KR101470661B1 - 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법과 그 방법에서 사용하는 센서 칩 및 측정 키트 - Google Patents

전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법과 그 방법에서 사용하는 센서 칩 및 측정 키트 Download PDF

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야요이 이리에
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Abstract

1, 5-안하이드로글루시톨의 측정에 간섭하는 글루코오스 및/또는 그 유도체를 미리 소거 또는 변환하는 공정, 및 그 후 실행되는 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 공정을 포함하고, 여기서 혈구 분리를 하지 않고 전혈 그대로로부터 글루코오스 및/또는 그 유도체를 소거 또는 변환하고, 혈구를 분리하는 일 없이 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 효소를 작용시켜서, 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정하는 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법에 의해, 원심 분리기 등을 사용하지 않고 미량의 전혈을 이용해 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 수 있게 된다. 따라서, 이 측정 방법은, 베드사이드(bedside) 혹은 진찰실에서의 1, 5-안하이드로글루시톨의 신속한 측정, 및 가정에서 환자에 의한 자가 측정에 적용할 수 있다.

Description

전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법과 그 방법에서 사용하는 센서 칩 및 측정 키트{METHOD FOR MEASURING 1, 5-ANHYDROGLUCITOL IN WHOLE BLOOD, AND SENSOR CHIP AND MEASUREMENT KIT TO BE USED IN THE METHOD}
본 발명은, 글루코오스 및/또는 그 유도체의 간섭을 받는, 혈액 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 방법에 관한 것으로, 특히, 검체(檢體)로서 전혈(全血)을 사용하고, 혈구(血球) 분리를 필요로 하지 않는 것을 특징으로 하는 혈액 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 전기 화학적 측정 방법, 상기 측정 방법에 사용하는 센서 칩, 및 상기 센서 칩을 갖춘 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 키트(kit)에 관한 것이다.
최근, 식생활이 풍요로와짐에 따라 당뇨병 환자의 수가 증가하고 있다. 당뇨병 환자의 합병증을 예방하기 위해서 혈당값을 건강한 자의 혈당값에 가까운 수준으로 유지할 필요가 있으며, 환자 자신이 자택에서 혈당값을 측정할 수 있도록 혈당 자가 측정 장치가 널리 사용되고 있다. 그러나, 혈당은 식사에 의해 변동하기 때문에, 측정을 자주 할 필요가 있어 환자의 부담이 크다. 또한 지식의 부족으로 인해 환자가 측정한 값을 정확하게 해석하는 것도 어려우며, 혈당값을 엄밀하게 제어하는 것은 용이하지 않다.
한편, 1, 5-안하이드로글루시톨은 식사의 영향을 받지 않고 당뇨병 환자의 과거 1주간의 혈당 제어 상태를 반영하므로, 자택에서 혼자 「1주간 1회」 측정만 함으로써 당뇨병 환자가 자신의 혈당 제어 상태를 정확하게 파악할 수 있다. 1, 5-안하이드로글루시톨 자가 측정 키트가 환자에게 큰 메리트(merit)를 제공하지만, 종래의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법은 혈구 분리가 필요한 혈청 또는 혈장을 검체로 하는 방법이며, 측정에 필요한 검체량도 많기 때문에 자가 측정에는 적합하지 않다. 그러므로, 미량의 전혈을 그대로 검체로서 이용하는 것을 포함하는 1, 5-안하이드로글루시톨의 자가 측정 키트는 실현되지 않고 있다.
특허 문헌 1∼9에 기재되어 있는 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법은, 사용되는 검체가 전혈이 아니고 혈청 또는 혈장이며, 또한, 전기 화학적인 측정 방법이 아니다.
또한, 전혈 검체가 일본국 와코 쥰야쿠 공업(和光純藥工業)(주)에서 판매되고 있는 동물용 1, 5 AG 키트(니혼 카야쿠(日本化藥)(주))에 사용되는 경우, 혈액은, 정제수 또는 10mM의 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA) 수용액을 더해서 용혈(溶血)하고, 또한 원심 분리하여, 그 상청을 칼럼 처리하고, 1, 5-안하이드로글루시톨을 색소(pigment)를 이용한 비색법(比色法)으로 측정하고 있다. 환언하면, 이 방법은, 혈구 분리를 하지 않고 전혈을 그대로 검체로 하는 1, 5-안하이드로글루시톨의 전기 화학적인 측정 방법이 아니다.
종래에 검체로서 전혈이 아닌 혈청 또는 혈장을 이용하는 이유는, 혈구 중에도 글루코오스가 포함되어 있기 때문이다. 전혈에 글루코오스를 소거 또는 변환하 는 시약을 첨가하더라도 혈구 중의 글루코오스가 소거 또는 변환되지 않고 남아 있다. 혈액 중 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 공정에 있어서 글루코오스가 세포막을 통해서 새 나오기 때문에, 글루코오스에 의한 간섭이 완전히 제거될 수 없다. 혈액 중 1, 5-안하이드로글루시톨의 검출 반응에서, 산화 환원 능력이 있는 적혈구 중의 헤모글로빈(hemoglobin)에 의한 방해가 예상된다. 지금까지, 전혈을 이용해서 효소적으로 글루코오스를 미리 소거 또는 변환하여, 혈구 분리하는 일없이 혈액 중 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 방법은 알려져 있지 않다.
또한, 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정하는 방법은, 비특허 문헌 1, 특허 문헌 10 및 특허 문헌 11에 기재되어 있다. 그러나, 비특허 문헌 1에는, 과산화 수소 전극과 효소 고정화 막(膜)으로 구성되는 효소 센서를 이용하여 소변 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 글루코오스 등이 공존하는 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정에 대해서는 언급되지 않고 있다. 특허 문헌 10에서는, 탈(脫)수소 효소(dehydrogenase)와 전자 수용체로서 페나진 메토설페이트(phenazine methosulfate)를 이용해서 전류 적정법(電流 滴定法; amperometry)에 의해 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하고 있다. 그러나, 1, 5-안하이드로글루시톨의 표품에 관한 실시예만이 기재되어 있으며, 전혈 중의 측정에 대해서는 일체 기재가 없다. 특허 문헌 11에는, 1, 5-안하이드로글루시톨을 산화하는 능력을 갖는 효소를 작용시켜서, 생성되는 과산화 수소를 과산화 수소 전극을 사용하여 전기 화학적으로 측정하고 있다. 그러나, 이 측정에 있어서도 혈청을 사용하고 있으며, 전혈을 사용하는 측정 방법이 아니다.
그런데, 1, 5-안하이드로글루시톨은 글루코오스의 1 위치가 환원된 화합물이며, 글루코오스와 지극히 닮은 화학 구조를 이루고 있다. 그러므로, 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정에 사용하는 많은 효소는 글루코오스와도 반응한다. 혈액 중에는 1, 5-안하이드로글루시톨에 비해 20배 이상의 다량의 글루코오스가 포함되어 있다. 그러므로, 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하기 위해서는, 글루코오스를 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하기 위한 효소와 반응하지 않도록 어떠한 방법으로든 소거(消去) 또는 변환하지 않으면 안 된다. 더욱이, 이 변환에 의해 생성된 글루코오스 유도체가, 또한 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하기 위한 효소와 반응할 경우에는, 이들 유도체도 소거 또는 변환하지 않으면 안 된다.
특허 문헌 1에서는 글루코오스를 글루코오스 옥시다제(glucose oxydase)에 의한 산화 또는 헥소키나아제(hexokinase)에 의한 인산화(phosphorylating)를 시키는 것에 의해, 특허 문헌 2에서는 글루코오스를 글루코오스 옥시다제와 글루코노락토나아제(gluconolactonase), 또는, 글루코오스 디하이드로게나아제와 글루코노락토나아제에 의한 산화를 시키는 것에 의해, 특허 문헌 3 및 특허 문헌 4에서는, 글루코오스를 헥소키나아제, 포스포헥소오스 이소메라아제 및 6-포스포프룩토키나아제(phosphofructokinase), 또는, 글루코오스 이소메라아제, 프룩토키나아제 및 6-포스포프룩토키나아제에 의한 프룩토오스-1, 6- 다이포스페이트에의 변환에 의해, 특허 문헌 5에서는 글루코키나아제(glucokinase) 또는 헥소키나아제에 의한 인산화를 하는 것에 의해, 특허 문헌 6에서는 글루코오스를 글루코오스―6-인산으로 인산화시키는 효소에 의한 인산화를 하는 것에 의해 글루코오스의 소거 또는 변환을 실 행하고 있으며, 그 다음에 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정을 실행하고 있다. 이들 문헌 중에서, 글루코오스는 글루코노-1, 5-락톤, 글루코오스―6-인산, 글루콘산, 프룩토오스-6-인산이나 프룩토오스-1, 6-다이포스페이트 등으로 변환되고 있다. 그러나, 현재까지 전혈을 이용해 효소에 의해 글루코오스를 소거 또는 변환한 후, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 양을 효소를 이용해 전기 화학적으로 측정하는 것에 대해서는 알려져 있지 않다.
(특허 문헌 1)
일본국 특허 제2983015호 공보
(특허 문헌 2)
일본국 특개2001-78797호 공보
(특허 문헌 3)
일본국 특허 제3170320호 공보
(특허 문헌 4)
일본국 특허 제3217180호 공보
(특허 문헌 5)
일본국 특개2001-116756호 공보
(특허 문헌 6)
일본국 특허 제2872983호 공보
(특허 문헌 7)
일본국 특개소63-185397호 공보
(특허 문헌 8)
일본국 특개평10-191998호 공보
(특허 문헌 9)
일본국 특개평8-70893호 공보
(특허 문헌 10)
일본국 특개평7-67697호 공보
(특허 문헌 11)
일본국 특개소62-79780호 공보
(특허 문헌 12)
일본국 특개평5-304997호 공보
(특허 문헌 13)
일본국 특개소63-22185호 공보
(특허 문헌 14)
일본국 특개평2-268679호 공보
(특허 문헌 15)
일본국 특개2000-135079호 공보
(특허 문헌 16)
일본국 특개평11-18760호 공보
(특허 문헌 17)
일본국 특개2000-175698호 공보
(특허 문헌 18)
일본국 특개평10-179140호 공보
(비특허 문헌 1)
Biomed. Chromatogr., vol. 7, p.41(1993)
(발명이 해결하려고 하는 과제)
최근, 임상 검사에 있어서, 현장 검사(Point of Care Testing)라고 불리는 베드사이드(bedside) 혹은 진찰실에서 여러 가지 검사 항목의 신속한 측정이 실행되게 되고, 또한, 환자 자신에 의한 가정에서의 혈당 측정도 증가하여 왔다. 그 경우에 혈청이나 혈장을 얻기 위한 원심 분리기 등의 사용은 번잡하고 시간을 요하기 때문에, 실제의 임상 현장에서의 사용은 어렵다. 특히, 환자 자신에 의한 가정에서의 측정에 있어서는, 랜싯 디바이스(lancet device)와 샘플 채취용 기구를 이용해서 채취되는 몇십 μL 이하의 미량을 샘플로서 사용한다. 그러므로, 원심 분리기를 사용해서 혈청을 얻는 측정 방법을 채용할 수는 없다. 따라서, 전혈을 그대로 검체로서 이용하는 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법이 기대되고 있다.
(과제를 해결하기 위한 수단)
본 발명의 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의(銳意) 각종 연구를 실행하였다. 그 결과, 전혈을 그대로 검체로서 이용하는 혈액 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 전기 화학적 측정 방법을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 다음과 같다.
(1) 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 방법이며, 그 측정에 간섭하는 글루코오스 및/또는 그 유도체를 소거 또는 변환하는 공정과, 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 후속 공정을 포함하고, 혈구 분리를 하지 않고 전혈이 그대로 사용되어서 글루코오스 및/또는 그 유도체를 소거 또는 변환하고, 또한 혈구를 분리하는 일 없이 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 효소를 작용시켜서, 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정하는, 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(2) 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하기 위한 효소가 산화환원효소인 상기 (1)에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(3) 산화환원효소가 피라노오스 옥시다아제, L-솔보스 옥시다아제(sorbose oxidase) 또는 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제인 상기 (2)에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(4) 산화환원효소가 슈도모나스(Pseudomonas)속 유래 또는 아그로박테리움(Agrobacterium)속 유래인 상기 (3)에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(5) 산화환원 매개체(redox mediator)의 존재 하에, 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정하는 상기 (1)∼(4)의 어느 1항에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(6) 산화환원 매개체가 오스뮴(osmium) 착체(錯體), 퀴논(quinone)계 화합물, 페로센(ferrocene)계 화합물, 페노티아진(phenothiazine)계 화합물, 페녹사진(phenoxazine)계 화합물, 페나진(phenazine)계 화합물, 인도페놀계 화합물, 다이페닐아민(diphenylamine)계 화합물, 또는 페놀계 화합물인 상기 (5)에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(7) 혈구 분리를 하지 않고 전혈 그대로 글루코오스 및/또는 그 유도체를 효소를 이용해서 소거 또는 변환하는 상기 (1)∼(6)의 어느 1항에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(8) 안정화제의 존재 하에, 전기 화학적으로 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 상기 (1)∼(7)의 어느 1항에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(9) 안정화제가 2-술포벤조산 또는 3-술포벤조산인 상기 (8)에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(10) 1, 5-안하이드로글루시톨을 전류 적정법, 전기량법(coulometry) 또는 순환 전압전류법(cyclic voltammentry)에 의해 전기 화학적으로 측정하는 상기 (1)∼(9)의 어느 1항에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(11) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체가 포함되어 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 작용극(作用極)과, 반대극을 갖는 전극을 이용해서 전기 화학적으로 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 상기 (1)∼(10)의 어느 1항에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(12) 차동형(差動型) 전극을 이용해서 전기 화학적으로 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 상기 (11)에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(13) 차동형 전극이, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체가 함유되어 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극과, 산화환원 매개체는 함유되어 있지만 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소는 함유되어 있지 않은 블랭크(blank) 측정용 작용극과, 반대극을 구비하는 전극인 상기 (12)에 따른 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(14) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체가 함유되어 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극과, 반대극을 구비하는 전극을 포함하는, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩.
(15) 글루코오스 및/또는 그 유도체를 소거 또는 변환하기 위한 시약을 더 포함하는, 상기 (14)에 따른 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩.
(16) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체가 함유되어 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극과, 산화환원 매개체는 함유되어 있지만 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소는 함유되어 있지 않은 블랭크 측정용 작용극과, 반대극을 갖는 전극으로 이루어지는 차동형 전극을 포함하는, 상기 (14) 또는 (15)에 따른 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩.
(17) 상기 (14)∼(16)의 어느 1항에 따른 센서 칩, 채혈에 사용하는 랜싯 디바이스 및 1, 5-안하이드로글루시톨용 측정기를 포함하는, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 키트.
(18) 글루코오스 및/또는 그 유도체를 소거 또는 변환하기 위한 시약을 더 포함하는, 상기 (17)에 따른 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 키트.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면, 검체로서 전혈을 이용하여 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있고, 혈구 분리를 필요로 하지 않으므로, 원심 분리기 등을 사용하는 일이 없고 측정이 간편하게 되어, 환자 자신에 의한 가정에서의 측정이 가능하게 된다.
도 1은 본 발명에서 이용하는 전극(11)을 간략화해서 나타낸 도면.
도 2는 본 발명에서 이용하는 전극(12)을 간략화해서 나타낸 도면.
도 3은 본 발명에서 이용하는 전극(13)을 간략화해서 나타낸 도면.
도 4는 참고 예 9로 작성한 검량선(檢量線).
도 5는 참고 예 10의 표 9의 시험 No.1에 관한 검량선.
도 6은 참고 예 10의 표 9의 시험 No.2에 관한 검량선.
도 7은 참고 예 10의 표 9의 시험 No.3에 관한 검량선.
도 8은 참고 예 10의 표 9의 시험 No.4에 관한 검량선.
도 9는 참고 예 10의 표 9의 시험 No.5에 관한 검량선.
도 10은 참고 예 10의 표 9의 시험 No.6에 관한 검량선.
도 11은 참고 예 10의 표 9의 시험 No.7에 관한 검량선.
도 12는 참고 예 10의 표 9의 시험 No.8에 관한 검량선.
도 13은 참고 예 10의 표 9의 시험 No.9에 관한 검량선.
도 14는 참고 예 11의 표 10의 시험 No.1에 관한 검량선.
도 15는 참고 예 11의 표 10의 시험 No.2에 관한 검량선.
도 16은 참고 예 11의 표 10의 시험 No.3에 관한 검량선.
도 17은 참고 예 11의 표 10의 시험 No.4에 관한 검량선.
도 18은 참고 예 11의 표 10의 시험 No.5에 관한 검량선.
도 19는 참고 예 11의 표 10의 시험 No.6에 관한 검량선.
도 20은 참고 예 11의 표 10의 시험 No.7에 관한 검량선.
도 21은 참고 예 11의 표 10의 시험 No.8에 관한 검량선.
도 22는 참고 예 11의 표 10의 시험 No.9에 관한 검량선.
도 23은 참고 예 11의 표 10의 시험 No.10에 관한 검량선.
도 24는 참고 예 11의 표 10의 시험 No.11에 관한 검량선.
도 25는 참고 예 11의 표 10의 시험 No.12에 관한 검량선.
도 26은 참고 예 11의 표 10의 시험 No.13에 관한 검량선.
도 27은 참고 예 11의 표 10의 시험 No.14에 관한 검량선.
도 28은 실시예 6에서 작성한 검량선.
도 29는 실시예 7에서 작성한 검량선.
도 30은 실시예 8에서 작성한 검량선.
도 31은 실시예 9에서 작성한 검량선.
도 32는 실시예 10에서 작성한 검량선.
*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명
1: 검체 첨가 위치
2: 지지체
3: 작용극
4: 반대극
5: 레지스트(resist)
6: 참조 전극(카본 잉크)
6a: 참조 전극(은-염화은 잉크)
11: 전극
12: 전극
13: 전극
이하에, 본 발명에 대해서 상세히 설명한다.
본 발명은, 글루코오스의 간섭을 받는 혈액 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정에 있어서, 전혈을 검체로서 이용하고 혈구 분리를 필요로 하지 않는 것을 특징으로 하는 혈액 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 전기 화학적 측정 방법이다. 특히, 본 발명의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법은, 혈구 분리를 하지 않고 전혈 그대로 글루코오스 및/또는 그 유도체를 소거 또는 변환 처리하고, 또한 혈구를 분리하는 일 없이 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하기 위한 효소를 작용시켜서, 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정하는 것을 특징으로 한다. 전술한 바와 같이 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하기 위한 효소는 글루코오스에도 작용하기 때문에, 글루코오스의 간섭을 받지 않도록 글루코오스 및/또는 그 유도체를 소거 또는 변환 처리할 필요가 있다.
본 발명의 측정 방법에 있어서의 글루코오스 및/또는 그 유도체를 소거 또는 변환하는 공정과 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 공정은 연속해 실행해도 좋고, 다른 공정을 사이에 끼워서 순차적으로 실행해도 좋다.
본 발명이 적용되는 전혈은, 혈구를 분리하지 않은 채혈 상태의 혈액이며, 채혈용의 채혈관 등에 포함되는 헤파린, 불화 나트륨, 모노 요오드 아세트산 등의 항응고제나 해당(解糖) 저지제 등을 함유하고 있어도 좋다. 보존한 혈액을 사용할 경우에는, 불화 나트륨과 헤파린을 함유하는 채혈관으로 채혈한 혈액이 바람직하다. 또한, 본 발명의 전혈에는 채혈관 등을 사용하지 않고, 자기 혈당 측정에 이용되는 랜싯 디바이스 등에 의해 채혈한 혈액 등도 포함된다. 채혈 부위도 특별히 제한되지 않고, 손가락의 끝이나, 전완(前腕) 외측이나, 복벽(腹壁) 또는 상완(上腕) 외측 등을 포함한다. 채혈량은, 예를 들면, 50μL 이하, 바람직하게는 0.1μL∼30μL이다. 더욱 바람직하게는, 3μL∼20μL면 충분하다.
본 발명에 있어서의 글루코오스 및/또는 그 유도체를 측정에 간섭하지 않는 물질로 소거 또는 변환하는 공정은, 목적으로 하는 혈액 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정에 영향을 주지 않는 한, 특별히 한정되지 않는다. 그것의 예는 특허 문헌 1∼9에 기재한 글루코오스 및/또는 그 유도체를 측정에 간섭하지 않는 물질로 소거 또는 변환하는 방법을 포함한다. 효소를 사용하는 방법이 더욱 바람직하며, 그것의 예는, 글루코오스를 효소적 산화 또는 효소적 인산화하는 방법을 포함한다.
전혈에 있어서의 효소에 의한 글루코오스의 소거 또는 변환은 상기의 예상에 반해서 어떤 문제도 없이 진행하고, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정이 가능하게 되었다.
글루코오스의 효소적 산화 방법의 예는, 글루코오스 옥시다제에 의해 글루코오스를 산화하는 방법, 글루코오스 디하이드로게나아제에 의해 부효소 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드((nicotinamide adenine dinucleotide)(NAD)) 혹은 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADP)의 존재 하에서 글루코오스를 산화하는 방법을 포함한다. 글루코오스의 효소적 인산화 방법의 예는, 헥소키나아제 혹은 글루코키나아제에 의해 글루코오스를 인산화해서 글루코오스―6-인산으로 변환하는 방법을 포함한다. 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정에 이용하는 효소의 종류에 따라서는, 글루코오스를 인산화해서 생성한 글루코오스―6-인산을 더욱 변환할 필요가 있다. 이 경우, 그것의 예는, 글루코오스―6-인산 디하이드로게나아제를 사용하여, 부효소 NAD+ 혹은 NADP+의 존재 하에서 글루코오스를 글루코노락톤-6인산으로 산화하는 방법, 아데노신(adenosine)―5'-다이포스페이트(ADP)와 아데노신―5'-3인산(ATP)의 존재 하에, 헥소키나아제, 포스포헥소오스 이소메라아제 및 6-포스포프룩토키나아제를 작용시켜서 글루코오스를 프룩토오스-1, 6-다이포스페이트로 변환하는 방법, 뉴클레오시드 다이포스페이트(NDP)와 뉴클레오시드 트리포스페이트(NTP)의 존재 하에, 글루코오스 이소메라아제, 프룩토키나아제, 및 6-포스포프룩토키나아제를 작용시켜서 글루코오스를 프룩토오스-1, 6-다이포스페이트로 변환하는 방법을 포함한다.
그 중에서도, 헥소키나아제 또는 글루코키나아제에 의한 글루코오스 인산화 방법이 더욱 바람직하다. 예를 들면, 마그네슘 이온, ATP, 포스포에놀피루베이트(PEP) 및 피루브산 키나아제(PK)의 존재 하에서 헥소키나아제 또는 글루코키나아제에 의해 실행되는 효소 사이클링(cycling)법에 의한 글루코오스를 인산화하는 방법이 특히 바람직하다.
상기 변환에 사용하는 효소로서는, 1, 5-안하이드로글루시톨을 기질(基質)로 하지 않는 효소이면 특히 제한은 없으며, 그것의 예는, IUPAC-IUB의 명명법에 따른 글루코오스 옥시다제(ECl. 1. 3. 4), 글루코오스 디하이드로게나아제(ECl. 1. 1. 47, ECl. 1. 1. 118, ECl. 1. 1. 119, 및 ECl. 1. 99. 10), 헥소키나아제(EC2. 7. 1. 1), 글루코키나아제(EC2. 7. 1. 2), 포스포헥소오스 이소메라아제로서 글루코오스―6-포스페이트 케톨 이소메라아제(EC5. 3. 1. 9), 글루코오스 이소메라아제(EC5. 3. 1. 18), 프룩토키나아제(EC2. 7. 1. 4), 및 6-포스포프룩토키나아제로서 포스포헥소키나아제(EC2. 7. 1. 11)로 분류되는 효소를 포함한다.?시판되는 효소도 사용할 수 있다. 헥소키나아제를, NDP 의존성 헥소키나아제, 특히 ADP 의존성 헥소키나아제 등으로 사용하는 데에 아무런 문제도 없다.
또한, 글루코오스 옥시다제와 글루코오스 디하이드로게나아제에 의해 글루코오스를 산화하는 방법에 있어서는, 생성하는 글루코노-1, 5-락톤을 완전히 글루콘산으로 변환하기 위해서 글루코노락토나아제(EC3. 1. 1. 17)를 사용하는 것도 가능하며, 필요에 따라서 뮤타로타아제(EC5. 1. 3. 3)와 조합해서 사용해도 좋다.
본 발명의 측정 방법에서, 1, 5-안하이드로글루시톨을 1, 5-안하이드로글루 시톨-6-인산으로 변환하고, 1, 5-안하이드로글루시톨-6-인산에 작용하는 효소를 이용해서 측정하는 방법에 있어서는, 글루코오스와 1, 5-안하이드로글루시톨을 함께 인산화하는 헥소키나아제 또는 글루코키나아제도 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 글루코오스 및/또는 그 유도체를 그 측정에 간섭하지 않는 물질에의 변환은, 예를 들면, 변환 시약과 전혈을 접촉시키는 것에 의해 실행된다. 구체적으로는, 이들 물질을 미리 용기 중에서 혼합하거나, 또는 그 변환 시약을 후술하는 센서 칩 위에 담지(擔持)시켜도 좋다. 그 변환 시약의 예는, 헥소키나아제(HK) 및/또는 글루코키나아제(GK), 피루브산 키나아제(PK), 아데노신―5'-3인산(ATP), 포스포에놀피루베이트(PEP), 염화 마그네슘 또는 황산 마그네슘, 및 염화 칼륨으로 이루어지는 용액, 또는 그 용액의 건조 제제를 포함한다.
헥소키나아제는 효모 유래의 것이 바람직하고, 글루코키나아제는 바실루스 스테아로서모필루스 유래의 것이 바람직하다. 변환 시약에는 헥소키나아제와 글루코키나아제를 모두 함유해도 좋고, 어느 한쪽을 함유해도 좋다. 헥소키나아제 및/또는 글루코키나아제의 변환 시약 용액 중의 농도는 1U/mL∼500U/mL, 바람직하게는 20U/mL∼300U/mL이다.
변환 시약 용액 중의 피루브산 키나아제의 농도는 1U/mL∼500U/mL이고, 바람직하게는 20U/mL∼300U/mL이다. ATP의 농도는 1mM∼200mM, 바람직하게는 10mM∼80mM이다. 포스포에놀피루베이트의 농도는 10mM∼1500mM이고, 바람직하게는 100mM∼500mM이다. 염화 마그네슘 또는 황산 마그네슘의 농도는 1mM∼200mM이고, 바람직하게는 5mM∼50mM이다. 염화 칼륨의 농도는 1mM∼200mM이고, 바람직하게는 5mM∼ 50mM이다.
또한, 아스코르브산 산화효소, 요산 산화효소, 또는 빌리루빈 산화효소 등의 각 간섭 물질에 작용하는 효소를 변환 시약에 첨가하는 것은, 글루코오스 이외의 간섭 물질의 측정 방해를 제거하기 위해서 효과적이다. 예를 들면, 아스코르브산 산화효소의 변환 시약 용액 중의 농도는 1U/mL∼1000U/mL이고, 바람직하게는 5U/mL∼500U/mL이다.
아래에, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 효소를 이용해서 전기 화학적으로 측정하는 공정에 대해서 설명한다. 그 측정 방법의 예는, 효소에 의한 산화 환원 반응에 의해 생기는 과산화 수소를 직접 측정하는 방법 및 산화 환원 반응에 관여하는 전자 이동을 매개하는 산화환원 매개체를 사용해서 측정하는 방법을 포함한다.
효소의 예는, 1, 5-안하이드로글루시톨을 산화하는 효소를 포함하며, 산화환원효소가 더욱 바람직하다. 그것의 예는, IUPAC-IUB의 명명법에 따른, 피라노오스 옥시다아제(ECl. 1. 3. 10), L-솔보스 옥시다아제(ECl. 1. 3. 11), L-솔보스 디하이드로게나아제(ECl. 1. 99. 12), 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제(ECl. 1. 99. 13)로 분류되는 효소를 포함한다.
산화환원효소의 예는, 특허 문헌 12에 기재한 바시디오마이세타우스 균류(Basidiomycetous fungi) No.52(독일 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터; 수탁 번호 FERM P-10106)나 특허 문헌 7에 기재한 폴리포루스 오브투수스(Polyporus obtusus) ATCC 26733 등에 의해 산생(産生)하는 피라노오스 옥시다아 제, 트라메테스 산구이네아(Trametes sanguinea) IFO 4923에 의해 산생하는 L-솔보스 옥시다아제, 특허 문헌 13에 기재한 글루코노박터 옥시단스 UV-10(독일 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터; 수탁 번호 FERM P-8422)에 의해 산생하는 L-솔보스 디하드로게나아제, 특허 문헌 11에 기재한 슈도모나스속 NK-85001(독일 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터; 수탁 번호 FERM BP-1037)에 의해 산생하는 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제, 특허 문헌 14에 기재한 오이페니실리움 쿠르스타세움 IFO-8938 등의 진균류에 의해 산생하는 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제, 특허 문헌 15에 기재한 트리코델마 롱기브라키아툼 KDK 3003(독일 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터; 수탁 번호 FERM BP-6458)에 의해 산생하는 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제, 특허 문헌 16에 기재한 라후넬라 아쿠아틸리스 474(독일 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터; 수탁 번호 FERM P-16158), 엔테로박터 클로아카에 340(독일 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터; 수탁 번호 FERM P-16157) 및 세라티아 마르셋센스 825(독일 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터; 수탁 번호 FERM P-16159)에 의해 산생하는 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제, 특허 문헌 6에 기재되어 있고 전자 수용체를 필요로 하지 않으면서 1, 5-안하이드로글루시톨을 탈(脫)수소화할 수 있는 아그로박테리움 투메파시엔스 NT1130 계통(독일 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터; 수탁 번호 FERM BP-5997)에 의해 산생하는 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제, 특허 문헌 10에 기재한 사이토파가 마리노플라바 ATCC 19326에 의해 산생하는 D-글루코시드―3-디하이드로게나아제 및 특허 문 헌 17, 특허 문헌 18, 특허 문헌 12에 기재한 효소 등을 포함한다. 또한, 1, 5-안하이드로글루시톨을 산화하는 그 밖의 시판되는 산화환원효소 등도 사용할 수 있다.
그 중에서도, 피라노오스 옥시다아제, L-솔보스 옥시다아제, 및 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제가 더욱 바람직하다.
또한, 이들 효소의 유전자를, 통상적인 유전자 조작 기술에 의해 동정(identification)하고 개량 또는 개변(改變)한 후에, 재조합 대장균 등을 이용해서 제조한 효소도 1, 5-안하이드로글루시톨을 기질(基質)로 하는 산화환원효소이면 본 발명의 측정 방법에 사용 가능하다.
전기 화학적 측정 방법의 예는, 전류 적정법(전류 측정 방법), 전기량법(전력량 측정 방법), 전위 스위프(sweep)법이나 순환 전압전류법 등을 포함한다. 그 중에서도 전류 적정법 및 전기량법이 더욱 바람직하다.
전기 화학적 측정 방법에 사용하는 전극은 금(金), 백금, 탄소, 팔라듐(Palladium), 은 또는 은-염화은을 이용하여 절연성 기판 위에 형성할 수 있다. 절연성 기판의 예는, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리카보네이트, 및 폴리비닐 카보네이트 등의 플라스틱, 및 유리를 포함하고, 폴리에틸렌 테레프탈레이트가 더욱 바람직하다. 이들 기판 위에, 스크린 인쇄법, 진공 증착법, 스퍼터법 등에 의해 전극을 형성할 수 있다. 그 중에서도 스크린 인쇄법이 더욱 바람직하다. 구체적으로, 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 제조된 기판 위에 도전성 카본 잉크 또는 은-염화은을 스크린 인쇄하고, 100℃∼150℃에서 상기 기판을 담금질하는 것에 의해 전 극을 형성하는 것이 바람직하다.
본 발명의 1, 5-안하이드로글루시톨의 전기 화학적인 측정에 사용하는 전극으로서는, 작용극(作用極), 반대극 및 참조 전극을 형성하는 3 전극이나, 또는 작용극과 반대극을 형성하는 2 전극의 그 어느 쪽도 사용 가능하다. 일반적으로, 3 전극을 사용하는 측정에서는, 참조 전극을 기준으로 해서 작용극에 전위를 인가(印加)하고, 작용극과 반대극 간에 흐르는 전류를 측정한다. 2 전극을 사용하는 측정에서는, 반대극을 참조 전극으로서 사용하고, 반대극을 기준으로 사용해서 작용극에 일정한 전위를 인가하여, 작용극과 반대극 간에 흐르는 전류를 측정한다.
전기 화학적 측정에는 여러 가지의 방법이 고려되지만, 본 발명의 예는, 발생하는 과산화 수소를 직접 과산화 수소 전극을 이용해서 측정하는 방법, 및 산화 환원 반응에 관여하는 전자 이동을 매개하는 산화환원 매개체를 사용해서 측정하는 방법을 포함한다.
산화환원 매개체의 예는, 산화형 매개체 및 환원형 매개체를 포함하며, 산화형 매개체가 더욱 바람직하다. 그 중에서도, 오스뮴 착체, 퀴논계 화합물, 페로센계 화합물, 페노티아진계 화합물, 페녹사진계 화합물, 페나진계 화합물, 인도페놀계 화합물, 다이페닐아민계 화합물, 페놀계 화합물 등이 더욱 바람직하다. 오스뮴 착체의 예는, [Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2 및 그것의 폴리머를 포함한다. 퀴논계 화합물의 예는, 벤조퀴논, 2-메틸벤조퀴논, 2, 6-다이메틸벤조퀴논, 2, 6-다이클로로벤조퀴논, 2, 5-다이히드록시벤조퀴논, 2-히드록시―1, 4-나프 토퀴논, 2-메틸―1, 4-나프토퀴논, 2, 3-다이메톡시―5-메틸―1, 4-벤조퀴논, 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ), 및 유비퀴논을 포함한다. 페로센계 화합물의 예는, 페로세닐 PEG, 페로세닐 TMA, N, N-다이메틸아미노메틸페로센, 및 페로센메탄올을 포함한다. 페노티아진계 화합물의 예로서는, 티오닌, 메틸렌 블루(methylene blue), 메틸렌 그린, 10-(카복시메틸아미노카보닐)-3, 7'－비스(다이메틸아미노)-페노티아진 나트륨염, 톨루이딘(toluidine) 블루 0, 아즈레(azure) Ⅰ, 아즈레 C, 아즈레 A, 뉴(new) 메틸렌 블루, 및 벤조일 로이코메틸렌 불루를 포함한다. 페녹사진계 화합물의 예는, 멜돌라 블루를 포함한다. 페나진계 화합물의 예는, 페나진 메토설페이트, 1-메톡시페나진 메토설페이트, 사프라닌, 및 페노사프라닌을 포함한다. 인도페놀계 화합물의 예는, 2-다이클로로페놀-인도페놀(DCIP)을 포함한다. 다이페닐 아민계 화합물의 예는, 4 , 4'－비스(다이메틸아미노)다이페닐아민, N-(카복시메틸아미노카보닐)-4, 4'－비스(다이메틸아미노)다이페닐아민 나트륨염, N-메틸―N-페닐-1, 4-페닐렌다이아민 염산염, 및 N-메틸―N-(3-메톡시페닐)-1, 4-페닐렌다이아민 염산염을 포함한다. 페놀계 화합물의 예는, p-아미노페놀을 포함한다.
또한, 본 발명에 사용 가능한 매개체의 예는, 페리시아닌(ferricyanine)계 화합물(페리시안화 칼륨 등), 루테늄(ruthenium) 착체 혹은 그 폴리머 착체, 바이피리딘계 화합물(메틸 비올로겐 등), 트리페닐메탄계 화합물(말라카이트 그린이나 TPM-PS 등), 벤조티아졸린계 화합물(2-히드라조노-2, 3-다이히드로-3-메틸―6-벤조티아졸이나 그 술폰산염 등), 시아닌(cyanine)계 화합물(갈로시아닌, 프탈로시아닌이나 피코시아닌 등), 아조계 화합물(마젠타(Magenta) J-3GL, 옐로우 C-Y9이나 블 랙 C-BK4 등), 바이피리딜아조계 화합물(5-Br-PSAA, 5-Br-PAPS나 TAMSMB 등), 아닐린 및 그 유도체(DAPS, HALPS, ADPS, ALPS, TOOS나 ALOS 등), 폴리아닐린 및 그 유도체, 페놀계 화합물(p-아미노페놀 등), 페닐렌다이아민계 화합물(발리아민 블루 B나, 2, 3, 5, 6-테트라메틸-p-페닐렌다이아민 등), 로다민계 화합물(로다민 B등), 크산텐계 화합물(피로닌 Y, 피로닌 B나 플루오레세인나트륨 등), 이소알록사진계 화합물(리보플라빈(riboflavin)이나 FAD 등), 인디고(indigo)계 화합물(인디고 3 술폰산이나 인디고 카민 등), 페난트롤린(phenanthroline)계 화합물(바소쿠프로인(Bathocuproin) 술폰산 나트륨이나 바소페난트롤린 술폰산 나트륨 등), 술포프탈레인계 화합물(메틸티몰 블루 등), 벤지딘계 화합물(TMBZ, TMBZ·PS, DAB나 아니시딘 블루 등), 테트라졸륨계 화합물(WST-1, MTT, 니트로-TB나 XTT 등), 시토크롬 C나 루미크롬, 페레독신류, EDTA류, NAD 및 NADP 등을 포함한다.
본 발명의 1, 5-안하이드로글루시톨의 전기 화학적인 측정에 있어서 전극에 의해 담지되는, 상기 효소 및 산화환원 매개체 등의 화합물은, 전극 시약으로서 정제수 또는 적당한 완충액에 용해시켜서, 전극 시약 용액으로서 전극에 도포한다.
전극 시약에 함유되는 상기한 산화환원 매개체의 농도는, 예를 들면, 전극 도포 시의 정제수 또는 적당한 완충액에 용해하여 수득한 전극 시약 용액 중의 농도로서 0.01μM∼1M 정도, 바람직하게는 0.1μM∼200mM이다. 상기한 효소의 농도는, 예를 들면, 전극 도포 시의 정제수 또는 적당한 완충액에 용해하여 수득한 전극 시약 용액 중의 농도로서 0.1U/mL∼5000U/mL 정도, 바람직하게는 1U/mL∼2000U/mL이다. 완충액으로서는, 통상적인 생화학 반응에 이용되는 완충액이 사용 가능하며, 그것의 예는, 2-모르폴리노에탄 슬폰산(MES) 완충액, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄 술폰산(HEPES) 완충액, N-트리스(히드록시메틸)메틸―3-아미노프로판 술폰산(TAPS) 완충액, 트리스 완충액, 및 인산 완충액을 포함한다. 그 pH는 3∼10, 바람직하게는 5∼9이다. 완충액의 농도는 1mM∼1M, 바람직하게는 5mM∼500mM이다.
전극 시약 용액에는, 효소 및 산화환원 매개체의 안정성을 향상시키고, 장기간에 걸쳐 안정된 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정을 가능하게 하여, 혈액의 측정에 있어서 정밀도 좋은 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정을 가능하게 하는 안정제로서, 술포벤조산, 당(糖), 당 알코올 등의 저분자 화합물, 알부민 등의 단백질, 카복시메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성(親水性) 고분자 화합물 등을 함유하는 것이 바람직하다. 술포벤조산으로서 바람직하게는 2-술포벤조산 및 3-술포벤조산을 포함한다. 술포벤조산 등의 저분자 화합물을 안정화제로서 사용할 경우, 그 농도는, 전극 도포 시의 전극 시약 용액 중의 농도로서 0.1mM∼500mM 정도, 바람직하게는 1mM∼100mM 정도이다. 알부민 등의 친수성 고분자 화합물을 안정화제로서 사용할 경우, 그 농도는, 예를 들면, 전극 도포 시의 전극 시약 용액 중의 농도로서 0.01％∼20％ 정도, 바람직하게는 0.02％∼10％ 정도이다.
상기 전극에는 상기 전극 시약을 담지시키는 것이 바람직하다. 이것은 공지의 방법에 의해 달성된다. 예를 들면, 상기 전극 시약의 일정량을 스폿팅(spotting), 딥핑(dipping)이나 스핀 코팅에 의해 전극에 도포하여, 건조한다. 또한, 이러한 물리적인 흡착법 이외에, 상기 전극 시약을 전극 위에 화학적으로 결합시켜도 좋다.
전극에 담지될 상기 안정화제는, 상기 전극 시약 용액에 첨가한 후, 도포 및 건조하거나 또는 효소가 담지되는 층 위에 적층해도 좋다.
아래에 차동형(差動型) 전극에 대해서 설명한다.
차동형 전극은, 예를 들면, 산화 환원형 효소와 산화환원 매개체 시약을 담지한 작용극(예를 들면, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극)과, 산화 환원형 효소를 함유하지 않고 산화환원 매개체 시약을 담지한 작용극(예를 들면, 블랭크 측정용 작용극)과, 반대극을 구비하고, 산화환원 매개체 등에 관계되는 간섭 물질을 함유하는 검체를 산화 환원형 효소와 산화환원 매개체 시약을 담지한 작용극과, 산화 환원형 효소를 함유하지 않고 산화환원 매개체 시약을 담지한 작용극을 이용해서 동시에 측정하고, 간섭에 의한 시그널(signal) 부분을 제함으로써 간섭 물질의 영향을 제외하는 전극이며, 그러한 작용을 실행하는 한 그것의 구조를 제한하지 않는다. 그것의 예는, 후술하는 실시예의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체가 함유되어 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극, 산화환원 매개체가 함유되어 있는 블랭크 측정용 작용극과, 반대극을 갖는 차동형 전극을 포함한다.
이 차동형 전극을 사용한 전기 화학적 측정 방법은 차동법이라고 불리우며, 글루코오스를 측정 대상으로 삼는 것이 알려져 있다. 이 경우에, 간섭 물질은 요산과 아스코르브산이다. 요산의 혈액 농도는, 글루코오스 5500㎛ol/L∼33000㎛ol/L에 대하여 요산 120㎛ol/L∼770㎛ol/L이고, 아스코르브산 11㎛ol/L∼210㎛ol/L이다. 이 농도는, 측정 대상물인 글루코오스의 농도에 비교해서 대단히 낮다.
한편, 1, 5-안하이드로글루시톨의 혈중 농도는 6㎛ol/L∼300㎛ol/L이며, 글루코오스보다 대단히 낮다. 혈중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 전기 화학적 측정에 있어서는, 마찬가지로 요산과 아스코르브산은 간섭 물질이 된다. 그러나, 그 농도는 1, 5-안하이드로글루시톨과 거의 동등 혹은 그 이상이다.
즉, 측정 대상물의 농도보다 간섭 물질의 농도가 매우 낮을 경우의 차동법에 의한 측정은 알려져 있지만, 측정 대상물의 농도보다 간섭 물질의 농도가 동등 또는 높을 경우에서의 차동법에 의한 측정에 대해서는 지금까지 보고가 없다. 그러므로, 1, 5-안하이드로글루시톨(측정 대상물)의 농도에 대하여, 동등 또는 그 이상의 농도를 갖는 간섭 물질(요산, 아스코르브산)이 존재할 경우에도 차동법이 유효하고, 정확한 측정 결과를 얻을 수 있을 것인가 아닌가의 여부는 알려져 있지 않았다.
본 발명의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩은, 절연성 기판 위에 형성된 상기 전극, 측정기에 접속하기 위한 접속부, 전극과 접속부를 연결하는 리드부, 또한 전극의 면적을 일정하게 해서 리드부를 절연하기 위한 레지스트(절연부) 등을 구비하고, 또한 검체로서 혈액 채취용 입구, 혈액이 들어가는 공간, 유로(流路) 등을 포함한다. 이 구조는 폴리에틸렌 필름이나 폴리이미드 필름 등의 필름 재료, 핫멜트(hotmelt) 접착 등의 접착제, 양면 테이프 등의 테이핑 재료 등에 의해 형성된다.
전극에 전극 시약을 담지하지 않고, 미리 검체와 상기 시약을 혼합해서 첨가하는 센서 칩을 사용해서도 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 수는 있다. 그러나, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체가 함유되어 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극과, 반대극을 갖는 전극을 포함하는 센서 칩이 바람직하고, 또한, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체가 함유되어 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극, 산화환원효소를 함유하지 않고 산화환원 매개체가 함유되어 있는 블랭크 측정용 작용극, 및 반대극을 갖는 차동형 전극을 포함하는 센서 칩이 더욱 바람직하다. 반대극에 필요하다면, 상기 전극 시약을 담지시켜도 좋다.
또한, 글루코오스 및/또는 그 유도체를 그 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하는 공정을 실행하는 시약을 함유하는 전(前)처리부를 구비하는 센서 칩을 사용할 수도 있다.
본 발명에서 사용하는 센서 칩의 일례의 간략 도면을 도 1∼도 3에 나타낸다.
본 발명에는, 적어도 상기 센서 칩과, 채혈에 사용하는 랜싯 디바이스, 및 1, 5-안하이드로글루시톨용 측정기를 구비하는 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 키트도 포함된다. 랜싯 디바이스는, 혈당 자가 측정 장치에 부착되어 있는 랜싯 디바이스와 유사한 것이어도 좋다. 이 키트에는, 또한, 글루코오스 및/또는 그 유도체를 그 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하기 위한 공정에 사용하는 시약이 포함되어 있어도 좋다.
또한, 이 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 키트에는, 샘플 채취용 기구, 전(前)처리용 시약, 캘리브레이터(calibrator) 등을 구비하고 있어도 좋다. 샘플 채취용 기구로서는 몇십 μL 이하 정도의 전혈을 채취할 수 있는 한 특히 한정되지 않으며, 헤마토크리트(hematocrit) 측정 시에 사용하는 모세관과 유사한 것이라도 좋다.
이하에, 다음의 실시예 및 참고 예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명의 하나의 특징을 나타내는 것이며, 본 발명의 범주를 한정하는 것이 아니다. 실시예 중에 있어서의 효소는 공지된 방법으로 얻은 것 또는 시판되는 것을 사용하였다.
모든 실시예와 참고 예 9, 10, 11에 있어서의 전기 화학 검출기는, (주)도호 기겐제(東方技硏製) GPIB RS232C를 부착한 8CH 다중전위기 MODEL PS-08을 사용하고, 참고 예 7, 8에 있어서의 전기 화학 검출기는, (주)도호 기겐제 함수 발생기 FG-02를 부착한 8CH 다중전위기 MODEL PS-08을 사용하였다.
도면 중의 1, 5AG는 1, 5-안하이드로글루시톨을 의미한다.
(실시예 1)
1) 글루코오스 변환 시약
1) 글루코오스 변환 시약
1N 수산화나트륨 수용액을 이용해서 pH 7.0에 조정한 후의 조성으로서, 17.6mM의 MgCl2, 17.6mM의 KCl, 175.7mM의 포스포에놀피루베이트(PEP), 17.6mM 의 ATP, 123U/mL의 피루브산 키나아제(PK), 75U/mL의 글루코키나아제, 200U/mL의 아스코르브산 산화효소, 100mM의 염화나트륨, 0.1％의 NaN3, 0.1mM의 EDTA, 및 0.06％의 BSA(소 혈청 알부민)가 되도록 10.0mM의 MES 완충액에 용해시켜서, 글루코오스 변환 시약을 마련하였다.
2) 전극 시약 용액
일본국 특허 제3713049호 공보에 기재된 오스뮴(ⅠⅠⅠ) 착체([Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2)를 23.6mM, 피라노오스 옥시다아제(바시디오마이세타우스 균 No.52 유래)를 930U/mL, 및 3-술포벤조산 50mM을 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
3) 센서 칩
폴리에틸렌 테레프탈레이트로 제조된 기반에 작용극과 리드부, 반대극과 리드부를 형성하기 위해, 카본 잉크((주)아사히 화학 연구소제, 제품명, 카본 페이스트 TU15ST)를, 두께 10㎛으로 스크린 인쇄하고, 150℃에서 40분 담금질하였다. 그 다음, 전극부와, 측정 장치와의 접속부를 제외하는 부분에 레지스트 잉크((주)아사히 화학 연구소제, 제품명, CR18G-KF)를 두께 20㎛으로 스크린 인쇄하고, 130℃에서 15분 담금질을 하였다. 그래서, 도 1에 나타내는 전극(11)을 제조하였다.
상기의 2)에서 얻은 전극 시약 용액 4μL를 전극(11)의 검체 첨가 위치(1)에 도포하고, 50℃에서 13분 건조해서 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨 검량선 작성을 위해서, 혈장에 농도가 알려진 1, 5-안하이드로글루시톨 표품 각각 20μL을 첨가해 얻은 5검체(혈구 분리 조작을 제외하고, 후술하는 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는 3.8, 7.8, 15.8, 31.4, 및 63.9μg/mL이었다)를 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 전극(11)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하였다. 80초 후에, 반대극에 대하여 작용극에 0.15V를 10초간 인가하고, 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기(GPIB RS232C를 부착한 8CH 다중전위기 MODEL PS-08: (주)도호 기켄)로 측정하였다. 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과, 블랭크 측정용 센서로부터 얻은 전류 값의 차이, 및 1, 5-안하이드로글루시톨의 농도로부터 검량선을 작성하였다.
5) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정 조작
상기 4)에서 얻은 검체의 레벨에 요산 값이 거의 균등하거나 또는 측정된 검체의 요산 값이 낮은 건강한 3 명으로부터의 전혈 각각 20μL를 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 전극(11)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하였다. 80초 후에 반대극에 대하여 작용극에 0.15V를 10초간 인가하고, 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 상기 4)의 검량선을 이용하여, 3 검체에 대해서 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨량을 얻었다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. 검량선 작성용 검체 에 대해 4회 측정한 평균치를 사용하고, 검체에 대해 1회 측정한 값을 사용하였다.
(참고 예 1)
실시예 1에 있어서의 5)에서 측정한 것과 같은 정상인 3명으로부터의 전혈 검체를 3000rpm으로 10분간 원심 분리하고, 그 상청(혈장)을 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 시약(라나(Lana) 1, 5AG 오토 리퀴드: 니혼카야쿠(日本化藥)(주)제)과 자동 분석 장치 7150((주)히타치 제작소(日立製作所)제)을 사용하여, 이하의 파라미터로써 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
분석법 2포인트(point)
측정 포인트 24-50
검체량 8μL
라나 1, 5AG 오토 리퀴드 전처리액(Rl) 240μL
라나 1, 5AG 오토 리퀴드 발색액(R2) 120μL
온도 37℃
측정 파장(부/정) 700/546nm
[표 1]
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1, 5-안하이드로글루시톨
농도(μg/mL)
--------------------------------------
참고 예 1 실시예 1
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전혈 검체 1 9.8 10.4
전혈 검체 2 15.6 16.8
전혈 검체 3 17.2 17.2
------------------------------------------------------------------
전혈을 이용하여, 이것에 글루코오스 변환 시약을 작용시켜서 글루코오스를 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하고, 혈구를 분리하지 않고 전극 시약과 반응시키는 경우, 전혈 검체 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정값(실시예 1)은, 공지된 측정 방법에 의한 참고 예 1의 측정값과 잘 일치(상관 계수, 0.9881)되어, 본 발명에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 수 있는 것을 나타내고 있다.
(실시예 2)
1) 글루코오스 변환 시약
1N 수산화나트륨 수용액을 이용해서 pH 7.0에 조정한 후의 조성으로서, 17.6mM의 MgCl2, 17.6mM의 KCl, 175.7mM의 포스포에놀피루베이트(PEP), 17.6mM의 ATP, 123U/mL의 피루브산 키나아제(PK), 97U/mL의 헥소키나아제, 및 20U/mL의 아스코르브산 산화효소가 되도록 10.OmM의 MES 완충액을 용해시켜서, 글루코오스 변환 시약을 준비하였다.
2) 전극 시약 용액
(i) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용
23.6mM의 오스뮴(ⅠⅠⅠ) 착체([Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2), 및 465.2U/mL의 피라노오스 옥시다아제(바시디오마이세타우스 균류 No.52 유래)를 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
(ii) 블랭크 측정용
23.6mM의 오스뮴(ⅠⅠⅠ) 착체([Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2)를 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
3) 센서 칩
실시예 1의 3)과 마찬가지 방법으로 제조한 전극(11)을 2개 준비하고, 상기의 2)의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 또는 블랭크 측정용의 전극 시약 용액 4μL를 각각의 전극의 검체 첨가 위치(1)에 도포하고, 50℃에서 13분 건조해서 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용과 블랭크 측정용의 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨 검량선 작성하기 위해서, 혈장에 대해, 농도가 공지된 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 첨가해 얻은 5 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는 9.4, 18.8, 37.5, 75.0, 및 150.0μg/mL이었다) 각각 20μL를 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 1, 5-안하 이드로글루시톨 측정용과 블랭크 측정용의 전극(11)의 검체 첨가 위치(1)에, 각각 반응액 10μL를 적하하였다. 80초 후에, 반대극에 대하여 작용극에 0.15V를 10초간 인가하고 다음 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과 블랭크 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과의 차이와, 1, 5-안하이드로글루시톨의 농도로부터 검량선을 작성하였다.
5) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정 조작
1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 정상인 6명으로부터의 전혈 20μL를 각각 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용과 블랭크 측정용의 전극(11)의 검체 첨가 위치(1)에, 각각 반응액 10μL를 적하하였다. 80초 후에 반대극에 대하여 작용극에 0.15V를 10초간 인가하고, 그 다음 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과 블랭크 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과의 차이를, 검량선과 비교하여, 6 검체의 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨량을 얻었다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 검량선 작성을 위해 검체에 대해 4회 측정한 평균치를 사용하고, 검체에 대해 1회 측정한 값을 사용하였다.
(참고 예 2)
실시예 2의 5)에서 측정한 것과 같은 전혈 검체를 참고 예 1의 사용 방법에 의해 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
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1, 5-안하이드로글루시톨
농도(μg/mL)
--------------------------------------
참고 예 2 실시예 2
--------------------------------------
전혈 검체 4 16.4 16.7
전혈 검체 5 17.5 14.2
전혈 검체 6 26.2 23.5
전혈 검체 7 31.5 26.9
전혈 검체 8 27.2 24.4
전혈 검체 9 31.4 36.7
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전혈을 이용하여, 이것에 글루코오스 변환 시약을 작용시켜서 글루코오스를 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하고, 혈구를 분리하지 않고 전극 시약과 반응시켜서 차동법에 의해 측정한 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정값은, 참고 예 2의 측정에 의해 얻은 값과 상관이 잘 되어(상관 계수, 0.8943), 본 발명에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 수 있는 것을 나타내고 있다.
(실시예 3)
1) 글루코오스 변환 시약
실시예 1의 1)에서 얻은 글루코오스 변환 시약을 사용하였다.
2) 전극 시약 용액
(i) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용
23.6mM의 오스뮴(ⅠⅠⅠ) 착체([Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2), 930U/mL의 피라노오스 옥시다아제(바시디오마이세타우스 균류 No.52 유래), 및 50mM의 3-술포벤조산을 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
(ii) 블랭크 측정용
23.6mM의 오스뮴(ⅠⅠⅠ) 착체([Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2), 및 50mM의 3-술포벤조산을 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
3) 센서 칩
상기 실시예 2의 3)과 마찬가지 방식으로 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩과 블랭크 측정용 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨 검량선을 작성하기 위해서, 혈장에, 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 첨가해 얻은 5 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 각 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는 9.5, 19.6, 39.6, 78.5, 및 159.8μg/mL이었다) 각각 20μL를 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용과 블랭크 측정용의 전극(11)의 검체 첨가 위치(1)에, 각각 반응액 10μL를 적하하였다. 80초 후에 반대극에 대하여 작용극에 0.15V를 10초간 인가하고 다음 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과 블랭크 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과의 차이와, 1, 5-안하이드로글루시톨 농도로부터 검량선을 작성하였다.
5) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정 조작
1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 정상인 6명으로부터의 전혈 20μL를 각각 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용과 블랭크 측정용의 전극(11)의 검체 첨가 위치(1)에, 각각 반응액 10μL를 적하하였다. 80초 후에 반대극에 대하여 작용극에 0.15V를 10초간 인가하고 다음 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과 블랭크 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과의 차이를 검량선과 대비하여, 6 검체에 대해서 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨량을 구하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 검량선 작성용 검체에 대해 4회 측정한 평균치를 사용하고, 검체에 대해서는 1회 측정값을 사용하였다.
(참고 예 3)
실시예 3 의 5)에서 측정한 것과 동일한 전혈 검체를 참고 예 1과 동일한 방식으로 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
------------------------------------------------------------------
1, 5-안하이드로글루시톨
농도(μg/mL)
--------------------------------------
참고 예 3 실시예 3
--------------------------------------
전혈 검체 10 9.8 9.7
전혈 검체 11 15.6 15.5
전혈 검체 12 17.2 17.3
전혈 검체 13 24.6 25.1
전혈 검체 14 30.1 32.8
전혈 검체 15 29.0 30.8
------------------------------------------------------------------
전혈을 이용하여, 이것에 글루코오스 변환 시약을 작용시켜서 글루코오스를 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하고, 혈구를 분리하지 않고 전극 시약과 반응시 켜서 차동법에 의해 측정한 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정값(실시예 3)은, 공지된 측정 방법에 의한 참고 예 3의 측정값에 잘 일치(상관 계수, 0.9982)되며, 본 발명에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 수 있음을 나타내고 있다. 또한, 그 결과는 상기 실시예 2(상관 계수, 0.8943)의 것보다 좋은 상관관계를 명확하게 나타낸다. 즉, 안정화제와 차동법을 조합하여 사용함으로써, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 더욱 정밀도가 좋게 측정하는 것을 나타내고 있다.
(실시예 4)
1) 글루코오스 변환 시약
실시예 1에서의 1)의 글루코오스 변환 시약을 사용하였다.
2) 전극 시약 용액
(i) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용
11.8mM의 오스뮴(ⅠⅠⅠ) 착체([Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2), 111.OU/mL의 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제(슈도모나스 sp. NK-85001 유래)를 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
(ii) 블랭크 측정용
11.8mM의 오스뮴(ⅠⅠⅠ) 착체([Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2)의 조성을 갖도록 구성 성분을 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제 하였다.
3) 센서 칩
실시예 1의 3)과 마찬가지 방식으로 제조한 전극(11)을 2개 준비하고, 상기 2)의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 및 블랭크 측정용의 각각의 전극 시약 용액 4μL를 각각의 전극의 검체 첨가 위치(1)에 도포하고, 50℃에서 8분 건조해서 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용과 블랭크 측정용의 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨 검량선을 작성하기 위해서, 혈장에, 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 첨가해 얻은 3 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 각 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는 24.2, 49.3, 98.8μg/mL이었다) 각각 20μL를 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용과 블랭크 측정용의 전극(11)의 검체 첨가 위치(1)에, 각각 반응액 10μL를 적하하였다. 80초 후에 반대극에 대하여 작용극에 0.15V를 10초간 인가하고, 그 다음 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과 블랭크 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과의 차이와, 1, 5-안하이드로글루시톨 농도로부터 검량선을 작성하였다.
5) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정 조작
1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 정상인 4명으로부터의 전혈 20μL를 각각 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였 다. 그 후, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용과 블랭크 측정용의 전극(11)의 검체 첨가 위치(1)에, 각각 반응액 10μL를 적하하였다. 80초 후에 반대극에 대하여 작용극에 0.15V를 10초간 인가하고, 그 다음 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과 블랭크 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값과의 차이를, 검량선과 대비하여, 4 검체에 대해서 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨량을 얻었다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. 검량선 작성을 위해 검체에 대해 4회 측정의 평균치를 사용하고, 검체에 대해서는 1회 측정한 값을 사용하였다.
(참고 예 4)
실시예 4에서 측정한 것과 동일한 전혈 검체를 참고 예 1의 조작 방법으로 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
------------------------------------------------------------------
1, 5-안하이드로글루시톨
농도(μg/mL)
--------------------------------------
참고 예 4 실시예 4
--------------------------------------
전혈 검체 16 9.4 10.0
전혈 검체 17 14.0 13.8
전혈 검체 18 27.8 26.2
전혈 검체 19 32.7 32.6
------------------------------------------------------------------
전혈을 이용하여, 이것에 글루코오스 변환 시약을 작용시켜서 글루코오스를 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하고, 혈구를 분리하지 않고, 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제를 함유하는 전극 시약과 반응시켜서 차동법에 의해 측정할 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정값(실시예 4)은, 참고 예 4의 측정값과 잘 상관되며(상관 계수, 0.9974), 본 발명에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 수 있음을 나타내고 있다.
(참고 예 5)
1) 글루코오스 변환 시약
1N 수산화나트륨 수용액을 이용해서 pH 7.0에 조정한 후의 조성이, 17.6mM의 MgCl2, 17.6mM의 KCl, 175.7mM의 포스포에놀피루베이트(PEP), 17.6mM의 ATP, 123U/mL의 피루브산 키나아제(PK), 및 97U/mL의 헥소키나아제가 되도록 10.OmM의 MES 완충액에 각 성분을 더해, 글루코오스 변환 시약을 준비하였다.
2) 전극 시약 용액
11.8mM의 오스뮴(ⅠⅠⅠ) 착체([Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2), 930U/mL의 피라노오스 옥시다아제(바시디오마이세타우스 균류 No.52 유 래) 및 50mM의 2-술포벤조산(참고 예 5-1) 또는 50mM의 3-술포벤조산(참고 예 5-2)를 이 조성으로 정제수에 용해하여, 2종류의 조성된 전극 시약 용액을 조제하였다. 술포벤조산을 첨가하지 않은 전극 시약 용액의 조제를 참고 예 5-3이라고 한다.
3) 센서 칩
상기 실시예 1의 3)과 마찬가지 방식에 의해 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩을 제작하였다.
4) 측정 조작
상기 3)에서 작성한 센서 칩을 이용하여, 0일째(작성 직후) 및 실온에서 습도 약 20％로 5일간 보존한 후에, 1, 5-안하이드로글루시톨 0μg/mL 및 50μg/mL의 시료 20μL를 각각 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 각각의 전극(11)의 검체 첨가 위치(1)에 반응액 10μL를 적하하였다. 80초 후에, 반대극에 대하여 작용극에 0.15V를 10초간 인가하고, 그 다음 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 4회 측정한 평균치 및 표준 편차와, 변동비를 표 5-1 및 표 5-2에 나타낸다.
[표 5-1]
---------------------------------------------------------------------
1, 5-안하이드로글루시톨 0μg/mL
-------------------------------------------------
1일째 5일째 변동비
-------------- ---------------- ---------
평균치 표준편차 평균치 표준편차 5일째/1일째
(μA) (μA)
참고 예 5-1 0.77 0.06 0.96 0.03 1.24
참고 예 5-2 0.74 0.02 1.04 0.04 1.41
참고 예 5-3 1.35 0.06 3.58 0.18 2.66
--------------------------------------------------------------------
[표 5-2]
---------------------------------------------------------------------
1, 5-안하이드로글루시톨 50μg/mL
-------------------------------------------------
1일째 5일째 변동비
-------------- ---------------- ---------
평균치 표준편차 평균치 표준편차 5일째/1일째
(μA) (μA)
참고 예 5-1 1.99 0.06 2.16 0.08 1.08
참고 예 5-2 1.89 0.02 2.21 0.04 1.17
참고 예 5-3 2.68 0.13 4.73 0.22 1.76
--------------------------------------------------------------------
참고 예 5-1 및 참고 예 5-2에서는, 참고 예 5-3에서보다 변동비(5일째의 평균 전류 값/1일째의 평균 전류 값)가 낮으며, 전류 값의 경시적 상승을 억제하고 있는 것을 나타낸다. 또한, 표준 편차도 작아, 측정의 신뢰성, 즉 측정 정밀도가 향상하고 있는 것을 나타내고 있다. 이 결과는 전극 시약에의 안정화제의 첨가에 의한 효과를 나타내고 있으며, 이것은 전혈을 사용한 1, 5-안하이드로글루시톨의 전기 화학적 측정에 적용할 수 있다.
(실시예 5)
1) 글루코오스 변환 시약
실시예 1의 1)에서 조제한 글루코오스 변환 시약을 사용하였다.
2) 전처리 조작(1, 5-안하이드로글루시톨 측정 및 블랭크 측정에서 공통)
1, 5-안하이드로글루시톨 검량선을 작성하기 위해서, 혈장에, 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 첨가해 얻은 4 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 각 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는 3.8, 7.8, 15.8, 및 31.4μg／mL이었다) 또는 4명의 인간 전혈 검체 각각 10μL를, 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다.
3) 전극 측정의 전조작(前操作)
(i) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 조작
상기의 전처리 조작 후의 용액에, 22.OmM의 2, 6-다이메틸벤조퀴논을 용해한 100mM의 인산 완충액(pH 7.0) 5μL와, 200U/mL의 피라노오스 옥시다아제(바시디오마이세타우스 균류 No.52 유래)를 용해한 100mM의 인산 완충액(pH 7.0) 5μL 를 순차 첨가하고, 혼합해서 5분간 방치하였다.
(ii) 블랭크 측정용 조작
상기의 전처리 조작 후의 용액에, 22.OmM의 2, 6-다이메틸벤조퀴논을 용해한 100mM의 인산 완충액(pH 7.0) 5μL와, 100mM의 인산 완충액(pH 7.0) 5μL를 순차 첨가하고, 혼합해서 5분간 방치하였다.
4) 센서 칩을 사용하는 측정 조작
폴리에틸렌 테레프탈레이트의 기반에 작용극과 리드부, 반대극과 리드부, 참조 전극과 리드부를 카본 잉크((주) 아사히 화학 연구소제, 제품명, 카본 페이스트 TU15ST)로, 두께 10㎛으로 스크린 인쇄하고, 150℃에서 40분 담금질하였다. 그 다음, 전극부와, 측정 장치와의 접속부를 제외하는 부분에 레지스트 잉크((주) 아사히 화학 연구소제, 제품명, CR18G-KF)를 두께 20㎛으로 스크린 인쇄하고, 130℃에서 15분 담금질하여, 도 2에 나타내는 전극(12)을 제작하였다.
전극(12)의 검체 첨가 위치(1)에 상기 3)에서 얻은 각각의 반응액 15μL를 적하하고, 참조 전극을 기준으로 사용하여 0.5V를 10초간 인가하고, 5초 후에 상기 센서 칩의 전류 값을 전기 화학 검출기로 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용과 블랭크 측정용에 대해서 각각 측정하였다.
5) 1, 5-안하이드로글루시톨량의 산출
상기 1, 5-안하이드로글루시톨 검량선 작성용 검체를 이용한 조작에 의해 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값에서, 블랭크 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값을 뺀 전류 값과, 1, 5-안하이드로글루시톨 농도로부 터 검량선을 작성하였다.
인간의 전혈 4 검체에 대해서 마찬가지로, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값에서, 블랭크 측정용 센서 칩으로부터 얻은 전류 값을 뺀 전류 값과, 검량선을 대비하여, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨량을 얻었다. 그 결과를 표 6에 나타낸다. 검량선 작성을 위해 검체에 대해 4회 측정한 평균치를 사용하고, 검체도 4회 측정한 평균치를 사용하였다.
(참고 예 6)
실시예 5에서 측정한 것과 동일한 전혈 검체를, 참고 예 1에서와 동일한 조작에 의해 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
[표 6]
------------------------------------------------------------------
1, 5-안하이드로글루시톨
농도(μg/mL)
--------------------------------------
참고 예 6 실시예 5
--------------------------------------
전혈 검체 20 16.7 17.0
전혈 검체 21 29.8 28.0
전혈 검체 22 28.9 28.6
전혈 검체 23 31.7 31.2
------------------------------------------------------------------
전혈을 이용하여, 이것에 글루코오스 변환 시약을 작용시켜서 글루코오스를 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하고, 혈구를 분리하지 않고, 전극에 담지하지 않은 전극 시약과 반응시키는 경우, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정값(실시예 5)은, 공지된 측정 방법에 의한 참고 예 6의 측정값에 잘 일치(상관 계수, 0.9941)됨을 나타내며, 본 발명에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 수 있음을 나타내고 있다.
(참고 예 7)
일본국 전기 화학 Vol. 63, No. 10, p906-913(1995)에 기재되어 있는 효소와 매개체와의 반응 속도 평가 방법에 따라, 상기 바시디오마이세타우스 균류 No. 52 유래의 피라노오스 옥시다아제와 표 7에 나타낸 산화환원 매개체와 1, 5-안하이드로글루시톨과의 반응을 조사하였다.
폴리에틸렌 테레프탈레이트의 기반에 작용극과 리드부, 반대극과 리드부를 카본 잉크((주) 아사히 화학 연구소제, 제품명, 카본 페이스트 TU15ST)로, 두께 10㎛으로 스크린 인쇄하고, 참조 전극과 리드부를 은-염화은 잉크(silver-silver chloride)(아치손(Acheson)(주)제, 제품명, Electrodag PE-409)로, 두께 10㎛으로 스크린 인쇄하고, 150℃에서 40분 담금질하였다. 그 다음, 전극부와 측정 장치의 접속부를 제외하는 부분에 레지스트 잉크((주) 아사히 화학 연구소제, 제품명, CR18G-KF)를 두께 20㎛으로 스크린 인쇄하고, 130℃에서 15분 담금질해서 도 3에 나타내는 전극(13)을 제작하였다.
전기 화학적인 측정은, 전기 화학 검출기(함수 발생기 FG-02 부착 8CH 다중전위기 MODEL PS-08; (주)도호 기켄)를 사용하였다.
피라노오스 옥시다아제 20U/mL와, 표 7에 나타낸 산화환원 매개체 60μM을 함유하는 수용액 10μL를, 전기 화학 검출기에 접속한 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 올려놓고, 전극(13)의 참조 전극을 기준으로 사용하여 -0.5V로부터 +1V까지, 1mV/초로 전위를 소인(掃引)하여, 순환 전압전류법에 의해, 산화전류 값 Id를 측정하였다. 이어서, 피라노오스 옥시다아제 20U/mL, 기질(基質)(1, 5-안하이드로글루시톨 500μg/mL)과, 표 7에 나타낸 산화환원 매개체 60μM을 함유하는 수용액 10μL를 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 올려놓고, 전극(13)의 참조 전극을 기준으로 사용해서 -0.5V로부터 +1V까지, 1mV/초로 전위를 소인하여, 순환 전압전류법에 의해, 접촉전류 값(catalytic current value) Ik를 측정하였다. 접촉전류 값 Ik를 산화환원 매개체만의 산화전류 값 Id로 나눔으로써 얻은 값 Ik/Id에 의해, 산화환원 매개체와 효소의 반응 속도를 비교하였다.
각각의 산화환원 매개체에 대해서 구한 Ik/Id의 결과를 표 7에 나타냈다.
[표 7]
산화환원 매개체 Ik/Id
페리시안화 칼륨 1.7
[Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2 14.0
2. 6-다이메틸-p-벤조퀴논 6.9
2-메틸-1, 4-나프토퀴논 2.3
2, 3-다이메톡시-5-메틸-1, 4-벤조퀴논 3.3
N, N-다이메틸아미노메틸 페로센 5.1
페로센 메탄올 3.4
티오닌 아세테이트 10.0
메틸렌 블루 5.3
톨루이딘 블루 O 4.1
아즈레 I 16.4
아즈레 C 5.8
멜돌라 블루 1.8
1-메톡시-5-메틸페나쥼 메틸설페이트 2.8
2-다이클로로페놀-인도페놀 나트륨염 2수화물 2.8
4, 4'-비스(다이메틸아미노)다이페닐아민 3.3
N-메틸-N-(3-메톡시페닐)-1, 4-페닐렌다이아민 염산염 2.6
N-메틸-N-페닐-1, 4-페닐렌다이아민 염산염 2.5
니트로-TB* 1.9
2, 2'-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)다이암모늄
1.5
2-하이드라조노-2, 3-다이하이드로-3-메틸-6-벤조티아졸 술폰산
1.2
비스-{4-[N-3'-술포-n-프로필-N-n-부틸]아미노-2, 6-다이메틸페닐}메테인
1.5
비스-{4-[N-3'-술포-n-프로필-N-에틸]아미노-2, 6-다이메틸페닐}메테인
1.0
p-아미노페놀 3.5
N-(3-술포프로필)-3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘 나트륨염
1.5
* 니트로-TB: 3, 3'-[3, 3'-다이메톡시-(1, 1'-바이페닐)-4, 4'-딜]-비스[2-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸륨 염화물]
표 7은, 피라노오스 옥시다아제가, 오스뮴 착체, 페로센계 화합물, 퀴논계 화합물, 페노티아진계 화합물, 페녹사진계 화합물, 페나진계 화합물, 다이페닐아민계 화합물, 인도페놀계 화합물, 및 페놀계 화합물 등의 여러 가지의 산화환원 매개체와 빠른 속도로 반응하는 것을 나타낸다. 이 결과는, 이들 산화환원 매개체와 피라노오스 옥시다아제를 사용하는, 예를 들면, 실시예 1∼3의 방법에 의해 전혈 중 의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있는 것을 나타내고 있다.
(참고 예 8)
참고 예 7과 마찬가지 방법에 의해, 상기 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제와 표 8에 나타낸 산화환원 매개체와의 반응을 조사하였다.
참고 예 7과 마찬가지 방식에 의해 전극(13)을 제작하였다.
1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제(슈도모나스 sp. NK-85001 유래) 20U/mL와, 표 8에 나타낸 산화환원 매개체 60μM을 함유하는 수용액 10μL를, 전기 화학 검출기에 접속한 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 올려놓고, 전극(13)의 참조 전극을 기준으로 사용하여 -0.5V로부터 +1V까지, 1mV/초로 전위를 소인하여, 순환 전압전류법에 의해, 산화전류 값 Id를 측정하였다. 이어서, 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제 20U/mL, 기질(基質)(1, 5-안하이드로글루시톨 500μg/mL)과, 표 8에 나타낸 산화환원 매개체 60μM을 함유하는 수용액 10μL를 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 올려놓고, 전극(13)의 참조 전극을 기준으로 사용하여 -0.5V로부터 +1V까지, 1mV/초로 전위를 소인하여서, 순환 전압전류법에 의해, 접촉전류 값 Ik를 측정하였다. 접촉전류 값 Ik를 기질 없이 산화환원 매개체만의 산화전류 값 Id로 나누어 얻은 값 Ik/Id에 의해, 산화환원 매개체와 효소와의 반응 속도를 비교하였다.
각각의 산화환원 매개체에 대해서 얻은 Ik/Id 결과를 표 8에 나타냈다.
[표 8]
산화환원 매개체 Ik/Id
페리시안화 칼륨 3.4
[Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2 18.0
2. 6-다이메틸-p-벤조퀴논 8.9
2-메틸-1, 4-나프토퀴논 64.4
2, 3-다이메톡시-5-메틸-1, 4-벤조퀴논 11.2
N, N-다이메틸아미노메틸 페로센 5.0
페로센 메탄올 4.9
티오닌 아세테이트 58.8
메틸렌 블루 10.9
톨루이딘 블루 O 21.1
아즈레 I 18.3
아즈레 C 25.4
뉴 메틸렌 블루 4.3
1-메톡시-5-메틸페나쥼 메틸설페이트 1.6
2-다이클로로페놀-인도페놀 나트륨염 2수화물 10.3
4, 4'-비스(다이메틸아미노)다이페닐아민 3.6
N-메틸-N-(3-메톡시페닐)-1, 4-페닐렌다이아민 염산염 1.4
N-메틸-N-페닐-1, 4-페닐렌다이아민 염산염 2.2
비스-{4-[N-3'-술포-n-프로필-N-n-부틸]아미노-2, 6-다이메틸페닐}메테인
1.3
p-아미노페놀 3.2
N-(3-술포프로필)-3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘 나트륨염
2.2
말라카이트 그린 2.1
표 8은, 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제가, 오스뮴 착체, 페로센계 화합물, 퀴논계 화합물, 페노티아진계 화합물, 페녹사진계 화합물, 페나진계 화합물, 다이페닐아민계 화합물, 인도페놀계 화합물, 및 페놀계 화합물 등의 여러 가지의 산화환원 매개체와 빠른 속도로 반응하는 것을 나타낸다. 이 결과는, 이들 산화환원 매개체와 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제를 사용하는, 예를 들면, 실시예 4의 방법에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있는 것을 나타내고 있다.
(참고 예 9)
1) 글루코오스 변환 시약
1N 수산화나트륨 수용액을 사용해서 pH를 pH 7.0로 조정한 후의 조성으로서, 14.8mM의 MgCl2, 99.2mM의 KCl, 48mM의 포스포에놀피루베이트(PEP), 2mM의 ATP, 20U/mL의 피루브산 키나아제(PK), 16U/mL의 글루코키나아제, 10U/mL의 아스코르브산 산화효소, 200mM의 염화나트륨, 0.2mM의 EDTA·2Na, 및 1.2g/L의 BSA가 되도록 50mM의 MES 완충액에 각 성분을 더해, 글루코오스 변환 시약을 준비하였다.
2) 전극 시약 용액
전극 시약 용용 (a), (b), 및 (c)를 조제하기 위해,
(a) 0.54mM 페로세닐 PEG((주) 동인 화학 연구소제);
(b) 6.25U/mL 서양 고추냉이 페르옥시다아제(도요방적(東洋紡績)(주)제); 또는
(c) 50U/mL 피라노오스 옥시다아제(바시디오마이세타우스 균류 No.52 유래)를 이 조성으로 100mM의 MES 완충액(pH 7.0)에 용해하였다.
3) 센서 칩
우선, 참고 예 7에서 작성한 전극(13)의 작용극의 작용 전극 부위에 0.5％ 카복시메틸셀룰로오스 수용액 10μL를 도포하고, 50℃에서 10분간 건조해서 전극 표면을 친수화하였다. 이어서, 상기 2)에서 얻은 전극 시약 용액 (a) 3μL를 친수화한 부분에 적하·건조하고, 그 위에 전극 시약 용액 (b) 3μL를 적하·건조하고, 그 다음, 또한 전극 시약 용액 (c) 3μL를 적하·건조해서 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨의 검량선을 작성하기 위해, 생리 식염액에 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 첨가해 얻은 3 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 각 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는, 0, 10, 및 50μg/mL이었다) 각각 20μL를 글루코오스 변환 시약 10μL와 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 3)의 센서 칩의 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 15μL를 적하하고, 5분간 반응한 후에, 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 0V를 인가하고, 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 전류 값과 1, 5-안하이드로글루시톨 농도로부터 검량선을 작성하였다. 도면에서, 1,5 AG는 1, 5-안하이드로글루시톨을 나타낸다.
얻어진 검량선은 농도 의존성이 양호한 검량선을 나타낸다. 이 결과는, 페로세닐 PEG와 피라노오스 옥시다아제를 사용하는, 예를 들면, 실시예 1∼3의 방법에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있음을 나타내고 있다.
(참고 예 10)
1) 글루코오스 변환 시약
실시예 1에 있어서의 1)의 글루코오스 변환 시약을 사용하였다.
2) 전극 시약 용액
표 9의 농도를 갖는 산화환원 매개체 및 표 9의 농도를 갖는 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제(슈도모나스 sp. NK-85001 유래)를 각각의 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
3) 센서 칩
참고 예 7에서 작성한 전극(13)의 작용극에, 상기의 2)에서 얻은 전극 시약 용액 2μL를 도포하고, 50℃에서 5분간 건조해서 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨의 검량선을 작성하기 위해서, 0.38％ 시트르산 나트륨 용액에, 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 더해 얻은 5 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 각 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는, 0, 2.5, 11.9, 24.2, 및 49.3μg/mL이었다) 각각 10μL와 글루코오스 변환 시약 5μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 표 9 기재의 각각의 전위를 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 인가하고, 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하여, 상기 전류 값과 1, 5-안하이드로글루시톨의 농도로부터 검량선을 작성하였다. 이들 검량선을 도 5∼도 13에 나타냈다.
[표 9]

시험
No.
산화환원 매개체		 전극 시약
용액의 매개체 농도
(μM)		 전극 시약 용액의 AGDH*
농도
(U/mL)
전위
No. 1 2, 6-다이메틸-p-벤조퀴논 150 50 0.5
No. 2 2-메틸-1, 4-나프토퀴논 150 50 0.1
No. 3 티오닌 염화물 75 50 -0.1
No. 4 메틸렌 블루 200 100 -0.2
No. 5 톨루이딘 블루 0 12.5 50 -0.1
No. 6 아즈레 C 75 50 0
No. 7 4, 4'-비스(다이메틸아미노)-다이페닐아민
75
50
0
No. 8 2-다이클로로페놀-인도페놀 나트륨염 2수화물
75
50
0.1
No. 9 1-메톡시-5-메틸페나쥼 메틸설페이트
150
50
0
* AGDH: 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제
얻어진 검량선은, 모두 농도 의존성이 있는 평탄한 검량선이다. 이 결과는, 이들 매개체와 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제를 사용하는 전류 적정법에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있음을 나타내고 있다.
(참고 예 11)
1) 글루코오스 변환 시약
실시예 1에 있어서의 1)에서 얻은 글루코오스 변환 시약을 사용하였다.
2) 전극 시약 용액
표 10에 기재된 농도를 갖는 산화환원 매개체 및 표 10에 기재된 농도를 갖는 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제(슈도모나스 sp. NK-85001 유래)를 각각의 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
3) 센서 칩
참고 예 7에서 작성한 전극(13)의 작용극에, 상기 2)의 전극 시약 용액 2μL를 도포하고, 50℃에서 5분간 건조해서 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨의 검량선을 작성하기 위해서, 0.38％ 시트르산 나트륨 용액에 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 더해 얻은 6 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨의 농도는, 0, 2.5, 5.0, 11.9, 24.2, 및 49.3μg/mL이었다) 10μL와 글루코오스 변환 시약 5μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 표 10의 각각의 제1전위를, 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 10초 인가하고, 그 후 제2전위를, 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해 110초 인가하였다. 제2전위의 인가 개시로부터 100초간에 대한 쿨롬 양(coulomb level)을 전기 화학 검출기로 전기량법에 대해 측정하고, 쿨롬 양과 1, 5-안하이드로글루시톨의 농도로부터 검량선을 작성하였다. 상기 검량선을 도 14∼도 27에 나타냈다.
[표 10]

시험
No.

산화환원 매개체		 전극 시약
용액의 매개체 농도
(μM)		 전극 시약 용액의 AGDH*
농도
(μM)
제1
전위
제2
전위
No. 1 [Os(ⅠⅠⅠ)(바이피리딜)2(이미다조일)Cl]Cl2
300
25
0.15
0.25
No. 2 2, 6-다이메틸-p-벤조퀴논 150 50 0.5 0.6
No. 3 2, 3-다이메톡시-5-메틸-1, 4-벤조퀴논
150
50
0.5
0.6
No. 4 2-메틸-1, 4-나프토퀴논 150 50 0.1 0.2
No. 5 티오닌 아세테이트 5 50 -0.1 0
No. 6 티오닌 염화물 75 50 -0.1 0
No. 7 메틸렌 블루 200 100 -0.2 -0.1
No. 8 톨루이딘 블루 0 12.5 50 -0.1 0
No. 9 아즈레 I 120 40 0.2 0.3
No. 10 아즈레 C 75 50 0 0.1
No. 11 멜돌라 블루 150 50 0 0.1
No. 12 4, 4'-비스(다이메틸아미노)-다이페닐아민
75
50
0
0.1
No. 13 2-다이클로로페놀-인도페놀 나트륨염 2수화물
75
50
0.1
0.2
No. 14 1-메톡시-5-메틸페나쥼 메틸설페이트
150
50
0
0.1
* AGDH: 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제
얻어진 검량선은 모두 농도 의존성이 있는 평탄한 검량선이다. 이 결과는, 이들 매개체와 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제를 사용하는 전기량법에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있다는 것을 나타내고 있다.
(실시예 6)
1) 글루코오스 변환 시약
실시예 1에 있어서의 1)에서 얻은 글루코오스 변환 시약을 사용하였다.
2) 전극 시약 용액
120μM의 티오닌 아세테이트(시그마-알드리히 일본(주)제), 및 40U/mL의 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제(슈도모나스 sp. NK-85001 유래)를 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
3) 센서 칩
참고 예 7에서 작성한 전극(13)의 작용극에, 상기 2)에서 얻은 전극 시약 용액 2μL를 도포하고, 50℃에서 5분간 건조해서 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨의 검량선을 작성하기 위해서, 0.38％ 시트르산 나트륨 용액에 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 더해 얻은 7 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 각 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는, 0, 2.5, 5.0, 11.9, 24.2, 49.3, 및 98.8μg/mL이었다) 각각 10μL와 글루코오스 변환 시약 5μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 -0.1V를 10초, 이어서 0V를 110초 인가하였다. 0V의 인가 개시로부터 100초동안 쿨롬 양을 전기 화학 검출기로 측정하고, 쿨롬 양과 1, 5-안하이드로글루시톨 농도로부터 검량선을 작성하였다. 양호한 직선성을 나타내는 검량선을 도 28에 나타냈다.
5) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정 조작
1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 7명으로부터의 인간의 전혈 검체 각각 10μL와 글루코오스 변환 시약 5μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 -0.1V를 10초, 이어서 0V를 110초 인가하였다. 0V의 인가 개시로부터 100초동안 쿨롬 양을 전기 화학 검출기로 측정하고, 검량선과 대비해서 7 검체에 대해서 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨량을 얻었다. 그 결과를 표 11에 나타낸다. 그 결과는 4회 측정한 평균치이다.
(참고 예 12)
비교를 위해서, 실시예 6의 5)에서 측정한 것과 동일한 전혈 검체를 참고 예 1의 조작 방법에 의해 1, 5-안하이드로글루시톨에 대해 측정하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[표 11]
------------------------------------------------------------------
1, 5-안하이드로글루시톨
농도(μg/mL)
--------------------------------------
참고 예 12 실시예 6
--------------------------------------
전혈 검체 24 8.5 10.1
전혈 검체 25 15.7 15.2
전혈 검체 26 12.9 12.1
전혈 검체 27 22.7 19.0
전혈 검체 28 25.6 24.5
전혈 검체 29 26.8 21.5
전혈 검체 30 28.5 26.3
------------------------------------------------------------------
전혈을 이용하여, 이것에 글루코오스 변환 시약을 작용시켜서 글루코오스를 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하고, 혈구를 분리하지 않고, 티오닌 아세테이트를 함유하는 전극 시약과 반응시키는 경우, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정값(실시예 6)은, 공지된 측정 방법에 의한 참고 예 12의 측정값과 잘 일치(상관 계수, 0.9711)하는 것을 나타내며, 본 발명에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있는 것을 나타내고 있다.
(실시예 7)
1) 글루코오스 변환 시약
실시예 1에 있어서의 1)에서 얻은 글루코오스 변환 시약을 사용하였다.
2) 전극 시약 용액
(i) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용
50μM의 메틸렌 블루(요네야마(米山) 약품 공업(주)제), 및 100U/mL의 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제(슈도모나스 sp. NK-85001 유래)를 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
(ii) 블랭크 측정용
50μM의 메틸렌 블루(요네야마(米山) 약품 공업(주)제)를 이 조성으 로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
3) 센서 칩
참고 예 7에서 작성한 도 3에 나타낸 2개의 전극(13)의 작용극에, 상기 2)에서 얻은 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 또는 블랭크 측정용의 전극 시약 용액 2μL를 도포하고, 50℃에서 5분간 건조해서 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 또는 블랭크 측정용 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨의 검량선을 작성하기 위해서, 1, 5-안하이드로글루시톨이 사실상 존재하지 않는 것으로 알려져 있는 양(羊) 혈청(일본 바이오 테스트(주)제)에 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 첨가해 얻은 6 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 각 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는, 0.6, 2.8, 5.0, 10.0, 24.7, 및 50.2μg/mL이었다) 각각 20μL와, 글루코오스 변환 시약 10μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩 또는 블랭크 측정용 센서 칩의 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 각각의 센서 칩의 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 -0.2V를 10초, 이어서 -0.1V를 110초간 인가하였다. -0.1V의 인가 개시로부터 100초동안 쿨롬 양을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩의 쿨롬 양으로부터 블랭크 측정용 센서 칩의 쿨롬 양을 뺀 쿨롬 양과 1, 5-안하이드로글루시톨 농도로부터 검량선을 작성하였다. 양호한 직선성을 나타내는 검량선을 도 29에 나타냈다.
5) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정 조작
실시예 6의 7명으로부터의 전혈 각각 20μL와 글루코오스 변환 시약 10μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 또는 블랭크 측정용 센서 칩의 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 각각의 센서 칩의 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 -0.2V를 10초, 이어서 -0.1V를 110초간 인가하였다. -0.1V의 인가 개시로부터 100초동안 쿨롬 양을 전기 화학 검출기(GPIB RS232C 부착 8CH 다중전위기(Multipotentiostat) MODEL PS-08; (주)도호 기켄제)로 측정하고, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩의 쿨롬 양으로부터 블랭크 측정용 센서 칩의 쿨롬 양을 뺀 쿨롬 양을 구하고, 검량선과 대비해서 7 검체에 대해서 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 양을 구하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다. 그 결과는 4회 측정한 평균치이다.
(참고 예 12)
실시예 7에서 사용한 검체는, 실시예 6에서와 동일한 전혈 검체이므로, 실시예 6의 결과를 참고 예 12로서 표 12에 나타낸다.
[표 12]
------------------------------------------------------------------
1, 5-안하이드로글루시톨
농도(μg/mL)
--------------------------------------
참고 예 12 실시예 7
--------------------------------------
전혈 검체 24 8.5 9.6
전혈 검체 25 15.7 14.5
전혈 검체 26 12.9 12.9
전혈 검체 27 22.7 23.7
전혈 검체 28 25.6 20.9
전혈 검체 29 26.8 23.9
전혈 검체 30 28.5 24.1
------------------------------------------------------------------
전혈을 이용하여, 이것에 글루코오스 변환 시약을 작용시켜서 글루코오스를 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하고, 혈구를 분리하지 않고, 메틸렌 블루를 함유하는 전극 시약과 반응시키는 경우, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정값(실시예 7)은, 공지된 측정 방법에 의한 참고 예 12의 측정값에 잘 일치(상관 계수, 0.9658)하는 것을 나타내며, 본 발명에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있음을 나타내고 있다.
(실시예 8)
1) 글루코오스 변환 시약
실시예 1에 있어서의 1)에서 얻은 글루코오스 변환 시약을 사용하였다.
2) 전극 시약 용액
120μM의 티오닌 아세테이트(시그마-알드리히 일본(주)제), 및 40U/mL의 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제(슈도모나스 sp. NK-85001 유래)를 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
3) 센서 칩
참고 예 7에서 작성한 전극(13)의 작용극에, 상기 2)에서 얻은 전극 시약 용액 2μL를 도포하고, 50℃에서 5분간 건조해서 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨의 검량선을 작성하기 위해서, 양 혈청(일본 바이오 테스트(주)제)에 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 첨가해 얻은 7 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 각 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는, 0.6, 2.8, 5.0, 10.0, 24.7, 50.2, 및 103.9μg/mL이었다) 각각 10μL와, 글루코오스 변환 시약 5μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 반응액 10μL를 적하하고, 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 -0.1V를 인가하여, 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하고, 전류 값과 1, 5-안하이드로글루시톨 농도로부터 검량선을 작성하였다. 양호한 직선성을 나타내는 검량선을 도 30에 나타냈다.
5) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정 조작
실시예 6의 7명으로부터의 전혈 각각 10μL와 글루코오스 변환 시약 5μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 -0.1V를 인가하여 5초 후의 전류 값을 전기 화학 검출기로 측정하고, 얻은 전류 값을 검량선과 대비해서, 7 검체에 대해서 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 양을 구하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다. 그 결과는 4회 측정한 평균치이다.
(참고 예 12)
실시예 8에서 사용한 검체는, 실시예 6에서와 동일한 전혈 검체이므로, 실시예 6의 측정 결과를 참고 예 12로서 표 13에 나타낸다.
[표 13]
------------------------------------------------------------------
1, 5-안하이드로글루시톨
농도(μg/mL)
--------------------------------------
참고 예 12 실시예 8
--------------------------------------
전혈 검체 24 8.5 10.0
전혈 검체 25 15.7 14.7
전혈 검체 26 12.9 11.7
전혈 검체 27 22.7 19.5
전혈 검체 28 25.6 25.4
전혈 검체 29 26.8 21.6
전혈 검체 30 28.5 27.0
------------------------------------------------------------------
전혈을 이용하여, 이것에 글루코오스 변환 시약을 작용시켜서 글루코오스를 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하고, 혈구를 분리하지 않고, 티오닌 아세테이트를 함유하는 전극 시약과 반응시키는 경우, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정값(실시예 8)은, 공지된 측정 방법에 의한 참고 예 12의 측정값에 잘 일치(상관 계수, 0.9700)하는 것을 나타내며, 본 발명에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있음을 나타내고 있다.
(실시예 9)
1) 글루코오스 변환 시약
실시예 1에 있어서의 1)에서 얻은 글루코오스 변환 시약을 사용하였다.
2) 전극 시약 용액
120μM의 티오닌 아세테이트(시그마-알드리히 일본(주)제), 및 40U/mL의 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제(슈도모나스 sp. NK-85001 유래)를 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
3) 센서 칩
참고 예 7에서 작성하고, 참고 예 9와 동일한 방식으로 처리를 한 전극(13)의 작용극에, 상기 2)에서 얻은 전극 시약 용액 2μL를 도포하고, 50℃에서 5분간 건조해서 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨의 검량선을 작성하기 위해서, 0.38％ 시트르산 나트륨 용액에 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 더해 얻은 4 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 각 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는, 0, 5.0, 11.9, 및 24.2μg/mL이었다) 각각 10μL와 글루코오스 변환 시약 5μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 0V를 110초 인가하고, 인가 개시로부터 100초동안 쿨롬 양을 전기 화학 검출기로 측정하여, 센서 칩의 쿨롬 양과 1, 5-안하이드로글루시톨 농도로부터 검량선을 작성하였다. 양호한 직선성을 나타내는 검량선을 도 31에 나타냈다.
5) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정 조작
1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 6명으로부터의 인간의 전혈 각각 10μL와 글루코오스 변환 시약 5μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 0V를 110초 인가하고, 인가 개시로부터 100초동안 쿨롬 양을 전기 화학 검출기로 측정하고, 얻은 쿨롬 양을 검량선과 대비해서 6 검체에 대해서 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨량을 얻었다. 그 결과를 표 14에 나타낸다. 그 결과는 4회 측정한 평균치이다.
(참고 예 13)
비교를 위해서, 실시예 9의 5)에서 측정한 것과 동일한 전혈 검체를 참고 예 1의 조작에 의해 1, 5-안하이드로글루시톨에 대해 측정하였다. 그 결과를 표 14에 나타낸다.
[표 14]
------------------------------------------------------------------
1, 5-안하이드로글루시톨
농도(μg/mL)
--------------------------------------
참고 예 13 실시예 9
--------------------------------------
전혈 검체 31 8.9 10.6
전혈 검체 32 16.2 15.2
전혈 검체 33 14.1 14.0
전혈 검체 34 23.3 21.3
전혈 검체 35 25.9 23.1
전혈 검체 36 32.1 24.7
------------------------------------------------------------------
전혈을 이용하여, 이것에 글루코오스 변환 시약을 작용시켜서 글루코오스를 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하고, 혈구를 분리하지 않고, 티오닌 아세테이트를 함유하는 전극 시약과 반응시키는 경우, 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정값(실시예 9)은, 공지된 측정 방법에 의한 참고 예 13의 측정값에 잘 일치(상관 계수, 0.9855)하는 것을 나타내며, 본 발명에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있는 것을 나타내고 있다.
(실시예 10)
1) 글루코오스 변환 시약
실시예 1에 있어서의 1)에서 얻은 글루코오스 변환 시약을 사용하였다.
2) 전극 시약 용액
(i) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용
100μM의 메틸렌 블루(동경 화성 공업(주)제), 및 50U/mL의 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제(슈도모나스 sp. NK-85001 유래)를 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
(ii) 블랭크 측정용
100μM의 메틸렌 블루(동경 화성 공업(주)제)를 이 조성으로 정제수에 용해해서 전극 시약 용액을 조제하였다.
3) 센서 칩
참고 예 7에서 작성하고 도 3에서 나타낸 2개의 전극(13)을 준비하여, 상기 2)에서 얻은 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 또는 블랭크 측정용의 전극 시약 용액 2μL를 상기 전극의 작용극에 도포하고, 50℃에서 5분간 건조해서, 1, 5-안하이 드로글루시톨 측정용 또는 블랭크 측정용 센서 칩을 제작하였다.
4) 검량선 작성
1, 5-안하이드로글루시톨의 검량선을 작성하기 위해서, 양 혈청(일본 바이오 테스트(주)제)에 농도를 아는 1, 5-안하이드로글루시톨 표품을 첨가해 얻은 4 검체(혈구 분리 조작을 제외하고 참고 예 1의 조작에 의해 얻은 각 검체의 1, 5-안하이드로글루시톨 농도는, 0.6, 10.0, 50.2, 및 103.9μg/mL이었다) 각각 20μL와 글루코오스 변환 시약 10μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 또는 블랭크 측정용 센서 칩의 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 센서 칩의 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 -0.1V를 110초 인가하고, -0.1V의 인가 개시로부터 100초동안 쿨롬 양을 전기 화학 검출기로 측정하였다. 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩으로부터 얻은 쿨롬 양과 블랭크 측정용 센서 칩으로부터 얻은 쿨롬 양의 차이와, 1, 5-안하이드로글루시톨의 농도로부터 검량선을 작성하였다. 양호한 직선성을 갖는 검량선을 도 32에 나타냈다.
5) 1, 5-안하이드로글루시톨 측정 조작
실시예 9의 6명으로부터의 전혈 각각 20μL와 글루코오스 변환 시약 10μL를 에펜도르프 튜브 내에서 혼합해서 5분간 방치하였다. 그 후, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 또는 블랭크 측정용 센서 칩의 전극(13)의 검체 첨가 위치(1)에 각각 반응액 10μL를 적하하고, 센서 칩의 참조 전극(은-염화은)을 기준으로 사용해서 -0.1V를 110초 인가하고, -0.1V의 인가 개시로부터 100초동안 쿨롬 양을 전기 화학 검출기로 측정하고, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩의 쿨롬 양으로부터 블랭크 측정용 센서 칩의 쿨롬 양을 뺀 쿨롬 양을 구하여, 검량선과 대비해서 6 검체에 대해서 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨량을 얻었다. 그 결과를 표 15에 나타낸다. 그 결과는 4회 측정한 평균치이다.
(참고 예 13)
실시예 10에서 사용한 검체는, 실시예 9에서 사용한 것과 동일한 전혈 검체이므로, 실시예 9의 측정 결과를 참고 예 13으로서 표 15에 나타낸다.
[표 15]
------------------------------------------------------------------
1, 5-안하이드로글루시톨
농도(μg/mL)
--------------------------------------
참고 예 13 실시예 10
--------------------------------------
전혈 검체 31 8.9 11.0
전혈 검체 32 16.2 17.2
전혈 검체 33 14.1 15.0
전혈 검체 34 23.3 24.0
전혈 검체 35 25.9 24.5
전혈 검체 36 32.1 31.4
------------------------------------------------------------------
전혈을 이용하여, 이것에 글루코오스 변환 시약을 작용시켜서 글루코오스를 측정에 간섭하지 않는 물질로 변환하고, 혈구를 분리하지 않고, 메틸렌 블루를 함유하는 전극 시약과 반응시키는 경우, 차동법에 의해 측정한 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정값(실시예 10)은, 공지된 측정 방법에 의한 참고 예 13의 측정값에 잘 일치(상관 계수, 0.9964)하는 것을 나타내며, 본 발명에 의해 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정할 수 있음을 나타내고 있다.
본 발명의 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정하는 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법에 의해, 원심 분리기 등을 이용하지 않고 미량의 전혈 내의 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 측정 방법은 베드사이드(bedside) 혹은 진찰실에서의 1, 5-안하이드로글루시톨의 신속측정 및 가정에서의 환자 자신에 의한 측정에 적용할 수 있다.

Claims (18)

  1. 전혈(全血) 중의 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 방법에 있어서,
    측정에 간섭하는 글루코오스 및 그 유도체 또는 글루코오스 또는 그 유도체를 소거 또는 변환하는 공정과, 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 후속 공정을 포함하고,
    또한 글루코오스 및 그 유도체 또는 글루코오스 또는 그 유도체를 소거 또는 변환함으로써 혈구 분리를 하지 않고 전혈 그대로 사용하며, 또한 혈구를 분리하는 일 없이 1, 5-안하이드로글루시톨을 측정하는 효소를 작용시켜서, 1, 5-안하이드로글루시톨을 전기 화학적으로 측정하는,
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 효소가 산화환원효소인
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    산화환원효소가 피라노오스 옥시다아제(pyranose oxidase), L-솔보스 옥시다아제(L-sorbose oxidase), 또는 1, 5-안하이드로글루시톨 디하이드로게나아제인
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    산화환원효소가 슈도모나스(Pseudomonas) 속 또는 아그로박테리움(Agrobacterium) 속에서 유래되는
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    1, 5-안하이드로글루시톨을 산화환원 매개체(redox mediator)의 존재 하에 전기 화학적으로 측정하는
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    산화환원 매개체가 오스뮴 착체, 퀴논계 화합물, 페로센계 화합물, 페노티아진계 화합물, 페녹사진계 화합물, 페나진계 화합물, 인도페놀계 화합물, 다이페닐아민계 화합물, 또는 페놀계 화합물인
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    혈구 분리를 하지 않고 효소를 이용해서 전혈 그대로로부터 글루코오스 및 그 유도체 또는 글루코오스 또는 그 유도체를 소거 또는 변환하는
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    1, 5-안하이드로글루시톨을 안정화제의 존재 하에 전기 화학적으로 측정하는
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    안정화제가 2-술포벤조산 또는 3-술포벤조산인
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  10. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    1, 5-안하이드로글루시톨을 전류 적정법, 전기량법, 또는 순환 전압전류법(cyclic voltammentry)에 의해 전기 화학적으로 측정하는
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    1, 5-안하이드로글루시톨을, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체가 함유되어 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극과, 반대극을 구비하는 전극을 이용해서 전기 화학적으로 측정하는
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    1, 5-안하이드로글루시톨을 차동형 전극(differential electrode)을 이용해서 전기 화학적으로 측정하는
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    차동형 전극은, 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체가 함유되어 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극과, 산화환원 매개체를 함유하지만 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 산화환원효소를 함유하고 있지 않은 블랭크 측정용 작용극, 및 반대극을 구비한 전극인
    1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
  14. 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체를 함유하고 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극과, 반대극을 구비한 전극을 포함하는
    전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩.
  15. 제14항에 있어서,
    글루코오스 및 그 유도체 또는 글루코오스 또는 그 유도체를 소거 또는 변환하는 시약을 더 함유하는
    전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩.
  16. 제14항에 있어서,
    1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소 및 산화환원 매개체를 함유하고 있는 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 작용극과, 산화환원 매개체를 함유하지만 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용의 산화환원효소를 함유하고 있지 않은 블랭크 측정용 작용극, 및 반대극을 구비한 전극을 포함하는 차동형 전극을 구비하는
    전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 센서 칩.
  17. 제14항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 센서 칩, 채혈에 사용하는 랜싯 디바이스(lancet device), 및 1, 5-안하이드로글루시톨용 측정기를 포함하는
    전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 키트.
  18. 제17항에 있어서,
    글루코오스 및 그 유도체 또는 글루코오스 또는 그 유도체를 소거 또는 변환하는 시약을 더 포함하는
    전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨 측정용 키트.
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