KR101716322B1 - 호모시스테인 측정수단 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

상기한 목적은, 호모시스테인 측정수단 및 제조방법에 있어서, 본체를 준비하는 단계와; 호모시스테인과의 반응을 통해 이노신을 생성하는 효소를 포함하는 1차시약을 상기 본체에 도포하는 단계와; 상기 이노신과 효소 반응을 통해 생성되는 과산화수소가 형성되며, 상기 과산화수소를 통한 과산화 반응에 의해 산화물이 형성되어 발색되는 2차시약을 상기 본체에 도포하는 단계와; 상기 본체 상부에 혈구제거층 및 확산층을 적층하는 단계를 포함하는 것을 기술적 요지로 한다. 이에 의해 호모시스테인과 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색되도록 하며, 가시광선 측정기를 통해 저렴하고 간편하게 호모시스테인의 농도를 측정할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

Description

호모시스테인 측정수단 및 그 제조방법 {Homocysteine measurement means and a method of manufacturing the same}
본 발명은 호모시스테인 측정수단 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 호모시스테인과 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색되도록 하며, 가시광선 측정기를 통해 저렴하고 간편하게 호모시스테인의 농도를 측정할 수 있는 호모시스테인 측정수단 및 그 제조방법에 관한 것이다.
호모시스테인(homocysteine)은 싸이올(thiol)기를 포함하는 아미노산으로, 신체 내에서 단백질을 분해할 때 생성되는 물질이다. 체내조직의 생성, 유지를 위해서 일정량의 호모시스테인을 필요로 하지만, 호모시스테인이 과량이 되는 경우에는 심장병, 뇌졸증 등 혈관성 질환의 원인이 된다. 즉 호모시스테인은 동맥손상의 위험인자로 고농도의 호모시스테인은 콜레스테롤 등 다른 물질들이 혈관에 축적되게 하여 동맥 혈관벽을 손상시킨다. 이렇게 손상된 동맥은 결국 좁아지거나 완전히 막히게 되어 관상동맥질환, 뇌졸중, 심장마비 등 혈관성 질환을 일으키는 원인이 된다. 또한 호모시스테인은 심혈관계 질환에 대한 위험도를 증가시키는 독립적인 위험인자임과 동시에 다른 위험인자의 영향을 더욱 증가시키는 역할을 한다.
최근 엽산 및 비타민 B12 결핍과 같이 흔히 발생하는 유전적 및 후천적 인자가 과호모시스틴혈증을 유발하는 것으로 추정되며, 이들을 투여함으로써 증가된 호모시스테인 수치를 감소시켜 심혈관계 질환의 발생 위험을 감소시키고자 하는 시도가 이루어지는 등 호모시스테인 관련 연구는 국내외적으로 매우 활발하게 이루어지고 있다. 특히 국내에서도 관상동맥질환으로 인한 사망률이 증가하고 있어 이에 대한 일반인들의 관심 또한 증가하고 있는 상황으로, 호모시스테인과 같은 위험인자의 관리에 대한 필요성은 명백하다고 할 수 있다. 따라서 이러한 임상적 요구에 따라 호모시스테인의 정확한 측정 및 관찰은 혈관계 질환의 위험도 평가, 진단, 예방 및 치료에 있어서 기본이 된다.
종래의 호모시스테인 측정방법으로는 방사선효소측정법, 가스크로마토그래피-질량분광법(gaschromatography-mass spectometry), 형광검출법에 의한 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)법, 전기화학검출법에 의한 HPLC법, 자동화된 이온 교환 크로마토그래피법, 형광편광면역측정법(fluorescence polarization immunoassay,FPIA) 등이 알려져 있다. 이 중에서 HPLC법이 표준방법으로 이용되어 왔으나, 내부표준물질을 사용하여야 하고 정밀도와 정확도가 높기는 하나 이를 위해 숙달된 인력을 필요로 하며 분석 과정에서 많은 시간과 노력이 들어 대량의 검사 결과 및 신속한 결과 보고가 불가능한 단점이 있다. 따라서 이러한 점들을 보완 극복할 수 있는 보다 정확하고 간편한 새로운 측정법 개발을 위한 시도가 꾸준히 진행되어 왔다. 그 중 하나로 시액타입의 검사 키트를 이용하는 방법이 있는데, 진단검사실에서 실시되고 있는 호모시스테인 검사 키트는 시액 타입으로 두 종류 이상의 시액을 사용하고, 각각의 시액을 시간별로 정량을 투입해야 하며, 이에 따른 정밀 장비가 필요하다. 또한 키트를 이용한 검사는 340nm 자외선 영역의 광원으로 측정하기 때문에 고가의 자외선 센서를 필요로 한다. 뿐만 아니라 전혈 샘플에서는 검사가 불가능하며, 전혈에서 혈청을 분리하는 선행 작업이 필요하다는 단점이 있다.
대한민국특허청 등록특허 제10-0487911호 대한민국특허청 공개특허 제10-2012-0024280호
따라서 본 발명의 목적은, 호모시스테인과 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색되도록 하며, 가시광선 측정기를 통해 저렴하고 간편하게 호모시스테인의 농도를 측정할 수 있는 호모시스테인 측정수단 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적은, 본체를 준비하는 단계와; 호모시스테인과의 반응을 통해 이노신을 생성하는 효소를 포함하는 1차시약을 상기 본체에 도포하는 단계와; 상기 이노신과 효소 반응을 통해 생성되는 과산화수소가 형성되며, 상기 과산화수소를 통한 과산화 반응에 의해 산화물이 형성되어 발색되는 2차시약을 상기 본체에 도포하는 단계와; 상기 본체 상부에 혈구제거층 및 확산층을 적층하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법에 의해 달성된다.
여기서, 상기 1차시약은, 완충제(buffer), 호모시스테인 메틸트랜스페라제(homocysteine methyltransferase), S-아데노실호모시스테인 히드로라아제(S-adenosylhomocysteine hydrolase), 아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase), S-아데노실메티오닌(S-adenocylmethionine)을 포함하며, 상기 1차시약에 포함된 상기 호모시스테인 메틸트랜스페라제를 통해 측정대상 샘플에 포함된 상기 호모시스테인 및 S-아데노실메티오닌을 S-아데노실호모시스테인 및 메티오닌으로 효소반응시키고, 상기 S-아데노실호모시스테인을 상기 1차시약에 포함된 S-아데노실호모시스테인 히드로라아제를 통해 아데노신으로 효소반응시키고, 상기 아데노신을 상기 1차시약에 포함된 상기 아데노신 디아미나아제를 통해 이노신 및 암모늄으로 효소반응이 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 2차시약은, 완충제, 발색제, 계면활성제, 퓨린 뉴클레오사이드 포르포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase), 잔틴 옥시다아제(xanthine oxidase), 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine)을 포함하며, 상기 2차시약에 포함된 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제를 통해 이노신을 히포잔틴으로 효소반응시키고, 상기 히포잔틴을 상기 2차시약에 포함된 잔틴 옥시다아제를 통해 요산 및 과산화수소로 효소반응 시키고, 상기 요산을 상기 2차시약에 포함된 퍼옥시다아제, 4-아미노안티피린 및 발색제를 통해 산화물로 효소반응이 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 완충제는, HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid), PIPES(1,4-Piperazinediethanesulfonic acid), Tris(hydroxymethyl)aminomethane , MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid) hydrate, 포스페이트(Phosphate) 계 완충제 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택되며, pH가 6.5 내지 8.2인 것이 바람직하다.
상기 발색제는, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline(MAOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline(DAOS), 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine, 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride, o-Toluidine, 3-methyl-2-benzothlazolinone hydrazone hydrochloride (MBTH), 8-anilino-1-naphthalenesulfonate (ANS) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 본체는 다공성 매트릭스로 이루어지며, 0.1 내지 20㎛의 구멍들이 형성되며, 상기 1차시약을 상기 본체에 도포하는 단계 이후에, 상기 1차시약을 건조하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
상기한 목적은 또한, 본체와, 호모시스테인과의 반응을 통해 이노신을 생성하는 효소를 포함하는 1차시약과, 상기 이노신과 효소 반응을 통해 생성되는 과산화수소가 형성되며 상기 과산화수소를 통한 과산화 반응에 의해 산화물이 형성되어 발색되는 2차시약으로 이루어지는 반응층과; 상기 반응층의 상부에 적층되는 혈구제거층 및 확산층을 포함하는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단에 의해서도 달성된다.
상술한 본 발명의 구성에 따르면 호모시스테인과 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색되도록 하며, 가시광선 측정기를 통해 저렴하고 간편하게 호모시스테인의 농도를 측정할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 호모시스테인 측정수단의 단면도이고,
호모시스테인 측정수단 제조방법을 나타낸 순서도이다.
이하 본 발명에 따른 호모시스테인 측정수단 및 그 제조방법을 도면을 통해 상세히 설명한다.
도 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 호모시스테인 측정수단은 반응층(10), 혈구제거층(30) 및 확산층(50)이 순차적으로 적층된다. 반응층(10)은 본체와, 본체를 침지 방법으로 도포하는 1차시약 및 2차시약으로 이루어진다. 이러한 1차시약은 호모시스테인과의 반응을 통해 이노신을 생성하는 효소를 포함하며, 2차시약은 이노신과 효소 반응을 통해 생성되는 과산화수소가 형성되며, 과산화수소를 통한 과산화 반응에 의해 산화물이 형성되어 발색되는 조성물로 이루어진다.
혈구제거층(30)의 경우 호모시스테인 측정대상인 전혈 샘플을 그대로 떨어뜨려 전혈 샘플 내의 혈구를 제거하여 혈청만 남도록 하기 위한 층이며, 확산층(50)의 경우 전혈 샘플이 측정수단 위에서 확산되어 혈구제거층(30) 및 반응층(10)과 골고루 반응하도록 하기 위해 형성된 것이다.
이와 같은 호모시스테인 측정수단 제조방법은 먼저, 본체, 1차시약 및 2차시약을 각각 준비한다(S1).
본체, 1차시약 및 2차시약을 통해 반응층(10)이 형성된다. 본체는 1차시약 및 2차시약이 침지되는 고체 매트릭스를 의미하며, 폴리설폰(polysulfone) 재질의 다공성 매트릭스로 추후에 샘플 중 혈청과 직접 접촉한다. 다공성 매트릭스인 본체는 비대칭 막으로 구성되어 상부의 큰 구멍으로는 샘플을 흡수하며, 하부의 작은구멍으로는 샘플이 빠르게 전개되도록 설계하는 것이 바람직하다. 여기서 상부 및 하부 구멍의 크기는 0.1 내지 20㎛이며, 상부 및 하부 구멍의 비율은 30 내지 50 : 1로 구성하는 것이 바람직하다. 본체 구멍의 크기가 0.1㎛ 미만일 경우 샘플이 제대로 본체 내로 스며들지 못하며, 20㎛를 초과할 경우 본체에 도포될 1차시약 및 2차시약이 외부로 흘러내리게 된다. 본체의 두께는 100 내지 200㎛로 이루어지는데, 100㎛ 미만일 경우 두께가 얇아 1차시약 및 2차시약이 충분히 도포되지 못하며, 200㎛를 초과할 경우 필요 이상으로 두께가 두꺼워져 제조단가가 상승한다는 단점이 있다.
이러한 본체는 이후에 컬러 결정 시약, 효소, 계면활성제 및 고분자가 포함되는데, 본체가 샘플 중 혈청과 접촉시 효소 반응이 먼저 일어나고, 효소 반응에 의해 생성된 반응물과 컬러 결정 시약과 반응하여 가시광선 영역의 색을 나타내게 된다.
본체에 1차시약을 도포한다(S2).
다공성 매트릭스로 이루어진 본체에 1차시약을 도포한다. 1차시약을 도포하는 방법으로는 준비된 1차시약에 본체를 침지시켜 1차시약이 본체 내에 충분히 스며들도록 한다. 그 후 열풍건조를 통해 1차시약이 본체로부터 흘러내리지 않도록 건조한다.
이러한 1차시약은 완충제(buffer), 호모시스테인 메틸트랜스페라제(homocysteine methyltransferase), S-아데노실호모시스테인 히드로라아제(S-adenosylhomocysteine hydrolase), 아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase), S-아데노실메티오닌(S-adenocylmethionine)으로 구성된다.
여기서 완충제는 효소 반응이 적절히 이루어질 수 있는 최적의 조건을 조성할 뿐 아니라 조성된 시약의 pH와 다른 pH 값을 가지는 샘플을 측정할 경우에도 발색제의 pH에 영향을 받지 않도록 하기 위해 사용된다. 본 발명의 바람직한 완충제의 pH 범위는 6.5 내지 8.2이며, pH가 6.5 미만일 경우 발색 감도가 낮아져 호모시스테인의 양을 제대로 측정할 수 없으며, 8.2를 초과할 경우 발색 안정도가 떨어진다는 문제가 생긴다.
본 발명의 바람직한 완충제는 HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid), PIPES(1,4-Piperazinediethanesulfonic acid), Tris(hydroxymethyl)aminomethane , MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid) hydrate, 포스페이트(Phosphate) 계 완충제 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 그 중 포스페이트 계인 포타슘 포스페이트(Potassium phosphate)가 가장 적절하며, 15 내지 100mM 농도로 이루어지는 것이 바람직하다. 완충제의 농도는 완충제는 pH와 같은 영향을 끼치게 된다. 즉 완충제의 농도가 15mM 미만일 경우 발색 감도가 낮아져 호모시스테인의 양을 제대로 측정할 수 없으며, 100mM를 초과할 경우 발색 안정도가 떨어진다는 문제가 생긴다. 가장 바람직한 농도는 50mM이다.
1차시약에 포함되는 호모시스테인 메틸트랜스페라제(homocysteine methyltransferase) 효소는, 측정대상인 샘플에 존재하는 호모시스테인(homocysteine, Hcy) 및 S-아데노실메티오닌(S-adenocylmethionine, SAM)과 반응하여 S-아데노실호모시스테인(S-adenosylhomocysteine, SAH) 및 메티오닌(methionine)이 생성된다. 이러한 호모시스테임 메틸트랜스페라제는 10 내지 300ku/L 농도로 포함되는 것이 바람직하다. 농도가 10ku/L 미만일 경우 본체 내에 골고루 존재하지 않아 샘플 내의 호모시스테인과 충분히 반응하지 않고 남는 호모시스테인이 생길 수 있으며 이로 인해 정확한 호모시스테인의 양을 확인하기 어렵다. 또한 300ku/L을 초과할 경우 양이 과도하게 많아 다른 효소가 본체 내에 배치되는 것을 방해한다.
S-아데노실호모시스테인 히드로라아제(S-adenosylhomocysteine hydrolase) 효소는 샘플에 존재하는 호모시스테인과 메틸트랜스페라제 효소와 반응하여 형성된 S-아데노실호모시스테인 및 메티오닌 중 S-아데노실호모시스테인과 반응하여 아데노신(adenosine)을 생성시킨다. 여기서 S-아데노실호모시스테인 히드로라아제 효소는 10 내지 100ku/L 포함되는 것이 바람직한데, 10ku/L 미만일 경우 S-아데노실호모시스테인이 충분히 반응하지 않고 잔존하게 될 수 있으며, 100ku/L을 초과할 경우 양이 많아 그만큼 다른 효소가 측정수단 내에 존재하지 못하게 된다.
아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase) 효소는 생성된 아데노신과 반응하여 이노신(inosine) 및 암모니아(NH3)를 생성한다. 종래의 경우 이 중 이노신이 아닌 암모니아를 이용하여 다음 효소 반응을 진행하는데 비해, 본 발명은 암모니아가 아닌 이노신을 이용하여 다음 효소와 반응한다.
본체에 2차시약을 도포하여 반응층을 형성한다(S3).
1차시약이 도포된 후 완전히 건조시킨 상태의 본체를 2차시약 내에 침지시켜 본체에 2차시약이 도포되도록 한다. 2차시약이 도포된 본체는 완전히 건조시켜 흘러내리지 않도록 한다. 1차시약과 2차시약의 경우 한꺼번에 혼합하여 같이 본체에 도포할 경우 1차시약과 2차시약 간에 원하지 않는 반응이 일어나기 때문에 이를 방지하기 위해 1차시약을 도포 및 건조한 후 2차시약을 도포 및 건조하는 과정을 거치게 된다.
2차시약은 완충제, 발색제, 계면활성제, 퓨린 뉴클레오사이드 포르포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase), 잔틴 옥시다아제(xanthine oxidase), 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine)을 포함한다.
여기서 완충제는 1차시약에 사용되는 완충제와 마찬가지로 효소 반응이 적절히 이루어질 수 있는 최적의 조건을 조성할 뿐 아니라 조성된 시약의 pH와 다른 pH 값을 가지는 샘플을 측정할 경우에도 발색제의 pH에 영향을 받지 않도록 하기 위해 사용된다. 이러한 완충제는 1차시약과 동일한 종류 및 농도로 이루어진 것을 사용하는 것이 가장 바람직하나 경우에 따라서는 다른 완충제를 사용할 수도 있다.
발색제는 호모시스테인이 효소와 여러 단계를 거쳐 반응한 다음 가시광선 영역에서 확인될 수 있도록 첨가하는 것으로, 과산화수소의 분광 측정과 관련된 발색제로 물에 녹는 아닐린(aniline) 계열의 시약이 바람직하다. 아닐린 계열의 시약은 N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline(MAOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline(DAOS), 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine, 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride, o-Toluidine, 3-methyl-2-benzothlazolinone hydrazone hydrochloride (MBTH), 8-anilino-1-naphthalenesulfonate (ANS) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 이 중 호모시스테인의 농도가 0 내지 50μmol/L에서 구간 측정 범위가 넓은 청색 계열의 발색제인 MAOS를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 발색제의 농도는 5 내지 15mM인 것을 사용하며, 그 중 적정 농도는 10mM이다. 발색제의 농도가 5mM 미만일 경우 측정수단의 발색 감도가 낮아지고, 15mM를 초과할 경우 발색 감도가 높아 호모시스테인 측정 구간의 측정수단 발색 구분이 낮아져 민감도가 떨어지게 된다.
계면활성제는 분산시약으로 측정수단의 구성물이 건조 상태로 유지되도록 하고, 안정제 역할, 측정수단 색 변화를 균일하게 유지, 측정수단 색 변화 강도를 높여주는 역할을 한다. 여기서 계면활성제는 다양한 계면활성제 중 발색 강도를 높여줄 수 있는 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS)를 사용한다. CHAPS의 농도는 5 내지 10mM로 이루어지는데, 5mM 미만일 경우 발색 증가 폭이 미미하며, 10mM를 초과할 경우 더 이상의 발색 증가 폭이 없어 그보다 높은 농도를 사용할 경우 계면활성제가 낭비된다는 단점이 있다.
2차시약에 포함된 퓨린 뉴클레오사이드 포르포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase) 효소는 1차시약을 통해 호모시스테인으로부터 형성된 이노신과 반응하여 히포잔틴(hypoxanthine)을 형성한다. 이러한 뉴클레오사이드 포르포릴라아제 효소는 40 내지 240ku/L의 농도로 첨가되는 것이 바람직한데, 40ku/L 미만의 경우 반응이 100% 일어나지 않고 일부 반응이 일어나지 않는 영역이 생겨 호모시스테인의 양을 제대로 확인할 수 없으며, 250ku/L를 초과할 경우 다른 효소와의 비율에 있어 적합하지 못하다.
생성된 히포잔틴으로부터 과산화수소를 생성시키기 위해 필요한 잔틴 옥시다아제(xanthine oxidase) 효소는 히포잔틴과 반응하게 되면 요산(uric acid) 및 과산화수소(H2O2)를 생성시킨다. 이와 같은 잔틴 옥시다아제는 20 내지 160ku/L가 사용될 수 있으며, 적정 농도는 90ku/L이다. 농도가 20ku/L 미만일 경우 일부 히포잔틴과 반응하지 않아 과산화수소가 제 용량만큼 형성되지 않을 수 있으며, 160ku/L을 초과할 경우 다른 효소와의 성분 비율이 적합하지 않다.
마지막으로 과산화수소를 통해 발색을 나타내기 위해 2차시약에는 퍼옥시다아제(peroxidase) 효소 및 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine)이 포함된다. 과산화수소의 존재 하에서 퍼옥시다아제 반응을 통해 4-아미노안티피린은 산화형이 되고, 이는 발색제인 MAOS와 반응하여 청색의 산화물이 생성된다. 여기서 퍼옥시다아제 효소의 농도는 10 내지 200ku/L가 바람직한데, 10ku/L 미만일 경우 반응이 제대로 일어나지 않으며 200ku/L일 경우 2차시약의 비율에 영향을 끼치게 된다.
반응층의 상부에 혈구제거층 및 확산층을 적층한다(S4).
본체, 1차시약 및 2차시약으로 이루어진 반응층의 상부에 순차적으로 혈구제거층 및 확산층을 적층한다. 전혈 샘플을 떨어뜨릴 경우 전혈 샘플이 먼저 측정수단에 확산층을 통해 골고루 퍼지도록 하고, 골고루 퍼진 전혈 샘플은 혈구제거층을 통해 혈구가 제거되어 혈청만 남게 된다. 이렇게 혈청만 남은 샘플은 반응층 내의 1차시약 및 2차시약과 만나 최종적으로 호모시스테인의 양을 확인할 수 있게 된다.
확산층의 경우 메쉬(mesh)로 이루어지는 것이 바람직하며, 메쉬의 사이즈는 200 내지 300㎛ 이다. 메쉬 사이즈가 200㎛ 미만일 경우 확산층을 지나 혈구제거층으로 샘플이 주입되는데 시간이 많이 소요되며, 300㎛를 초과할 경우 메쉬 간 간격이 넓어 샘플이 원활하게 확산되지 않을 수 있다.
혈구제거층의 경우 완충제 및 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol)을 혼합한 조성을 도포하여 형성된다. 여기서 완충제는 pH 7 내지 8의 HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid) 100중량부에 대해 폴리비닐알콜 5 내지 20중량부가 혼합되는 것이 바람직하다.
이하에서 본 발명의 실시예를 좀 더 명확하게 설명한다.
<실시예>
완충제 및 효소 용액으로 이루어진 1차시약과, 완충제, 발색제, 계면활성제 및 효소 용액으로 이루어진 2차시약을 준비한다. 1차시약 및 2차시약의 정확한 성분 및 혼합량은 다음 표 1 및 2에서 확인할 수 있다.
1차시약
potassium phosphate 50mM
Homocysteine methyltransterase 100ku/L
S-adenosylhomocysteine hydrolase 60ku/L
adenosine deaminase 300ku/L
S-adenocylmethionine(SAM) 6mM
2차시약
potassium phosphate 50mM
purine nucleoside phosphorylase 120ku/L
xanthine oxidase 90ku/L
peroxidase 100ku/L
CHAPS 10mM
4-aminoantipyrine 10mM
MAOS 10mM
이와 같은 조성으로 이루어진 1차시약 및 2차시약 중 1차시약 용액에 다공성 매트릭스를 침지시켜 1차시약 성분이 충분히 스며들게 한다. 그 후 1차시약으로부터 다공성 매트릭스를 꺼낸 후 유리봉으로 과잉의 용액을 제거하고, 40℃ 열풍건조기에서 10분 정도 건조한다. 건조된 다공성 매트릭스를 다시 2차시약 용액에 침지시키고 40℃ 열풍건조기에서 10분 동안 건조한 후 상부에 혈구제거층 및 확산층을 적층시켜 최종 측정수단을 제작한다.
이와 같은 방법을 통해 제작된 호모시스테인 측정수단은 측정수단에 전혈 샘플을 떨어뜨리게 되면 다음과 같은 메커니즘을 통해 호모시스테인이 발색된다.
1) Hcy + S-adenocylmethionine(SAM) → S-adenosylhomocysteine(SAH) + Methionine (효소: Hcy methyltransterase)
2) S-adenosylhomocysteine(SAH) → adenosine + Hcy (효소: SAH hydrolase)
3) adenosine → inosine + NH3 (효소 : adenosine deaminase)
4) inosine → hypoxanthine (효소 : purin nucleoside phosphorylase)
5) hypoxanthine → uric acid, H2O2 생성 (효소 : xanthine oxide)
6) MAOS + 4-aminoantipyrine + H2O2 → 산화물(청색) (효소 : peroxidase)
청색을 띄는 산화물의 경우 가시광선 영역에서 발색하기 때문에 630nm 영역에서 흡광도를 측정하였다.
<비교예>
비교 제품으로 기존에 판매되고 있는 미국 Diazyme 사의 호모시스테인 효소 분석 측정수단은 다음과 같은 메커니즘에 의해 반응이 진행된다.
1) Hcy + S-adenocylmethionine(SAM) → S-adenosylhomocysteine(SAH) + Methionine (효소: Hcy methyltransterase)
2) S-adenosylhomocysteine(SAH) → adenosine + Hcy (효소: SAH hydrolase)
3) adenosine → inosine + NH3 (효소 : adenosine deaminase)
4) NH3 + NADH ----> NAD (효소 : glutamate dehydrogenase)
최종 생성되는 NAD는 가시광선 영역에서 발색되지 않기 때문에 340nm의 자외선 영역에서 흡광도를 측정하였다.
상기 실시예 및 비교예(Diazyme 사)를 통한 측정 결과는 다음 표 3에서 확인할 수 있다.
샘플 실시예 (μmol/L) Diazyme 사 (μmol/L)
1 7 9
2 9 12
3 12 14
4 10 13
5 30 29
6 15 17
7 12 15
8 14 11
9 8 8
0 7 11
표 3은 기존에 판매되는 제품과 본 발명의 실시예의 상관성을 평가한 것으로 10개의 샘플에서 호모시스테인 수치를 측정한 것으로, 호모시스테인 측정 단위는 μmol/L이다. 측정 결과 실시예 및 Diazyme 사의 상관성 결과는 90% 정도인 것으로 나타났으며, 이를 통해 시중에 판매되고 있는 분석 키트와 본 발명의 호모시스테인 측정수단은 유사한 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
종래의 호모시스테인 측정 키트는 가시광선 영역에서 측정이 불가능하기 때문에 340nm 자외선 영역의 광원으로 측정하며, 따라서 고가의 자외선 센서를 필요로 한다. 이에 비해 본 발명의 경우 가시광선 영역에서 측정 가능하도록 호모시스테인과 효소 간의 반응을 일으키기 때문에 부피가 작고 저렴한 가시광선 광원을 통해 흡광도를 측정할 수 있다. 이로 인해 사용자가 간편하게 휴대 가능하고, 측정 비용이 저렴하여 호모시스테인의 측정이 용이하다는 장점이 있다.
10: 반응층
30: 혈구제거층
50: 확산층

Claims (11)

  1. 본체를 준비하는 단계와;
    호모시스테인과의 반응을 통해 이노신을 생성하는 효소를 포함하는 1차시약을 상기 본체에 도포하는 단계와;
    상기 이노신과 효소 반응을 통해 생성되는 과산화수소가 형성되며, 상기 과산화수소를 통한 과산화 반응에 의해 산화물이 형성되어 발색되는 2차시약을 상기 본체에 도포하는 단계와;
    상기 본체 상부에 혈구제거층 및 확산층을 적층하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 1차시약은,
    완충제(buffer), 호모시스테인 메틸트랜스페라제(homocysteine methyltransferase), S-아데노실호모시스테인 히드로라아제(S-adenosylhomocysteine hydrolase), 아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase), S-아데노실메티오닌(S-adenocylmethionine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 1차시약에 포함된 상기 호모시스테인 메틸트랜스페라제를 통해 측정대상 샘플에 포함된 상기 호모시스테인 및 S-아데노실메티오닌을 S-아데노실호모시스테인 및 메티오닌으로 효소반응시키고, 상기 S-아데노실호모시스테인을 상기 1차시약에 포함된 S-아데노실호모시스테인 히드로라아제를 통해 아데노신으로 효소반응시키고, 상기 아데노신을 상기 1차시약에 포함된 상기 아데노신 디아미나아제를 통해 이노신 및 암모늄으로 효소반응이 이루어지는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 2차시약은,
    완충제, 발색제, 계면활성제, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase), 잔틴 옥시다아제(xanthine oxidase), 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 2차시약에 포함된 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제를 통해 이노신을 히포잔틴으로 효소반응시키고, 상기 히포잔틴을 상기 2차시약에 포함된 잔틴 옥시다아제를 통해 요산 및 과산화수소로 효소반응 시키고, 상기 요산을 상기 2차시약에 포함된 퍼옥시다아제, 4-아미노안티피린 및 발색제를 통해 산화물로 효소반응이 이루어지는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법.
  6. 제 2 및 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충제는,
    HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid), PIPES(1,4-Piperazinediethanesulfonic acid), Tris(hydroxymethyl)aminomethane , MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid) hydrate, 포스페이트(Phosphate) 계 완충제 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법.
  7. 제 2 및 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충제는, pH가 6.5 내지 8.2인 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법.
  8. 제 4항에 있어서,
    상기 발색제는,
    N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline(MAOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline(DAOS), 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine, 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride, o-Toluidine, 3-methyl-2-benzothlazolinone hydrazone hydrochloride (MBTH), 8-anilino-1-naphthalenesulfonate (ANS) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 본체는 다공성 매트릭스로 이루어지며, 0.1 내지 20㎛의 구멍들이 형성되는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 1차시약을 상기 본체에 도포하는 단계 이후에,
    상기 1차시약을 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단 제조방법.
  11. 본체와; 호모시스테인과의 반응을 통해 이노신을 생성하는 효소를 포함하는 1차시약과, 상기 이노신과 효소 반응을 통해 생성되는 과산화수소가 형성되며 상기 과산화수소를 통한 과산화 반응에 의해 산화물이 형성되어 발색되는 2차시약으로 이루어지는 반응층과;
    상기 반응층의 상부에 적층되는 혈구제거층 및 확산층을 포함하는 것을 특징으로 하는 호모시스테인 측정수단.
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