JP3150868B2 - ６ホスホグルコン酸脱水素酵素とその製造法 - Google Patents
６ホスホグルコン酸脱水素酵素とその製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、６ホスホグルコン酸
脱水素酵素とその製造法に関するものである。さらに詳
しくは、この発明は、その反応において補酵素としてニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤ
と略記する）に特異的に作用し、安定性に優れた新規な
６ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下６ＰＧＤＨと略記
する）とその製造法に関するものである。
脱水素酵素とその製造法に関するものである。さらに詳
しくは、この発明は、その反応において補酵素としてニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤ
と略記する）に特異的に作用し、安定性に優れた新規な
６ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下６ＰＧＤＨと略記
する）とその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、酵素は、その反応の安定性、基質
との特異的結合性、および光学的定量化の容易性などの
優れた特性が注目され、医療分野や食品の成分分析など
に広く触媒として利用されている。なかでも６ＰＧＤＨ
は、とくにグルコース６リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６Ｐ
ＤＨと略記する）との共存下でグルコース６リン酸（以
下Ｇ６Ｐと略記する）を定量する場合に、高い測定感度
が得られるという点においてその有用性が指摘されてい
る。すなわち、そのようなＧ６Ｐ測定の場合、一般的に
はＧ６ＰＤＨまたは６ＰＧＤＨの反応により生成した還
元型ＮＡＤ（以下ＮＡＤＨと略記する）あるいは還元型
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以
下ＮＡＤＰＨと略記する）の３４０ｎｍにおける吸光度
を分光学的に測定するが、さらにジアホラーゼやフェナ
ジンメトサルフェート（以下ＰＭＳと略記する）および
その誘導体により、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈを基質とし
てニトロブルーテトラゾリウム（以下ＮＢＴと略記す
る）などのテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノール（以下ＤＣＰＩＰと略記する）な
どを還元発色させ、可視部で測定することもできる。
との特異的結合性、および光学的定量化の容易性などの
優れた特性が注目され、医療分野や食品の成分分析など
に広く触媒として利用されている。なかでも６ＰＧＤＨ
は、とくにグルコース６リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６Ｐ
ＤＨと略記する）との共存下でグルコース６リン酸（以
下Ｇ６Ｐと略記する）を定量する場合に、高い測定感度
が得られるという点においてその有用性が指摘されてい
る。すなわち、そのようなＧ６Ｐ測定の場合、一般的に
はＧ６ＰＤＨまたは６ＰＧＤＨの反応により生成した還
元型ＮＡＤ（以下ＮＡＤＨと略記する）あるいは還元型
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以
下ＮＡＤＰＨと略記する）の３４０ｎｍにおける吸光度
を分光学的に測定するが、さらにジアホラーゼやフェナ
ジンメトサルフェート（以下ＰＭＳと略記する）および
その誘導体により、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈを基質とし
てニトロブルーテトラゾリウム（以下ＮＢＴと略記す
る）などのテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノール（以下ＤＣＰＩＰと略記する）な
どを還元発色させ、可視部で測定することもできる。
【０００３】この様なＧ６Ｐまたは６ＰＧを経由する各
種分析対象を可視部域で測定する場合、ジアホラーゼは
ＮＡＤＨに特異性が高く、またＰＭＳにも適用できるた
め、ＮＡＤに対して特異的に作用する６ＰＧＤＨを利用
することが望ましい。この６ＰＧＤＨは、細菌から高等
生物に至るまで広く生物界に存在し、補酵素として、ニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下
ＮＡＤＰと略記する）に特異的に作用するもの（ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Euro
pean Journal of Biochemistry）、１巻、１７０頁（１
９６７年））、ＮＡＤＰとＮＡＤ両方に作用するもの
（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Agricultural and Biological Chemistry
）、４６巻、３９１頁（１９８２年））、ＮＡＤのみ
に作用するもの（エフエムビーエス・マイクロバイオロ
ジー・レターズ（FMBS Microbiology Letters ）、５２
巻、１９９頁（１９８８年））が知られているが、その
ほとんどはＮＡＤＰに特異的に作用するものである。
種分析対象を可視部域で測定する場合、ジアホラーゼは
ＮＡＤＨに特異性が高く、またＰＭＳにも適用できるた
め、ＮＡＤに対して特異的に作用する６ＰＧＤＨを利用
することが望ましい。この６ＰＧＤＨは、細菌から高等
生物に至るまで広く生物界に存在し、補酵素として、ニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下
ＮＡＤＰと略記する）に特異的に作用するもの（ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Euro
pean Journal of Biochemistry）、１巻、１７０頁（１
９６７年））、ＮＡＤＰとＮＡＤ両方に作用するもの
（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Agricultural and Biological Chemistry
）、４６巻、３９１頁（１９８２年））、ＮＡＤのみ
に作用するもの（エフエムビーエス・マイクロバイオロ
ジー・レターズ（FMBS Microbiology Letters ）、５２
巻、１９９頁（１９８８年））が知られているが、その
ほとんどはＮＡＤＰに特異的に作用するものである。
【０００４】また、６ＰＧＤＨは、上記の通り、Ｇ６Ｐ
ＤＨとの共存下、ＮＡＤまたはＮＡＤＰから生成される
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を測定することによりＧ６Ｐを定量す
る測定系において、測定感度を高めるものであるが、こ
の測定方法を反応式に示すと以下のようになる。
ＤＨとの共存下、ＮＡＤまたはＮＡＤＰから生成される
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を測定することによりＧ６Ｐを定量す
る測定系において、測定感度を高めるものであるが、こ
の測定方法を反応式に示すと以下のようになる。
【０００５】
【化２】
【０００６】
【化３】
【０００７】この測定方法については、たとえば特開平
３−２３２４９８号公報には、ＮＡＤＰに特異的に作用
する６ＰＧＤＨを用いた測定系が記載されている。この
ように、ＮＡＤ（Ｐ）から生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測
定することでＧ６Ｐを定量できる。Ｇ６ＰＤＨのみを用
いた場合、１モルのＧ６Ｐに対し、１モルのＮＡＤ
（Ｐ）Ｈしか生成しないのに対し、６ＰＧＤＨを共役さ
せることにより、１モルのＧ６Ｐから２モルのＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを生成させることができるため、Ｇ６ＰＤＨの
みを用いる場合の２倍の感度が得られる。
３−２３２４９８号公報には、ＮＡＤＰに特異的に作用
する６ＰＧＤＨを用いた測定系が記載されている。この
ように、ＮＡＤ（Ｐ）から生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測
定することでＧ６Ｐを定量できる。Ｇ６ＰＤＨのみを用
いた場合、１モルのＧ６Ｐに対し、１モルのＮＡＤ
（Ｐ）Ｈしか生成しないのに対し、６ＰＧＤＨを共役さ
せることにより、１モルのＧ６Ｐから２モルのＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを生成させることができるため、Ｇ６ＰＤＨの
みを用いる場合の２倍の感度が得られる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、たとえ
ば、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー誌（Agricultural and Biological Chemistr
y ）、４６巻、３９１頁（１９８２年）に記載されてい
るグルコノバクター・サブオキシダンス（Gluconobacte
r suboxydans）ＩＦＯ１２５２８株は、ＮＡＤとＮＡ
ＤＰ両方に作用する６ＰＧＤＨを生産するが、この酵素
はＡＴＰにより強く阻害される。また、エフエムビーエ
ス・マイクロバイオロジーレターズ（FMBS Microbiolog
y Letters）、５２巻、１９９頁（１９８８年）に記載
されているメチロバチルス・フラゲラタム（Methyrobac
illus flagellatum ）ＫＴ１株から得られるＮＡＤに
特異的に作用する６ＰＧＤＨも知られているが、その安
定性は極めて悪く、４℃で３日間保存しただけで約９０
％失活するため、実用的でなかった。そのため、この酵
素を実際に反応試薬中へ適用することは不可能であっ
た。
ば、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー誌（Agricultural and Biological Chemistr
y ）、４６巻、３９１頁（１９８２年）に記載されてい
るグルコノバクター・サブオキシダンス（Gluconobacte
r suboxydans）ＩＦＯ１２５２８株は、ＮＡＤとＮＡ
ＤＰ両方に作用する６ＰＧＤＨを生産するが、この酵素
はＡＴＰにより強く阻害される。また、エフエムビーエ
ス・マイクロバイオロジーレターズ（FMBS Microbiolog
y Letters）、５２巻、１９９頁（１９８８年）に記載
されているメチロバチルス・フラゲラタム（Methyrobac
illus flagellatum ）ＫＴ１株から得られるＮＡＤに
特異的に作用する６ＰＧＤＨも知られているが、その安
定性は極めて悪く、４℃で３日間保存しただけで約９０
％失活するため、実用的でなかった。そのため、この酵
素を実際に反応試薬中へ適用することは不可能であっ
た。
【０００９】以上のような理由から、ＮＡＤに特異的に
作用し、安定性に優れた６ＰＧＤＨの実現が強く要望さ
れていた。
作用し、安定性に優れた６ＰＧＤＨの実現が強く要望さ
れていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】そこで、この発明は、上
記の課題を解決するものとして、以下のからの理化
学的性質を有する６ＰＧＤＨを提供する。また、その６
ＰＧＤＨ生産能を有する菌株を培養し、培養物から６Ｐ
ＧＤＨを採取することを特徴とする６ＰＧＤＨの製造法
を提供する。
記の課題を解決するものとして、以下のからの理化
学的性質を有する６ＰＧＤＨを提供する。また、その６
ＰＧＤＨ生産能を有する菌株を培養し、培養物から６Ｐ
ＧＤＨを採取することを特徴とする６ＰＧＤＨの製造法
を提供する。
【００１１】 作 用 下記反応式の反応を触媒し、補酵素としてＮＡＤに特異
的に作用する。
的に作用する。
【００１２】
【化４】
【００１３】 安定性：５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）中、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸存在
下、室温で１カ月放置後、９０％以上の残存活性を有す
る。 分子量：約１３万〜２６万（セファクリルＳ−３０
０ゲルクロマトグラフィー法） 基質特異性：６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸に特異性
を示し、補酵素としてはＮＡＤに特異的に作用し、ＮＡ
Ｄを補酵素としたときの活性値を１００とすると、ＮＡ
ＤＰを用いた場合１以下である。
Ｈ７．２）中、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸存在
下、室温で１カ月放置後、９０％以上の残存活性を有す
る。 分子量：約１３万〜２６万（セファクリルＳ−３０
０ゲルクロマトグラフィー法） 基質特異性：６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸に特異性
を示し、補酵素としてはＮＡＤに特異的に作用し、ＮＡ
Ｄを補酵素としたときの活性値を１００とすると、ＮＡ
ＤＰを用いた場合１以下である。
【００１４】 至適ｐＨ範囲：６．５〜８．５（温度
３０℃） 安定ｐＨ：５〜９ 作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲（Ｍ
ＥＳ緩衝液ｐＨ７．２） そしてこの発明の上記の菌株は、ロイコノストック・ラ
クティス(Leuconostoc lactis）ＳＨＯ４７またはロイコ
ノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis) ＳＨＯ
５４株であり、その菌学的性質を示したものが表１〜表
４である。
３０℃） 安定ｐＨ：５〜９ 作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲（Ｍ
ＥＳ緩衝液ｐＨ７．２） そしてこの発明の上記の菌株は、ロイコノストック・ラ
クティス(Leuconostoc lactis）ＳＨＯ４７またはロイコ
ノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis) ＳＨＯ
５４株であり、その菌学的性質を示したものが表１〜表
４である。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】
【表３】
【００１８】
【表４】
【００１９】この表１〜４に示した菌学的性質から、バ
ージィのマニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー（Bargey's Mannual of Systematic Bacteri
ology ）およびメソッズ・イン・マイクロバイオロジー
(METHODS IN MICROBIOLOGY)第１６巻、第１４７〜１７
８頁に基づき検索した結果、ＳＨＯ４７株およびＳＨＯ
５４株は共にロイコノストック・ラクティス(Leuconost
oc lactis) に属する細菌と判明したが、生理的性質に
おいて既存菌株とは異なるものがあり、新菌株と判断で
きるので、それぞれロイコノストック・ラクティス(Leu
conostoc lactis）ＳＨＯ４７株、ロイコノストック・
ラクティス(Leuconostoc lactis）ＳＨＯ５４株と命名
し、平成５年１１月１７日に通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託した。その受託番号はそれぞれ、
ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０，ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１
である。
ージィのマニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー（Bargey's Mannual of Systematic Bacteri
ology ）およびメソッズ・イン・マイクロバイオロジー
(METHODS IN MICROBIOLOGY)第１６巻、第１４７〜１７
８頁に基づき検索した結果、ＳＨＯ４７株およびＳＨＯ
５４株は共にロイコノストック・ラクティス(Leuconost
oc lactis) に属する細菌と判明したが、生理的性質に
おいて既存菌株とは異なるものがあり、新菌株と判断で
きるので、それぞれロイコノストック・ラクティス(Leu
conostoc lactis）ＳＨＯ４７株、ロイコノストック・
ラクティス(Leuconostoc lactis）ＳＨＯ５４株と命名
し、平成５年１１月１７日に通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託した。その受託番号はそれぞれ、
ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０，ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１
である。
【００２０】この発明における微生物を培養する際に用
いられる栄養培地については、炭素源として、グルコー
ス、シュークロース、ラクトース等が使用でき、窒素源
としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有機物が使用
できる。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリ
ウム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩類、
必要に応じて微量金属塩、ビタミン類などを使用しても
よい。
いられる栄養培地については、炭素源として、グルコー
ス、シュークロース、ラクトース等が使用でき、窒素源
としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有機物が使用
できる。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリ
ウム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩類、
必要に応じて微量金属塩、ビタミン類などを使用しても
よい。
【００２１】培養は通常、嫌気的あるいは微好気的な条
件下で行う。培養温度は２０℃から４２℃、好ましくは
３０℃から４２℃、最適には３５℃から４２℃で行う。
培地のｐＨは５．８〜７．２、好ましくは６．０〜７．
０、最適には６．４〜６．７である。このような条件下
で３〜３０時間、好ましくは６から１０時間培養するこ
とにより、菌体内に６ＰＧＤＨが生成、蓄積される。
件下で行う。培養温度は２０℃から４２℃、好ましくは
３０℃から４２℃、最適には３５℃から４２℃で行う。
培地のｐＨは５．８〜７．２、好ましくは６．０〜７．
０、最適には６．４〜６．７である。このような条件下
で３〜３０時間、好ましくは６から１０時間培養するこ
とにより、菌体内に６ＰＧＤＨが生成、蓄積される。
【００２２】また、この発明で６ＰＧＤＨを製造するに
は、たとえば上記のごとく微生物を培養し、培養終了
後、遠心分離や濾過などの操作で培養液から菌体を回収
し、菌体から粗酵素液を抽出し、精製すればよい。抽出
法には、超音波破砕、フレンチプレス、界面活性剤処
理、リゾチーム処理などいずれを用いてもよく、こうし
た処理後、遠心分離により細胞片を除去し、粗酵素液を
得る。粗酵素液については、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマ
トグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマ
トグラフィーを組み合わせることにより、本発明の６Ｐ
ＧＤＨを単離、精製することができる。イオン交換クロ
マトグラフィーにはＱ−セファロースＦＦ（ファルマシ
ア社製）、ＤＥＡＥ−セファロースカラム（ファルマシ
ア社製）など、アフィニティークロマトグラフィーに
は、プロシオンブルーＨ−ＥＲＤ（ＩＣＩ製）、ブルー
セファロースＣＬ−６Ｂカラム（ファルマシア社製）な
ど、疎水クロマトグラフィーには、オクチル−セファロ
ースＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア社製）など、ゲル
濾過クロマトグラフィーには、セファデックスカラムな
どが挙げられる。また、これらのカラムクロマトグラフ
ィーに加え、硫酸ストレプトマイシンや硫酸プロタミン
処理による除核酸、硫酸アンモニウム処理によるタンパ
ク質の塩析を行ってもよい。
は、たとえば上記のごとく微生物を培養し、培養終了
後、遠心分離や濾過などの操作で培養液から菌体を回収
し、菌体から粗酵素液を抽出し、精製すればよい。抽出
法には、超音波破砕、フレンチプレス、界面活性剤処
理、リゾチーム処理などいずれを用いてもよく、こうし
た処理後、遠心分離により細胞片を除去し、粗酵素液を
得る。粗酵素液については、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマ
トグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマ
トグラフィーを組み合わせることにより、本発明の６Ｐ
ＧＤＨを単離、精製することができる。イオン交換クロ
マトグラフィーにはＱ−セファロースＦＦ（ファルマシ
ア社製）、ＤＥＡＥ−セファロースカラム（ファルマシ
ア社製）など、アフィニティークロマトグラフィーに
は、プロシオンブルーＨ−ＥＲＤ（ＩＣＩ製）、ブルー
セファロースＣＬ−６Ｂカラム（ファルマシア社製）な
ど、疎水クロマトグラフィーには、オクチル−セファロ
ースＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア社製）など、ゲル
濾過クロマトグラフィーには、セファデックスカラムな
どが挙げられる。また、これらのカラムクロマトグラフ
ィーに加え、硫酸ストレプトマイシンや硫酸プロタミン
処理による除核酸、硫酸アンモニウム処理によるタンパ
ク質の塩析を行ってもよい。
【００２３】このようにして得られた６ＰＧＤＨは、前
記の通りの理化学的性質を有するが、この点をさらに詳
しく説明すると次の通りである。 （１）作用：次の反応式の反応を触媒する。
記の通りの理化学的性質を有するが、この点をさらに詳
しく説明すると次の通りである。 （１）作用：次の反応式の反応を触媒する。
【００２４】
【化５】
【００２５】（２）基質特異性およびＫｍ値：６ＰＧお
よびＮＡＤに対するミカエリス定数（Ｋｍ値）は、それ
ぞれ１．１ｍＭ、０．５４ｍＭである。また、ＮＡＤを
補酵素としたときの活性値を１００とすると、ＮＡＤＰ
を用いた場合は、１以下である。 （３）至適ｐＨ：６．５〜８．５（温度３０℃） （４）安定ｐＨ：５〜９（各ｐＨで２４時間、４℃処理
後の活性：ｐＨ４〜５．５、酢酸緩衝液、ｐＨ５．５〜
７ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７〜８、イミダゾール−塩酸緩衝
液、ｐＨ８〜９．５、グリシル・グリシン−ＫＯＨ緩衝
液） （５）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲。
よびＮＡＤに対するミカエリス定数（Ｋｍ値）は、それ
ぞれ１．１ｍＭ、０．５４ｍＭである。また、ＮＡＤを
補酵素としたときの活性値を１００とすると、ＮＡＤＰ
を用いた場合は、１以下である。 （３）至適ｐＨ：６．５〜８．５（温度３０℃） （４）安定ｐＨ：５〜９（各ｐＨで２４時間、４℃処理
後の活性：ｐＨ４〜５．５、酢酸緩衝液、ｐＨ５．５〜
７ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７〜８、イミダゾール−塩酸緩衝
液、ｐＨ８〜９．５、グリシル・グリシン−ＫＯＨ緩衝
液） （５）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲。
【００２６】（ＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．２） （６）安定性：５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）
中、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡと
略記する。）の存在下、室温で３０日放置後９０％以上
の残存活性を有する。 （７）分子量：約１３万〜２６万（セファクリルＳ−３
００ゲルクロマトグラフィー法による測定において、ｐ
Ｈ６．０で行った場合約１３万。ｐＨ８．０で行った場
合約２６万） なお、活性の測定は、１．７ｍＭの６ＰＧ、２．０ｍＭ
のＮＡＤおよび８．０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣ
ｌ2 ）を含むグリシル・グリシン緩衝液（ｐＨ７．５）
に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で
３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。測定は、３
０℃で行った。１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生
成させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。
中、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡと
略記する。）の存在下、室温で３０日放置後９０％以上
の残存活性を有する。 （７）分子量：約１３万〜２６万（セファクリルＳ−３
００ゲルクロマトグラフィー法による測定において、ｐ
Ｈ６．０で行った場合約１３万。ｐＨ８．０で行った場
合約２６万） なお、活性の測定は、１．７ｍＭの６ＰＧ、２．０ｍＭ
のＮＡＤおよび８．０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣ
ｌ2 ）を含むグリシル・グリシン緩衝液（ｐＨ７．５）
に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で
３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。測定は、３
０℃で行った。１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生
成させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００２７】
【実施例】次に、この発明の実施例を示し、さらに具体
的に説明する。実施例１ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２リットルを３リット
ル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で１５
分間オートクレーブ滅菌した後、ロイコノストック・ラ
クティス(Leuconostoc lactis）ＳＨＯ５４株（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３９７１）を接種し、４０℃で１０時間、２
００ｒｐｍで攪拌し、通気しない条件下、４ＮのＮａＯ
ＨでｐＨを６．４に調整しながら１０時間培養した。遠
心分離により菌体を採取して約２０ｇの菌体を得た。得
られた菌体を凍結状態で保存した。
的に説明する。実施例１ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２リットルを３リット
ル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で１５
分間オートクレーブ滅菌した後、ロイコノストック・ラ
クティス(Leuconostoc lactis）ＳＨＯ５４株（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３９７１）を接種し、４０℃で１０時間、２
００ｒｐｍで攪拌し、通気しない条件下、４ＮのＮａＯ
ＨでｐＨを６．４に調整しながら１０時間培養した。遠
心分離により菌体を採取して約２０ｇの菌体を得た。得
られた菌体を凍結状態で保存した。
【００２８】次に、凍結菌体約２０ｇをＥＤＴＡおよび
２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１８０ｍ１に懸濁し、超音波
処理により菌体破砕後、遠心分離により細胞片を除去
し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を得た。この粗酵素液に
蛋白質１００ｍｇ当たり１％の硫酸プロタミン溶液１．
０ｍｌを加え、充分攪拌した後、生じた沈澱を遠心分離
で除去した。この上清を硫酸アンモニウムで塩析処理し
た。固形硫酸アンモニウムを４５％飽和まで加え、生じ
た沈澱を除去した後、上清に７５％飽和となるまで固形
硫酸アンモニウムを加え生じた沈澱を２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ついで２０倍量の２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファクリ
ルＳ−２００ゲルカラム（ファルマシア社製）に通じ、
６ＰＧＤＨ活性がみられた画分を集めた後、予め２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したプロシオン
ブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシオンブルーＨ−ＢＲＤ
はＩＣＩ社より購入）に通じ、１００ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ６．８）で溶出した。続いて、ファルマシア社
製ＦＰＬＣシステム（Ｐ５００ポンプ２台、ＧＰ２５０
コントローラー、ＵＶ−１検出器）により、予め２０ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したモ
ノＱ−セファロースカラム（ファルマシア社製）に通
じ、ＫＣｌを緩衝液に加えた溶液で溶出せしめると、Ｋ
Ｃｌ濃度０．４〜０．４５Ｍの近くで６ＰＧＤＨ活性画
分を得た。得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得
ることができた。また、活性の収率は約７０％で、酵素
１ｍｇ当たり約１０１単位の比活性を示し、その精製度
は粗酵素液を１とすると約５５倍であった。実施例２ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間オートクレーブ滅菌した後、ロイコノストック
・ラクティス(Leuconostoc lactis）ＳＨＯ５４株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３９７１）を接種し、４０℃で１０時
間、２００ｒｐｍで攪拌し、通気しない条件下、４Ｎの
ＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら培養した。遠心
分離により菌体を採取して約１８０ｇの菌体を得た。得
られた菌体を凍結状態で保存した。
２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１８０ｍ１に懸濁し、超音波
処理により菌体破砕後、遠心分離により細胞片を除去
し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を得た。この粗酵素液に
蛋白質１００ｍｇ当たり１％の硫酸プロタミン溶液１．
０ｍｌを加え、充分攪拌した後、生じた沈澱を遠心分離
で除去した。この上清を硫酸アンモニウムで塩析処理し
た。固形硫酸アンモニウムを４５％飽和まで加え、生じ
た沈澱を除去した後、上清に７５％飽和となるまで固形
硫酸アンモニウムを加え生じた沈澱を２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ついで２０倍量の２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファクリ
ルＳ−２００ゲルカラム（ファルマシア社製）に通じ、
６ＰＧＤＨ活性がみられた画分を集めた後、予め２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したプロシオン
ブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシオンブルーＨ−ＢＲＤ
はＩＣＩ社より購入）に通じ、１００ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ６．８）で溶出した。続いて、ファルマシア社
製ＦＰＬＣシステム（Ｐ５００ポンプ２台、ＧＰ２５０
コントローラー、ＵＶ−１検出器）により、予め２０ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したモ
ノＱ−セファロースカラム（ファルマシア社製）に通
じ、ＫＣｌを緩衝液に加えた溶液で溶出せしめると、Ｋ
Ｃｌ濃度０．４〜０．４５Ｍの近くで６ＰＧＤＨ活性画
分を得た。得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得
ることができた。また、活性の収率は約７０％で、酵素
１ｍｇ当たり約１０１単位の比活性を示し、その精製度
は粗酵素液を１とすると約５５倍であった。実施例２ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間オートクレーブ滅菌した後、ロイコノストック
・ラクティス(Leuconostoc lactis）ＳＨＯ５４株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３９７１）を接種し、４０℃で１０時
間、２００ｒｐｍで攪拌し、通気しない条件下、４Ｎの
ＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら培養した。遠心
分離により菌体を採取して約１８０ｇの菌体を得た。得
られた菌体を凍結状態で保存した。
【００２９】次に、凍結菌体約１００ｇをＥＤＴＡおよ
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１リットルに懸濁し、これ
にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％、リゾチーム
を０．２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅＩを０．２ｍｇ／ｍｌ
になるように添加し、２時間室温で攪拌後、遠心分離に
より細胞片を除去し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を得
た。
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１リットルに懸濁し、これ
にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％、リゾチーム
を０．２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅＩを０．２ｍｇ／ｍｌ
になるように添加し、２時間室温で攪拌後、遠心分離に
より細胞片を除去し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を得
た。
【００３０】この粗酵素液を酢酸を加えｐＨ５．８に調
整し、予め２０ｍＭリン酸同緩衝液（ｐＨ５．７５）で
平衡化したプロシオンブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシ
オンブルーＨ−ＢＲＤはＩＣＩ社より購入）に通じ、１
００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。濃
縮後、予め２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（ファル
マシア社製）に通じ、ＫＣｌを平衡液に加えた溶液で溶
出せしめると、ＫＣｌ濃度０．４０〜０．４５Ｍの近く
に活性画分が溶出した。この溶出画分を濃縮後、硫酸ア
ンモニウムを０．５Ｍになるように加え、予め１Ｍの硫
酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．
５）で平衡化されたオクチルセファロースカラムＣＬ−
４Ｂ（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液で溶出し
た。活性画分を集めて濃縮後、脱塩した。このようにし
て得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることが
できた。また、活性の収率は約５５％で、酵素１ｍｇ当
たり約１３０単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素
液を１とすると約２５倍であった。
整し、予め２０ｍＭリン酸同緩衝液（ｐＨ５．７５）で
平衡化したプロシオンブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシ
オンブルーＨ−ＢＲＤはＩＣＩ社より購入）に通じ、１
００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。濃
縮後、予め２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（ファル
マシア社製）に通じ、ＫＣｌを平衡液に加えた溶液で溶
出せしめると、ＫＣｌ濃度０．４０〜０．４５Ｍの近く
に活性画分が溶出した。この溶出画分を濃縮後、硫酸ア
ンモニウムを０．５Ｍになるように加え、予め１Ｍの硫
酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．
５）で平衡化されたオクチルセファロースカラムＣＬ−
４Ｂ（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液で溶出し
た。活性画分を集めて濃縮後、脱塩した。このようにし
て得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることが
できた。また、活性の収率は約５５％で、酵素１ｍｇ当
たり約１３０単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素
液を１とすると約２５倍であった。
【００３１】実施例１及び実施例２で得られた６ＰＧＤ
Ｈは、セファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）ゲ
ルクロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、
測定をｐＨ６．０で行った場合約１３万であった。ま
た、同様にｐＨ８．０で行った場合は約２６万であっ
た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において
は分子量約３．３万の位置に単一のバンドを与えた。実施例３ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間オートクレーブ滅菌した後、ロイコノストック
・ラクティス(Leuconostoc lactis）ＳＨＯ４７株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３９７０）を接種し 、４０℃で７時
間、１００ｒｐｍで攪拌し、通気しない条件下、４Ｎの
ＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら培養した。遠心
分離により菌体を採取して約１６０ｇの菌体を得た。得
られた菌体を凍結状態で保存した。
Ｈは、セファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）ゲ
ルクロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、
測定をｐＨ６．０で行った場合約１３万であった。ま
た、同様にｐＨ８．０で行った場合は約２６万であっ
た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において
は分子量約３．３万の位置に単一のバンドを与えた。実施例３ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間オートクレーブ滅菌した後、ロイコノストック
・ラクティス(Leuconostoc lactis）ＳＨＯ４７株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３９７０）を接種し 、４０℃で７時
間、１００ｒｐｍで攪拌し、通気しない条件下、４Ｎの
ＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら培養した。遠心
分離により菌体を採取して約１６０ｇの菌体を得た。得
られた菌体を凍結状態で保存した。
【００３２】次に、凍結菌体約１００ｇをＥＤＴＡおよ
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１リットルに懸濁し、これ
にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％、リゾチーム
を０．２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅＩを０．２ｍｇ／ｍｌ
になるように添加し、２時間室温で攪拌後、遠心分離に
より細胞片を除去し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を得、
菌体中の６ＰＧＤＨ含量を測定したところ１８万Ｕ／ｋ
ｇ湿菌体を示した。
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１リットルに懸濁し、これ
にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％、リゾチーム
を０．２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅＩを０．２ｍｇ／ｍｌ
になるように添加し、２時間室温で攪拌後、遠心分離に
より細胞片を除去し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を得、
菌体中の６ＰＧＤＨ含量を測定したところ１８万Ｕ／ｋ
ｇ湿菌体を示した。
【００３３】この粗酵素液を酢酸を加えｐＨ５．８に調
整し、予め２０ｍＭリン酸同緩衝液（ｐＨ５．７５）で
平衡化したプロシオンブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシ
オンブルーＨ−ＢＲＤはＩＣＩ社より購入）に通じ、１
００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。濃
縮後、予め２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（ファル
マシア社製）に通じ、ＫＣｌを平衡液に加えた溶液で溶
出せしめると、ＫＣｌ濃度０．４０〜０．４５Ｍの近く
に活性画分が溶出した。この溶出画分を濃縮後、硫酸ア
ンモニウムを０．５Ｍになるように加え、予め１Ｍの硫
酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．
５）で平衡化されたオクチルセファロースカラムＣＬ−
４Ｂ（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液で溶出し
た。活性画分を集めて濃縮後、脱塩した。このようにし
て得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることが
できた。また、活性の収率は約５５％で、酵素１ｍｇ当
たり約１１０単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素
液を１とすると約３３倍であった。
整し、予め２０ｍＭリン酸同緩衝液（ｐＨ５．７５）で
平衡化したプロシオンブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシ
オンブルーＨ−ＢＲＤはＩＣＩ社より購入）に通じ、１
００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。濃
縮後、予め２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（ファル
マシア社製）に通じ、ＫＣｌを平衡液に加えた溶液で溶
出せしめると、ＫＣｌ濃度０．４０〜０．４５Ｍの近く
に活性画分が溶出した。この溶出画分を濃縮後、硫酸ア
ンモニウムを０．５Ｍになるように加え、予め１Ｍの硫
酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．
５）で平衡化されたオクチルセファロースカラムＣＬ−
４Ｂ（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液で溶出し
た。活性画分を集めて濃縮後、脱塩した。このようにし
て得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることが
できた。また、活性の収率は約５５％で、酵素１ｍｇ当
たり約１１０単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素
液を１とすると約３３倍であった。
【００３４】このＳＨＯ４７株の培養菌体から得られた
６ＰＧＤＨは、セファクリルＳ−３００（ファルマシア
社製）ゲルクロマトグラフィーにより分子量を測定した
ところ、ＳＨＯ５４株と同様、測定をｐＨ６．０で行っ
た場合約１３万、ｐＨ８．０で行った場合は約２６万で
あった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動においてもＳＨＯ５４株同様、分子量約３．３万の位
置に単一のバンドを与えた。至適ｐＨもＳＨＯ５４株の
６ＰＧＤＨと同様にｐＨ６．５〜８．５（温度３０℃）
付近であった。実施例４ ＳＨＯ５４株から精製した６ＰＧＤＨの補酵素の特異性
を調べた。１．７ｍＭの６ＰＧ、２．０ｍＭのＮＡＤま
たはＮＡＤＰ、および８．０ｍＭの塩化マグネシウム
（ＭｇＣｌ2 ）を含むグリシル・グリシン緩衝液（ｐＨ
７．５）１．０ｍｌをセルに入れ、３０℃で約３分間保
温した後、酵素溶液０．０２ｍｌを加え、緩やかに混和
した後、分光光度計で３４０ｎｍにおける吸光度変化を
測定した。１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成さ
せる酵素量を１単位（Ｕ）とした。ＮＡＤ、ＮＡＤＰを
補酵素として用いた場合の比活性を算出し、比較に用い
た。比活性は蛋白質１ｍｇ当たりの活性値とした。結果
を表５に示した。
６ＰＧＤＨは、セファクリルＳ−３００（ファルマシア
社製）ゲルクロマトグラフィーにより分子量を測定した
ところ、ＳＨＯ５４株と同様、測定をｐＨ６．０で行っ
た場合約１３万、ｐＨ８．０で行った場合は約２６万で
あった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動においてもＳＨＯ５４株同様、分子量約３．３万の位
置に単一のバンドを与えた。至適ｐＨもＳＨＯ５４株の
６ＰＧＤＨと同様にｐＨ６．５〜８．５（温度３０℃）
付近であった。実施例４ ＳＨＯ５４株から精製した６ＰＧＤＨの補酵素の特異性
を調べた。１．７ｍＭの６ＰＧ、２．０ｍＭのＮＡＤま
たはＮＡＤＰ、および８．０ｍＭの塩化マグネシウム
（ＭｇＣｌ2 ）を含むグリシル・グリシン緩衝液（ｐＨ
７．５）１．０ｍｌをセルに入れ、３０℃で約３分間保
温した後、酵素溶液０．０２ｍｌを加え、緩やかに混和
した後、分光光度計で３４０ｎｍにおける吸光度変化を
測定した。１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成さ
せる酵素量を１単位（Ｕ）とした。ＮＡＤ、ＮＡＤＰを
補酵素として用いた場合の比活性を算出し、比較に用い
た。比活性は蛋白質１ｍｇ当たりの活性値とした。結果
を表５に示した。
【００３５】
【表５】
【００３６】ＮＡＤを補酵素とした時の活性値を１００
とすると、ＮＡＤＰを用いた場合は０．４であった。実施例５ ＳＨＯ５４株から精製した６ＰＧＤＨの保存安定性を調
べた。６ＰＧＤＨを、２ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ
のＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈することにより、
１０Ｕ／ｍｌの濃度の６ＰＧＤＨ液を調製した。この酵
素液を０．５ｍｌずつ１．５ｍｌ容のエッペンドルフチ
ューブに分注し、３０℃の恒温槽で保存した。適当な時
間保存した後の残存酵素活性を測定し、保存開始時の酵
素活性を１００％として、各保存時間での残存活性をプ
ロットした安定性曲線を図１に示した。
とすると、ＮＡＤＰを用いた場合は０．４であった。実施例５ ＳＨＯ５４株から精製した６ＰＧＤＨの保存安定性を調
べた。６ＰＧＤＨを、２ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ
のＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈することにより、
１０Ｕ／ｍｌの濃度の６ＰＧＤＨ液を調製した。この酵
素液を０．５ｍｌずつ１．５ｍｌ容のエッペンドルフチ
ューブに分注し、３０℃の恒温槽で保存した。適当な時
間保存した後の残存酵素活性を測定し、保存開始時の酵
素活性を１００％として、各保存時間での残存活性をプ
ロットした安定性曲線を図１に示した。
【００３７】
【発明の効果】この発明の６ＰＧＤＨは、補酵素として
ＮＡＤのみ特異的に作用するため、紫外部での測定のみ
ならず、ジアホラーゼやＰＭＳと共役させることによ
り、酵素反応により生成したＮＡＤＨを基質としてＮＢ
ＴやＤＣＰＩＰなどを還元発色させ可視部での測定を可
能とさせる。また、ジアホラーゼはＮＡＤＰＨに対する
特異性が低いため、従来のＮＡＤＰ特異的な６ＰＧＤＨ
を用いた場合、可視部での測定には多量のジアホラーゼ
を使用しなければならないという問題があったが、この
発明の酵素により可視部での測定が容易となる。また従
来知られているＮＡＤに特異的といわれている６ＰＧＤ
Ｈが極めて不安定（メチロバチルス・フラゲラタム（Me
thyrobacillus flagrllatum ）ＫＴ１株由来のＮＡＤ
特異的といわれている６ＰＧＤＨの場合、４℃で３日間
保存しただけで９０％失活）で、実用的でなかったのに
対し、この発明の６ＰＧＤＨは室温で３０日放置後も９
０％以上の残存活性を有する程安定性に優れているた
め、各種測定用試薬への利用が可能となる。
ＮＡＤのみ特異的に作用するため、紫外部での測定のみ
ならず、ジアホラーゼやＰＭＳと共役させることによ
り、酵素反応により生成したＮＡＤＨを基質としてＮＢ
ＴやＤＣＰＩＰなどを還元発色させ可視部での測定を可
能とさせる。また、ジアホラーゼはＮＡＤＰＨに対する
特異性が低いため、従来のＮＡＤＰ特異的な６ＰＧＤＨ
を用いた場合、可視部での測定には多量のジアホラーゼ
を使用しなければならないという問題があったが、この
発明の酵素により可視部での測定が容易となる。また従
来知られているＮＡＤに特異的といわれている６ＰＧＤ
Ｈが極めて不安定（メチロバチルス・フラゲラタム（Me
thyrobacillus flagrllatum ）ＫＴ１株由来のＮＡＤ
特異的といわれている６ＰＧＤＨの場合、４℃で３日間
保存しただけで９０％失活）で、実用的でなかったのに
対し、この発明の６ＰＧＤＨは室温で３０日放置後も９
０％以上の残存活性を有する程安定性に優れているた
め、各種測定用試薬への利用が可能となる。
【図１】この発明の６ＰＧＤＨの保存安定性試験におけ
る安定性曲線を示した図である。
る安定性曲線を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近藤 仁司 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ 株式会社中央研究所内 (72)発明者 小原 仁実 京都府京都市中京区西ノ京桑原町１ 株 式会社島津製作所三条工場内 (72)発明者 矢幡 雅人 京都府京都市中京区西ノ京桑原町１ 株 式会社島津製作所三条工場内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 以下の理化学的性質を有する６ホスホグ
ルコン酸脱水素酵素。 作 用 次式の反応を触媒し、補酵素としてニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチドに特異的に作用する。 【化１】 安定性：５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）
中、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸存在下、室温で１
カ月放置後、９０％以上の残存活性を有する。 分子量：約１３万〜２６万（セファクリルＳ−３０
０ゲルクロマトグラフィー法） 基質特異性：６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸に特異性
を示し、補酵素としてはニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチドに特異的に作用し、ニコチンアミド・アデ
ニン・ジヌクレオチドを補酵素としたときの活性値を１
００とすると、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チドリン酸を用いた場合１以下である。 至適ｐＨ範囲：６．５〜８．５（温度３０℃） 安定ｐＨ：５〜９ 作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲（Ｍ
ＥＳ緩衝液ｐＨ７．２） - 【請求項２】 請求項１記載の６ホスホグルコン酸脱水
素酵素の生産能を有するロイコノストック・ラクティス
ＳＨＯ４７（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）またはロイコ
ノストック・ラクティスＳＨＯ５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１
３９７１）を培養し、培養物から請求項１記載の６ホス
ホグルコン酸脱水素酵素を採取することを特徴とする６
ホスホグルコン酸脱水素酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5543895A JP3150868B2 (ja) | 1995-03-15 | 1995-03-15 | ６ホスホグルコン酸脱水素酵素とその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5543895A JP3150868B2 (ja) | 1995-03-15 | 1995-03-15 | ６ホスホグルコン酸脱水素酵素とその製造法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05329332 Division |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07265071A JPH07265071A (ja) | 1995-10-17 |
| JP3150868B2 true JP3150868B2 (ja) | 2001-03-26 |
Family
ID=12998607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5543895A Expired - Lifetime JP3150868B2 (ja) | 1995-03-15 | 1995-03-15 | ６ホスホグルコン酸脱水素酵素とその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3150868B2 (ja) |
-
1995
- 1995-03-15 JP JP5543895A patent/JP3150868B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07265071A (ja) | 1995-10-17 |
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