JP3532937B2 - 耐熱性の高い新規ｎａｄｐｈ依存性ディアフォラ−ゼおよびその製造法 - Google Patents
耐熱性の高い新規ｎａｄｐｈ依存性ディアフォラ−ゼおよびその製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、耐熱性が高く、還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下NA
DPHと略す）に特異的に作用する、NADPH依存性新規ディ
アフォラ−ゼ、該酵素を多量に生産する新菌株、該菌株
を使用する当該酵素の製造法、および該酵素を使用した
代謝成分あるいは酵素力価の測定方法に関するものであ
る。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下NA
DPHと略す）に特異的に作用する、NADPH依存性新規ディ
アフォラ−ゼ、該酵素を多量に生産する新菌株、該菌株
を使用する当該酵素の製造法、および該酵素を使用した
代謝成分あるいは酵素力価の測定方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】ディアフォラ−ゼは、正式には、NAD(P)
H:(アクセプタ−)オキシドレダクタ−ゼと称され、電子
受容体の存在下、NAD(P)Hの酸化を触媒する酵素であ
る。その他、NAD(P)Hデヒドロゲナ−ゼ、旧黄色酵素
等、種々の別称で呼ばれることもある（以下 "NAD(P)H"
は、NADH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド)、あるいはNADPH(還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸)を、表わすものとする）。ディア
フォラ−ゼは、動物、植物、酵母、ラン藻、さらに嫌気
性菌、好熱菌、古細菌等を含む、生物一般に広く見出さ
れている酵素である。その電子受容体としては、2,6-ジ
クロロフェノ−ルインドフェノ−ル、フェリシアナイ
ド、メナジオン、ニトロブル−テトラゾリウム等のテト
ラゾリウム塩等が挙げられるが、ディアフォラ−ゼの作
用により、NAD(P)Hが酸化される際、通常これらの電子
受容体は、可視光域の吸収が変化する。この性質を利用
して、各種NAD(P)Hの関与する反応に基づく臨床検査、
あるいは研究用各種分析キット、さらにはバイオセンサ
−の検出部への応用が図られ、需要が増大している。
H:(アクセプタ−)オキシドレダクタ−ゼと称され、電子
受容体の存在下、NAD(P)Hの酸化を触媒する酵素であ
る。その他、NAD(P)Hデヒドロゲナ−ゼ、旧黄色酵素
等、種々の別称で呼ばれることもある（以下 "NAD(P)H"
は、NADH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド)、あるいはNADPH(還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸)を、表わすものとする）。ディア
フォラ−ゼは、動物、植物、酵母、ラン藻、さらに嫌気
性菌、好熱菌、古細菌等を含む、生物一般に広く見出さ
れている酵素である。その電子受容体としては、2,6-ジ
クロロフェノ−ルインドフェノ−ル、フェリシアナイ
ド、メナジオン、ニトロブル−テトラゾリウム等のテト
ラゾリウム塩等が挙げられるが、ディアフォラ−ゼの作
用により、NAD(P)Hが酸化される際、通常これらの電子
受容体は、可視光域の吸収が変化する。この性質を利用
して、各種NAD(P)Hの関与する反応に基づく臨床検査、
あるいは研究用各種分析キット、さらにはバイオセンサ
−の検出部への応用が図られ、需要が増大している。
【０００３】
【発明が解決しようとする問題点】生体内の標準的な高
エネルギ−物質である、アデノシン 5'-トリヌクレオチ
ド(ATP)を定量するには、ホタルのルシフェラ−ゼを用
いる方法が知られており、鋭敏かつ特異的であって、適
当な方法であるが、基質として使用するルシフェリンが
高価であるため、汎用性が乏しい。また、ATPないしそ
れを利用するキナ−ゼ、あるいは生成物であるリン酸化
物の定量を、各種酵素の組み合わせで、簡便に測定しよ
うとする場合、最終的にNADHではなく、NADPHが生成さ
れる系が多く利用されている。さらに、上記のATP関連
の測定系以外にも、生体内にはNADPHを要求する酵素系
が多く存在する。かように、ディアフォラ−ゼは、NAD
(P)Hの関与する反応、あるいは反応物質の測定に有用で
あるが、特開昭60-78578, 特開昭60-156381, および特
開平3-151899等に見られる如く、その報告のほとんど
は、NADH依存性ディアフォラ−ゼに関するものであっ
て、NADPH依存性ディアフォラ−ゼに関するものは非常
に少ない。 なかでも、ディアフォラ−ゼの主な用途で
ある、ドライケミストリ−やバイオセンサ−に使用する
場合には、かなりの耐熱性が必要とされているのである
が、これらの条件を満たす、優れたNADPH依存性ディア
フォラ−ゼは、まだ見出されておらず、その出現が強く
待たれていた。
エネルギ−物質である、アデノシン 5'-トリヌクレオチ
ド(ATP)を定量するには、ホタルのルシフェラ−ゼを用
いる方法が知られており、鋭敏かつ特異的であって、適
当な方法であるが、基質として使用するルシフェリンが
高価であるため、汎用性が乏しい。また、ATPないしそ
れを利用するキナ−ゼ、あるいは生成物であるリン酸化
物の定量を、各種酵素の組み合わせで、簡便に測定しよ
うとする場合、最終的にNADHではなく、NADPHが生成さ
れる系が多く利用されている。さらに、上記のATP関連
の測定系以外にも、生体内にはNADPHを要求する酵素系
が多く存在する。かように、ディアフォラ−ゼは、NAD
(P)Hの関与する反応、あるいは反応物質の測定に有用で
あるが、特開昭60-78578, 特開昭60-156381, および特
開平3-151899等に見られる如く、その報告のほとんど
は、NADH依存性ディアフォラ−ゼに関するものであっ
て、NADPH依存性ディアフォラ−ゼに関するものは非常
に少ない。 なかでも、ディアフォラ−ゼの主な用途で
ある、ドライケミストリ−やバイオセンサ−に使用する
場合には、かなりの耐熱性が必要とされているのである
が、これらの条件を満たす、優れたNADPH依存性ディア
フォラ−ゼは、まだ見出されておらず、その出現が強く
待たれていた。
【０００４】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、NADPH
に特異的に作用し、かつ耐熱性の高いディアフォラ−ゼ
生産菌を、広く自然界より分離すべく鋭意検討した結
果、福島県会津若松市の土壌より優秀な一菌株を発見
し、1764a株を得た。この菌株について、培地並びに培
養条件を検討した結果、3日間の培養で、著量のNADPH依
存性ディアフォラ−ゼを蓄積すること、さらに培養時間
を制御することにより、菌体あるいは培養濾液のどちら
にでも、酵素を蓄積せしめ得る特徴を有することを見出
した。また、培養液の状態で100℃、3分間加熱しても失
活せず、優れた耐熱性を有することを認め、本発明を完
成した。すなわち本発明は、ここに得られた極めて優れ
た耐熱性を示す、新規なNADPH依存性ディアフォラ−ゼ
とその生産菌株、該菌株を使用するNADPH依存性ディア
フォラ−ゼの製造方法、および該酵素を使用した代謝成
分ないし酵素力価の測定方法を、提供するものである。
に特異的に作用し、かつ耐熱性の高いディアフォラ−ゼ
生産菌を、広く自然界より分離すべく鋭意検討した結
果、福島県会津若松市の土壌より優秀な一菌株を発見
し、1764a株を得た。この菌株について、培地並びに培
養条件を検討した結果、3日間の培養で、著量のNADPH依
存性ディアフォラ−ゼを蓄積すること、さらに培養時間
を制御することにより、菌体あるいは培養濾液のどちら
にでも、酵素を蓄積せしめ得る特徴を有することを見出
した。また、培養液の状態で100℃、3分間加熱しても失
活せず、優れた耐熱性を有することを認め、本発明を完
成した。すなわち本発明は、ここに得られた極めて優れ
た耐熱性を示す、新規なNADPH依存性ディアフォラ−ゼ
とその生産菌株、該菌株を使用するNADPH依存性ディア
フォラ−ゼの製造方法、および該酵素を使用した代謝成
分ないし酵素力価の測定方法を、提供するものである。
【０００５】本発明において使用する、耐熱性NADPH依
存性ディアフォラ−ゼ生産菌1764a株は、以下の菌学的
性質を示す。
存性ディアフォラ−ゼ生産菌1764a株は、以下の菌学的
性質を示す。
【０００６】1) 形態的性質
菌 形： 桿菌。
大 き さ： 1.0〜1.2 × 5.0〜7.0 μm
グラム 染色： 陽性。
運 動 性： 周鞭毛により運動。
培 養 形 態： 肉汁寒天平板に生育。表面は粗い。色
は半透明で白色。 胞 子： 確認されない。
は半透明で白色。 胞 子： 確認されない。
【０００７】2) 生理学的性質
生 育 温 度： 25 〜 40℃
肉汁培地での 生育： 陽性。サフ゛ロー
培地での生育： 陽性。
酸 素 要 求 性： 微好気性または通性嫌気性。
食 塩 耐 性： 5%まで生育。
澱 粉 分 解： 陽性。
カ ゼ イ ン 分 解： 陽性。
チ ロ シ ン 分 解： 陽性。フェニルアラニン
の脱アミノ化： 陰性。
硝 酸 還 元 能： 陽性。
硝 酸 呼 吸 能： 陽性。
Ｖ − Ｐ テ ス ト： 陽性または擬陽性。
Ｖ-Ｐ培養液のｐＨ： 4.63
カ タ ラ − ゼ： 陽性。シト
クロム オキシ タ゛ ーセ゛： 陽性。
クエン酸 の 資 化： 陰性。
Ｏ - Ｆ テ ス ト： 発酵的。
糖よりの 酸 生 成：
陽 性： グルコ−ス。
陰 性： L-アラビノ−ス、キシロ−ス、マンニト−
ル。
ル。
【０００８】以上の性質に基づき、「バ−ジ−ズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジ− 第2巻」
(Bergy's Manual of Systematic Bacteriology Vol.2)
によって、周鞭毛を有する無胞子性のグラム陽性桿菌を
検索したが、本株に該当する属並びに種は、全く見あた
らなかった。また、本菌のグラム陽性は、染色性が判然
としており疑問の余地はなく、その他の項目についても
詳細に検討した結果、胞子着生能を欠損したバチルス(B
acillus)属以外には、該当する属はないと判断されたの
で、バチルス・エスピ− 1764a株（Bacillus sp. 1764
a）と命名した。また、本菌株は、工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託され、その寄託番号は、FERM P-1
3371号である。
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジ− 第2巻」
(Bergy's Manual of Systematic Bacteriology Vol.2)
によって、周鞭毛を有する無胞子性のグラム陽性桿菌を
検索したが、本株に該当する属並びに種は、全く見あた
らなかった。また、本菌のグラム陽性は、染色性が判然
としており疑問の余地はなく、その他の項目についても
詳細に検討した結果、胞子着生能を欠損したバチルス(B
acillus)属以外には、該当する属はないと判断されたの
で、バチルス・エスピ− 1764a株（Bacillus sp. 1764
a）と命名した。また、本菌株は、工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託され、その寄託番号は、FERM P-1
3371号である。
【０００８】本発明に使用する本酵素生産株は、上記17
64a株はもとより、その人工変異株あるいは自然変異株
も、本酵素を生産する能力を有するものであれば、使用
が可能である。上記1764a株の人工変異株は、例えば紫
外線照射、コバルト60照射、化学変異誘発剤により容易
に得ることができる。また、遺伝子工学的な手法によ
り、本酵素をクロ−ニングすることにより、他の微生物
に、本酵素の生産能力を導入することも可能である。こ
れらの菌株の培養方法としては、通常の細菌類の培養方
法が、利用可能であるが、液体培地を用い、振盪培養あ
るいは攪拌培養による方法が、好適である。酵素生産用
培地の炭素源としては、ふすま、大豆粕、綿実、澱粉、
デキストリン、白糠、コ−ンミ−ル等の多糖類、ラクト
−ス、シュ−クロ−ス等の二糖類、グルコ−ス、フラク
ト−ス、マンノ−ス等の単糖類などの使用が可能であ
り、またこれらを組み合わせて使用することも可能であ
る。窒素源としては、コ−ンスティ−プリカ−(CSL)、
大豆粕、きなこ、グルテン、魚粉、乾燥酵母、麦芽エキ
ス、カゼイン、肉エキス、ペプトン、無機アンモニウム
塩、硝酸塩等を使用することができる。また、KH2PO4,
MgSO4, FeSO4, MnSO4, CaCl2, CoCl2, KCl, NaClなどの
無機塩類や、ビタミン等の有機微量要素、さらにはツイ
−ン40, ツイ−ン80, スパン80等の界面活性剤を、必要
に応じて加えることができる。また、培養の初発pHは、
6.5〜8.5までの広い範囲で可能である。本酵素の生産
は、上記の栄養源等を使用した培地で、20〜45℃、好ま
しくは30〜37℃付近で行うことができ、24〜72時間の培
養で、充分なディアフォラ−ゼ活性が得られる。なお、
ディアフォラ−ゼ活性は、30時間程度で最大に達する
が、培養24時間までは活性の大半は菌体内に存在する。
しかし、次第に培養濾液中に移行し、64時間では、大半
が培養濾液中に存在するようになるという、培養性状の
特徴を有する。回収に当たっては、この性質を利用し
て、菌体あるいは培養濾液のどちらからでも、酵素を得
ることができるので、都合の良い方を選択することが可
能である。
64a株はもとより、その人工変異株あるいは自然変異株
も、本酵素を生産する能力を有するものであれば、使用
が可能である。上記1764a株の人工変異株は、例えば紫
外線照射、コバルト60照射、化学変異誘発剤により容易
に得ることができる。また、遺伝子工学的な手法によ
り、本酵素をクロ−ニングすることにより、他の微生物
に、本酵素の生産能力を導入することも可能である。こ
れらの菌株の培養方法としては、通常の細菌類の培養方
法が、利用可能であるが、液体培地を用い、振盪培養あ
るいは攪拌培養による方法が、好適である。酵素生産用
培地の炭素源としては、ふすま、大豆粕、綿実、澱粉、
デキストリン、白糠、コ−ンミ−ル等の多糖類、ラクト
−ス、シュ−クロ−ス等の二糖類、グルコ−ス、フラク
ト−ス、マンノ−ス等の単糖類などの使用が可能であ
り、またこれらを組み合わせて使用することも可能であ
る。窒素源としては、コ−ンスティ−プリカ−(CSL)、
大豆粕、きなこ、グルテン、魚粉、乾燥酵母、麦芽エキ
ス、カゼイン、肉エキス、ペプトン、無機アンモニウム
塩、硝酸塩等を使用することができる。また、KH2PO4,
MgSO4, FeSO4, MnSO4, CaCl2, CoCl2, KCl, NaClなどの
無機塩類や、ビタミン等の有機微量要素、さらにはツイ
−ン40, ツイ−ン80, スパン80等の界面活性剤を、必要
に応じて加えることができる。また、培養の初発pHは、
6.5〜8.5までの広い範囲で可能である。本酵素の生産
は、上記の栄養源等を使用した培地で、20〜45℃、好ま
しくは30〜37℃付近で行うことができ、24〜72時間の培
養で、充分なディアフォラ−ゼ活性が得られる。なお、
ディアフォラ−ゼ活性は、30時間程度で最大に達する
が、培養24時間までは活性の大半は菌体内に存在する。
しかし、次第に培養濾液中に移行し、64時間では、大半
が培養濾液中に存在するようになるという、培養性状の
特徴を有する。回収に当たっては、この性質を利用し
て、菌体あるいは培養濾液のどちらからでも、酵素を得
ることができるので、都合の良い方を選択することが可
能である。
【０００９】酵素液として使用するには、培養液、菌体
またはこれらの抽出液を、直接用いることも可能である
が、培養濾液、菌体抽出物またはこれらから硫安、食塩
等による塩析、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニ
ティクロマトグラフィ、等電点沈澱、溶媒分画、吸着ク
ロマトグラフィ等の精製法を、単独もしくは組合せて得
られる部分精製標品、または精製標品を用いることが望
ましい。
またはこれらの抽出液を、直接用いることも可能である
が、培養濾液、菌体抽出物またはこれらから硫安、食塩
等による塩析、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニ
ティクロマトグラフィ、等電点沈澱、溶媒分画、吸着ク
ロマトグラフィ等の精製法を、単独もしくは組合せて得
られる部分精製標品、または精製標品を用いることが望
ましい。
【００１０】なお、当該NADPH依存性ディアフォラ−ゼ
の活性は、以下の方法で測定した。即ち、１mM NADPH、
5μM フラビンアデニンジヌクレオチド、0.6mM MTT[3-
(4,5-シ゛メチル-2-チアソ゛リル)-2,5-シ゛フェニルテトラソ゛リウム フ゛ロミト゛]、
0.1% ウシ血清アルブミン、0.1M トリス塩酸緩衝液(pH
8.0)を含む基質液1mlを、37℃で1分加熱後、酵素液 0.
1mlを加え、37℃にて10分間反応させる。0.1N 塩酸を2m
l加えて反応を停止させ、550nmの吸光度を測定する。酵
素力価は、1分間に1マイクロモルのNADPHを酸化する酵素量を1
単位と定義した。
の活性は、以下の方法で測定した。即ち、１mM NADPH、
5μM フラビンアデニンジヌクレオチド、0.6mM MTT[3-
(4,5-シ゛メチル-2-チアソ゛リル)-2,5-シ゛フェニルテトラソ゛リウム フ゛ロミト゛]、
0.1% ウシ血清アルブミン、0.1M トリス塩酸緩衝液(pH
8.0)を含む基質液1mlを、37℃で1分加熱後、酵素液 0.
1mlを加え、37℃にて10分間反応させる。0.1N 塩酸を2m
l加えて反応を停止させ、550nmの吸光度を測定する。酵
素力価は、1分間に1マイクロモルのNADPHを酸化する酵素量を1
単位と定義した。
【００１１】次に、得られた精製酵素の諸性質は、以下
に示すとおりである。 (1) 作用pHおよび安定性 37℃における作用pHは、図１に示すように、8.0近傍が
至適であった。また、80℃に1時間保持した際の安定性
は、図２のとおり、pH5.5以上で安定であった。なお緩
衝液には、酢酸緩衝液、燐酸緩衝液、3-(N-モルフォリノ)フ゜ロハ
゜ンスルフォン酸(MOPS)緩衝液、N-トリス(ヒト゛ロキシメチル)メチル-3-アミノフ゜
ロハ゜ンスルフォン酸(TAPS)緩衝液、トリス緩衝液、ク゛リシン緩衝液、
あるいは2-(シクロヘキシルアミノ)エタンスルフォン酸(CHES)を使用した。 (2) 基質特異性 基質濃度を 1mMとしたときの相対活性の比較を、表１に
示した。本酵素が、NADPHのみに特異的に作用すること
が示されている。
に示すとおりである。 (1) 作用pHおよび安定性 37℃における作用pHは、図１に示すように、8.0近傍が
至適であった。また、80℃に1時間保持した際の安定性
は、図２のとおり、pH5.5以上で安定であった。なお緩
衝液には、酢酸緩衝液、燐酸緩衝液、3-(N-モルフォリノ)フ゜ロハ
゜ンスルフォン酸(MOPS)緩衝液、N-トリス(ヒト゛ロキシメチル)メチル-3-アミノフ゜
ロハ゜ンスルフォン酸(TAPS)緩衝液、トリス緩衝液、ク゛リシン緩衝液、
あるいは2-(シクロヘキシルアミノ)エタンスルフォン酸(CHES)を使用した。 (2) 基質特異性 基質濃度を 1mMとしたときの相対活性の比較を、表１に
示した。本酵素が、NADPHのみに特異的に作用すること
が示されている。
【００１２】
【表１】
【００１３】次に、各種テトラゾリウム塩を用いて、本
酵素の、電子受容体の選択性を検討した。テトラゾリウ
ム塩としては、3-(4,5-シ゛メチル-2-チアソ゛リル)-2,5-シ゛フェニルテトラ
ソ゛リウム フ゛ロミト゛ (MTT)、ニトロフ゛ル-テトラソ゛リウム (NBT)、および3
-(p-ヨ-ト゛フェニル)-2-(p-ニトロフェニル)-5-フェニルテトラソ゛リウム クロリト゛
(INT)を、それぞれ 0.6mMの濃度で用い、相対活性を、
表２に示した。
酵素の、電子受容体の選択性を検討した。テトラゾリウ
ム塩としては、3-(4,5-シ゛メチル-2-チアソ゛リル)-2,5-シ゛フェニルテトラ
ソ゛リウム フ゛ロミト゛ (MTT)、ニトロフ゛ル-テトラソ゛リウム (NBT)、および3
-(p-ヨ-ト゛フェニル)-2-(p-ニトロフェニル)-5-フェニルテトラソ゛リウム クロリト゛
(INT)を、それぞれ 0.6mMの濃度で用い、相対活性を、
表２に示した。
【００１４】
【表２】
【００１５】(3) 作用温度および安定性
pH8.0, 10分間反応における、作用温度の影響を検討し
たところ、測定した温度範囲(50℃まで)では、直線的に
反応が増加した。また、pH8.0で1時間保持した際の温度
安定域は70℃までであった。次いで、市販通常酵素(旭
化成製)について、同様にして温度安定性を比較し、図
３に対比した。
たところ、測定した温度範囲(50℃まで)では、直線的に
反応が増加した。また、pH8.0で1時間保持した際の温度
安定域は70℃までであった。次いで、市販通常酵素(旭
化成製)について、同様にして温度安定性を比較し、図
３に対比した。
【００１６】
【実施例】本発明を、実施例によりさらに詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００１７】実施例１
バチルス・エスピ− 1764a株の1白金耳を、20mlのブイ
ヨン培地に接種し、30℃で16時間振盪培養を行い、前培
養液を得た。ついで、この前培養液を、100mlの同培地
に、濃度2%となるよう接種し、30℃で2日間振盪培養し
た。培養液を超音波処理後、遠心分離によって残渣を除
去し、上清液を採取した。得られた上清中の、NADPH依
存性ディアフォラ−ゼ活性は、1.5 U/mlであった。
ヨン培地に接種し、30℃で16時間振盪培養を行い、前培
養液を得た。ついで、この前培養液を、100mlの同培地
に、濃度2%となるよう接種し、30℃で2日間振盪培養し
た。培養液を超音波処理後、遠心分離によって残渣を除
去し、上清液を採取した。得られた上清中の、NADPH依
存性ディアフォラ−ゼ活性は、1.5 U/mlであった。
【００１８】実施例２
実施例１と同様にして前培養液を調製し、2.5Lのブイヨ
ン培地を含む、5L容ミニジャ−ファ−メンタ−に、濃度
2%となるよう接種し、30℃, 300rpm, 1VVMで40時間培養
した。培養液を超音波処理後、遠心分離によって残渣を
除去して、上清液を採取した。得られた上清中のNADPH
依存性ディアフォラ−ゼ活性は、2.4 U/mlであった。ま
た培養液を、直接遠心分離して得られた培養濾液中の活
性は、1.8 U/mlであった。
ン培地を含む、5L容ミニジャ−ファ−メンタ−に、濃度
2%となるよう接種し、30℃, 300rpm, 1VVMで40時間培養
した。培養液を超音波処理後、遠心分離によって残渣を
除去して、上清液を採取した。得られた上清中のNADPH
依存性ディアフォラ−ゼ活性は、2.4 U/mlであった。ま
た培養液を、直接遠心分離して得られた培養濾液中の活
性は、1.8 U/mlであった。
【００１９】実施例３
実施例２で得た上清を集め、分画分子量6000の中空糸膜
型限外濾過装置により、約10倍に濃縮・透析した。濃縮
液のNADPH依存性ディアフォラ−ゼ活性は、22.6U/ml、
比活性は5.4 U/mg protein であった。
型限外濾過装置により、約10倍に濃縮・透析した。濃縮
液のNADPH依存性ディアフォラ−ゼ活性は、22.6U/ml、
比活性は5.4 U/mg protein であった。
【００２０】
【発明の効果】本発明により、耐熱性に優れたNADPH依
存性新規ディアフォラ−ゼ、該酵素を多量に生産するバ
チルス属新菌株、および該菌株を使用する当該酵素の製
造法が、提供され、さらに該酵素を使用して、代謝成分
あるいは酵素力価の測定する方法が可能となった。
存性新規ディアフォラ−ゼ、該酵素を多量に生産するバ
チルス属新菌株、および該菌株を使用する当該酵素の製
造法が、提供され、さらに該酵素を使用して、代謝成分
あるいは酵素力価の測定する方法が可能となった。
【図１】 本発明の酵素のpH依存性を示す。縦軸は相対
活性、横軸はpHである。
活性、横軸はpHである。
図中の曲線は、それぞれ１：酢酸緩衝液、２：燐酸緩衝
液、３：MOPS緩衝液、４：TAPS緩衝液、５：トリス緩衝
液、６：ク゛リシン緩衝液、７：CHES緩衝液によるものであ
る。
液、３：MOPS緩衝液、４：TAPS緩衝液、５：トリス緩衝
液、６：ク゛リシン緩衝液、７：CHES緩衝液によるものであ
る。
【図２】 本発明の酵素のpH安定性を示す。縦軸は相対
活性残存率、横軸はpHである。
活性残存率、横軸はpHである。
図中の曲線は、それぞれ１：酢酸緩衝液、２：燐酸緩衝
液、３：MOPS緩衝液、４：TAPS緩衝液、５：トリス緩衝
液、６：CHES緩衝液によるものである。
液、３：MOPS緩衝液、４：TAPS緩衝液、５：トリス緩衝
液、６：CHES緩衝液によるものである。
【図３】 本発明の酵素および市販酵素の温度安定性を
示す。縦軸は相対活性残存率、横軸は温度(℃)である。
示す。縦軸は相対活性残存率、横軸は温度(℃)である。
図中の曲線は、それぞれ１：本発明の酵素、２：市販酵
素である。
素である。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 9/04
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 9/00 - 9/99
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ
Ｓ（ＳＴＮ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (4)
- 【請求項１】 Bacillus 属に属する微生物（ Bacillus
sp.1764a ＦＥＲＭ Ｐ−１３３７１）が産生する酵素
であって、下記の理化学的性質を有することを特徴とす
るＮＡＤＰＨ依存性ディアフォラーゼ。 （１）作用：ＮＡＤＰＨに特異的に作用し、電子受容体
共存下でＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに変換する。 （２）基質特異性：ＮＡＤＨにほとんど作用せず、ＮＡ
ＤＰＨに特異的。 （３）至適ｐＨ：７．５〜８．５。 （４）至適作用温度：５０℃以上。 （５）熱安定性：ｐＨ８．０で１時間保持した場合、８
０℃で９０％以上の活性を保持する。 - 【請求項２】 請求項１に記載の微生物を培養し、培養
物から請求項１に記載のＮＡＤＰＨ依存性ディアフォラ
ーゼを分離・精製することを特徴とするＮＡＤＰＨ依存
性ディアフォラーゼの製造法。 - 【請求項３】 請求項２に記載の細菌株を培地中に接種
し、培養して請求項１に記載のディアフォラ−ゼを、菌
体内または培地中に生成蓄積せしめ、蓄積区分よりこれ
を採取することを特徴とする、耐熱性の高いNADPH依存
性ディアフォラ−ゼの製造法。 - 【請求項４】 請求項１に記載のディアフォラ−ゼを、
反応関与成分として使用する、生体代謝成分あるいは酵
素力価の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06250393A JP3532937B2 (ja) | 1993-03-01 | 1993-03-01 | 耐熱性の高い新規ｎａｄｐｈ依存性ディアフォラ−ゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06250393A JP3532937B2 (ja) | 1993-03-01 | 1993-03-01 | 耐熱性の高い新規ｎａｄｐｈ依存性ディアフォラ−ゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06253834A JPH06253834A (ja) | 1994-09-13 |
| JP3532937B2 true JP3532937B2 (ja) | 2004-05-31 |
Family
ID=13202043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06250393A Expired - Lifetime JP3532937B2 (ja) | 1993-03-01 | 1993-03-01 | 耐熱性の高い新規ｎａｄｐｈ依存性ディアフォラ−ゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3532937B2 (ja) |
-
1993
- 1993-03-01 JP JP06250393A patent/JP3532937B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９６７， Ｖｏｌ．１， Ｎｏ．１， ｐ．１０２−１０９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06253834A (ja) | 1994-09-13 |
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