した。

【００７３】次いで、透析した粗酵素液を、Q-セファロ
ースFF（ファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグ
ラフィー（吸着および洗浄：10mMリン酸カリウム緩衝液
（pH6.8）、溶出：20〜200mMリン酸カリウム緩衝液（pH
6.8）濃度グラジエント）により精製した。ＨＣＭＴａ
ｓｅ活性画分を集め、さらにセファクリルS-100（ファ
ルマシア社製）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによ
り精製を行った。得られた活性画分を、SDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブ
ルー染色することによって、ＨＣＭＴａｓｅがほぼ単一
バンドにまで精製されたことを確認した。

【００７４】［実施例４］測定試薬安定性試験 日立7170自動分析装置を用いて、測定試薬の安定性につ
いて以下のように試験を行った。

【００７５】正常コントロール血清セラクリアHE（アズ
ウェル社）にホモシスチンを0、10、20、30、40、およ
び50μM（ホモシステイン換算値0〜100μM）添加した試
料20μlに、測定試薬Ａ［100mM PIPES(pH7.0)、120U/L
ＨＣＭＴａｓｅ（ＹａｇＤ、ＭＨＴ１、およびＳＡＭ４
由来のいずれかの酵素）、10mMジチオスレイトール、0.
45mM D-メチオニンメチルスルホニウム、0.3mM臭化亜
鉛、1.2mM DA-67、および0.01％トリトンX-100］50μl
を添加して混合し、37℃にて約５分間反応させた。な
お、ＨＣＭＴａｓｅの１Uは、D-メチオニンメチルスル
ホニウムをメチル供与体とし、ホモシステインをメチル
受容体として用いたとき、１分間あたり１μmolのD-メ
チオニン合成を触媒する酵素量である。次に、測定試薬
Ｂ［100mM PIPES (pH7.0)、８ｍM N-エチルマレイミ
ド、0.003mMフェロシアン化カリ、および0.01％トリト
ンX-100］150μlを添加して混合し、37℃にて約５分間
反応させた。続いて、測定試薬Ｃ［100mM PIPES (pH7.
0)、3.5U/ml D-アミノ酸オキシダーゼ、4.8U/mlパーオ
キシダーゼ、１mM FAD、および0.01％トリトンX-100］1
00μlを添加して混合し、37℃にてさらに約５分間反応
させた。測定ポイント16から34における吸光度（主波長
660nm、副波長750nm）変化を測定した。

【００７６】測定試薬Ａを４℃にて２日間および12日間
保存した後、用時調製した測定試薬ＢおよびＣをともに
用いて、上記と同様に測定した。その結果を、横軸を添
加ホモシスチン濃度、縦軸を添加したホモシステインに
対応する吸光度変化として図４に示した。図から明らか
なように、測定試薬Ａに大腸菌由来のＨＣＭＴａｓｅ
（ＹａｇＤの遺伝子産物）を用いた場合の測定結果は、
12日間の保存後も、調製直後の結果とほぼ同様の定量性
を備えており、測定試薬Ａが非常に安定であることがわ
かった。一方、酵母由来の酵素（ＭＨＴ１およびＳＡＭ
４の遺伝子産物）を用いた測定試薬Ａでは、２日間保存
後には、良好な結果が得られなかった。

【００７７】

【発明の効果】本発明の細菌由来のＨＣＭＴａｓｅを含
むホモシステイン測定用組成物および／またはキットに
より、微量濃度のホモシステインを、迅速、簡便かつ感
度よく測定することが可能になった。この組成物は、測
定試薬として混合して調製した後も安定であるため、冷
蔵保存が可能である。そのため、調製された測定試薬お
よび／またはキットの形態で販売ルートに載せることが
でき、使用時の利便性に優れている。また、測定試薬形
態で安定であるため、不安定な測定試薬を用いるより
も、測定の精度が確保され得る。

【００７８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Azwell Inc. <120> A stable composition for measuring homocysteine and a method for m easuring homocysteine therewith <130> P101A03177 <160> 6 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gaattcatgt cgcagaataa tccgtt 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ctgcagtcag cttcgcgctt ttaacg 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 aagcttaaaa tggcacgtct tcctct 26 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 aagcttttac gtgtatttct tgacggctg 29 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 aagcttaaga tgaagcgcat tccaatc 27 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 aagcttttag gagtatttat ctacagctga tgc 33

【図面の簡単な説明】

【図１】ホモシステイントランスフェラーゼおよびD-メ
チオニンメチルスルホニウムを用いるホモシステイン測
定の反応概略図である。

【図２】発現ベクターｐＫＨＣＭＴの作成の概略図であ
る。

【図３】発現ベクターｐＡＨＣＭＴの作成の概略図であ
る。

【図４】種々の量のホモシステインを添加した試料中の
ホモシステイン測定において、ＹａｇＤ、ＭＨＴ１、お
よびＳＡＭ４遺伝子由来の各ＨＣＭＴａｓｅを用いた場
合の、用時調製、２日間保存後、および12日間保存後の
それぞれの吸光度変化による定量性を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山口 誠博 大阪府茨木市上郡２−８−20 (72)発明者 坊垣 隆之 兵庫県神戸市東灘区魚崎北町８−３−20− 203 (72)発明者 峰時 俊貴 兵庫県神戸市須磨区清水台１−８−1024 (72)発明者 尾関 健二 兵庫県西宮市鳴尾町２−26−20−204 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA10 CA02 DA06 DA12 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ26 QQ80 QR06 QR49 QX01

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細菌由来のホモシステインメチルトラン
   スフェラーゼおよびD-メチオニンメチルスルホニウムを
   含む、ホモシステイン測定用組成物。
2. 【請求項２】 前記ホモシステインメチルトランスフェ
   ラーゼが大腸菌由来である、請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 前記ホモシステインメチルトランスフェ
   ラーゼが組換え酵素である、請求項１または２に記載の
   組成物。
4. 【請求項４】 さらにチオール化合物を含む、請求項１
   から３のいずれかの項に記載の組成物。
5. 【請求項５】 試料中のホモシステインを検出または測
   定するための方法であって、 （ａ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還
   元処理する工程； （ｂ）還元されたホモシステインに、細菌由来のホモシ
   ステインメチルトランスフェラーゼおよびD-メチオニン
   メチルスルホニウムを作用させ、D-メチオニンを生じさ
   せる工程；および （ｃ）生成したD-メチオニンを、（ｉ）ＳＨ試薬の存在
   下で酵素的に酸化して過酸化水素を生成させ、生成した
   過酸化水素を酸化系発色剤により発色させることによっ
   て、または（ｉｉ）D-アミノ酸変換酵素を作用させてオ
   キソ酸および／またはアンモニアを生成させ、生成した
   オキソ酸および／またはアンモニアを検出または測定す
   ることによって、検出または測定する工程、を含む、方
   法。
6. 【請求項６】 前記工程（ａ）および（ｂ）が同時に行
   われる、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記ホモシステインメチルトランスフェ
   ラーゼが大腸菌由来である、請求項５または６に記載の
   方法。
8. 【請求項８】 チオール化合物、細菌由来のホモシステ
   インメチルトランスフェラーゼ、D-メチオニンメチルス
   ルホニウム、およびD-アミノ酸変換酵素を含む、ホモシ
   ステイン測定用キット。
9. 【請求項９】 前記D-アミノ酸変換酵素が、D-アミノ酸
   オキシダーゼである、請求項８に記載のキット。
10. 【請求項１０】 前記ホモシステインメチルトランスフ
    ェラーゼが大腸菌由来である、請求項８または９に記載
    のキット。
11. 【請求項１１】 細菌由来のホモシステインメチルトラ
    ンスフェラーゼおよびD-メチオニンメチルスルホニウム
    を緩衝液中で混合して調製された、ホモシステイン測定
    試薬。
12. 【請求項１２】 前記ホモシステインメチルトランスフ
    ェラーゼが大腸菌由来である、請求項１１に記載の測定
    試薬。