JP4349697B2 - １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１，５−アンヒドログルシトール（以下、「１，５−ＡＧ」と記載する。）を基質とする１，５−ＡＧ脱水素酵素及び前記酵素の製造方法、前記酵素を用いた１，５−ＡＧの定量法、並びに、前記酵素をコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
１，５−ＡＧは、健常人の場合、一定以上の濃度で生体内に存在しているが、糖尿病の患者の場合、著しい濃度低下が見られるため、糖尿病の診断マーカーとして臨床検査における重要な検査項目の１つとして用いられ、その利用価値は極めて高い。
【０００３】
従来より知られている、酵素を用いた１，５−ＡＧの定量法としては、１，５−ＡＧを含む試料にピラノースオキシダーゼを作用させることによって生成する過酸化水素を、パーオキシダーゼ発色系にて比色定量する方法（特公平5-41238号公報）が知られている。
【０００４】
それ以外の方法として、１，５−ＡＧ酸化能を有する酸化酵素を作用させ、酸素の消費量や電子受容体の還元体又は酸化された１，５−ＡＧ反応生成物を測定する方法等が知られている。その中でも特に特開昭62-79780号公報には、ピクノポラス属、コリオラス属、シュードモナス属細菌の生産する１，５−ＡＧ脱水素酵素について、特開平10-155479号公報にはアグロバクテリウム属細菌の生産する１，５−ＡＧ脱水素酵素について開示されており、どちらの酵素も１，５−ＡＧの測定に用いることが可能であることが知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来から知られている１，５−ＡＧを基質とする酵素は、１，５−ＡＧに対する特異性は高いとは言えない。
【０００６】
特開昭62-79780号公報には、１，５−ＡＧ脱水素酵素は、１，５−ＡＧ以外にもグルコース、ガラクトース、ソルボース、キシロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、アラビトール、エリスリトールの糖質に活性を示すとの記載がある。
【０００７】
特開平10-155479号公報には、１，５−ＡＧ脱水素酵素は、１，５−ＡＧ以外にソルボース、グルコースに対して活性があると記載されている。
【０００８】
１，５−ＡＧの定量に使用される場合、１，５−ＡＧに作用する酵素であっても、前述の様な基質特異性が低い酵素であれば、酵素のメリットが十分に生かされなくなってしまうことがある。この様な従来から知られている酵素の特異性の低さは、測定対象となる試料に由来する諸事情によっても更に大きな問題点となる。
【０００９】
糖尿病患者の血中グルコース濃度は健常人と比較して高く、健常人では６０〜１１０ｍｇ／ｄｌ位であるのに対して、糖尿病患者では１１０〜１０００ｍｇ／ｄｌと高い値を示す。
【００１０】
一方、血中の１，５−ＡＧの濃度は、健常人では１．５〜２．８ｍｇ／ｄｌ位であるのに対して、糖尿病患者では０．１５〜０．２ｍｇ／ｄｌ位の低い値を示す。グルコース濃度と１，５−ＡＧとの濃度差が糖尿病患者で約１０００倍程度になるため、１，５−ＡＧを酵素法によって測定する場合、従来の脱水素酵素を使用するときは、グルコースの除去や修飾を行う前処理操作が必要となる。
【００１１】
前処理方法としては、試料中に含まれる１，５−ＡＧ以外の糖質をイオン交換カラム等を用いて除去する方法があるが、この方法は分離操作が煩雑であり、特に多数の試料を処理する場合には非常に時間がかかる。また、グルコース等の糖質に対してリン酸化による修飾を行う方法は、グルコースのリン酸化反応の至適条件と１，５−ＡＧ測定条件とが異なるため、それぞれ別々の反応条件で行う必要がある。
【００１２】
微生物を培養して目的の酵素を精製分離する方法において、通常用いられる方法としては、目的の酵素と特異的に反応する基質を培地に添加して培養を行う方法がある。１，５−ＡＧ脱水素酵素の場合、１，５−ＡＧ添加培地で、１，５−ＡＧ脱水素酵素生産菌を培養するのが一般的な酵素の製造法である。
【００１３】
しかし、１，５−ＡＧは値段が高く大量の酵素を入手する場合は、１，５−ＡＧを大量に消費しなければならないため分離精製された酵素の単価が高くなってしまうという欠点を持つ。培養菌が、目的とする１，５−ＡＧ以外の物質を栄養源として利用できない性質を持つ場合は、栄養源を他の物質で代用することができない。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
従来の酵素における欠点を克服するため、本発明者らは、１，５−ＡＧに対する基質特異性が従来の脱水素酵素よりも高く、しかも従来に知られていない１，５−ＡＧ脱水素酵素を生産する菌のスクリーニングを行った。そして１，５−ＡＧ分解菌の生成する酵素が、１，５−ＡＧの測定に利用できる酵素であるか否かの検討を行うと共に、酵素の持つ物理化学的な特徴について検討を行った。
【００１５】
その結果、土壌より採取した微生物の培養上清中に、基質として１，５−ＡＧに特異的に反応する酵素の存在を見出した。
【００１６】
前記酵素は、電子受容体として酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下で１，５−ＡＧに作用させると、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の生成を示唆する、３４０ｎｍにおける吸光度の増加が見られたため、脱水素酵素であることが確認された。
【００１７】
更に分離精製された１，５−ＡＧ脱水素酵素の物理化学的諸性質を調べたところ従来に知られていない新規な酵素であることが確認された。
【００１８】
すなわち、本発明は、次にあげる理化学的特性を示す１，５−ＡＧ脱水素酵素（以下、「本発明酵素」ともいう）を提供する。
(1) 作用： １，５−ＡＧの脱水素反応を触媒する。
(2) 基質特異性：１，５−ＡＧを基質として認識するが、グルコースを基質として認識しない。
(3) 至適ｐＨ：９．０付近である。
(4) ｐＨ安定性：ｐＨ６．０〜１０．０で安定である。
(5) 至適温度：４０〜５０℃である。
(6) 温度安定性：７０℃、１０分間のインキュベーションで５０％以上の活性が残存している。
(7) 電子受容体：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を利用できる。
(8) 分子量：ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約３６，０００であり、ゲルろ過法による分子量は約１４１，０００である。
【００１９】
本発明酵素は、好ましくは、トリコデルマ属の菌を培養することによって生産されるものである。トリコデルマ属の菌は、好ましくは、トリコデルマ・ロンギブラキアツムＫＤＫ３００３(Tricoderma longibrachiatum KDK3003)である。
【００２０】
本発明酵素は、また、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。
【００２１】
また、本発明は、本発明酵素の製造方法（以下、「本発明製造方法」ともいう）及び本発明酵素を用いる１，５−ＡＧの定量法（以下、「本発明定量法」ともいう）を提供する。本発明製造法は、本発明酵素を生産するトリコデルマ属の菌を栄養培地で培養し、培養物から、生産された本発明酵素を分離精製することを特徴とする。本発明定量法は、ＮＡＤ存在下で、１，５−ＡＧを含む試料に本発明酵素を反応させることによって生成するＮＡＤＨを吸光度の変化量により測定することを特徴とする。
【００２２】
さらに、また、本発明は、本発明酵素の一部分をコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡは配列番号１に示す塩基配列を有する。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明酵素は、１，５−ＡＧ以外で生体内に最も多く存在する糖質であるグルコースを基質として認識することができないが、１，５−ＡＧに対しては特異的な活性を示す脱水素酵素である。なお、本明細書において、糖及び糖アルコールであって光学異性体のあるものは、特記しない限りＤ型のものを意味する。
【００２４】
先ず、本発明酵素の理化学的特性について説明する。
(1) 作用
１，５−ＡＧの脱水素反応を触媒する。脱水素反応は電子受容体の存在下に起こる。
(2) 基質特異性：１，５−ＡＧを基質として認識するが、グルコースを基質として認識しない。より具体的には、後記実施例に記載の条件において、グルコース、ソルビトール、キシリトール及びマンニトールに対して活性が検出されず、グリセルアルデヒドに対しては、１，５−ＡＧに対する活性を１００％とした場合、５０％程度位の活性を示す。
(3) 至適ｐＨ：９．０付近である。
(4) ｐＨ安定性：ｐＨ６．０〜１０．０で安定である。
(5) 至適温度：４０〜５０℃である。
(6) 温度安定性：７０℃、１０分間のインキュベーションで５０％以上の活性が残存している。
(7) 電子受容体：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を利用できる。電子受容体として利用できるか否かは後記実施例に記載の方法で確認することができる。
(8) 分子量：ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約３６，０００であり、ゲルろ過法による分子量は約１４１，０００である。
【００２５】
なお、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性及び分子量は後記実施例に記載の方法で測定できる。
【００２６】
本発明酵素は、好ましくは、トリコデルマ属の菌を培養することによって生産されるものである。トリコデルマ属の菌は、好ましくは、トリコデルマ・ロンギブラキアツムＫＤＫ３００３(Tricoderma longibrachiatum KDK3003)である。本発明酵素を生産するトリコデルマ属の菌及びその培養の条件については本発明製造方法に関して説明する。
【００２７】
本発明酵素は、また、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。配列番号２に示すアミノ酸配列は、トリコデルマ・ロンギブラキアツムＫＤＫ３００３から取得された本発明酵素の部分ｃＤＮＡの塩基配列から推定されたものである。酵素については、一般に、種間や個体間でアミノ酸配列に酵素の活性に実質的に影響を与えない変異が存在し得ること、及び、このような変異を人工的に生じさせることができることが周知であり、したがって、好ましい本発明酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列においてこのような変異を有するアミノ酸配列を有するものも包含する。すなわち、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の欠失、置換又は挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記本発明酵素の(1)及び(2)の特性（好ましくは上記の(1)〜(8)の特性）を損なわないものも包含する。
【００２８】
本発明酵素は、以下に説明する本発明製造方法により得ることができる。
【００２９】
本発明製造方法は、本発明酵素を生産するトリコデルマ属の菌を栄養培地で培養し、培養物から、生産された本発明酵素を分離精製することを特徴とする。
【００３０】
本発明酵素を生産するトリコデルマ属の菌は、トリコデルマ属の菌を１，５−ＡＧ資化能を指標としてスクリーニングし、次いで、無細胞抽出液のＮＡＤ依存的１，５−ＡＧ脱水素活性を指標としてスクリーニングをすることによって得ることができる。
【００３１】
１，５−ＡＧ資化能は、１，５−ＡＧからのグルコースへの変換により評価できる。評価法としては、特に限定されないが、例としては、１，５−ＡＧを単独の炭素源とする培地で、スクリーニングされる菌を培養して得た培養ろ液中におけるグルコースの生成をグルコースオキシダーゼにより測定する方法、緩衝液中で休止細胞を１，５−ＡＧに作用させて緩衝液中におけるグルコースの生成を薄層クロマトグラフィーで検出する方法、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。これらの方法の具体的条件としては後記実施例１に記載された条件を挙げられる。
【００３２】
無細胞抽出液のＮＡＤ依存的１，５−ＡＧ脱水素活性は、細胞を破砕し遠心分離して得た上清を無細胞抽出液とし、これにＮＡＤ及び１，５−ＡＧを添加し、３４０ｎｍの吸光度の変化を測定することにより評価できる。細胞の破砕及び吸光度の測定の条件は、ＮＡＤ依存的１，５−ＡＧ脱水素活性が測定できる限り、特に制限されないが、後記実施例１に記載された条件を挙げることができる。
【００３３】
上記のようなスクリーニング法で得られた菌の例としてはトリコデルマ・ロンギブラキアツム KDK3003（Trichoderma longibrachitaum KDK3003）が挙げられる。この菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（住所 〒３０５−００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約の規定に基づいて平成10年8月10日から国際寄託されている（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５８）。
【００３４】
本発明製造方法には、本発明酵素の産生能を保持する限り、トリコデルマ・ロンギブラキアツム KDK3003（Trichoderma longibrachitaum KDK3003）の変異株を使用することもできる。変異誘発法としては公知の方法を使用できる。また、自然突然変異により変異株が生じる可能性もある。変異株の中、本発明酵素の産生能を保持するものは、上述のスクリーニング法により選択可能である。
【００３５】
本発明製造方法における栄養培地とは、トリコデルマ属の菌が増殖し本発明酵素を産生するものである限り特に限定されない。炭素源、窒素源、及び、その他の微量栄養素を含む、トリコデルマ属の菌の培養に通常に使用される培地が挙げられる。炭素源としては、１，５−ＡＧ、グルコース、グリセロール等が挙げられるが、安価でありかつ良好な酵素産生をもたらすことからグルコースを用いることが好ましい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等が挙げられるが、良好な酵素産生をもたらすことから硝酸ナトリウムを用いることが好ましい。
【００３６】
１，５−ＡＧ脱水素酵素を生産する前記トリコデルマ属の菌を、１，５−ＡＧを含まない培地で培養したところ、１，５−ＡＧ脱水素酵素を生成することが確認された。よって高価な１，５−ＡＧを培地に添加しなくとも安価なグルコースを炭素源として１，５−ＡＧ脱水素酵素が製造できる事が確認された。したがって、本発明製造方法においては、１，５−ＡＧを含まない栄養培地を用いることが好ましい。１，５−ＡＧを含まないとは、上記から明らかなとおり、１，５−ＡＧを培地に添加しないことを意味するものであり、栄養培地に本来的に含まれている１，５−ＡＧは存在しても差し支えない。
【００３７】
分離精製の方法は、特に限定されず、タンパク質の分離精製に使用される、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過等を組み合わせて用い、上記の本発明酵素の特性を指標にして分離精製を行うことができる。好ましい方法としては、硫安分画（３５〜５５％飽和）、陽イオン交換クロマトグラフィー（例えばDEAE Toyopeal 650M(東ソー社製)）、硫安分画（０〜５５％飽和）、疎水クロマトグラフィー（例えばフェニルセファロース(アマシャムファルマシアバイテク社製)）、ゲル濾過（スーパーデックス２００ｐｇ(アマシャムファルマシアバイテク社製)）を順次行う方法が挙げられる。
【００３８】
更に本発明は、電子受容体として酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下で、１，５−ＡＧを含む試料に本発明酵素を作用させることにより生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を、吸光度の変化量により測定することによって１，５−ＡＧを定量する方法も提供する。
【００３９】
１，５−ＡＧを含む試料としては、血清、血漿、尿等の生物学的液体が挙げられる。試料が、吸光度の測定を妨げる性質を有する場合には、必要に応じ遠心分離等の試料の前処理を行う。
【００４０】
ＮＡＤの存在量、温度、ｐＨ、酵素量等の、本発明酵素を作用させる条件としては、１，５−ＡＧ量に応じてＮＡＤＨの量が変化する限り、特に限定されないが、通常には、ＮＡＤの濃度が０．０１〜１０ｍＭ、温度が２０〜７０℃、ｐＨが５〜１１、酵素量が０．００１〜２０Ｕ／ｍｌの条件が挙げられる。酵素の１Ｕは、後記実施例において定義した通りである。
【００４１】
吸光度を測定する波長は、その波長における吸光度の変化がＮＡＤＨの量の変化量に特異的なものであれば特に制限されないが、通常には３４０ｎｍである。反応開始時の反応の遅延等により誤差が生じることがあるため、反応開始から第一の時間（例えば５０秒）が経過してから、第２の時間（例えば１００秒）が経過するまでの間における吸光度の変化量を測定することが好ましい。
【００４２】
本発明酵素は、１，５−ＡＧに特異的であるため、本発明定量法によれば、生理条件的に高濃度のグルコース（例えば１１０ｍｇ／ｄｌ以上）の存在下でも、その影響を受けずに、生理条件的に低濃度（例えば０．２ｍｇ／ｄｌ以下）の１，５−ＡＧを定量することが可能である。したがって、特に、糖尿病患者由来の試料に、グルコースの除去や修飾をする必要がないため、有利に適用できる。
【００４３】
本発明定量法に使用するための、本発明酵素を含む１，５−ＡＧ定量用キットを提供することもできる。このキットは、上述の理由により特に糖尿病患者の試料に適用するのに適している。
【００４４】
上記キットは、通常には、本発明酵素の他に、ＮＡＤ、緩衝液等の試薬を含む。本発明酵素は、固体支持体に固定化してもよい。固体支持体としては、高分子ゲル、ビーズ、プレート等が挙げられる。固定化は、担体結合法、架橋化法、包括法、複合法等の公知の方法によって行うことができる。また、標準物質（１，５−ＡＧ）をキットに含めてもよい。本発明酵素、ＮＡＤ及び標準物質は、溶液状態でなくてもよく、その場合には溶解用溶媒をキットに含めることが好ましい。
【００４５】
本発明は、配列番号１に示す塩基配列を有するＫＤＫ３００３株由来の本発明酵素の部分ｃＤＮＡも提供する。このｃＤＮＡは全長ｃＤＮＡ（本発明酵素をコードするＤＮＡ）の取得に使用できる。例えば、このｃＤＮＡの塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いて、ＫＤＫ３００３株から調製されたｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる。また、このｃＤＮＡの塩基配列に基づいて５’ＲＡＣＥ法を行うこともできる。
【００４６】
得られた本発明酵素をコードするＤＮＡは、本発明酵素の製造に使用できる。すなわち、本発明酵素をコードするＤＮＡにより適当な宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養物から本発明酵素を取得することができる。形質転換の方法としては、本発明酵素をコードするＤＮＡを、宿主に適合した発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターを宿主に導入する方法が挙げられる。宿主は、原核細胞及び真核細胞のいずれでもよく、具体的には大腸菌、酵母などが挙げられる。培養物からの本発明酵素の取得は、上記に本発明製造方法について説明したような分離精製の方法によって行うことができる。
【００４７】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００４８】
【実施例１】
１，５−ＡＧ脱水素酵素の生産能を有する菌の取得
（１） スクリーニング
土壌試料を５ｍｌの下記組成の培養培地に加え、３０℃で２日間振盪（１分当たり３００往復）した。０．０１ｍｌの培養物を新しい培地に移し、同条件で培養を行った。そして、培養物を同一培地の寒天プレートに接種することにより純粋培養物を得た。
【００４９】
培養培地の組成は、３ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇＫ2ＨＰＯ4、１ｇＮａＨ2ＰＯ4、０．５ｇＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｇＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、５ｇ１，５−ＡＧ、１ｍｌビタミン混合物及び１０ｍｌ金属溶液を１０００ｍｌの蒸留水に含むもの（ｐＨ５．５）であった。ビタミン混合物の組成は、１ｍｇチアミン・ＨＣｌ、２ｍｇリボフラビン、２ｍｇＣａパントテン酸、２ｍｇピリドキシン・ＨＣｌ、０．１ｍｇビオチン、１ｍｇｐ−アミノ安息香酸、２ｍｇニコチン酸及び０．１ｍｇ葉酸を１００ｍｌの蒸留水に含むものであった。金属溶液の組成は、１１．７ｇＭｎＳＯ4・３Ｈ2Ｏ、２．２ｇＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４ｇＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．２８ｇＣｏＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．２６ｇＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．４ｇＨ3ＢＯ3及び０．０６ｇＫＩを１０００ｍｌの蒸留水に含むものであった。
【００５０】
種々の３２の土壌試料から１９６の培養物が単離された。単離した微生物は１，５−ＡＧを単独の炭素源として増殖したものであり、７３の菌類、４６の酵母及び７７の細菌を含んでいた。
【００５１】
単離した微生物を、５ｍｌの１，５−ＡＧ培地（培養培地において、ビタミン混合物及び金属溶液の代わりに５％酵母エキスを用いたもの）で、３０℃において数日間振盪培養した。細菌及び酵母の細胞を、８，０００×ｇ、５分間の遠心分離で回収した。菌類の菌糸は濾紙による濾過で回収した。細胞及び菌糸を０．８５％ＫＣｌで洗浄し、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、ミニビーズビーターモデル３１１０ＢＸ（日本ラムダ社製）で破砕した。破砕液を、８，０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞片を除去することにより、無細胞抽出液を得た。
【００５２】
無細胞抽出液についてオキシダーゼ活性を、ＰＯＤと共役させた比色法により測定した。すなわち、１００μｍｏｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４．５μｍｏｌ４−アミノアンチピリン、６．０μｍｏｌフェノール、６．０ユニットパーオキシダーゼ及び２μｍｏｌ１，５−ＡＧを総容量３ｍｌに含む反応混合物を用い、３０℃でキノン染料の生成を５０５ｎｍの吸光度により測定（日立Ｕ−３３００分光光度計）することによりオキシダーゼ活性を求めた。しかし、１，５−ＡＧに特異的な酵素活性は観察されなかった。１，５−ＡＧの構造は、グルコースの構造に類似しているため、１，５−ＡＧに特異的な酵素活性のスクリーニングは難しいと予測された。そこで、単離体について、１，５−ＡＧをグルコースに変換する活性を、培養ろ液中のグルコースの定量により、検出した。
【００５３】
培養ろ液中のグルコースはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）法で測定した。すなわち、１００μｍｏｌＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ５．７）、４．５μｍｏｌ４−アミノアンチピリン、６．０μｍｏｌフェノール、６．０ユニットＰＯＤ、１００ユニットＧＯＤ、５μｍｏｌ１，５−ＡＧ及び５０μｌ試料を総容量３ｍｌに含む反応混合液を３０℃で３０分間インキュベートし、反応混合物の５０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、２つの菌類を含む７つの単離体の培養ろ液でグルコースが検出された。
【００５４】
ＧＯＤ試験において陽性であった微生物について休止細胞反応を行いさらに選択を行った。すなわち、１００μｍｏｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２μｍｏｌ１，５−ＡＧ及び０．１ｇ休止細胞を総容量１ｍｌに含む反応混合物を３０℃で１〜３時間振盪させて反応させた。反応混合物をシリカゲル（２５ＴＬＣプレート２０×２０、メルク社製）にのせ、フェノール／水（４：１、ｖ／ｖ）を展開溶媒としてＴＬＣを行った。スポットを、２０％硫酸又は０．５ｍｌアニスアルデヒド／０．５ｍｌ硫酸／９ｍｌ９５％メタノール／数滴の酢酸を噴霧することにより検出した。硫酸は還元糖の検出、アニスアルデヒド／硫酸／メタノール溶液は炭水化物の検出に用いた。その結果、１１−３株が休止細胞反応で１，５−ＡＧをグルコースに変換する活性を有することが判明した。
【００５５】
１１−３株の菌糸から調製された無細胞抽出液を、１，５−ＡＧとの酵素反応に用いたが、休止細胞反応において観察された１，５−ＡＧからグルコースへの反応は、無細胞抽出液及び１，５−ＡＧのみでは起こらなかった。還元性のコエンザイム及びコファクター（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ及びＧＳＨ）及びα−ケトグルタル酸、そして、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＧＳＳＧ、及びＰＭＳなどの酸化還元反応に関係する他のコエンザイム及びコファクターを酵素反応に用いたが、全ての場合において、グルコースも他の反応生成物もＴＬＣにより反応混合物中に検出されなかった。Ｃｕ2+、Ｆｅ2+、Ｍｇ2+及びＺｎ2+などの金属イオンの添加も効果が無かった。
【００５６】
酵素が細胞膜に結合している可能性もあったので、無細胞抽出液の調製後の細胞片を１，５−ＡＧとの反応に用いたが、グルコースは反応混合物中に検出されなかった。
【００５７】
さらに、１１−３株の無細胞抽出液を用いて、酵素活性を、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨをコエンザイムとして３４０ｎｍで分光光度測定的に測定した。その結果、ＮＡＤ、１，５−ＡＧ及び無細胞抽出液を含む反応混合物で吸光度の増加が認められた。したがって、１，５−ＡＧのＮＡＤ依存性デヒドロゲナーゼ活性が１１−３株の無細胞抽出液で確認された。
【００５８】
（２） １，５−ＡＧ脱水素酵素生産能の検討
（２−１） 炭素源の検討
１，５−ＡＧ脱水素酵素の生産能に関し、１，５−ＡＧ以外の炭素源培地によっても前記酵素が生産され、酵素活性が維持できるか否かの検討を行った。
【００５９】
１，５−ＡＧの他の炭素源として１，４−ＡＧ、グルコース、グリセロール及びそれらの組み合わせを選択し、各濃度が０．５％になる様に、上記培養培地に添加した。各培地（５ｍｌ）に１１−３株を１白金耳接種し、３０℃で２日間振とう培養を行った。
【００６０】
培養上清液中の酵素活性は、以下の組成からなる反応液を３０℃でインキュベーションして測定した。すなわち生成されるＮＡＤＨを、インキュベーション開始後５０秒から１００秒後の間の３４０ｎｍにおける吸光度変化の測定を行い、それを相対値として用いるか、または６２２０Ｍ-1・ｃｍ-1のＮＡＤＨの吸光係数を用いて酵素活性量に換算した。１ユニット（Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成する酵素量と定義した。
【００６１】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８） ３３ｍＭ
β−ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製） １．６７ｍＭ
１，５−ＡＧ（和光純薬社製） ０．０８３％
酵素液（培養上清液） ５０μｌ
【００６２】
増殖は、菌糸湿潤重量を測定し、培地１ｌ当たりの値を指標とした。
【００６３】
測定結果を表１に示す。１，５−ＡＧ以外の炭素源としては、グルコースを用いても同等若しくはそれ以上の酵素活性が得られた。よって、高価な１，５−ＡＧを酵素の誘導培地として用いなくとも、安価なグルコースで代用できることが可能であることがわかった。このため以後の実験はグルコースを炭素源として用いることにした。
【００６４】
【表１】
表１ 炭素源の影響
──────────────────────────────
炭素源 増殖（ｇ／Ｌ） 活性（％）
──────────────────────────────
１，５−ＡＧ ２４ １００
１，４−ＡＧ ８ ３２
グルコース ３０ １１２
グリセロール ２８ ６８
グリセロール＋１，５−ＡＧ ３６ ７４
グリセロール＋１，４−ＡＧ １６ ９８
──────────────────────────────
ＡＧ：アンヒドロ−Ｄ−グルシトール
【００６５】
（２−２） 窒素源の検討
（ＮＨ4）2ＳＯ4の代わりに、ポリペプトン、ビーフエキストラクト、ＮＨ4Ｃｌ、ＮＨ4ＮＯ3及びＮａＮＯ3を用いて、１１−３株の１，５−ＡＧ脱水素酵素産生に対し、窒素源の影響も調べた。表２に示すように１１−３株は、ＮａＮＯ3を含む培地で培養したときに、最大の１，５−ＡＧに対する活性及び増殖が観察された。
【００６６】
【表２】
表２ 窒素源の影響
──────────────────────────────
窒素源 増殖（ｇ／Ｌ） 活性（％）
──────────────────────────────
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３４ １００
ＮＨ4Ｃｌ ３０ ８７．６
ＮＨ4ＮＯ3 ２６ ５９．９
ＮａＮＯ3 ３０ １５０
ビーフエキス ４６ ３２．２
ポリペプトン ５２ ２５．６
──────────────────────────────
【００６７】
（２−３） タイムコース
１１−３株を、１０Ｌジャーファーメンタ（速度：５００ｒｐｍ、空気：５．０ｌ／分）を用いて、１，５−ＡＧ及び（ＮＨ4）2ＳＯ4の代わりにそれぞれグルコース及びＮａＮＯ3を含む７ｌの培養培地で培養し、菌糸の増殖及び１，５−ＡＧ脱水素酵素の比活性のタイムコースを調べた（図１）。図１中、白丸は菌糸湿潤重量、黒丸は酵素活性、黒四角は比活性を示す。比活性算出のためのタンパク質量は、BIO-RADプロテインアッセイキットを用いてブラッドフォード法により定量した。
【００６８】
増殖及び比活性は４０時間まで増加し、定常状態初期に最大に達した。１，５−ＡＧ脱水粗酵素活性は一過性に検出された。
【００６９】
（３） １１−３株の同定
１１−３株は、糸状菌であり、コロニーは緑色を呈する。顕微鏡下で、分岐したフィアライドの頂端に多くのフィアロ型分生子が観察された。分生子は、鎖生ではなく塊生であった。これらの観察結果から、１１−３株はトリコデルマ属に属すると認められる。
【００７０】
１１−３株の同定をオランダのＣｅｎｔａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）に依頼したところ、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ Ｒｉｆａｉ）であることがわかった。
【００７１】
１１−３株は、トリコデルマ・ロンギブラキアツム KDK3003（Trichoderma longibrachitaum KDK3003）と命名され、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（住所 〒３０５−００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約の規定に基づいて平成10年8月10日から国際寄託されている（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５８）。
【００７２】
【実施例２】
１，５−ＡＧ脱水素酵素の製造及び特性評価
ＫＤＫ３００３株を、１０Ｌジャーファーメンタを用い、８Ｌの培地中、２８℃、２日間培養した。培地の組成は、３ｇＮａＮＯ3、１ｇＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｇＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、５ｇ酵母エキス及び４ｇグルコースを１０００ｍｌの蒸留水に含むもの（ｐＨ５．５）であった。
【００７３】
その後，培養液を吸引ろ過して菌糸体を集め、洗浄後、２ｍＭＤＴＴを含む０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１３０ｍｌ）に懸濁し、ビードビーター（日本ラムダ社製）を用いてガラスビーズ（３００ｍｌ、０．２５〜０．５０ｍｍｆ）で菌糸体を破砕した。破砕物を、４℃において９，０００×ｇで３０分間遠心分離して非破砕細胞及び細胞片を除き、上清を無細胞抽出液とした。以下の精製操作は全て４℃で行った。
【００７４】
無細胞抽出液に、撹拌しながら硫酸アンモニウムを３５％飽和になるように加え、ｐＨを３５％水酸化アンモニウム溶液で７．０に調整した。１時間撹拌した後、沈殿を１６，０００×ｇで３０分間遠心分離して沈殿を除いた。上清を回収し、硫酸アンモニウムを５５％飽和になるように加えて、上記と同様にして沈殿物を回収し、緩衝液Ａ（２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に溶解し、同緩衝液に対して透析した。
【００７５】
透析液を、緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２．２φ×２０ｃｍ）にアプライした。カラムを同緩衝液で洗浄し、吸着したタンパク質をＫＣｌのリニアグラジエント（０〜０．５Ｍ）で溶出した。溶出した酵素活性画分を回収し、撹拌しながら硫酸アンモニウムを５５％飽和になるように加え、ｐＨを３５％水酸化ナトリウム溶液で７．０に調整した。１時間撹拌後、沈殿を１６，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を除いた。沈殿を緩衝液Ａに溶解し、２５％飽和の硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａに対して透析後、２５％飽和の硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで平衡化したフェニル−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（アマシャムファルマシアバイテク社製）カラム（１．０φ×１０ｃｍ）にアプライした。同緩衝液で洗浄し、酵素を、硫酸アンモニウムの２５％飽和から０％飽和へのリニアグラジエントにより溶出した（流速１ｍｌ／ｍｉｎ）。溶出した酵素活性画分を回収し、０．１ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化したスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ ｐｇ（アマシャムファルマシアバイテク社製）カラム（１．６φ×６０ｃｍ）にアプライし、酵素を同緩衝液で溶出した（２ｍｌ／ｍｉｎ）。
【００７６】
精製結果を表３に示す。酵素活性及びタンパク質量は上記実施例１の（２）に記載した方法により測定した。
【００７７】
【表３】
【００７８】
スーパーデックス２００ｐｇによるクロマトグラフィー後に得られた酵素を、以下の酵素の物理化学的特性を検討する酵素として使用した。
【００７９】
（１）至適ｐＨ及びｐＨ安定性の検討
ｐＨが５．５、６．５、７．０、７．５を示す１００ｍＭのＭｃＩｌｖａｉｎｅ、ｐＨが７．５、８．０、８．５、９．０を示す１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨが９．０、９．５、１１．０、１２．０、１２．５を示す１００ｍＭのグリシン−ＮａＯＨの緩衝液を作製した。これらの緩衝液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）の代わりに同モル濃度となるように用いる他は、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定した。最大の酵素活性を１００としたときの相対的な酵素活性をパーセントで求めた結果を図２に示す。この結果、本酵素の至適ｐＨは９付近であることがわかった。
【００８０】
また、本酵素を各ｐＨの各緩衝液中で、３０℃，１０分間インキュベーションし、インキュベーション後の混合液を酵素液とし、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定し、最大の酵素活性を１００としたときの相対的な酵素活性をパーセントで求めた結果を図３に示す。この結果、本酵素は、ｐＨ６〜１０の範囲において安定であることがわかった。
【００８１】
（２）至適温度及び温度安定性の検討
反応温度を２０〜６０℃の範囲において１０℃間隔の温度にする他は、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定し、最大の酵素活性を１００としたときの相対的な酵素活性をパーセントで求めた結果を図４に示す。この結果、本酵素の至適温度は、４０〜５０℃の間にあることがわかった。
【００８２】
また、酵素液を３０〜８０℃の範囲において１０℃間隔の温度でそれぞれ１０分間インキュベーションした後、この酵素液を用いて、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定した結果、本酵素は、７０℃、１０分間のインキュベーションでも５０％以上の活性が残存しており、温度安定性は良好であることが確認された（図５）。
【００８３】
（３）電子受容体の検討
本酵素は、電子受容体としてＮＡＤを利用することが培養上清における検討時に確認された。３００μｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、２５μｌの１０ｍＭの酸化型ＮＡＤＰ、２５μｌの５％の１，５−ＡＧ、１０μｌの酵素液、及び、６４０μｌの水を良く混合し、３０℃でインキュベーションを行い、３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定したところ、吸光度は増加しなかった。よって本酵素は、ＮＡＤを補酵素として利用できるが、ＮＡＤＰは利用できないことがわかった。
【００８４】
（４）分子量の検討
精製した酵素をスーパーデックス２００ｐｇ（アマシャムファルマシアバイテク社製）によるゲルろ過法を用いて溶出し、予め求めた分子量マーカー（ベーリンガーマンハイム社製 Ｎｏ１０４５５８）の溶出容量から分子量を求めた結果、分子量は１４１，０００（１４１ｋＤａ）であった。
【００８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）による分析も行った。ファーストシステム（アマシャムファルマシアバイテク社製）を使用し、ＰａｓｔＧｅｌ Ｇｒａｄｉｅｎｔ １０−１５（アマシャムファルマシアバイテク社製）ゲルを使用して、２５０Ｖで、３０分間泳動し、タンパク染色は、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０で行った。同時に泳動した分子量マーカー（ＬＭＷマーカーキット）から分子量を求めた結果、３６，０００（３６ｋＤａ）であった。本酵素は、４量体であることが予想された。
【００８６】
（５）基質特異性の検討
グルコース、フルクトース、ソルビトール、キシリトール、マンニトール、グリセルアルデヒド、グリセルアルデヒド３リン酸、アセトアルデヒドに対する基質特異性を調べるため、０．２５％の基質水溶液を作製した。
【００８７】
前記基質水溶液を最終濃度３ｍＭとなるように加える他は、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定し、最大の酵素活性を１００とした時の相対的な酵素活性をパーセントで求めた，結果を表４に示す。
【００８８】
１，５−ＡＧ脱水素酵素は、従来酵素とは異なりグルコース、フルクトース、ソルビトール、マンニトール、キシリトールには反応しない。また、グリセルアルデヒドに対しては、１，５−ＡＧを基質としたときの活性と比較して、半分程度の活性を示す。よって従来より知られる酵素とは全く別の１，５−ＡＧ脱水素酵素であることが示唆された。
【００８９】
【表４】
表４ 基質特異性
─────────────────────────
基質（３ｍＭ） 相対活性
─────────────────────────
１，５−ＡＧ １００
グルコース 検出されず
フルクトース 検出されず
ソルビトール 検出されず
キシリトール 検出されず
マンニトール 検出されず
グリセルアルデヒド ５２
グリセルアルデヒド３リン酸 検出されず
アセトアルデヒド 検出されず
─────────────────────────
【００９０】
実施例１の（２）に記載の条件で１，５−ＡＧ及びＮＡＤの濃度を変化させて測定を行ったところ、１，５−ＡＧ及びＮＡＤのＫｍ値はそれぞれ０．６７ｍＭ及び０．５０ｍＭであった。
【００９１】
（６）金属イオン及び試薬の影響の検討
種々の金属イオン及び試薬の酵素活性に対する影響を検討した。
【００９２】
表５に示す金属塩を最終濃度１ｍＭとなるように、基質溶液を含まない反応混合液に加え３０℃で１０分間インキュベートした後、基質溶液を加える他は、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定し、最大の酵素活性を１００としたときの相対的な酵素活性をパーセントで求めた結果を表５に示す。
【００９３】
【表５】
表５ 金属イオンの影響
────────────────────
化合物 相対活性（％）
────────────────────
無し １００
ＬｉＣｌ2 検出されず
ＭｇＣｌ2 ２４
ＣａＣｌ2 検出されず
ＭｎＣｌ2 検出されず
ＣｏＣｌ2 ５７
ＮｉＣｌ2 検出されず
ＣｕＣｌ2 １４
ＺｎＣｌ2 ２４
ＢａＣｌ2 検出されず
ＨｇＣｌ2 ２１
ＦｅＣｌ2 ２６９
ＦｅＣｌ3 検出されず
────────────────────
【００９４】
酵素活性は、１ｍＭのＭｎ2+、Ｆｅ3+、Ｎｉ2+、Ｃａ2+、Ｂａ2+及びＬｉ2+により完全に阻害された。一方、Ｆｅ2+で活性化が認められた。
【００９５】
表６に示す試薬を最終濃度１ｍＭ（ＰＣＭＢは０．１ｍＭ）となるように、基質溶液を含まない反応混合液に加え３０℃で１０分間インキュベートした後、基質溶液を加える他は、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定し、最大の酵素活性を１００としたときの相対的な酵素活性をパーセントで求めた結果を表６に示す。
【００９６】
【表６】
表６ 試薬の影響
────────────────────
化合物 相対活性（％）
────────────────────
無し １００
２，２−ビピリジル ５７
ｏ−フェナントロリン 検出されず
エチレンジアミン四酢酸 １０４
シアン化カリウム １００
アジ化ナトリウム 検出されず
フッ化カリウム １３０
ヨード酢酸 ７０
ＰＣＭＢ（０．１ｍＭ） 検出されず
ＤＴＮＢ 検出されず
フェニルヒドラジン １７８
────────────────────
ＰＣＭＢ：ｐ−クロロメルクリ安息香酸
ＤＴＮＢ：ジチオビス（ニトロ安息香酸）
【００９７】
酵素活性は、ＰＣＭＢ、ＤＴＮＢ、ＮａＮ3及びｏ−フェナントロリンにより強く阻害された。
【００９８】
これらの結果より、酵素反応にＳＨ基及び鉄イオンが関与していることが示唆される。
【００９９】
（７）反応生成物の検討
実施例１で記載したように、ＫＤＫ３００３株の菌糸を用いた休止細胞反応ではグルコースの生成が検出されたが、酵素反応混合物のＴＬＣにおける分析ではグルコースの生成は検出されなかった。無細胞抽出液においてグルコノ−δ−ラクトンレダクターゼ活性が顕著に認められたことから、グルコノ−δ−ラクトンの加水分解物であるグルコン酸の検出をグルコン酸デヒドゲナーゼを用いて試みた。この結果、１，５−ＡＧ脱水素反応後の反応液を基質溶液としたときにグルコン酸デヒドロゲナーゼ反応が顕著に認められた。したがって、１，５−ＡＧは１，５−ＡＧ脱水素酵素によりグルコノ−δ−ラクトンに変換されると推定される。
【０１００】
【実施例３】
１，５−ＡＧ脱水素酵素を用いた１，５−ＡＧの定量
１，５−ＡＧ脱水素酵素（ＡＧＤＨ）を用いた、１，５−ＡＧの量の酵素的定量について検討した。用いた精製ＡＧＤＨは、最後のゲル濾過を行わなかった他は実施例２に記載の方法により調製したものであった。
【０１０１】
糖尿病の患者の血清１，５−ＡＧ濃度は一般に０．１５〜０．２ｍｇ／ｄｌである。そこで０．２ｍｇ／ｄｌの１，５−ＡＧを試料として基質溶液の代わりに用い、２．７Ｕ／ｍｌの精製ＡＧＤＨを酵素液として用い、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の代わりにリン酸カリウム緩衝液を用いた他は実施例１の（２）と同様にして測定を行った。この結果、この濃度の１，５−ＡＧを検出可能であることが判明した。
【０１０２】
さらに、血清中の１，５−ＡＧレベルに基づく種々の濃度（０．５〜２ｍｇ／ｄｌ）の１，５−ＡＧを試料として上記と同様に測定を行った。また、グルコース（試料中１１０ｍｇ／ｄｌ）及びフルクトース（試料中０．５６ｍｇ／ｄｌ）の存在下でも同様に測定を行った。結果を図６〜８に示す。図６は１，５−ＡＧのみ、図７はグルコース存在下、図８はフルクトース存在下の結果を示す。
【０１０３】
図６から明らかなように、１，５−ＡＧの濃度とＮＡＤＨ形成との間に直線関係が観察された。さらに、生理的条件に匹敵する濃度のグルコース及びフルクトースの共存は、ＡＧＤＨによる１，５−ＡＧの定量に影響を与えないことが示された（図７及び８）。
【０１０４】
これらの結果は、本発明のＡＧＤＨを用いた１，５−ＡＧの定量が糖尿病の診断に適したものであることを示す。
【０１０５】
【実施例４】
１，５−ＡＧ脱水素酵素のｃＤＮＡの取得
ＫＤＫ３００３株からＡＧＤＨを実施例２のようにして精製した。精製した酵素をプロテアーゼＶ８（シグマアルドリッチジャパン社製）により部分消化し、SDS-PAGEに付し、PVDF膜上にブロットした。各バンドのペプチドのアミノ酸配列をプロテインシークエンサ（Applied Bipsystem model 476A）で決定した。決定された部分アミノ酸配列に基づいて下記のプライマーを設計した。
【０１０６】
ＫＤＫ３００３株を実施例２に記載したようにして３２時間培養して得られた菌体から全RNAを酸グアニジン−フェノール−クロロホルム法（Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987)）により調製し、全RNAからmRNAを、Quick Prep mRNA精製キット（アマシャムファルマシアバイテク社製）を用いてオリゴ（ｄＴ）−セルローススパンカラムにより精製した。5 mgのmRNAから、Ready To-Go PCR Beads（アマシャムファルマシアバイテク社製）を用いて製造者の指示書に基づいてcDNAを合成した。
【０１０７】
得られたcDNAを鋳型として用い、増幅特異性を最大化するために、AmpliWax（商標）PCR Gem（パーキンエルマージャパン社製）を用いたオート−ホット−スタートPCRを行った（J. Virol., 5272-5281 (1996)）。プライマーを除く他の全ての反応成分を80℃に５分間加熱した後、プライマーを加え、次いで、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP（宝酒造社製）を用いたサーモサイクラーシークエンス（94℃で１分間の最初の変性、94℃１分間、55℃１分間及び72℃２分間を35サイクル、そして72℃で３分間の最終の伸長）に付した。PCR混合物は、6.25μM変性プライマー（5'-ATYCCNGTBCARAAGCCNGGN（配列番号３）又は5'-AAGCCNGGNGTBGAYGARGTBYT（配列番号４）及び3'-CVACRTGNGCNGCCTTNGCRA（配列番号５））を含むものであった。
【０１０８】
その結果、PCR産物として約300bpのフラグメントが得られた。PCR産物を直接pT7Blue-2 Tベクターに結合し、その組換えプラスミドで、ELECTRO CELL MANUPULATER 600 (BTX社製)を用いてE. coli JM109を形質転換した(Nucleic Acids Res., 16, 6127-6145(1988); Genetic Engineering-Principles and Methods vol. 12, pp. 275-295(1990))。プラスミドを含むコロニーは、0.1%IPTG及び2.0%X-galを含む２×YT寒天培地で白色コロニーとして検出された。PCR産物のクローニングは、コロニーPCRにより確認した。コロニーから得られたプラスミドを、ABI PRISM（商標）BigDye（商標）ターミネーターサイクルシークエンシングレディリアクションキットを用いてダイデオキシターミネーション反応に付し、ABI PRISM 310ジェネティックアナライザーで配列決定した。
【０１０９】
決定された塩基配列に基づいて、３’−ＲＡＣＥを、３’−ＲＡＣＥＣｏｒｅセット（宝酒造社製）を用いて行い、3'フランキング領域をクローニングした(J. Virol., 5272-5281(1996))。ＫＤＫ３００３株のmRNAを、オリゴdT-3サイトアダプタープライマーを用いて逆転写酵素のためにプライミングした。逆転写反応は、30℃で10分行いさらにAMVトランスクリプターゼと共に50℃で30分インキュベートした。PCRの２回目は、５μＭの３サイトアダプタープライマー（宝酒造社製）、５μＭの、cDNAの塩基配列に基づいて設計した遺伝子特異的プライマー（5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCCGCTGCACGTACTGCATGAACGG-3'（配列番号６））、及び、鋳型としてのRT-PCR産物を用いて行った。PCR条件は、94℃１分、65℃１分及び72℃２分を35サイクルであった。増幅産物のクローニング及び配列決定の手順は前記と同様に実施した。
【０１１０】
その結果、約1.2 kbpのフラグメントが得られ、308アミノ酸（配列番号２）をコードする1231bpヌクレオチド（配列番号１）から成ることが明らかになった。推定アミノ酸配列は、精製ＡＧＤＨで決定された二つのアミノ酸配列（配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１６及びアミノ酸番号１０２〜１１７）を含んでいた。
【０１１１】
【発明の効果】
本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素は、１，５−ＡＧには特異的に反応するが生体成分中に最も多く含まれるグルコースには反応しないため、本酵素によって１，５−ＡＧを測定する場合は前処理操作が不要である。従って、有利に、自動分析装置に適用することができる。
【０１１２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 培養のタイムコースの一例を示す。
【図２】 １，５−ＡＧ脱水素酵素の各ｐＨにおける活性％を示す。
【図３】 １，５−ＡＧ脱水素酵素の各ｐＨにおける安定性を示す。
【図４】 １，５−ＡＧ脱水素酵素の各温度における活性％を示す。
【図５】 １，５−ＡＧ脱水素酵素の各温度における安定性を示す。
【図６】 １，５−ＡＧ脱水素酵素を用いた１，５−ＡＧの定量を示す。
【図７】 グルコース存在下における１，５−ＡＧ脱水素酵素を用いた１，５−ＡＧの定量を示す。
【図８】 フルクトース存在下における１，５−ＡＧ脱水素酵素を用いた１，５−ＡＧの定量を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、１，５−アンヒドログルシトール（以下、「１，５−ＡＧ」と記載する。）を基質とする１，５−ＡＧ脱水素酵素及び前記酵素の製造方法、前記酵素を用いた１，５−ＡＧの定量法、並びに、前記酵素をコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
１，５−ＡＧは、健常人の場合、一定以上の濃度で生体内に存在しているが、糖尿病の患者の場合、著しい濃度低下が見られるため、糖尿病の診断マーカーとして臨床検査における重要な検査項目の１つとして用いられ、その利用価値は極めて高い。
【０００３】
従来より知られている、酵素を用いた１，５−ＡＧの定量法としては、１，５−ＡＧを含む試料にピラノースオキシダーゼを作用させることによって生成する過酸化水素を、パーオキシダーゼ発色系にて比色定量する方法（特公平5-41238号公報）が知られている。
【０００４】
それ以外の方法として、１，５−ＡＧ酸化能を有する酸化酵素を作用させ、酸素の消費量や電子受容体の還元体又は酸化された１，５−ＡＧ反応生成物を測定する方法等が知られている。その中でも特に特開昭62-79780号公報には、ピクノポラス属、コリオラス属、シュードモナス属細菌の生産する１，５−ＡＧ脱水素酵素について、特開平10-155479号公報にはアグロバクテリウム属細菌の生産する１，５−ＡＧ脱水素酵素について開示されており、どちらの酵素も１，５−ＡＧの測定に用いることが可能であることが知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来から知られている１，５−ＡＧを基質とする酵素は、１，５−ＡＧに対する特異性は高いとは言えない。
【０００６】
特開昭62-79780号公報には、１，５−ＡＧ脱水素酵素は、１，５−ＡＧ以外にもグルコース、ガラクトース、ソルボース、キシロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、アラビトール、エリスリトールの糖質に活性を示すとの記載がある。
【０００７】
特開平10-155479号公報には、１，５−ＡＧ脱水素酵素は、１，５−ＡＧ以外にソルボース、グルコースに対して活性があると記載されている。
【０００８】
１，５−ＡＧの定量に使用される場合、１，５−ＡＧに作用する酵素であっても、前述の様な基質特異性が低い酵素であれば、酵素のメリットが十分に生かされなくなってしまうことがある。この様な従来から知られている酵素の特異性の低さは、測定対象となる試料に由来する諸事情によっても更に大きな問題点となる。
【０００９】
糖尿病患者の血中グルコース濃度は健常人と比較して高く、健常人では６０〜１１０ｍｇ／ｄｌ位であるのに対して、糖尿病患者では１１０〜１０００ｍｇ／ｄｌと高い値を示す。
【００１０】
一方、血中の１，５−ＡＧの濃度は、健常人では１．５〜２．８ｍｇ／ｄｌ位であるのに対して、糖尿病患者では０．１５〜０．２ｍｇ／ｄｌ位の低い値を示す。グルコース濃度と１，５−ＡＧとの濃度差が糖尿病患者で約１０００倍程度になるため、１，５−ＡＧを酵素法によって測定する場合、従来の脱水素酵素を使用するときは、グルコースの除去や修飾を行う前処理操作が必要となる。
【００１１】
前処理方法としては、試料中に含まれる１，５−ＡＧ以外の糖質をイオン交換カラム等を用いて除去する方法があるが、この方法は分離操作が煩雑であり、特に多数の試料を処理する場合には非常に時間がかかる。また、グルコース等の糖質に対してリン酸化による修飾を行う方法は、グルコースのリン酸化反応の至適条件と１，５−ＡＧ測定条件とが異なるため、それぞれ別々の反応条件で行う必要がある。
【００１２】
微生物を培養して目的の酵素を精製分離する方法において、通常用いられる方法としては、目的の酵素と特異的に反応する基質を培地に添加して培養を行う方法がある。１，５−ＡＧ脱水素酵素の場合、１，５−ＡＧ添加培地で、１，５−ＡＧ脱水素酵素生産菌を培養するのが一般的な酵素の製造法である。
【００１３】
しかし、１，５−ＡＧは値段が高く大量の酵素を入手する場合は、１，５−ＡＧを大量に消費しなければならないため分離精製された酵素の単価が高くなってしまうという欠点を持つ。培養菌が、目的とする１，５−ＡＧ以外の物質を栄養源として利用できない性質を持つ場合は、栄養源を他の物質で代用することができない。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
従来の酵素における欠点を克服するため、本発明者らは、１，５−ＡＧに対する基質特異性が従来の脱水素酵素よりも高く、しかも従来に知られていない１，５−ＡＧ脱水素酵素を生産する菌のスクリーニングを行った。そして１，５−ＡＧ分解菌の生成する酵素が、１，５−ＡＧの測定に利用できる酵素であるか否かの検討を行うと共に、酵素の持つ物理化学的な特徴について検討を行った。
【００１５】
その結果、土壌より採取した微生物の培養上清中に、基質として１，５−ＡＧに特異的に反応する酵素の存在を見出した。
【００１６】
前記酵素は、電子受容体として酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下で１，５−ＡＧに作用させると、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の生成を示唆する、３４０ｎｍにおける吸光度の増加が見られたため、脱水素酵素であることが確認された。
【００１７】
更に分離精製された１，５−ＡＧ脱水素酵素の物理化学的諸性質を調べたところ従来に知られていない新規な酵素であることが確認された。
【００１８】
すなわち、本発明は、次にあげる理化学的特性を示す１，５−ＡＧ脱水素酵素（以下、「本発明酵素」ともいう）を提供する。
(1) 作用： １，５−ＡＧの脱水素反応を触媒する。
(2) 基質特異性：１，５−ＡＧを基質として認識するが、グルコースを基質として認識しない。
(3) 至適ｐＨ：９．０付近である。
(4) ｐＨ安定性：ｐＨ６．０〜１０．０で安定である。
(5) 至適温度：４０〜５０℃である。
(6) 温度安定性：７０℃、１０分間のインキュベーションで５０％以上の活性が残存している。
(7) 電子受容体：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を利用できる。
(8) 分子量：ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約３６，０００であり、ゲルろ過法による分子量は約１４１，０００である。
【００１９】
本発明酵素は、好ましくは、トリコデルマ属の菌を培養することによって生産されるものである。トリコデルマ属の菌は、好ましくは、トリコデルマ・ロンギブラキアツムＫＤＫ３００３(Tricoderma longibrachiatum KDK3003)である。
【００２０】
本発明酵素は、また、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。
【００２１】
また、本発明は、本発明酵素の製造方法（以下、「本発明製造方法」ともいう）及び本発明酵素を用いる１，５−ＡＧの定量法（以下、「本発明定量法」ともいう）を提供する。本発明製造法は、本発明酵素を生産するトリコデルマ属の菌を栄養培地で培養し、培養物から、生産された本発明酵素を分離精製することを特徴とする。本発明定量法は、ＮＡＤ存在下で、１，５−ＡＧを含む試料に本発明酵素を反応させることによって生成するＮＡＤＨを吸光度の変化量により測定することを特徴とする。
【００２２】
さらに、また、本発明は、本発明酵素の一部分をコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡは配列番号１に示す塩基配列を有する。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明酵素は、１，５−ＡＧ以外で生体内に最も多く存在する糖質であるグルコースを基質として認識することができないが、１，５−ＡＧに対しては特異的な活性を示す脱水素酵素である。なお、本明細書において、糖及び糖アルコールであって光学異性体のあるものは、特記しない限りＤ型のものを意味する。
【００２４】
先ず、本発明酵素の理化学的特性について説明する。
(1) 作用
１，５−ＡＧの脱水素反応を触媒する。脱水素反応は電子受容体の存在下に起こる。
(2) 基質特異性：１，５−ＡＧを基質として認識するが、グルコースを基質として認識しない。より具体的には、後記実施例に記載の条件において、グルコース、ソルビトール、キシリトール及びマンニトールに対して活性が検出されず、グリセルアルデヒドに対しては、１，５−ＡＧに対する活性を１００％とした場合、５０％程度位の活性を示す。
(3) 至適ｐＨ：９．０付近である。
(4) ｐＨ安定性：ｐＨ６．０〜１０．０で安定である。
(5) 至適温度：４０〜５０℃である。
(6) 温度安定性：７０℃、１０分間のインキュベーションで５０％以上の活性が残存している。
(7) 電子受容体：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を利用できる。電子受容体として利用できるか否かは後記実施例に記載の方法で確認することができる。
(8) 分子量：ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約３６，０００であり、ゲルろ過法による分子量は約１４１，０００である。
【００２５】
なお、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性及び分子量は後記実施例に記載の方法で測定できる。
【００２６】
本発明酵素は、好ましくは、トリコデルマ属の菌を培養することによって生産されるものである。トリコデルマ属の菌は、好ましくは、トリコデルマ・ロンギブラキアツムＫＤＫ３００３(Tricoderma longibrachiatum KDK3003)である。本発明酵素を生産するトリコデルマ属の菌及びその培養の条件については本発明製造方法に関して説明する。
【００２７】
本発明酵素は、また、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。配列番号２に示すアミノ酸配列は、トリコデルマ・ロンギブラキアツムＫＤＫ３００３から取得された本発明酵素の部分ｃＤＮＡの塩基配列から推定されたものである。酵素については、一般に、種間や個体間でアミノ酸配列に酵素の活性に実質的に影響を与えない変異が存在し得ること、及び、このような変異を人工的に生じさせることができることが周知であり、したがって、好ましい本発明酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列においてこのような変異を有するアミノ酸配列を有するものも包含する。すなわち、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の欠失、置換又は挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記本発明酵素の(1)及び(2)の特性（好ましくは上記の(1)〜(8)の特性）を損なわないものも包含する。
【００２８】
本発明酵素は、以下に説明する本発明製造方法により得ることができる。
【００２９】
本発明製造方法は、本発明酵素を生産するトリコデルマ属の菌を栄養培地で培養し、培養物から、生産された本発明酵素を分離精製することを特徴とする。
【００３０】
本発明酵素を生産するトリコデルマ属の菌は、トリコデルマ属の菌を１，５−ＡＧ資化能を指標としてスクリーニングし、次いで、無細胞抽出液のＮＡＤ依存的１，５−ＡＧ脱水素活性を指標としてスクリーニングをすることによって得ることができる。
【００３１】
１，５−ＡＧ資化能は、１，５−ＡＧからのグルコースへの変換により評価できる。評価法としては、特に限定されないが、例としては、１，５−ＡＧを単独の炭素源とする培地で、スクリーニングされる菌を培養して得た培養ろ液中におけるグルコースの生成をグルコースオキシダーゼにより測定する方法、緩衝液中で休止細胞を１，５−ＡＧに作用させて緩衝液中におけるグルコースの生成を薄層クロマトグラフィーで検出する方法、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。これらの方法の具体的条件としては後記実施例１に記載された条件を挙げられる。
【００３２】
無細胞抽出液のＮＡＤ依存的１，５−ＡＧ脱水素活性は、細胞を破砕し遠心分離して得た上清を無細胞抽出液とし、これにＮＡＤ及び１，５−ＡＧを添加し、３４０ｎｍの吸光度の変化を測定することにより評価できる。細胞の破砕及び吸光度の測定の条件は、ＮＡＤ依存的１，５−ＡＧ脱水素活性が測定できる限り、特に制限されないが、後記実施例１に記載された条件を挙げることができる。
【００３３】
上記のようなスクリーニング法で得られた菌の例としてはトリコデルマ・ロンギブラキアツム KDK3003（Trichoderma longibrachitaum KDK3003）が挙げられる。この菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（住所 〒３０５−００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約の規定に基づいて平成10年8月10日から国際寄託されている（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５８）。
【００３４】
本発明製造方法には、本発明酵素の産生能を保持する限り、トリコデルマ・ロンギブラキアツム KDK3003（Trichoderma longibrachitaum KDK3003）の変異株を使用することもできる。変異誘発法としては公知の方法を使用できる。また、自然突然変異により変異株が生じる可能性もある。変異株の中、本発明酵素の産生能を保持するものは、上述のスクリーニング法により選択可能である。
【００３５】
本発明製造方法における栄養培地とは、トリコデルマ属の菌が増殖し本発明酵素を産生するものである限り特に限定されない。炭素源、窒素源、及び、その他の微量栄養素を含む、トリコデルマ属の菌の培養に通常に使用される培地が挙げられる。炭素源としては、１，５−ＡＧ、グルコース、グリセロール等が挙げられるが、安価でありかつ良好な酵素産生をもたらすことからグルコースを用いることが好ましい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等が挙げられるが、良好な酵素産生をもたらすことから硝酸ナトリウムを用いることが好ましい。
【００３６】
１，５−ＡＧ脱水素酵素を生産する前記トリコデルマ属の菌を、１，５−ＡＧを含まない培地で培養したところ、１，５−ＡＧ脱水素酵素を生成することが確認された。よって高価な１，５−ＡＧを培地に添加しなくとも安価なグルコースを炭素源として１，５−ＡＧ脱水素酵素が製造できる事が確認された。したがって、本発明製造方法においては、１，５−ＡＧを含まない栄養培地を用いることが好ましい。１，５−ＡＧを含まないとは、上記から明らかなとおり、１，５−ＡＧを培地に添加しないことを意味するものであり、栄養培地に本来的に含まれている１，５−ＡＧは存在しても差し支えない。
【００３７】
分離精製の方法は、特に限定されず、タンパク質の分離精製に使用される、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過等を組み合わせて用い、上記の本発明酵素の特性を指標にして分離精製を行うことができる。好ましい方法としては、硫安分画（３５〜５５％飽和）、陽イオン交換クロマトグラフィー（例えばDEAE Toyopeal 650M(東ソー社製)）、硫安分画（０〜５５％飽和）、疎水クロマトグラフィー（例えばフェニルセファロース(アマシャムファルマシアバイテク社製)）、ゲル濾過（スーパーデックス２００ｐｇ(アマシャムファルマシアバイテク社製)）を順次行う方法が挙げられる。
【００３８】
更に本発明は、電子受容体として酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下で、１，５−ＡＧを含む試料に本発明酵素を作用させることにより生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を、吸光度の変化量により測定することによって１，５−ＡＧを定量する方法も提供する。
【００３９】
１，５−ＡＧを含む試料としては、血清、血漿、尿等の生物学的液体が挙げられる。試料が、吸光度の測定を妨げる性質を有する場合には、必要に応じ遠心分離等の試料の前処理を行う。
【００４０】
ＮＡＤの存在量、温度、ｐＨ、酵素量等の、本発明酵素を作用させる条件としては、１，５−ＡＧ量に応じてＮＡＤＨの量が変化する限り、特に限定されないが、通常には、ＮＡＤの濃度が０．０１〜１０ｍＭ、温度が２０〜７０℃、ｐＨが５〜１１、酵素量が０．００１〜２０Ｕ／ｍｌの条件が挙げられる。酵素の１Ｕは、後記実施例において定義した通りである。
【００４１】
吸光度を測定する波長は、その波長における吸光度の変化がＮＡＤＨの量の変化量に特異的なものであれば特に制限されないが、通常には３４０ｎｍである。反応開始時の反応の遅延等により誤差が生じることがあるため、反応開始から第一の時間（例えば５０秒）が経過してから、第２の時間（例えば１００秒）が経過するまでの間における吸光度の変化量を測定することが好ましい。
【００４２】
本発明酵素は、１，５−ＡＧに特異的であるため、本発明定量法によれば、生理条件的に高濃度のグルコース（例えば１１０ｍｇ／ｄｌ以上）の存在下でも、その影響を受けずに、生理条件的に低濃度（例えば０．２ｍｇ／ｄｌ以下）の１，５−ＡＧを定量することが可能である。したがって、特に、糖尿病患者由来の試料に、グルコースの除去や修飾をする必要がないため、有利に適用できる。
【００４３】
本発明定量法に使用するための、本発明酵素を含む１，５−ＡＧ定量用キットを提供することもできる。このキットは、上述の理由により特に糖尿病患者の試料に適用するのに適している。
【００４４】
上記キットは、通常には、本発明酵素の他に、ＮＡＤ、緩衝液等の試薬を含む。本発明酵素は、固体支持体に固定化してもよい。固体支持体としては、高分子ゲル、ビーズ、プレート等が挙げられる。固定化は、担体結合法、架橋化法、包括法、複合法等の公知の方法によって行うことができる。また、標準物質（１，５−ＡＧ）をキットに含めてもよい。本発明酵素、ＮＡＤ及び標準物質は、溶液状態でなくてもよく、その場合には溶解用溶媒をキットに含めることが好ましい。
【００４５】
本発明は、配列番号１に示す塩基配列を有するＫＤＫ３００３株由来の本発明酵素の部分ｃＤＮＡも提供する。このｃＤＮＡは全長ｃＤＮＡ（本発明酵素をコードするＤＮＡ）の取得に使用できる。例えば、このｃＤＮＡの塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いて、ＫＤＫ３００３株から調製されたｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる。また、このｃＤＮＡの塩基配列に基づいて５’ＲＡＣＥ法を行うこともできる。
【００４６】
得られた本発明酵素をコードするＤＮＡは、本発明酵素の製造に使用できる。すなわち、本発明酵素をコードするＤＮＡにより適当な宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養物から本発明酵素を取得することができる。形質転換の方法としては、本発明酵素をコードするＤＮＡを、宿主に適合した発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターを宿主に導入する方法が挙げられる。宿主は、原核細胞及び真核細胞のいずれでもよく、具体的には大腸菌、酵母などが挙げられる。培養物からの本発明酵素の取得は、上記に本発明製造方法について説明したような分離精製の方法によって行うことができる。
【００４７】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００４８】
【実施例１】
１，５−ＡＧ脱水素酵素の生産能を有する菌の取得
（１） スクリーニング
土壌試料を５ｍｌの下記組成の培養培地に加え、３０℃で２日間振盪（１分当たり３００往復）した。０．０１ｍｌの培養物を新しい培地に移し、同条件で培養を行った。そして、培養物を同一培地の寒天プレートに接種することにより純粋培養物を得た。
【００４９】
培養培地の組成は、３ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇＫ2ＨＰＯ4、１ｇＮａＨ2ＰＯ4、０．５ｇＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｇＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、５ｇ１，５−ＡＧ、１ｍｌビタミン混合物及び１０ｍｌ金属溶液を１０００ｍｌの蒸留水に含むもの（ｐＨ５．５）であった。ビタミン混合物の組成は、１ｍｇチアミン・ＨＣｌ、２ｍｇリボフラビン、２ｍｇＣａパントテン酸、２ｍｇピリドキシン・ＨＣｌ、０．１ｍｇビオチン、１ｍｇｐ−アミノ安息香酸、２ｍｇニコチン酸及び０．１ｍｇ葉酸を１００ｍｌの蒸留水に含むものであった。金属溶液の組成は、１１．７ｇＭｎＳＯ4・３Ｈ2Ｏ、２．２ｇＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４ｇＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．２８ｇＣｏＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．２６ｇＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．４ｇＨ3ＢＯ3及び０．０６ｇＫＩを１０００ｍｌの蒸留水に含むものであった。
【００５０】
種々の３２の土壌試料から１９６の培養物が単離された。単離した微生物は１，５−ＡＧを単独の炭素源として増殖したものであり、７３の菌類、４６の酵母及び７７の細菌を含んでいた。
【００５１】
単離した微生物を、５ｍｌの１，５−ＡＧ培地（培養培地において、ビタミン混合物及び金属溶液の代わりに５％酵母エキスを用いたもの）で、３０℃において数日間振盪培養した。細菌及び酵母の細胞を、８，０００×ｇ、５分間の遠心分離で回収した。菌類の菌糸は濾紙による濾過で回収した。細胞及び菌糸を０．８５％ＫＣｌで洗浄し、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、ミニビーズビーターモデル３１１０ＢＸ（日本ラムダ社製）で破砕した。破砕液を、８，０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞片を除去することにより、無細胞抽出液を得た。
【００５２】
無細胞抽出液についてオキシダーゼ活性を、ＰＯＤと共役させた比色法により測定した。すなわち、１００μｍｏｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４．５μｍｏｌ４−アミノアンチピリン、６．０μｍｏｌフェノール、６．０ユニットパーオキシダーゼ及び２μｍｏｌ１，５−ＡＧを総容量３ｍｌに含む反応混合物を用い、３０℃でキノン染料の生成を５０５ｎｍの吸光度により測定（日立Ｕ−３３００分光光度計）することによりオキシダーゼ活性を求めた。しかし、１，５−ＡＧに特異的な酵素活性は観察されなかった。１，５−ＡＧの構造は、グルコースの構造に類似しているため、１，５−ＡＧに特異的な酵素活性のスクリーニングは難しいと予測された。そこで、単離体について、１，５−ＡＧをグルコースに変換する活性を、培養ろ液中のグルコースの定量により、検出した。
【００５３】
培養ろ液中のグルコースはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）法で測定した。すなわち、１００μｍｏｌＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ５．７）、４．５μｍｏｌ４−アミノアンチピリン、６．０μｍｏｌフェノール、６．０ユニットＰＯＤ、１００ユニットＧＯＤ、５μｍｏｌ１，５−ＡＧ及び５０μｌ試料を総容量３ｍｌに含む反応混合液を３０℃で３０分間インキュベートし、反応混合物の５０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、２つの菌類を含む７つの単離体の培養ろ液でグルコースが検出された。
【００５４】
ＧＯＤ試験において陽性であった微生物について休止細胞反応を行いさらに選択を行った。すなわち、１００μｍｏｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２μｍｏｌ１，５−ＡＧ及び０．１ｇ休止細胞を総容量１ｍｌに含む反応混合物を３０℃で１〜３時間振盪させて反応させた。反応混合物をシリカゲル（２５ＴＬＣプレート２０×２０、メルク社製）にのせ、フェノール／水（４：１、ｖ／ｖ）を展開溶媒としてＴＬＣを行った。スポットを、２０％硫酸又は０．５ｍｌアニスアルデヒド／０．５ｍｌ硫酸／９ｍｌ９５％メタノール／数滴の酢酸を噴霧することにより検出した。硫酸は還元糖の検出、アニスアルデヒド／硫酸／メタノール溶液は炭水化物の検出に用いた。その結果、１１−３株が休止細胞反応で１，５−ＡＧをグルコースに変換する活性を有することが判明した。
【００５５】
１１−３株の菌糸から調製された無細胞抽出液を、１，５−ＡＧとの酵素反応に用いたが、休止細胞反応において観察された１，５−ＡＧからグルコースへの反応は、無細胞抽出液及び１，５−ＡＧのみでは起こらなかった。還元性のコエンザイム及びコファクター（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ及びＧＳＨ）及びα−ケトグルタル酸、そして、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＧＳＳＧ、及びＰＭＳなどの酸化還元反応に関係する他のコエンザイム及びコファクターを酵素反応に用いたが、全ての場合において、グルコースも他の反応生成物もＴＬＣにより反応混合物中に検出されなかった。Ｃｕ2+、Ｆｅ2+、Ｍｇ2+及びＺｎ2+などの金属イオンの添加も効果が無かった。
【００５６】
酵素が細胞膜に結合している可能性もあったので、無細胞抽出液の調製後の細胞片を１，５−ＡＧとの反応に用いたが、グルコースは反応混合物中に検出されなかった。
【００５７】
さらに、１１−３株の無細胞抽出液を用いて、酵素活性を、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨをコエンザイムとして３４０ｎｍで分光光度測定的に測定した。その結果、ＮＡＤ、１，５−ＡＧ及び無細胞抽出液を含む反応混合物で吸光度の増加が認められた。したがって、１，５−ＡＧのＮＡＤ依存性デヒドロゲナーゼ活性が１１−３株の無細胞抽出液で確認された。
【００５８】
（２） １，５−ＡＧ脱水素酵素生産能の検討
（２−１） 炭素源の検討
１，５−ＡＧ脱水素酵素の生産能に関し、１，５−ＡＧ以外の炭素源培地によっても前記酵素が生産され、酵素活性が維持できるか否かの検討を行った。
【００５９】
１，５−ＡＧの他の炭素源として１，４−ＡＧ、グルコース、グリセロール及びそれらの組み合わせを選択し、各濃度が０．５％になる様に、上記培養培地に添加した。各培地（５ｍｌ）に１１−３株を１白金耳接種し、３０℃で２日間振とう培養を行った。
【００６０】
培養上清液中の酵素活性は、以下の組成からなる反応液を３０℃でインキュベーションして測定した。すなわち生成されるＮＡＤＨを、インキュベーション開始後５０秒から１００秒後の間の３４０ｎｍにおける吸光度変化の測定を行い、それを相対値として用いるか、または６２２０Ｍ-1・ｃｍ-1のＮＡＤＨの吸光係数を用いて酵素活性量に換算した。１ユニット（Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成する酵素量と定義した。
【００６１】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８） ３３ｍＭ
β−ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製） １．６７ｍＭ
１，５−ＡＧ（和光純薬社製） ０．０８３％
酵素液（培養上清液） ５０μｌ
【００６２】
増殖は、菌糸湿潤重量を測定し、培地１ｌ当たりの値を指標とした。
【００６３】
測定結果を表１に示す。１，５−ＡＧ以外の炭素源としては、グルコースを用いても同等若しくはそれ以上の酵素活性が得られた。よって、高価な１，５−ＡＧを酵素の誘導培地として用いなくとも、安価なグルコースで代用できることが可能であることがわかった。このため以後の実験はグルコースを炭素源として用いることにした。
【００６４】
【表１】
表１ 炭素源の影響
──────────────────────────────
炭素源 増殖（ｇ／Ｌ） 活性（％）
──────────────────────────────
１，５−ＡＧ ２４ １００
１，４−ＡＧ ８ ３２
グルコース ３０ １１２
グリセロール ２８ ６８
グリセロール＋１，５−ＡＧ ３６ ７４
グリセロール＋１，４−ＡＧ １６ ９８
──────────────────────────────
ＡＧ：アンヒドロ−Ｄ−グルシトール
【００６５】
（２−２） 窒素源の検討
（ＮＨ4）2ＳＯ4の代わりに、ポリペプトン、ビーフエキストラクト、ＮＨ4Ｃｌ、ＮＨ4ＮＯ3及びＮａＮＯ3を用いて、１１−３株の１，５−ＡＧ脱水素酵素産生に対し、窒素源の影響も調べた。表２に示すように１１−３株は、ＮａＮＯ3を含む培地で培養したときに、最大の１，５−ＡＧに対する活性及び増殖が観察された。
【００６６】
【表２】
表２ 窒素源の影響
──────────────────────────────
窒素源 増殖（ｇ／Ｌ） 活性（％）
──────────────────────────────
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３４ １００
ＮＨ4Ｃｌ ３０ ８７．６
ＮＨ4ＮＯ3 ２６ ５９．９
ＮａＮＯ3 ３０ １５０
ビーフエキス ４６ ３２．２
ポリペプトン ５２ ２５．６
──────────────────────────────
【００６７】
（２−３） タイムコース
１１−３株を、１０Ｌジャーファーメンタ（速度：５００ｒｐｍ、空気：５．０ｌ／分）を用いて、１，５−ＡＧ及び（ＮＨ4）2ＳＯ4の代わりにそれぞれグルコース及びＮａＮＯ3を含む７ｌの培養培地で培養し、菌糸の増殖及び１，５−ＡＧ脱水素酵素の比活性のタイムコースを調べた（図１）。図１中、白丸は菌糸湿潤重量、黒丸は酵素活性、黒四角は比活性を示す。比活性算出のためのタンパク質量は、BIO-RADプロテインアッセイキットを用いてブラッドフォード法により定量した。
【００６８】
増殖及び比活性は４０時間まで増加し、定常状態初期に最大に達した。１，５−ＡＧ脱水粗酵素活性は一過性に検出された。
【００６９】
（３） １１−３株の同定
１１−３株は、糸状菌であり、コロニーは緑色を呈する。顕微鏡下で、分岐したフィアライドの頂端に多くのフィアロ型分生子が観察された。分生子は、鎖生ではなく塊生であった。これらの観察結果から、１１−３株はトリコデルマ属に属すると認められる。
【００７０】
１１−３株の同定をオランダのＣｅｎｔａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）に依頼したところ、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ Ｒｉｆａｉ）であることがわかった。
【００７１】
１１−３株は、トリコデルマ・ロンギブラキアツム KDK3003（Trichoderma longibrachitaum KDK3003）と命名され、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（住所 〒３０５−００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約の規定に基づいて平成10年8月10日から国際寄託されている（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５８）。
【００７２】
【実施例２】
１，５−ＡＧ脱水素酵素の製造及び特性評価
ＫＤＫ３００３株を、１０Ｌジャーファーメンタを用い、８Ｌの培地中、２８℃、２日間培養した。培地の組成は、３ｇＮａＮＯ3、１ｇＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｇＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、５ｇ酵母エキス及び４ｇグルコースを１０００ｍｌの蒸留水に含むもの（ｐＨ５．５）であった。
【００７３】
その後，培養液を吸引ろ過して菌糸体を集め、洗浄後、２ｍＭＤＴＴを含む０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１３０ｍｌ）に懸濁し、ビードビーター（日本ラムダ社製）を用いてガラスビーズ（３００ｍｌ、０．２５〜０．５０ｍｍｆ）で菌糸体を破砕した。破砕物を、４℃において９，０００×ｇで３０分間遠心分離して非破砕細胞及び細胞片を除き、上清を無細胞抽出液とした。以下の精製操作は全て４℃で行った。
【００７４】
無細胞抽出液に、撹拌しながら硫酸アンモニウムを３５％飽和になるように加え、ｐＨを３５％水酸化アンモニウム溶液で７．０に調整した。１時間撹拌した後、沈殿を１６，０００×ｇで３０分間遠心分離して沈殿を除いた。上清を回収し、硫酸アンモニウムを５５％飽和になるように加えて、上記と同様にして沈殿物を回収し、緩衝液Ａ（２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に溶解し、同緩衝液に対して透析した。
【００７５】
透析液を、緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２．２φ×２０ｃｍ）にアプライした。カラムを同緩衝液で洗浄し、吸着したタンパク質をＫＣｌのリニアグラジエント（０〜０．５Ｍ）で溶出した。溶出した酵素活性画分を回収し、撹拌しながら硫酸アンモニウムを５５％飽和になるように加え、ｐＨを３５％水酸化ナトリウム溶液で７．０に調整した。１時間撹拌後、沈殿を１６，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を除いた。沈殿を緩衝液Ａに溶解し、２５％飽和の硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａに対して透析後、２５％飽和の硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで平衡化したフェニル−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（アマシャムファルマシアバイテク社製）カラム（１．０φ×１０ｃｍ）にアプライした。同緩衝液で洗浄し、酵素を、硫酸アンモニウムの２５％飽和から０％飽和へのリニアグラジエントにより溶出した（流速１ｍｌ／ｍｉｎ）。溶出した酵素活性画分を回収し、０．１ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化したスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ ｐｇ（アマシャムファルマシアバイテク社製）カラム（１．６φ×６０ｃｍ）にアプライし、酵素を同緩衝液で溶出した（２ｍｌ／ｍｉｎ）。
【００７６】
精製結果を表３に示す。酵素活性及びタンパク質量は上記実施例１の（２）に記載した方法により測定した。
【００７７】
【表３】
スーパーデックス２００ｐｇによるクロマトグラフィー後に得られた酵素を、以下の酵素の物理化学的特性を検討する酵素として使用した。
【００７９】
（１）至適ｐＨ及びｐＨ安定性の検討
ｐＨが５．５、６．５、７．０、７．５を示す１００ｍＭのＭｃＩｌｖａｉｎｅ、ｐＨが７．５、８．０、８．５、９．０を示す１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨが９．０、９．５、１１．０、１２．０、１２．５を示す１００ｍＭのグリシン−ＮａＯＨの緩衝液を作製した。これらの緩衝液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）の代わりに同モル濃度となるように用いる他は、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定した。最大の酵素活性を１００としたときの相対的な酵素活性をパーセントで求めた結果を図２に示す。この結果、本酵素の至適ｐＨは９付近であることがわかった。
【００８０】
また、本酵素を各ｐＨの各緩衝液中で、３０℃，１０分間インキュベーションし、インキュベーション後の混合液を酵素液とし、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定し、最大の酵素活性を１００としたときの相対的な酵素活性をパーセントで求めた結果を図３に示す。この結果、本酵素は、ｐＨ６〜１０の範囲において安定であることがわかった。
【００８１】
（２）至適温度及び温度安定性の検討
反応温度を２０〜６０℃の範囲において１０℃間隔の温度にする他は、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定し、最大の酵素活性を１００としたときの相対的な酵素活性をパーセントで求めた結果を図４に示す。この結果、本酵素の至適温度は、４０〜５０℃の間にあることがわかった。
【００８２】
また、酵素液を３０〜８０℃の範囲において１０℃間隔の温度でそれぞれ１０分間インキュベーションした後、この酵素液を用いて、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定した結果、本酵素は、７０℃、１０分間のインキュベーションでも５０％以上の活性が残存しており、温度安定性は良好であることが確認された（図５）。
【００８３】
（３）電子受容体の検討
本酵素は、電子受容体としてＮＡＤを利用することが培養上清における検討時に確認された。３００μｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、２５μｌの１０ｍＭの酸化型ＮＡＤＰ、２５μｌの５％の１，５−ＡＧ、１０μｌの酵素液、及び、６４０μｌの水を良く混合し、３０℃でインキュベーションを行い、３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定したところ、吸光度は増加しなかった。よって本酵素は、ＮＡＤを補酵素として利用できるが、ＮＡＤＰは利用できないことがわかった。
【００８４】
（４）分子量の検討
精製した酵素をスーパーデックス２００ｐｇ（アマシャムファルマシアバイテク社製）によるゲルろ過法を用いて溶出し、予め求めた分子量マーカー（ベーリンガーマンハイム社製 Ｎｏ１０４５５８）の溶出容量から分子量を求めた結果、分子量は１４１，０００（１４１ｋＤａ）であった。
【００８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）による分析も行った。ファーストシステム（アマシャムファルマシアバイテク社製）を使用し、ＰａｓｔＧｅｌ Ｇｒａｄｉｅｎｔ １０−１５（アマシャムファルマシアバイテク社製）ゲルを使用して、２５０Ｖで、３０分間泳動し、タンパク染色は、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０で行った。同時に泳動した分子量マーカー（ＬＭＷマーカーキット）から分子量を求めた結果、３６，０００（３６ｋＤａ）であった。本酵素は、４量体であることが予想された。
【００８６】
（５）基質特異性の検討
グルコース、フルクトース、ソルビトール、キシリトール、マンニトール、グリセルアルデヒド、グリセルアルデヒド３リン酸、アセトアルデヒドに対する基質特異性を調べるため、０．２５％の基質水溶液を作製した。
【００８７】
前記基質水溶液を最終濃度３ｍＭとなるように加える他は、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定し、最大の酵素活性を１００とした時の相対的な酵素活性をパーセントで求めた，結果を表４に示す。
【００８８】
１，５−ＡＧ脱水素酵素は、従来酵素とは異なりグルコース、フルクトース、ソルビトール、マンニトール、キシリトールには反応しない。また、グリセルアルデヒドに対しては、１，５−ＡＧを基質としたときの活性と比較して、半分程度の活性を示す。よって従来より知られる酵素とは全く別の１，５−ＡＧ脱水素酵素であることが示唆された。
【００８９】
【表４】
表４ 基質特異性
─────────────────────────
基質（３ｍＭ） 相対活性
─────────────────────────
１，５−ＡＧ １００
グルコース 検出されず
フルクトース 検出されず
ソルビトール 検出されず
キシリトール 検出されず
マンニトール 検出されず
グリセルアルデヒド ５２
グリセルアルデヒド３リン酸 検出されず
アセトアルデヒド 検出されず
─────────────────────────
【００９０】
実施例１の（２）に記載の条件で１，５−ＡＧ及びＮＡＤの濃度を変化させて測定を行ったところ、１，５−ＡＧ及びＮＡＤのＫｍ値はそれぞれ０．６７ｍＭ及び０．５０ｍＭであった。
【００９１】
（６）金属イオン及び試薬の影響の検討
種々の金属イオン及び試薬の酵素活性に対する影響を検討した。
【００９２】
表５に示す金属塩を最終濃度１ｍＭとなるように、基質溶液を含まない反応混合液に加え３０℃で１０分間インキュベートした後、基質溶液を加える他は、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定し、最大の酵素活性を１００としたときの相対的な酵素活性をパーセントで求めた結果を表５に示す。
【００９３】
【表５】
表５ 金属イオンの影響
────────────────────
化合物 相対活性（％）
────────────────────
無し １００
ＬｉＣｌ2 検出されず
ＭｇＣｌ2 ２４
ＣａＣｌ2 検出されず
ＭｎＣｌ2 検出されず
ＣｏＣｌ2 ５７
ＮｉＣｌ2 検出されず
ＣｕＣｌ2 １４
ＺｎＣｌ2 ２４
ＢａＣｌ2 検出されず
ＨｇＣｌ2 ２１
ＦｅＣｌ2 ２６９
ＦｅＣｌ3 検出されず
────────────────────
【００９４】
酵素活性は、１ｍＭのＭｎ2+、Ｆｅ3+、Ｎｉ2+、Ｃａ2+、Ｂａ2+及びＬｉ2+により完全に阻害された。一方、Ｆｅ2+で活性化が認められた。
【００９５】
表６に示す試薬を最終濃度１ｍＭ（ＰＣＭＢは０．１ｍＭ）となるように、基質溶液を含まない反応混合液に加え３０℃で１０分間インキュベートした後、基質溶液を加える他は、実施例１の（２）に記載の条件で酵素活性を測定し、最大の酵素活性を１００としたときの相対的な酵素活性をパーセントで求めた結果を表６に示す。
【００９６】
【表６】
表６ 試薬の影響
────────────────────
化合物 相対活性（％）
────────────────────
無し １００
２，２−ビピリジル ５７
ｏ−フェナントロリン 検出されず
エチレンジアミン四酢酸 １０４
シアン化カリウム １００
アジ化ナトリウム 検出されず
フッ化カリウム １３０
ヨード酢酸 ７０
ＰＣＭＢ（０．１ｍＭ） 検出されず
ＤＴＮＢ 検出されず
フェニルヒドラジン １７８
────────────────────
ＰＣＭＢ：ｐ−クロロメルクリ安息香酸
ＤＴＮＢ：ジチオビス（ニトロ安息香酸）
【００９７】
酵素活性は、ＰＣＭＢ、ＤＴＮＢ、ＮａＮ3及びｏ−フェナントロリンにより強く阻害された。
【００９８】
これらの結果より、酵素反応にＳＨ基及び鉄イオンが関与していることが示唆される。
【００９９】
（７）反応生成物の検討
実施例１で記載したように、ＫＤＫ３００３株の菌糸を用いた休止細胞反応ではグルコースの生成が検出されたが、酵素反応混合物のＴＬＣにおける分析ではグルコースの生成は検出されなかった。無細胞抽出液においてグルコノ−δ−ラクトンレダクターゼ活性が顕著に認められたことから、グルコノ−δ−ラクトンの加水分解物であるグルコン酸の検出をグルコン酸デヒドゲナーゼを用いて試みた。この結果、１，５−ＡＧ脱水素反応後の反応液を基質溶液としたときにグルコン酸デヒドロゲナーゼ反応が顕著に認められた。したがって、１，５−ＡＧは１，５−ＡＧ脱水素酵素によりグルコノ−δ−ラクトンに変換されると推定される。
【０１００】
【実施例３】
１，５−ＡＧ脱水素酵素を用いた１，５−ＡＧの定量
１，５−ＡＧ脱水素酵素（ＡＧＤＨ）を用いた、１，５−ＡＧの量の酵素的定量について検討した。用いた精製ＡＧＤＨは、最後のゲル濾過を行わなかった他は実施例２に記載の方法により調製したものであった。
【０１０１】
糖尿病の患者の血清１，５−ＡＧ濃度は一般に０．１５〜０．２ｍｇ／ｄｌである。そこで０．２ｍｇ／ｄｌの１，５−ＡＧを試料として基質溶液の代わりに用い、２．７Ｕ／ｍｌの精製ＡＧＤＨを酵素液として用い、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の代わりにリン酸カリウム緩衝液を用いた他は実施例１の（２）と同様にして測定を行った。この結果、この濃度の１，５−ＡＧを検出可能であることが判明した。
【０１０２】
さらに、血清中の１，５−ＡＧレベルに基づく種々の濃度（０．５〜２ｍｇ／ｄｌ）の１，５−ＡＧを試料として上記と同様に測定を行った。また、グルコース（試料中１１０ｍｇ／ｄｌ）及びフルクトース（試料中０．５６ｍｇ／ｄｌ）の存在下でも同様に測定を行った。結果を図６〜８に示す。図６は１，５−ＡＧのみ、図７はグルコース存在下、図８はフルクトース存在下の結果を示す。
【０１０３】
図６から明らかなように、１，５−ＡＧの濃度とＮＡＤＨ形成との間に直線関係が観察された。さらに、生理的条件に匹敵する濃度のグルコース及びフルクトースの共存は、ＡＧＤＨによる１，５−ＡＧの定量に影響を与えないことが示された（図７及び８）。
【０１０４】
これらの結果は、本発明のＡＧＤＨを用いた１，５−ＡＧの定量が糖尿病の診断に適したものであることを示す。
【０１０５】
【実施例４】
１，５−ＡＧ脱水素酵素のｃＤＮＡの取得
ＫＤＫ３００３株からＡＧＤＨを実施例２のようにして精製した。精製した酵素をプロテアーゼＶ８（シグマアルドリッチジャパン社製）により部分消化し、SDS-PAGEに付し、PVDF膜上にブロットした。各バンドのペプチドのアミノ酸配列をプロテインシークエンサ（Applied Bipsystem model 476A）で決定した。決定された部分アミノ酸配列に基づいて下記のプライマーを設計した。
【０１０６】
ＫＤＫ３００３株を実施例２に記載したようにして３２時間培養して得られた菌体から全RNAを酸グアニジン−フェノール−クロロホルム法（Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987)）により調製し、全RNAからmRNAを、Quick Prep mRNA精製キット（アマシャムファルマシアバイテク社製）を用いてオリゴ（ｄＴ）−セルローススパンカラムにより精製した。5 mgのmRNAから、Ready To-Go PCR Beads（アマシャムファルマシアバイテク社製）を用いて製造者の指示書に基づいてcDNAを合成した。
【０１０７】
得られたcDNAを鋳型として用い、増幅特異性を最大化するために、AmpliWax（商標）PCR Gem（パーキンエルマージャパン社製）を用いたオート−ホット−スタートPCRを行った（J. Virol., 5272-5281 (1996)）。プライマーを除く他の全ての反応成分を80℃に５分間加熱した後、プライマーを加え、次いで、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP（宝酒造社製）を用いたサーモサイクラーシークエンス（94℃で１分間の最初の変性、94℃１分間、55℃１分間及び72℃２分間を35サイクル、そして72℃で３分間の最終の伸長）に付した。PCR混合物は、6.25μM変性プライマー（5'-ATYCCNGTBCARAAGCCNGGN（配列番号３）又は5'-AAGCCNGGNGTBGAYGARGTBYT（配列番号４）及び3'-CVACRTGNGCNGCCTTNGCRA（配列番号５））を含むものであった。
【０１０８】
その結果、PCR産物として約300bpのフラグメントが得られた。PCR産物を直接pT7Blue-2 Tベクターに結合し、その組換えプラスミドで、ELECTRO CELL MANUPULATER 600 (BTX社製)を用いてE. coli JM109を形質転換した(Nucleic Acids Res., 16, 6127-6145(1988); Genetic Engineering-Principles and Methods vol. 12, pp. 275-295(1990))。プラスミドを含むコロニーは、0.1%IPTG及び2.0%X-galを含む２×YT寒天培地で白色コロニーとして検出された。PCR産物のクローニングは、コロニーPCRにより確認した。コロニーから得られたプラスミドを、ABI PRISM（商標）BigDye（商標）ターミネーターサイクルシークエンシングレディリアクションキットを用いてダイデオキシターミネーション反応に付し、ABI PRISM 310ジェネティックアナライザーで配列決定した。
【０１０９】
決定された塩基配列に基づいて、３’−ＲＡＣＥを、３’−ＲＡＣＥＣｏｒｅセット（宝酒造社製）を用いて行い、3'フランキング領域をクローニングした(J. Virol., 5272-5281(1996))。ＫＤＫ３００３株のmRNAを、オリゴdT-3サイトアダプタープライマーを用いて逆転写酵素のためにプライミングした。逆転写反応は、30℃で10分行いさらにAMVトランスクリプターゼと共に50℃で30分インキュベートした。PCRの２回目は、５μＭの３サイトアダプタープライマー（宝酒造社製）、５μＭの、cDNAの塩基配列に基づいて設計した遺伝子特異的プライマー（5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCCGCTGCACGTACTGCATGAACGG-3'（配列番号６））、及び、鋳型としてのRT-PCR産物を用いて行った。PCR条件は、94℃１分、65℃１分及び72℃２分を35サイクルであった。増幅産物のクローニング及び配列決定の手順は前記と同様に実施した。
【０１１０】
その結果、約1.2 kbpのフラグメントが得られ、308アミノ酸（配列番号２）をコードする1231bpヌクレオチド（配列番号１）から成ることが明らかになった。推定アミノ酸配列は、精製ＡＧＤＨで決定された二つのアミノ酸配列（配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１６及びアミノ酸番号１０２〜１１７）を含んでいた。
【０１１１】
【発明の効果】
本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素は、１，５−ＡＧには特異的に反応するが生体成分中に最も多く含まれるグルコースには反応しないため、本酵素によって１，５−ＡＧを測定する場合は前処理操作が不要である。従って、有利に、自動分析装置に適用することができる。
【０１１２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 培養のタイムコースの一例を示す。
【図２】 １，５−ＡＧ脱水素酵素の各ｐＨにおける活性％を示す。
【図３】 １，５−ＡＧ脱水素酵素の各ｐＨにおける安定性を示す。
【図４】 １，５−ＡＧ脱水素酵素の各温度における活性％を示す。
【図５】 １，５−ＡＧ脱水素酵素の各温度における安定性を示す。
【図６】 １，５−ＡＧ脱水素酵素を用いた１，５−ＡＧの定量を示す。
【図７】 グルコース存在下における１，５−ＡＧ脱水素酵素を用いた１，５−ＡＧの定量を示す。
【図８】 フルクトース存在下における１，５−ＡＧ脱水素酵素を用いた１，５−ＡＧの定量を示す。
Claims (6)
- 次にあげる理化学的特性を示す１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素。
(1) 作用： １，５−アンヒドログルシトールの脱水素反応を触媒する。
(2) 基質特異性：１，５−アンヒドログルシトールを基質として認識するが、グルコースを基質として認識しない。
(3) 至適ｐＨ：９．０付近である。
(4) ｐＨ安定性：ｐＨ６．０〜１０．０で安定である。
(5) 至適温度：４０〜５０℃である。
(6) 温度安定性：７０℃、１０分間のインキュベーションで５０％以上の活性が残存している。
(7) 電子受容体：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を利用できる。
(8) 分子量：ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は３６，０００であり、ゲルろ過法による分子量は１４１，０００である。 - トリコデルマ属の菌を培養することによって生産される請求項１記載の１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素。
- 前記トリコデルマ属の菌が、トリコデルマ・ロンギブラキアツムＫＤＫ３００３(Tricoderma longibrachiatum KDK3003)（FERM BP-6458）であることを特徴とする請求項２記載の１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素。
- 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する請求項１記載の１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素を生産するトリコデルマ属の菌を栄養培地で培養し、培養物から、生産された１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素を分離精製することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素の製造方法。
- 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）存在下で、１，５−アンヒドログルシトールを含む試料に請求項１〜４のいずれか１項に記載の１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素を反応させることによって生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を、吸光度の変化量により測定することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの定量法。
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