KR102033470B1 - 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법 - Google Patents

1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법에 있어서, 전혈 샘플 내의 글루코스를 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)로 변환시키는 글루코스제거시약이 도포된 글루코스제거층과, 글루코스가 제거된 샘플에 포함된 1,5-안하이드로글루시톨과 효소 반응을 통해 생성되는 과산화수소(H2O2)로부터 과산화 반응에 의해 산화물이 형성되어 발색되는 글루시톨반응시약이 도포된 반응층을 형성하는 단계를 포함하는 것을 기술적 요지로 한다. 이에 의해 1,5-안하이드로글루시톨과 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색되도록 하며, 가시광선 측정기를 통해 저렴하고 간편하게 1,5-안하이드로글루시톨의 농도를 측정할 수 있다. 또한 1,5-안하이드로글루시톨과 동일한 효소 반응을 일으키는 글루코스를 전혈로부터 제거할 수 있기 때문에 전혈을 그대로 샘플로 사용하여 1,5-안하이드로글루시톨를 측정할 수 있다.

Description

1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법{Method of manufacturing 1,5-anhydroglucitol measurement means}
본 발명은 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 1,5-안하이드로글루시톨과 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색되도록 하며, 가시광선 측정기를 통해 저렴하고 간편하게 1,5-안하이드로글루시톨의 농도를 측정할 수 있는 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법을 제공하는 것이다.
1,5-안하이드로글루시톨(1,5-anhydroglucitol, 1,5-AG)는 건강한 사람의 혈중에 글루코스(glucose)의 뒤를 이어 두 번째로 많이 존재하는 글루코스 유도체(glucose derivatives)의 일종으로, 화학적 및 생화학적으로 매우 안정한 물질이다. 이러한 1,5-AG는 생리활성은 불분명하고 생체 내에서는 안정하며, 거의 대사되지 않고 요중에 배설된다. 뿐만 아니라 체내 유지량에 비하여 공급, 배설, 대사량이 극히 적어서 혈중 1,5-AG 값의 일내 변동은 거의 없고 식사의 영향을 거의 받지 않는다. 체내의 1,5-AG는 음식물에서 유래되며 혈중 1,5-AG는 신장에서 재흡수되어 극히 일부만 요중으로 배설된다. 정상인의 경우 일상에서 경구적으로 공급되는 양과 요중에 배설되는 양이 균형을 이루어 혈중 1,5-AG 값은 오랫동안 거의 일정하다. 그러나 1,5-AG는 글루코스와 구조적으로 유사하여 신장 근위세뇨관에서 경쟁적으로 재흡수가 되기 때문에 당뇨병 환자의 경우 1,5-AG의 배설이 상대적으로 증가되어 1,5-AG의 혈중농도는 감소하게 된다.
최근, 식생활이 풍요로워짐에 따라 당뇨병 환자의 수가 증가하고 있다. 당뇨병 환자의 합병증을 예방하기 위해서는 혈당수치를 건강한 자의 혈당수치에 가까운 수준으로 유지할 필요가 있으며, 환자 자신이 직접 혈당수치를 측정할 수 있도록 혈당 자가 측정장치가 널리 사용되고 있다. 그러나 혈당은 식사에 의해 변동되기 때문에 글루코스의 측정을 자주할 필요가 있어 환자의 부담이 크다. 또한 지식의 부족으로 인해 환자가 측정한 글루코스의 수치를 정확하게 해석하기 어려우며, 혈당수치를 엄밀하게 제어하는 것이 용이하지 못하다.
한편 1,5-AG는 식사의 영향을 거의 받지 않기 때문에 글루코스 측정에 비해 혈당수치를 측정하기 용이하며, 이러한 1,5-AG 검사는 다음과 같은 임상적 유용성을 갖는다. 첫째, 혈중농도가 안정적이다. 1,5-AG는 새로운 생산이나 대사의 영향을 거의 받지 않고, 일중 또는 일간 변동이 없으며, 성별, 나이, 인종, 간기능, 호르몬, 식이, 운동, 당뇨 유병기간, 치료방법 등 다른 외부 인자들의 영향이 거의 없어 요중 당배설의 정도에 따라 일정한 비율로 변화한다. 둘째, 샘플 제한 조건이 적다. HbA1c는 용혈의 영향을 받고 프룩토사민(fructosamine)은 알부민이나 빌리루빈 농도의 영향을 받는 반면, 1,5-AG는 용혈이나 지지혈증의 영향이 별로 없고 식이, 운동, 일중변동의 영향이 없으므로 언제든지 샘플 수집이 가능하다. 셋째, 1,5-AG는 다른 혈장조절지표들과 상관성이 좋으면서 혈당변화에는 민감하다. 따라서 혈당악화의 early alarm이 되고, 혈당조절감시에 있어 신뢰성 있는 검사로서 기존의 혈당조절지표를 대신하거나 부가적으로 사용할 수 있다. 넷째, 비교적 단시일 이내의 혈당조절을 반영함으로써 치료 효과를 빠르게 평가할 수 있다. 즉 1,5-AG는 요당 배설 증가에 따라 기존의 지표들에 비해 더 민감하고 빠른 감소를 보이기 때문에 현재 또는 바로 직전 혈당조절 상황을 real time으로 예민하게 반응하고, 혈당조절의 실패를 조기에 발견하여 이에 대한 적절한 대책을 강구할 수 있다. 다섯째, 1,5-AG는 간헐적인 고혈당 및 요당 배설 증가를 시사하기도 한다. 당뇨병 환자에 있어서 고혈당증 발생 횟수를 줄이고 혈당을 안정적으로 유지하는 것이 치료 및 예후에 매우 중요한데, HbA1c나 프룩토사민의 경우 비교적 긴 일정 기간의 혈당조절에 대한 평균적인 정보만 주는 것이기 때문에 1,5-AG측정이 더 유용하다. 여섯째, 측정수치의 범위가 넓다. 1,5-AG는 변동 폭이 매우 넓어서 정상에 가까운 혈당치를 보이는 경도의 고혈당 영역의 환자들에게 혈당조절의 미묘한 변화를 쉽게 발견할 수 있다. 일곱째, 당뇨 진단에 있어서 민감도 및 특이도가 높아 이상적인 검사라고 할 수 있다.
종래의 1,5-AG를 측정하는 방법으로는 가스 크로마토그래피(gas chromatography) 또는 액체 크로마토그래피(liquid chromatography)가 있으나 이러한 검사방법은 너무 번거로워 병원 검사실에서 일상검사로 흔히 사용되어지지는 못한다. 최근에는 효소로 포도당의 간섭을 제거하여 측정할 수 있는 시액검사 키트가 소개되고 있다. 시액검사 키트는 당뇨병 환자의 과거 1주간의 혈당 제어 상태를 반영하며, 환자가 직접 주 1회 정도 측정만 함으로써 당뇨병 환자가 자신의 혈당 제어 상태를 정확하게 파악할 수 있는 자가측정 키트이다. 이러한 1,5-AG 자가측정 키트가 환자에게 큰 메리트를 제공하긴 하지만 종래의 1,5-AG 측정방법은 혈구 분리가 필요한 혈청 또는 혈장을 샘플로 하는 방법이며, 측정에 필요한 샘플량도 많기 때문에 자가측정에 있어서는 적합하지 않다. 그러므로, 미량의 전혈을 그대로 샘플로 이용하는 1,5-AG 자가측정 키트는 실현되지 않고 있다.
대한민국특허청 등록특허 제10-1470661호
따라서 본 발명의 목적은, 1,5-안하이드로글루시톨과 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색되도록 하며, 가시광선 측정기를 통해 저렴하고 간편하게 1,5-안하이드로글루시톨의 농도를 측정할 수 있는 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 1,5-안하이드로글루시톨과 동일한 효소 반응을 일으키는 글루코스를 전혈로부터 제거할 수 있기 때문에 전혈을 그대로 샘플로 사용하여 1,5-안하이드로글루시톨를 측정할 수 있는 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적은, 글루코스제거시약에 글루코스제거본체를 침지시켜 글루코스제거층을 형성하는 단계; 글루시톨반응시약에 글루시톨반응본체를 침지시켜 반응층을 형성하는 단계; 상기 글루코스제거층와 상기 반응층은, 길이방향을 따라 형성된 상기 글루코스제거층의 일단부가 상기 반응층의 일단부에 적층되도록 결합하는 단계; 및 상기 반응층과 결합되지 않는 글루코스제거층 단부의 상부에, 메쉬로 이루어져 전혈샘플을 확산하는 확산층을 형성하는 단계;를 포함하여 제조되어, 상기 확산층의 상부에 상기 전혈 샘플을 떨어뜨려, 상기 전혈 샘플은 수평 방향으로 확산을 통해 상기 글루코스제거층 및 상기 반응층을 이동하여, 상기 전혈샘플로부터 글루코스를 제거하고 반응을 통해 1,5-안하이드로글루시톨의 농도를 바로 측정할 수 있는 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단을 제조하는 방법으로,
상기 글루코스제거층에 있어서, 상기 글루코스제거본체는 유리섬유 재질의 고체매트릭스로 이루어지고, 상기 글루코스제거시약은 상기 전혈 샘플 내의 글루코스를 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)로 변환시키는 시약으로 완충제, 촉진제, 글루코스변환효소 및 역반응제거시약을 포함하며, 상기 역반응제거시약은 상기 글루코스-6-포스페이트가 글루코스로 돌아가는 역반응을 제거하기 위한 시약으로 피루브산 키나아제(pyruvate kinase), 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate) 및 포스포엔올 피루브산(phospho(enol)pyruvic acid)를 포함하고,
상기 반응층에 있어서 상기 글루시톨반응본체는 나일론 재질의 고체매트릭스로 이루어지고, 상기 글루시톨반응시약은 상기 글루코스가 제거된 샘플에 포함된 1,5-안하이드로글루시톨과 효소 반응을 통해 생성되는 과산화수소(H2O2)로부터 과산화 반응에 의해 산화물이 형성되어 발색되는 시약으로 완충제, 발색제, 계면활성제, 산화반응효소, 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine)을 포함하며, 상기 산화반응효소는 1,5-안하이드로글루시톨과 반응하여 과산화수소를 생성하는 효소로 피라노스 옥시다아제(pyranose oxidase), L-소르보스 옥시다아제(L-sorbose oxidase), L-소르보스 디하이드로제나아제(L-sorbose dehydrogenase), 1,5-안하이드로글루시톨 디하이드로제나아제(1,5-anhydroglucitol dehydrogenase) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하고,
상기 전혈 샘플이 상기 반응층까지 도달하는 시간이 30 내지 90초가 되도록 하고, 상기 글루코스제거층 및 상기 반응층을 통해 전개된 전혈샘플에서 60 내지 180초 내에서 반응이 완료되어, 가시광선측정기에 의하여 1,5-안하이드로글루시톨의 농도를 측정할 수 있는 것으로,
상기 글루코스제거본체는 240 내지 400㎛의 두께로 이루어진 유리섬유 재질의 고체매트릭스이고, 상기 글루시톨반응본체는 140 내지 190㎛의 두께로 이루어진 나일론 재질의 고체매트릭스이며,
상기 글루코스제거시약의 완충제는 상기 발색제의 pH에 영향을 받지 않도록 6.5 내지 8.3의 pH 범위 및 15 내지 50mM의 농도를 가지고, 상기 글루시톨반응시약의 완충제는 50 내지 300mM의 농도를 가지는 것을 특징으로 하는, 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법에 의해 달성된다.
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상술한 본 발명의 구성에 따르면 1,5-안하이드로글루시톨과 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색되도록 하며, 가시광선 측정기를 통해 저렴하고 간편하게 1,5-안하이드로글루시톨의 농도를 측정할 수 있다.
또한 1,5-안하이드로글루시톨과 동일한 효소 반응을 일으키는 글루코스를 전혈로부터 제거할 수 있기 때문에 전혈을 그대로 샘플로 사용하여 1,5-안하이드로글루시톨를 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 단면도이고,
도 2는 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단 제조방법을 나타낸 순서도이다.
이하 본 발명에 따른 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법을 도면을 통해 상세히 설명한다.
도 1에 도시된 바와 같이 1,5-안하이드로글루시톨(1,5-anhydroglucitol, 1,5-AG) 측정수단(10)은 글루코스제거층(11) 및 반응층(13)을 포함한다. 글루코스제거층(11)은 전혈 샘플(1)을 떨어뜨려 퍼지는 영역으로 전혈 샘플(1) 내에 존재하는 글루코스(glucose)를 제거하기 위해 존재하는 층이다. 글루코스는 1,5-안하이드로글루시톨과 동일한 효소 반응을 하기 때문에 1,5-안하이드로글루시톨을 측정하는 데 있어 정확한 측정을 방해한다. 따라서 전혈 샘플(1)로부터 글루코스를 제거하여 1,5-안하이드로글루시톨 수치를 정확하게 측정할 수 있도록 한다. 글루코스제거층(11)에 떨어뜨린 전혈 샘플(1)은 글루코스제거층(11)에서 글루코스가 제거된 상태로 반응층(13)으로 이동된다. 즉 글루코스제거층(11)과 반응층(13)은 단부가 서로 결합되어 있어 글루코스가 제거된 전혈 샘플(1)이 반응층(13)으로 이동 가능하며, 반응층(13)에서 효소 반응을 통해 산화물이 형성되어 발색된다. 발색된 산화물은 가시광선 측정기를 통해 측정하여 최종적으로 1,5-안하이드로글루시톨의 양을 확인할 수 있다. 여기서 전혈 샘플은 수평 방향으로 글루코스제거층(11) 및 반응층(13)을 이동하여 1,5-안하이드로글루시톨의 양이 측정된다.
이와 같은 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단 제조방법은 먼저 도 2에 도시된 바와 같이, 글루코스제거층(11)을 제조한다(S1).
1,5-안하이드로글루시톨 측정에 사용되어지는 산화반응효소는 전혈 샘플(1) 속의 글루코스와도 반응하기 때문에 글루코스 제거 반응이 선행되어져야 한다. 따라서 글루코스 제거를 위해 글루코스를 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)로 변환시키는 글루코스제거시약을 준비한 후, 고체 매트릭스인 글루코스제거본체를 글루코스제거시약에 침지시키는 방식을 통해 도포하여 글루코스제거층(11)을 형성한다.
글루코스제거본체를 이루는 고체 매트릭스는 유리섬유 재질로 이루어진 매트릭스를 사용한다. 유리섬유 매트릭스의 경우 전혈 샘플(1)이 전개될 때 샘플(1)을 균일한 성분을 갖는 상태로 유지시켜준다는 장점과, 샘플(1)이 전개될 때 혈구를 제거가능한 효과도 있다. 이러한 글루코스제거본체는 전혈 샘플(1)의 빠른 전개를 위해서 240 내지 400㎛의 두께로 이루어진 유리섬유 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다. 글루코스제거본체의 두께가 240㎛ 미만일 경우 두께가 얇아 글루코스제거시약이 충분히 도포되지 못하며 그로 인해 글루코스가 완전히 제거되지 못하고 잔존하는 경우가 발생한다. 또한 400㎛를 초과할 경우 필요 이상으로 두께가 두꺼워져 제조단가가 상승한다는 단점이 있다. 글루코스제거본체의 사이즈는 폭 5mm, 길이 20 내지 40mm가 적당하며, 전혈 샘플(1)이 35μL에서 반응층(13)까지 도달하는 시간이 30 내지 90초가 되도록 한다.
글루코스제거본체에 도포되어 글루코스를 글루코스-6-포스페이트로 변환시키는 글루코스제거시약은 완충제, 촉진제, 글루코스변환효소 및 역반응제거시약을 포함한다. 경우에 따라서 촉진제는 글루코스제거시약에 포함되지 않아도 무방하다.
완충제(buffer)는 효소 반응이 적절히 이루어질 수 있는 최적의 조건을 조성할 뿐 아니라 조성된 시약의 pH와 다른 pH 값을 가지는 샘플을 측정할 경우에도 발색제의 pH에 영향을 받지 않도록 하기 위해 사용된다. 본 발명의 바람직한 완충제의 pH 범위는 6.5 내지 8.3이며, pH가 6.5 미만일 경우 발색 감도가 낮아져 1,5-안하이드로글루시톨의 양을 제대로 측정할 수 없으며, 8.3을 초과할 경우 발색 안정도가 떨어진다는 문제가 생긴다. 더욱 바람직한 완충제의 pH는 6.1 내지 7.0이다.
완충제는 HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid), PIPES(1,4-Piperazinediethanesulfonic acid), Tris(hydroxymethyl)aminomethane , MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid) hydrate, 포스페이트(Phosphate) 계 완충제 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이 중 본 발명에서는 HEPES 완충제가 가장 적절하며, 15 내지 50mM 농도로 이루어지는 것이 바람직하다. 완충제의 농도는 완충제의 pH와 같은 영향을 끼치게 된다. 즉 완충제의 농도가 15mM 미만일 경우 효소 반응이 원활하게 이루어지지 않아 반응층에서 글루코스의 간섭을 받게 된다. 또한 완충제의 농도가 50mM를 초과할 경우에도 마찬가지로 효소 반응이 원활하게 이루어지지 않아 글루코스가 글루코스-6-포스페이트로 변환되지 않으며 이로 인해 글루코스가 잔존하게 된다. 가장 바람직한 농도는 20mM이다.
촉진제로 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate)가 사용되는데 마그네슘 설페이트는 10 내지 40mM의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다. 마그네슘 설페이트의 농도가 10mM 미만일 경우 촉진제의 역할을 제대로 하지 못하며, 40mM를 초과할 경우 반응 속도가 과하게 빨라져 부반응(side reaction)이 발생될 수 있다.
글루코스변환효소는 글루코스를 글루코스-6-포스페이트로 변환시키는 효소를 의미하며, 글루코스에 특이성이 높은 헥소키나아제(hexokinase) 또는 글루코키나아제(glucokinase)를 사용 가능하다. 이중 본 발명에서는 헥소키나아제를 포함하는 시약을 사용하지만 글루코키나아제를 사용하여도 무방하다. 여기서 헥소키나아제 또는 글루코키나아제 효소는 50 내지 500ku/L 포함되는 것이 바람직한데, 50ku/L 미만일 경우 글루코스 제거 효과가 떨어지며, 500ku/L을 초과할 경우 더 이상의 제거효과가 없기 때문에 효소를 낭비하게 된다. 적정 농도는 400ku/L이다.
헥소키나아제 또는 글루코키나아제를 이용한 반응은 가역반응으로, 역반응 제거가 필요하다. 역반응 제거를 하지 않을 경우 글루코스-6-포스페이트가 다시 글루코스로 돌아가 글루코스 제거가 용이하지 못하게 된다. 따라서 역반응 제거를 위해 글루코스제거시약에는 역반응제거시약이 더 포함되며, 이러한 역반응제거시약은 피루브산 키나아제(pyruvate kinase), 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate) 및 포스포엔올 피루브산(phospho(enol)pyruvic acid)으로 구성된다.
역반응제거시약 중 피루브산 키나아제의 농도는 50 내지 300ku/L 범위 내로 이루어지며, 적정 농도는 150ku/L이다. 여기서 피루브산 키나아제의 농도가 50ku/L 미만일 경우 글루코스-6-포스페이트의 역반응을 제대로 제어할 수 없으며, 300ku/L을 초과할 경우 그만큼 다른 성분의 농도가 낮아져 최적의 역반응제거시약을 만들 수 없게 된다. 아데노신 5'-트리포스페이트는 5 내지 40mM이 되도록 포함되며, 가장 바람직한 농도는 20mM이다. 아데노신 5'-트리포스페이트의 농도가 5mM 미만일 경우 역반응제거시약의 역할을 제대로 수행할 수 없으며, 40mM를 초과하더라도 더 이상의 효과 증가는 없기 때문에 추가로 첨가하는 의미가 없다. 또한 포스포엔올 피루브산의 농도는 10 내지 50mM이며, 걱정 농도는 20mM이다. 포스포엔올 피루브산의 농도가 10mM 미만일 경우 역반응제거시약 중 다른 성분을 늘리더라도 글루코스의 역반응을 완전히 제어하기 어려우며, 50mM를 초과할 경우 아데노신 5'-트리포스페이트와 마찬가지로 효과 증가가 없기 때문에 시약이 낭비된다.
경우에 따라서 글루코스제거층(11)의 상부에는 전혈 샘플(1)의 확산이 용이하도록 확산층(15)을 더 포함할 수 있다. 확산층(15)의 경우 반응층(13)과 결합되지 않는 글루코스제거층(11)의 단부에 형성되며, 확산층(15)에 전혈 샘플(1)을 떨어뜨려 샘플(1)이 빠른 시간 내에 골고루 퍼져 글루코스가 더욱 효과적으로 제거되도록 할 수 있다. 이러한 확산층(15)의 경우 메쉬(mesh)로 이루어지는 것이 바람직하며, 메쉬의 사이즈는 200 내지 300㎛이다. 메쉬 사이즈가 200㎛ 미만일 경우 전혈 샘플(1)이 빠르게 퍼지지 않고 떨어뜨린 위치에 뭉쳐진 상태로 있어 글루코스 제거 속도가 늦어지며, 300㎛를 초과할 경우 메쉬 간 간격이 넓어 샘플(1)이 원활하게 확산되지 않을 수 있다. 이러한 확산층의 사이즈는 가로 5mm, 세로 5 내지 10mm가 적당하다.
1,5-안하이드로글루시톨 반응층을 제조한다(S1').
글루코스제거층(11)을 제조하는 S1 단계와는 별개로 1,5-안하이드로글루시톨 반응층을 제조한다. 즉 글루코스제거층(11)과 1,5-안하이드로글루시톨 반응층(13)은 하나의 매트릭스에 함께 배치될 수도 있지만 제조의 용이성을 위해 각각 따로 제조하는 것이 바람직하다. 반응층(13)의 경우 글루코스제거층(11)을 통해 글루코스가 제거된 샘플(1)이 이동되어 1,5-안하이드로글루시톨의 양을 확인하는 층이다. 이러한 반응층(13)을 통해 1,5-안하이드로글루시톨의 양을 확인하는 방법으로는, 샘플(1)에 존재하는 1,5-안하이드로글루시톨이 반응층(13) 내의 산화반응효소와 반응하여 산화되면서 과산화수소를 생성한다. 이렇게 얻어지는 과산화수소는 발색제와 반응하여 보라색을 띄는 착색물이 형성되며, 착색물은 가시광선 측정기를 통해 수치를 측정하여 1,5-안하이드로글루시톨의 양을 알 수 있다.
이러한 방법을 통해 1,5-안하이드로글루시톨을 측정할 수 있도록 1,5-안하이드로글루시톨을 산화 및 확인시킬 수 있는 글루시톨반응시약을 준비한 후, 고체 매트릭스인 글루시톨반응본체를 글루시톨반응시약에 침지시키는 방식을 통해 도포하여 반응층(13)을 형성한다.
글루시톨반응본체를 이루는 고체 매트릭스는 최적의 샘플 적용과 내구성이 뛰어난 나일론 6,6 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다. 나일론 6,6 매트릭스는 낮은 압력에서도 빠른 샘플 전개 속도를 나타내며 소량의 샘플량에도 적용 가능하기 때문에 미세한 양의 1,5-안하이드로글루시톨도 정확히 확인 가능하다는 장점이 있다. 이러한 글루시톨반응본체는 140 내지 190㎛의 두께로 이루어지는 것이 바람직한데, 두께가 140㎛ 미만일 경우 글루시톨반응시약을 충분히 도포하지 못하며, 190㎛를 초과할 경우 필요 이상으로 두께가 두꺼워져 그만큼 글루시톨반응시약이 도포되는 양이 증가하며 이로 인해 제조단가가 상승한다는 단점이 있다. 글루시톨반응본체는 가로 5mm, 세로 5 내지 10mm 사이즈가 적당하며, 글루코스제거층(11)을 통해 전개된 샘플(1)에서 60 내지 180초 내에서 반응이 완료되도록 한다.
글루시톨반응본체에 도포되어 1,5-안하이드로글루시톨과 산화반응을 통해 과산화수소를 발생시키는 글루시톨반응시약은 완충제, 발색제, 계면활성제, 산화반응효소, 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine)을 포함한다.
여기서 완충제는 글루코스제거시약에 사용되는 완충제와 마찬가지로 효소 반응이 적절히 이루어질 수 있는 최적의 조건을 조성할 뿐 아니라 조성된 시약의 pH와 다른 pH 값을 가지는 샘플(1)을 측정할 경우에도 발색제의 pH에 영향을 받지 않도록 하기 위해 사용된다. 이러한 완충제는 글루코스제거시약과 동일한 종류 및 농도로 이루어진 것을 사용하는 것이 바람직하나 경우에 따라서는 서로 다른 완충제를 사용할 수도 있다. 완충제의 농도는 50 내지 300mM인 것을 사용하는 것이 바람직한데, 50mM 미만일 경우 효소 반응이 원활하게 이루어지지 않아 1,5-안하이드로글루시톨의 정확한 양을 확인하기 어려우며, 300mM을 초과할 경우에도 마찬가지로 효소 반응이 원활하게 이루어지지 않는다는 문제점이 있다. 더욱 바람직한 농도는 100 내지 150mM이다. 이러한 완충제의 종류는 상기 글루코스제거시약에 기재된 종류로부터 선택 가능하다.
발색제는 1,5-안하이드로글루시톨이 산화반응효소와 반응한 다음 가시광선 영역에서 확인될 수 있도록 첨가하는 것으로, 과산화수소의 분광 측정과 관련된 발색제로 물에 녹는 아닐린(aniline) 계열의 시약이 바람직하다. 아닐린 계열의 시약은 N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline(MAOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline(DAOS), 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine, 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride, o-Toluidine, 3-methyl-2-benzothlazolinone hydrazone hydrochloride (MBTH), 8-anilino-1-naphthalenesulfonate (ANS) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 이 중 1,5-안하이드로글루시톨의 농도가 0 내지 100μmol/L에서 구간 측정 범위가 넓은 보라색 계열의 발색제인 TOOS를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 발색제의 농도는 5 내지 20mM인 것을 사용하며, 그 중 최적의 농도는 10 내지 15mM이다. 발색제의 농도가 5mM 미만일 경우 측정수단의 발색 감도가 낮아지고, 20mM를 초과할 경우 발색 감도가 높아 과산화수소의 발색 구분이 낮아져 민감도가 떨어지게 된다.
계면활성제는 분산시약으로 측정수단(10)의 구성물이 건조 상태로 유지되도록 하고, 안정제 역할, 측정수단 색 변화를 균일하게 유지, 측정수단 색 변화 강도를 높여주는 역할을 한다. 여기서 계면활성제는 다양한 계면활성제 중 발색 강도를 높여줄 수 있는 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS)를 사용한다. CHAPS의 농도는 5 내지 10mM로 이루어지는데, 5mM 미만일 경우 발색 증가 폭이 미미하며, 10mM를 초과할 경우 더 이상의 발색 증가 폭이 없어 그보다 높은 농도를 사용할 경우 계면활성제가 낭비된다는 단점이 있다.
글루시톨반응시약에는 1,5-안하이드로글루시톨의 산화반응을 위한 산화반응효소가 포함되는데, 산화반응효소와의 효소반응을 통해 1,5-안하이드로글루시톨로부터 과산화수소가 발생되고 이 과산화수소와 발색제가 반응하여 1,5-안하이드로글루시톨의 양을 확인할 수 있다. 이와 같이 1,5-안하이드로글루시톨로부터 과산화수소가 발생되고, 과산화수소가 발색되기 위해서는 산화반응효소, 퍼옥시다아제 및 4-아미노안티피린이 필요하다.
1,5-안하이드로글루시톨을 산화시키는 산화반응효소는 피라노스 옥시다아제(pyranose oxidase), L-소르보스 옥시다아제(L-sorbose oxidase), L-소르보스 디하이드로제나아제(L-sorbose dehydrogenase), 1,5-안하이드로글루시톨 디하이드로제나아제(1,5-anhydroglucitol dehydrogenase)가 있으며, 이들을 단독으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 여기서 산화반응효소는 300 내지 500ku/L의 농도를 포함하는 것이 바람직한데, 300ku/L 미만일 경우 1,5-안하이드로글루시톨이 전량 반응하지 않아 정확한 양을 측정하기 어려우며, 500ku/L를 초과할 경우 산화반응효소가 과하게 첨가되어 있기 때문에 산화반응효소가 낭비되는 단점이 있다.
1,5-안하이드로글루시톨는 산화반응효소를 통해 산화반응을 하여 생성물로 과산화수소를 얻게 된다. 글루시톨반응시약에는 퍼옥시다아제 및 4-아미노안티피린이 포함되어 있으며, 과산화수소는 퍼옥시다아제 효소와 반응을 통해 4-아미노안티피린을 산화형으로 만든다. 이와 같이 산화된 4-아미노안티피린은 발색제인 TOOS와 반응하여 보라색 산화물을 생성한다. 이와 같이 보라색 산화물은 가시광선 측정기를 통해 그 양을 확인할 수 있으며, 측정된 양은 1,5-안하이드로글루시톨의 양이 된다. 여기서 퍼옥시다아제 효소의 농도는 10 내지 200ku/L가 바람직한데, 10ku/L 미만일 경우 반응이 제대로 일어나지 않으며 200ku/L일 경우 글루시톨반응시약의 비율에 영향을 끼치게 된다.
글루코스제거층(11) 및 반응층(13)을 결합한다(S2).
도 2에 도시된 바와 같이 S1 단계를 통해 제조된 글루코스제거층(11)과 S1' 단계를 통해 제조된 반응층(13)을 결합한다. 경우에 따라서 글루코스제거층(11)과 반응층(13)을 하나의 매트릭스 내에 형성시킬 수도 있지만 시약 도포의 용이성을 생각할 경우 글루코스제거층(11)과 반응층(13)을 각각 제조한 후 이를 결합시키는 것이 바람직하다. 하지만 하나의 매트릭스에 글루코스제거층(11)과 반응층(13)을 함께 형성하여도 무방하다.
길이방향을 따라 길게 형성된 글루코스제거층(11)의 일단부와 반응층(13)의 일단부를 결합한다. 그 후 글루코스제거층(11)의 타단부에 전혈 샘플(1)을 떨어뜨리면 글루코스제거층(11)의 길이방향을 따라 전혈 샘플(1)이 이동하면서 샘플(1) 내에 글루코스가 제거되고, 글루코스가 제거된 샘플은 글루코스제거층(11)의 일단부에 결합된 반응층(13)으로 전달되어 반응층(13) 내의 반응을 통해 발색이 일어나게 된다. 따라서 반응층(13)은 글루코스제거층(11)의 길이방향의 일단부에 결합되며, 반응층(13)과 결합되지 않은 글루코스제거층(11)의 타단부에 전혈 샘플(1)을 떨어뜨리는 것이 바람직하다.
이때 글루코스제거층(11)의 일단부와 반응층(13)의 일단부는 전혈 샘플(1)이 반응층(13)으로 전달 가능하도록 반응층(13)의 전체 길이인 100길이부 중 20 내지 40길이부 정도 적층되도록 결합하는 것이 바람직하다. 적층되는 영역이 20길이부 미만일 경우 샘플(1)이 반응층으로 전달되기 용이하지 못하여 1,5-안하이드로글루시톨의 양을 확인하는 데 오랜 시간이 소요되며, 40길이부를 초과할 경우 적층되지 않고 1,5-안하이드로글루시톨이 발색되기 위한 반응층(13)의 길이가 짧아 1,5-안하이드로글루시톨의 정확한 양을 측정하기 어렵다.
경우에 따라서 결합된 글루코스제거층(11) 및 반응층(13)의 하부에 지지대(17)를 더 포함할 수도 있으며, 지지대는 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride, PVC) 소재로 이루어지는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지는 않는다.
이하에서는 본 발명의 실시예를 좀 더 명확하게 설명한다.
<실시예>
완충제, 촉진제, 글루코스변환효소 및 역반응제거시약을 포함하는 글루코스제거시약과, 완충제, 발색제, 계면활성제, 산화반응효소, 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine)을 포함하는 글루시톨반응시약을 준비한다. 글루코스제거시약 및 글루시톨반응시약은 다음 표 1 및 2에서 확인할 수 있다.
글루코스제거시약
HEOES 20mM
hexokinase 400ku/L
ATP 20mM
pyruvate kinase 300ku/L
phospho(enol)pyruvic acid 20mM
magnesium sulfate 20mM
글루시톨반응시약
HEPES 120mM
pyranose oxidase 60ku/L
peroxidase 120ku/L
TOOS 15mM
4-aminoantipyrine 15mM
CHAPS 10mM
sodium azide 10mM
이러한 성분 및 농도로 준비된 글루코스제거시약 및 글루시톨반응시약에 각각 준비된 다공성 매트릭스를 침지시켜 각각의 성분이 충분히 스며들게 한다. 그 후 글루코스제거시약 및 글루시톨반응시약으로부터 매트릭스를 꺼낸 후 유리봉으로 과잉의 시약을 제거하고, 40℃ 열풍건조기에서 10분 정도 건조하여 글루코스제거층 및 반응층을 얻는다. 얻어진 글루코스제거층은 폭 5mm 및 길이 30mm 사이즈로 제단하고, 반응층은 폭 5mm 및 길이 5mm 사이즈로 제단하여 사용한다. 이러한 글루코스제거층 및 반응층은 측정 샘플의 전개가 수평 흐름으로 되도록 수평 방향으로 배치한 후, 글루코스제거층과 반응층이 1mm 정도 겹치도록 적층시켜 이를 결합시켜 최종적으로 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단을 제조한다.
이와 같은 실시예를 통해 제조된 본 발명의 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단과, 이미 확립되어 병원에서 사용되어지고 있는 Lara 1,5-AG Auto Liquid 제품과 비교한 결과를 표 3 및 도 3을 통해 확인할 수 있다. 도 3의 그래프의 결과와 같이 두 제품 사이에는 상관식 y=0.9821x + 1.5938, 상관계수(r) = 0.952로 양호한 상관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
샘플 본 발명 (μg/mL) Lara 1,5-AG (μg/mL)
1 1 2
2 4 3
3 10 12
4 15 18
5 23 26
6 15 17
7 30 33
8 31 27
9 21 23
10 14 16
종래의 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 경우 혈구 분리가 필요한 혈청 또는 혈장을 샘플로 하는 방법이며, 측정에 필요한 샘플량도 많기 때문에 자가측정에 있어서는 적합하지 않다. 이에 비해 본원발명의 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단은 측정수단 내에 글루코스를 제거하는 층이 포함되어 있기 때문에 전혈 샘플을 그대로 떨어뜨려도 1,5-안하이드로글루시톨의 양을 측정 가능하기 때문에 사용자가 사용하기 매우 편리하다. 또한 종래의 경우 가시광선 영역에서 1,5-안하이드로글루시톨의 양을 측정하기 불가능하기 때문에 1,5-안하이드로글루시톨을 측정하기 위한 고가의 장비를 필요로 한다. 이에 비해 본 발명의 경우 가시광선 영역에서 측정 가능하도록 1,5-안하이드로글루시톨과 효소 간의 반응을 일으키기 때문에 부피가 작고 저렴한 가시광선 광원을 통해 흡광도를 측정할 수 있다. 이로 인해 사용자가 간편하게 휴대 가능하고, 측정 비용이 저렴하여 1,5-안하이드로글루시톨의 측정이 용이하다는 장점이 있다.
1: 전혈 샘플
10: 측정수단
11: 글루코스제거층
13: 반응층
15: 확산층
17: 지지대

Claims (2)

  1. 글루코스제거시약에 글루코스제거본체를 침지시켜 글루코스제거층을 형성하는 단계;
    글루시톨반응시약에 글루시톨반응본체를 침지시켜 반응층을 형성하는 단계;
    상기 글루코스제거층와 상기 반응층은, 길이방향을 따라 형성된 상기 글루코스제거층의 일단부가 상기 반응층의 일단부에 적층되도록 결합하는 단계; 및
    상기 반응층과 결합되지 않는 글루코스제거층 단부의 상부에, 메쉬로 이루어져 전혈샘플을 확산하는 확산층을 형성하는 단계;를 포함하여 제조되어,
    상기 확산층의 상부에 상기 전혈 샘플을 떨어뜨려, 상기 전혈 샘플은 수평 방향으로 확산을 통해 상기 글루코스제거층 및 상기 반응층을 이동하여, 상기 전혈샘플로부터 글루코스를 제거하고 반응을 통해 1,5-안하이드로글루시톨의 농도를 바로 측정할 수 있는 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단을 제조하는 방법으로,
    상기 글루코스제거층에 있어서, 상기 글루코스제거본체는 유리섬유 재질의 고체매트릭스로 이루어지고, 상기 글루코스제거시약은 상기 전혈 샘플 내의 글루코스를 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)로 변환시키는 시약으로 완충제, 촉진제, 글루코스변환효소 및 역반응제거시약을 포함하며, 상기 역반응제거시약은 상기 글루코스-6-포스페이트가 글루코스로 돌아가는 역반응을 제거하기 위한 시약으로 피루브산 키나아제(pyruvate kinase), 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate) 및 포스포엔올 피루브산(phospho(enol)pyruvic acid)를 포함하고,
    상기 반응층에 있어서 상기 글루시톨반응본체는 나일론 재질의 고체매트릭스로 이루어지고, 상기 글루시톨반응시약은 상기 글루코스가 제거된 샘플에 포함된 1,5-안하이드로글루시톨과 효소 반응을 통해 생성되는 과산화수소(H2O2)로부터 과산화 반응에 의해 산화물이 형성되어 발색되는 시약으로 완충제, 발색제, 계면활성제, 산화반응효소, 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine)을 포함하며, 상기 산화반응효소는 1,5-안하이드로글루시톨과 반응하여 과산화수소를 생성하는 효소로 피라노스 옥시다아제(pyranose oxidase), L-소르보스 옥시다아제(L-sorbose oxidase), L-소르보스 디하이드로제나아제(L-sorbose dehydrogenase), 1,5-안하이드로글루시톨 디하이드로제나아제(1,5-anhydroglucitol dehydrogenase) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하고,
    상기 전혈 샘플이 상기 반응층까지 도달하는 시간이 30 내지 90초가 되도록 하고, 상기 글루코스제거층 및 상기 반응층을 통해 전개된 전혈샘플에서 60 내지 180초 내에서 반응이 완료되어, 가시광선측정기에 의하여 1,5-안하이드로글루시톨의 농도를 측정할 수 있는 것으로,
    상기 글루코스제거본체는 240 내지 400㎛의 두께로 이루어진 유리섬유 재질의 고체매트릭스이고, 상기 글루시톨반응본체는 140 내지 190㎛의 두께로 이루어진 나일론 재질의 고체매트릭스이며,
    상기 글루코스제거시약의 완충제는 상기 발색제의 pH에 영향을 받지 않도록 6.5 내지 8.3의 pH 범위 및 15 내지 50mM의 농도를 가지고, 상기 글루시톨반응시약의 완충제는 50 내지 300mM의 농도를 가지는 것을 특징으로 하는, 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법.
  2. 삭제
KR1020180046214A 2018-04-20 2018-04-20 1,5-안하이드로글루시톨 측정수단의 제조방법 KR102033470B1 (ko)

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