JP4511655B2 - ソルビトール脱水素酵素、それを産生する微生物およびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なソルビトール脱水素酵素、それを産生する微生物およびそれを用いたソルビトール脱水素酵素の製造方法に関するものであり、さらに詳しくは、ソルビトールに高感度かつ特異的に作用するソルビトール脱水素酵素と、それを産生する微生物およびそれを用いたソルビトール脱水素酵素の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−ソルビトールは、ヒトの赤血球中及び血清中に微量に存在する化合物であるが、ある種の疾患、特に糖尿病の際にはその含有量が重要な指標となることが知られており、糖尿病の診断マーカーとして有効であることが報告されている。
【０００３】
また、Ｄ−ソルビトールおよびＤ−フルクトースは、食品業界では古くから甘味料などとして広範囲にわたり利用されている。
【０００４】
ソルビトールを測定する方法としては、ガスクロマトグラフィーによる方法、液体クロマトグラフィーによる方法、酵素を用いる方法などがある。しかし、ガスクロマトグラフィーによる方法、液体クロマトグラフィーによる方法は、いずれも操作が煩雑であるため、大量の検体を処理することが難しいという問題があった。
【０００５】
酵素を用いる方法は、ソルビトール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１４）を用い、ＮＡＤ+の存在下にＤ−ソルビトールを酸化してＮＡＤＨに還元される量を蛍光強度で測定する方法であり、自動分析器への適用も容易であるため、現在最も多く実用化されている。
従来知られているソルビトール脱水素酵素の例を挙げると、動物肝由来の酵素では、例えばロシュ社などから販売されている羊肝由来のソルビトール脱水素酵素が、また、微生物由来の酵素としては、例えばエンザイム・マイクロバクテリア・テクノロジー〔（Enzyme Microb. Ｔechnol.）第１３巻、４月号、第３３２〜３３７頁、１９９１年〕に記載のシュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）由来の酵素、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー〔（Journal of Biological Chemistry）第２６７巻、３５号、第２４９８９〜２４９９４頁、１９９２年〕に記載のバチラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来の酵素、ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング〔（Journal of Fermentation and Bioengineering）第８４巻、３号、第２５４〜２５６頁、１９９７年〕に記載のシュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）由来の酵素、あるいはバイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー〔（Biosci. Biotechnol. Biochem.）第６３巻、３号、第５７３〜５７４頁、１９９９年〕に記載のバチラス・フルクトサス（Bacillus fructosus）由来の酵素がある。
【０００６】
しかしながら、前記のソルビトール脱水素酵素はいずれも基質特異性が低く、またソルビトールに対するＫｍが大きいという欠点を有していた。すなわち、前記の動物肝由来のソルビトール脱水素酵素はイヂトールに、バチラス・サチリス由来の酵素はイヂトールおよびキシリトールに、また、シュードモナス エスピー由来のソルビトール脱水素酵素は、いずれもガラクチトールに、それぞれソルビトールと同程度の反応性を示すものであった。さらに、前記のソルビトール脱水素酵素のソルビトールに対するＫｍはいずれも約１０ｍＭ以上の値であり、ソルビトールの測定に用いるにあたり問題となっていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトの赤血球中や血清中に微量に存在するＤ−ソルビトールの測定あるいは食品中に含有されるＤ−ソルビトールまたはＤ−フルクトースの測定に利用できる、基質親和性および基質特異性に優れた新規なソルビトール脱水素酵素、ならびにこの酵素を産生する微生物およびこの微生物を用いて安価に、そして容易にこの酵素を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこのような課題を解決するために鋭意研究した結果、土壌より分離したフラビモナス属およびシュードモナス属に属する微生物が、基質親和性および基質特異性に優れたソルビトール脱水素酵素を産生するということを見い出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、第１の発明は、以下の理化学的性質を有するソルビトール脱水素酵素を要旨とするものである。
（１）作用：ＮＡＤ＋の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ＋を生成する。
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax/Ｋｍを１００としたときの、ガラクチトールに対するＶmax/Ｋｍは２８．９付近で、Ｌ−イジトールに対するＶmax／Ｋｍは１．９９付近であり、Ｄ−アラビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトール、Ｄ−グルコースには反応しない。
（３）ソルビトールに対するＫｍ：２．５ｍＭ付近である。
（４）至適ＰＨ：１０〜１１
（５）ｐＨ安定性：５〜１０．５
（６）至適温度：４０℃付近
（７）熱安定性：ｐＨ８．０の条件下３５℃で１時間処理した後も８０％以上の活性を保持。
（８）分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた分子量は６８，０００付近であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量は２６，０００付近である。
また、第２の発明は、以下の理化学的性質を有するソルビトール脱水素酵素を要旨とするものである。
（１）作用：ＮＡＤ ＋ の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ ＋ を生成する。
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax/Ｋｍを１００としたときの、ガラクチトールに対するＶmax/Ｋｍは３６．８付近で、Ｌ−イジトールに対するＶmax／Ｋｍは２．７８付近であり、Ｄ−アラビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトール、Ｄ−グルコースには反応しない。
（３）ソルビトールに対するＫｍ：５．９ｍＭ付近である。
（４）至適ＰＨ：９．５〜１０．５
（５）ｐＨ安定性：５〜１０
（６）至適温度：４０℃付近
（７）熱安定性：ｐＨ８．０の条件下３０℃で１時間処理した後も６０％以上の活性を保持。
（８）分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた分子量は５２，０００付近であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量は２８，０００付近である。
さらに、第３の発明は、以下の理化学的性質を有するソルビトール脱水素酵素を要旨とするものである。
（１）作用：ＮＡＤ ＋ の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ ＋ を生成する。
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax/Ｋｍを１００としたときの、ガラクチトールに対するＶmax/Ｋｍは３１．９付近で、Ｌ−イジトールに対するＶmax／Ｋｍは１．５５付近であり、Ｄ−アラビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトール、Ｄ−グルコースには反応しない。
（３）ソルビトールに対するＫｍ：３．５ｍＭ付近である。
（４）至適ＰＨ：１０〜１１
（５）ｐＨ安定性：７〜１０
（６）至適温度：４０℃付近
（７）熱安定性：ｐＨ８．０の条件下３５℃で１時間処理した後も８０％以上の活性を保持。
（８）分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた分子量は３８，０００付近であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量は２６，０００付近である。
【００１０】
また、別の発明は、上記した第１の発明であるソルビトール脱水素酵素の生産能を有することを特徴とするフラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）Ａ−５２０株に属する微生物を要旨とするものである。
また、別の発明は、上記した第２又は第３の発明であるソルビトール脱水素酵素の生産能を有することを特徴とするシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）Ａ−９８９株若しくはＡ−６５４株に属する微生物を要旨とするものである。
さらに、別の発明は、上記したフラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）Ａ−５２０株に属する微生物又はシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）Ａ−９８９株若しくはＡ−６５４株に属する微生物を培地にて培養し、培養物からソルビトール脱水素酵素を採取することを特徴とするソルビトール脱水素酵素の製造方法を要旨とするものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のソルビトール脱水素酵素は上述のような理化学的性質を有するものである。なお、本発明においてソルビトール脱水素酵素の活性は、５０ｍＭのＤ−ソルビトール、２ｍＭのＮＡＤ+を含む８０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定することにより行った。測定は３０℃で行った。１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００１２】
このようなソルビトール脱水素酵素を産生する微生物としては、フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株が挙げられる。以下に、これらの菌株の菌学的性質を以下に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】
以上の菌学的性質から、バージィのマニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bargey's mannual of Systematic Bacteriology）に基き検索した結果、Ａ−５２０株はフラビモナス・オリジハビタンス、Ａ−９８９株およびＡ−６５４株はシュードモナス・フルオレッセンスに属する細菌と判明し、それぞれフラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４と命名し、平成１１年７月１３日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。その寄託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１７４６１、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４６２、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４６３である。
【００１５】
これらの微生物から本発明のソルビトール脱水素酵素を得るには、まず、これらの微生物を培地にて培養し、培養終了後、遠心分離や濾過などの操作で培養液から菌体を回収する。次に、菌体から粗酵素液を抽出し、精製すればよい。
このような微生物を培養する際に用いられる培地中の炭素源としては、これらの微生物が資化しうる炭素源ならいかなるものでも使用できるが、通常、Ｄ−ソルビトール、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、グリセロール、コハク酸、ラクトース等が使用される。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コーンスチープリカー等の有機窒素が使用できる。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩類、必要に応じて微量金属塩、ビタミン類、消泡剤なども添加することができる。本発明においては、ソルビトール脱水素酵素の産生をより効率よく行うために、酵素産生促進物質として、基質であるソルビトールを培養のいずれかの時期に培養中に添加しておくことが望ましい。
【００１６】
培養は、固体培養、液体培養のいずれも採用できるが、通常、通気攪拌培養又は振盪培養を行うのが好ましい。培地のｐＨとしては、ｐＨ６〜８付近に調整して用いるのが望ましい。培養温度としては１８〜４２℃、好ましくは２５〜３５℃で行う。培養時間としては、該酵素産生が最大となる時間とすればよいが、通常１０〜１００時間、好ましくは２０〜７０時間培養することにより、菌体内にソルビトール脱水素酵素が生成、蓄積される。
【００１７】
このようにして得られた菌体から酵素を抽出する方法としては、自己消化、超音波破砕、フレンチプレス、界面活性剤処理、リゾチーム処理などいずれを用いてもよく、こうした処理後、遠心分離により細胞片を除去することにより、粗酵素液が得られる。
さらに、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより、粗酵素液から本発明のソルビトール脱水素酵素を精製することができる。イオン交換樹脂としては、Ｑ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社製）などが挙げられる。アフィニティークロマト用樹脂としては、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ、レッドセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）や、プロシオンブルーＨ−ＥＲＤ（ＩＣＩ社製）、チバクロンイエローＨＥ−３Ｇ（チバガイギー社製）などのトリアジン色素から作製した樹脂が挙げられる。疎水クロマト用樹脂としては、オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）などが挙げられる。ゲル濾過用担体または樹脂としては、セファデックスＧ−１００などが挙げられる。また、これらのカラムクロマトグラフィーに加え、硫酸ストレプトマイシンや硫酸プロタミン処理による除核酸、硫酸アンモニウム処理によるタンパク質の塩析を行ってもよい。
【００１８】
このようにして製造された本発明のソルビトール脱水素酵素の理化学的性質を以下に示す。
【００１９】
（１）作用：ＮＡＤ+の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ+を生成する。
【００２０】
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax／Ｋｍの値を１００としたときの各種基質に対するＶmax／Ｋｍは、以下の表２に示すとおりである。
【００２１】
【表２】
【００２２】
（３）至適ｐＨ：各ｐＨの緩衝液中で３０℃で各酵素の活性を測定した結果、図１〜３に示すとおり、フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素の至適ｐＨは１０〜１１であり、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素の至適ｐＨも１０〜１１であり、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素由来の至適ｐＨは９．５〜１０．５であった。なお、緩衝液としては、ｐＨ４〜６は１００ｍＭ酢酸緩衝液を、ｐＨ６〜８は１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液を、ｐＨ８〜９は１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液を、ｐＨ９〜１１は１００ｍＭグリシン−水酸化カリウム緩衝液を、ｐＨ１０．５〜１２は１００ｍＭリン酸２ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。
図１〜３は、本発明の酵素の酵素活性に対するｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸にｐＨを示しており、酵素活性は測定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活性で示した。
【００２３】
（４）ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液中で４℃において２４時間放置した後の残存活性を測定した結果、図４〜６に示すとおり、活性が６０％以上残存するｐＨの範囲は、フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素ではｐＨ５〜１０．５であり、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素ではｐＨ７〜１０であり、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素ではｐＨ５〜１０であった。
図４〜６は、本発明の酵素の安定性に対するｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸にｐＨを示しており、残存活性は測定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活性で示した。
【００２４】
（５）至適温度と熱安定性：各酵素の至適温度は４０℃付近であり、フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素およびシュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素ではｐＨ８．０の条件下３５℃で１時間処理した後も、８０％以上の活性を保持した。シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素は、ｐＨ８．０の条件下３０℃で１時間処理した後も、６０％以上の活性を保持した。
図７〜９は、本発明の酵素の活性に対する温度の影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸に温度を示しており、酵素活性は測定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活性で示した。また、図１０〜１２は、本発明の酵素の安定性に対する温度の影響を示すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸に経過時間を示しており、残存活性は、インキュベート開始時の活性を１００とした相対活性で示した。
【００２５】
（６）分子量：フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株およびシュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素の分子量をスーパーロース（ファルマシア社製）ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた結果はそれぞれ約６８，０００、約３８，０００、約５２，０００であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量はそれぞれ、約２６，０００、約２６，０００、約２８，０００あった。
【００２６】
このような本発明のソルビトール脱水素酵素を用いてＤ−ソルビトールを定量する際に用いる電子受容体としては、Ｄ−ソルビトールを脱水素により酸化するものであれば特に制限はなく、ＮＡＤ+以外に、酸素、フェナンジンメトサルフェート、ジクロルフェノールインドフェノール、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウムなどのフェリシアン化化合物、チトクロムＣ、ＮＡＤＰ+、ＦＭＮなどの補酵素が挙げられる。電子受容体としてＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を用いた場合には、生成したＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを基質としてニトロブルーテトラゾリウムなどのテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフェノールインドフェノールなどを還元発色させ、可視部で測定することもできる。
【００２７】
【実施例】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。
実施例１
Ｄ−ソルビトール２．０％（重量％を表す。以下同様）、ペプトン０．５％、酵母エキス ０．５％、リン酸水素二カリウム０．１％、ｐＨ７．０よりなる培地１８リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で１５分間滅菌した後、フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株（ＦＥＲＭＰ−１７４６１）を接種した。３０℃で７０時間、２００ｒｐｍで撹拌しながら、１ｖｖｍの通気条件下で培養し、遠心分離により約３００ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は凍結で保存した。次に、凍結菌体を、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２Ｌに懸濁し、フレンチプレスにより菌体を破砕後、遠心分離により細胞片を除去し、ソルビトール脱水素酵素を含む粗酵素液を得た。この粗酵素液を２ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦカラム（ファルマシア社製）に通じ、０〜０．６５ＭＫＣｌのリニアグラジエントにより溶出せしめると、ＫＣｌ濃度０．２０〜０．２５Ｍの近くでソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。続いて、得られた画分に硫酸アンモニウムを２０％となるように加え、２０％硫酸アンモニウム、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラム（東ソー社製）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウムの濃度を徐々に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウム濃度７％〜４％付近にソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。この活性画分を透析した後、２ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−トリスアクリルカラム（ファルマシア社製）に通じ、０〜０．２５ＭＫＣｌのリニアグラジエントにより溶出せしめると、ＫＣｌ濃度０．１５〜０．２Ｍの近くでソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。続いて、得られた画分に硫酸アンモニウムを５％となるように加え、５％硫酸アンモニウム、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセルロファインカラム（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウムの濃度を徐々に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウム濃度２％〜１％付近にソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。このようにして得られたソルビトール脱水素酵素の収率は約４０％で、酵素蛋白質１ｍｇ当たり約３３単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とすると約３７０倍であった。得られたソルビトール脱水素酵素は、上述の理化学的性質を有していた。
【００２８】
実施例２
実施例１と同様の培地、条件により、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４６２）を培養し、約２１０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は、凍結で保存した。次に、これらの菌体から実施例１と同様にして粗抽出液を得た。この粗酵素液を２ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦカラム（ファルマシア社製）に通じたところ、一部を除いた殆どのソルビトール脱水素酵素画分はカラムに吸着しなかった。非吸着画分のソルビトール脱水素酵素を回収し、硫酸アンモニウムを１０％となるように加え、１０％硫酸アンモニウム、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラム（東ソー社製）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウムの濃度を段階的に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウム濃度４％〜３％付近にソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラム（東ソー社製）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウムの濃度を段階的に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウム濃度４％〜３％付近にソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。このようにして得られたソルビトール脱水素酵素の収率は約５６％で、酵素蛋白質１ｍｇ当たり約４単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とすると約１１０倍であった。得られたソルビトール脱水素酵素は、上述の理化学的性質を有していた。
【００２９】
実施例３
実施例１と同様の培地、条件により、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４６３）を培養し、約３００ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は、凍結で保存した。次に、これらの菌体から実施例１と同様にして粗抽出液を得た。この粗酵素液を２ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦカラム（ファルマシア社製）に通じ、０〜０．６ＭＫＣｌのリニアグラジエントにより溶出せしめると、ＫＣｌ濃度０．２０〜０．２５Ｍの近くでソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。続いて、得られた画分に硫酸アンモニウムを２０％となるように加え、２０％硫酸アンモニウム、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラム（東ソー社製）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウムの濃度を徐々に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウム濃度２％〜１％付近にソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。この活性画分を透析した後、２ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したレッドセファロースカラム（ファルマシア社製）に通じ、２ｍＭＮＡＤＨにより段階的に溶出して、ソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。このようにして得られたソルビトール脱水素酵素の収率は約１７％で、酵素蛋白質１ｍｇ当たり約２５単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とすると約１,１３０倍であった。また、得られたソルビトール脱水素酵素は、上述の理化学的性質を有していた。
【００３０】
参考例１
実施例１で精製したフラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素を用いて、以下の成分のソルビトール定量用試薬を調製した。
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０） １００ｍＭ
ＮＡＤ+（オリエンタル酵母工業（株）製） ２．５ｍＭ
本酵素 ２．５Ｕ／ml
このソルビトール定量用試薬０．８ｍｌを、３７℃で５分間プレインキュベーションした後、Ｄ−ソルビトール標品（ナカライ（株）製、１級）を用いて５、２５、４０、１２５、２５０、４００、７５０μＭに調整した試料各０．２ｍｌを添加し、島津社製分光光度計（ＵＶ−２６５型）内で３７℃で３０分間反応を行い、３０分後の３４０ｎｍの吸光度を求め、試料の代わりに蒸留水を用いたブランク値を差し引いた、該吸光度変化量（ΔＯＤ）を求めた。この吸光度変化量とＮＡＤ+の分子吸光係数（６２２０Ｍ-1ｃｍ-1）から計算された濃度と、Ｄ−ソルビトール含有量との間には直線的な相関があった。図１３に、実際のＤ−ソルビトール濃度と、上記試薬により測定されたＤ−ソルビトール濃度の相関を表した散布図を示す。最小二乗法により線形近似した回帰曲線の式は、ｙ＝−０．９８ｘ＋２．１（ｒ＝０．９９８）となり、ｘの係数および相関係数（ｒ）がほぼ１に等しいことから、上記試薬により試料中のＤ−ソルビトールを正確に定量できることがわかる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のソルビトール脱水素酵素は、基質特異性および基質親和性に優れており、ソルビトールの測定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素の３０℃における至適ｐＨを示すグラフである。
【図２】Ａ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素の３０℃における至適ｐＨを示すグラフである。
【図３】Ａ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素の３０℃における至適ｐＨを示すグラフである。
【図４】Ａ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素の４℃における安定ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図５】Ａ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素の４℃における安定ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図６】Ａ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素の４℃における安定ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図７】Ａ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における作用適温の範囲を示すグラフである。
【図８】Ａ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における作用適温の範囲を示すグラフである。
【図９】Ａ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における作用適温の範囲を示すグラフである。
【図１０】Ａ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における熱安定性を示すグラフである。
【図１１】Ａ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における熱安定性を示すグラフである。
【図１２】Ａ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における熱安定性を示すグラフである。
【図１３】本発明のソルビトール脱水素酵素を用いて作製したＤ−ソルビトール定量用試薬による、Ｄ−ソルビトール濃度の測定結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なソルビトール脱水素酵素、それを産生する微生物およびそれを用いたソルビトール脱水素酵素の製造方法に関するものであり、さらに詳しくは、ソルビトールに高感度かつ特異的に作用するソルビトール脱水素酵素と、それを産生する微生物およびそれを用いたソルビトール脱水素酵素の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−ソルビトールは、ヒトの赤血球中及び血清中に微量に存在する化合物であるが、ある種の疾患、特に糖尿病の際にはその含有量が重要な指標となることが知られており、糖尿病の診断マーカーとして有効であることが報告されている。
【０００３】
また、Ｄ−ソルビトールおよびＤ−フルクトースは、食品業界では古くから甘味料などとして広範囲にわたり利用されている。
【０００４】
ソルビトールを測定する方法としては、ガスクロマトグラフィーによる方法、液体クロマトグラフィーによる方法、酵素を用いる方法などがある。しかし、ガスクロマトグラフィーによる方法、液体クロマトグラフィーによる方法は、いずれも操作が煩雑であるため、大量の検体を処理することが難しいという問題があった。
【０００５】
酵素を用いる方法は、ソルビトール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１４）を用い、ＮＡＤ+の存在下にＤ−ソルビトールを酸化してＮＡＤＨに還元される量を蛍光強度で測定する方法であり、自動分析器への適用も容易であるため、現在最も多く実用化されている。
従来知られているソルビトール脱水素酵素の例を挙げると、動物肝由来の酵素では、例えばロシュ社などから販売されている羊肝由来のソルビトール脱水素酵素が、また、微生物由来の酵素としては、例えばエンザイム・マイクロバクテリア・テクノロジー〔（Enzyme Microb. Ｔechnol.）第１３巻、４月号、第３３２〜３３７頁、１９９１年〕に記載のシュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）由来の酵素、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー〔（Journal of Biological Chemistry）第２６７巻、３５号、第２４９８９〜２４９９４頁、１９９２年〕に記載のバチラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来の酵素、ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング〔（Journal of Fermentation and Bioengineering）第８４巻、３号、第２５４〜２５６頁、１９９７年〕に記載のシュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）由来の酵素、あるいはバイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー〔（Biosci. Biotechnol. Biochem.）第６３巻、３号、第５７３〜５７４頁、１９９９年〕に記載のバチラス・フルクトサス（Bacillus fructosus）由来の酵素がある。
【０００６】
しかしながら、前記のソルビトール脱水素酵素はいずれも基質特異性が低く、またソルビトールに対するＫｍが大きいという欠点を有していた。すなわち、前記の動物肝由来のソルビトール脱水素酵素はイヂトールに、バチラス・サチリス由来の酵素はイヂトールおよびキシリトールに、また、シュードモナス エスピー由来のソルビトール脱水素酵素は、いずれもガラクチトールに、それぞれソルビトールと同程度の反応性を示すものであった。さらに、前記のソルビトール脱水素酵素のソルビトールに対するＫｍはいずれも約１０ｍＭ以上の値であり、ソルビトールの測定に用いるにあたり問題となっていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトの赤血球中や血清中に微量に存在するＤ−ソルビトールの測定あるいは食品中に含有されるＤ−ソルビトールまたはＤ−フルクトースの測定に利用できる、基質親和性および基質特異性に優れた新規なソルビトール脱水素酵素、ならびにこの酵素を産生する微生物およびこの微生物を用いて安価に、そして容易にこの酵素を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこのような課題を解決するために鋭意研究した結果、土壌より分離したフラビモナス属およびシュードモナス属に属する微生物が、基質親和性および基質特異性に優れたソルビトール脱水素酵素を産生するということを見い出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、第１の発明は、以下の理化学的性質を有するソルビトール脱水素酵素を要旨とするものである。
（１）作用：ＮＡＤ＋の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ＋を生成する。
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax/Ｋｍを１００としたときの、ガラクチトールに対するＶmax/Ｋｍは２８．９付近で、Ｌ−イジトールに対するＶmax／Ｋｍは１．９９付近であり、Ｄ−アラビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトール、Ｄ−グルコースには反応しない。
（３）ソルビトールに対するＫｍ：２．５ｍＭ付近である。
（４）至適ＰＨ：１０〜１１
（５）ｐＨ安定性：５〜１０．５
（６）至適温度：４０℃付近
（７）熱安定性：ｐＨ８．０の条件下３５℃で１時間処理した後も８０％以上の活性を保持。
（８）分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた分子量は６８，０００付近であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量は２６，０００付近である。
また、第２の発明は、以下の理化学的性質を有するソルビトール脱水素酵素を要旨とするものである。
（１）作用：ＮＡＤ ＋ の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ ＋ を生成する。
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax/Ｋｍを１００としたときの、ガラクチトールに対するＶmax/Ｋｍは３６．８付近で、Ｌ−イジトールに対するＶmax／Ｋｍは２．７８付近であり、Ｄ−アラビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトール、Ｄ−グルコースには反応しない。
（３）ソルビトールに対するＫｍ：５．９ｍＭ付近である。
（４）至適ＰＨ：９．５〜１０．５
（５）ｐＨ安定性：５〜１０
（６）至適温度：４０℃付近
（７）熱安定性：ｐＨ８．０の条件下３０℃で１時間処理した後も６０％以上の活性を保持。
（８）分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた分子量は５２，０００付近であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量は２８，０００付近である。
さらに、第３の発明は、以下の理化学的性質を有するソルビトール脱水素酵素を要旨とするものである。
（１）作用：ＮＡＤ ＋ の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ ＋ を生成する。
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax/Ｋｍを１００としたときの、ガラクチトールに対するＶmax/Ｋｍは３１．９付近で、Ｌ−イジトールに対するＶmax／Ｋｍは１．５５付近であり、Ｄ−アラビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトール、Ｄ−グルコースには反応しない。
（３）ソルビトールに対するＫｍ：３．５ｍＭ付近である。
（４）至適ＰＨ：１０〜１１
（５）ｐＨ安定性：７〜１０
（６）至適温度：４０℃付近
（７）熱安定性：ｐＨ８．０の条件下３５℃で１時間処理した後も８０％以上の活性を保持。
（８）分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた分子量は３８，０００付近であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量は２６，０００付近である。
【００１０】
また、別の発明は、上記した第１の発明であるソルビトール脱水素酵素の生産能を有することを特徴とするフラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）Ａ−５２０株に属する微生物を要旨とするものである。
また、別の発明は、上記した第２又は第３の発明であるソルビトール脱水素酵素の生産能を有することを特徴とするシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）Ａ−９８９株若しくはＡ−６５４株に属する微生物を要旨とするものである。
さらに、別の発明は、上記したフラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）Ａ−５２０株に属する微生物又はシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）Ａ−９８９株若しくはＡ−６５４株に属する微生物を培地にて培養し、培養物からソルビトール脱水素酵素を採取することを特徴とするソルビトール脱水素酵素の製造方法を要旨とするものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のソルビトール脱水素酵素は上述のような理化学的性質を有するものである。なお、本発明においてソルビトール脱水素酵素の活性は、５０ｍＭのＤ−ソルビトール、２ｍＭのＮＡＤ+を含む８０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定することにより行った。測定は３０℃で行った。１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００１２】
このようなソルビトール脱水素酵素を産生する微生物としては、フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株が挙げられる。以下に、これらの菌株の菌学的性質を以下に示す。
【００１３】
【表１】
以上の菌学的性質から、バージィのマニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bargey's mannual of Systematic Bacteriology）に基き検索した結果、Ａ−５２０株はフラビモナス・オリジハビタンス、Ａ−９８９株およびＡ−６５４株はシュードモナス・フルオレッセンスに属する細菌と判明し、それぞれフラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４と命名し、平成１１年７月１３日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。その寄託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１７４６１、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４６２、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４６３である。
【００１５】
これらの微生物から本発明のソルビトール脱水素酵素を得るには、まず、これらの微生物を培地にて培養し、培養終了後、遠心分離や濾過などの操作で培養液から菌体を回収する。次に、菌体から粗酵素液を抽出し、精製すればよい。
このような微生物を培養する際に用いられる培地中の炭素源としては、これらの微生物が資化しうる炭素源ならいかなるものでも使用できるが、通常、Ｄ−ソルビトール、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、グリセロール、コハク酸、ラクトース等が使用される。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コーンスチープリカー等の有機窒素が使用できる。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩類、必要に応じて微量金属塩、ビタミン類、消泡剤なども添加することができる。本発明においては、ソルビトール脱水素酵素の産生をより効率よく行うために、酵素産生促進物質として、基質であるソルビトールを培養のいずれかの時期に培養中に添加しておくことが望ましい。
【００１６】
培養は、固体培養、液体培養のいずれも採用できるが、通常、通気攪拌培養又は振盪培養を行うのが好ましい。培地のｐＨとしては、ｐＨ６〜８付近に調整して用いるのが望ましい。培養温度としては１８〜４２℃、好ましくは２５〜３５℃で行う。培養時間としては、該酵素産生が最大となる時間とすればよいが、通常１０〜１００時間、好ましくは２０〜７０時間培養することにより、菌体内にソルビトール脱水素酵素が生成、蓄積される。
【００１７】
このようにして得られた菌体から酵素を抽出する方法としては、自己消化、超音波破砕、フレンチプレス、界面活性剤処理、リゾチーム処理などいずれを用いてもよく、こうした処理後、遠心分離により細胞片を除去することにより、粗酵素液が得られる。
さらに、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより、粗酵素液から本発明のソルビトール脱水素酵素を精製することができる。イオン交換樹脂としては、Ｑ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社製）などが挙げられる。アフィニティークロマト用樹脂としては、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ、レッドセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）や、プロシオンブルーＨ−ＥＲＤ（ＩＣＩ社製）、チバクロンイエローＨＥ−３Ｇ（チバガイギー社製）などのトリアジン色素から作製した樹脂が挙げられる。疎水クロマト用樹脂としては、オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）などが挙げられる。ゲル濾過用担体または樹脂としては、セファデックスＧ−１００などが挙げられる。また、これらのカラムクロマトグラフィーに加え、硫酸ストレプトマイシンや硫酸プロタミン処理による除核酸、硫酸アンモニウム処理によるタンパク質の塩析を行ってもよい。
【００１８】
このようにして製造された本発明のソルビトール脱水素酵素の理化学的性質を以下に示す。
【００１９】
（１）作用：ＮＡＤ+の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ+を生成する。
【００２０】
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax／Ｋｍの値を１００としたときの各種基質に対するＶmax／Ｋｍは、以下の表２に示すとおりである。
【００２１】
【表２】
（３）至適ｐＨ：各ｐＨの緩衝液中で３０℃で各酵素の活性を測定した結果、図１〜３に示すとおり、フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素の至適ｐＨは１０〜１１であり、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素の至適ｐＨも１０〜１１であり、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素由来の至適ｐＨは９．５〜１０．５であった。なお、緩衝液としては、ｐＨ４〜６は１００ｍＭ酢酸緩衝液を、ｐＨ６〜８は１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液を、ｐＨ８〜９は１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液を、ｐＨ９〜１１は１００ｍＭグリシン−水酸化カリウム緩衝液を、ｐＨ１０．５〜１２は１００ｍＭリン酸２ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。
図１〜３は、本発明の酵素の酵素活性に対するｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸にｐＨを示しており、酵素活性は測定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活性で示した。
【００２３】
（４）ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液中で４℃において２４時間放置した後の残存活性を測定した結果、図４〜６に示すとおり、活性が６０％以上残存するｐＨの範囲は、フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素ではｐＨ５〜１０．５であり、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素ではｐＨ７〜１０であり、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素ではｐＨ５〜１０であった。
図４〜６は、本発明の酵素の安定性に対するｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸にｐＨを示しており、残存活性は測定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活性で示した。
【００２４】
（５）至適温度と熱安定性：各酵素の至適温度は４０℃付近であり、フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素およびシュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素ではｐＨ８．０の条件下３５℃で１時間処理した後も、８０％以上の活性を保持した。シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素は、ｐＨ８．０の条件下３０℃で１時間処理した後も、６０％以上の活性を保持した。
図７〜９は、本発明の酵素の活性に対する温度の影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸に温度を示しており、酵素活性は測定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活性で示した。また、図１０〜１２は、本発明の酵素の安定性に対する温度の影響を示すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸に経過時間を示しており、残存活性は、インキュベート開始時の活性を１００とした相対活性で示した。
【００２５】
（６）分子量：フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株およびシュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素の分子量をスーパーロース（ファルマシア社製）ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた結果はそれぞれ約６８，０００、約３８，０００、約５２，０００であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量はそれぞれ、約２６，０００、約２６，０００、約２８，０００あった。
【００２６】
このような本発明のソルビトール脱水素酵素を用いてＤ−ソルビトールを定量する際に用いる電子受容体としては、Ｄ−ソルビトールを脱水素により酸化するものであれば特に制限はなく、ＮＡＤ+以外に、酸素、フェナンジンメトサルフェート、ジクロルフェノールインドフェノール、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウムなどのフェリシアン化化合物、チトクロムＣ、ＮＡＤＰ+、ＦＭＮなどの補酵素が挙げられる。電子受容体としてＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を用いた場合には、生成したＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを基質としてニトロブルーテトラゾリウムなどのテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフェノールインドフェノールなどを還元発色させ、可視部で測定することもできる。
【００２７】
【実施例】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。
実施例１
Ｄ−ソルビトール２．０％（重量％を表す。以下同様）、ペプトン０．５％、酵母エキス ０．５％、リン酸水素二カリウム０．１％、ｐＨ７．０よりなる培地１８リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で１５分間滅菌した後、フラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株（ＦＥＲＭＰ−１７４６１）を接種した。３０℃で７０時間、２００ｒｐｍで撹拌しながら、１ｖｖｍの通気条件下で培養し、遠心分離により約３００ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は凍結で保存した。次に、凍結菌体を、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２Ｌに懸濁し、フレンチプレスにより菌体を破砕後、遠心分離により細胞片を除去し、ソルビトール脱水素酵素を含む粗酵素液を得た。この粗酵素液を２ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦカラム（ファルマシア社製）に通じ、０〜０．６５ＭＫＣｌのリニアグラジエントにより溶出せしめると、ＫＣｌ濃度０．２０〜０．２５Ｍの近くでソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。続いて、得られた画分に硫酸アンモニウムを２０％となるように加え、２０％硫酸アンモニウム、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラム（東ソー社製）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウムの濃度を徐々に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウム濃度７％〜４％付近にソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。この活性画分を透析した後、２ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−トリスアクリルカラム（ファルマシア社製）に通じ、０〜０．２５ＭＫＣｌのリニアグラジエントにより溶出せしめると、ＫＣｌ濃度０．１５〜０．２Ｍの近くでソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。続いて、得られた画分に硫酸アンモニウムを５％となるように加え、５％硫酸アンモニウム、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセルロファインカラム（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウムの濃度を徐々に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウム濃度２％〜１％付近にソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。このようにして得られたソルビトール脱水素酵素の収率は約４０％で、酵素蛋白質１ｍｇ当たり約３３単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とすると約３７０倍であった。得られたソルビトール脱水素酵素は、上述の理化学的性質を有していた。
【００２８】
実施例２
実施例１と同様の培地、条件により、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−９８９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４６２）を培養し、約２１０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は、凍結で保存した。次に、これらの菌体から実施例１と同様にして粗抽出液を得た。この粗酵素液を２ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦカラム（ファルマシア社製）に通じたところ、一部を除いた殆どのソルビトール脱水素酵素画分はカラムに吸着しなかった。非吸着画分のソルビトール脱水素酵素を回収し、硫酸アンモニウムを１０％となるように加え、１０％硫酸アンモニウム、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラム（東ソー社製）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウムの濃度を段階的に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウム濃度４％〜３％付近にソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラム（東ソー社製）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウムの濃度を段階的に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウム濃度４％〜３％付近にソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。このようにして得られたソルビトール脱水素酵素の収率は約５６％で、酵素蛋白質１ｍｇ当たり約４単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とすると約１１０倍であった。得られたソルビトール脱水素酵素は、上述の理化学的性質を有していた。
【００２９】
実施例３
実施例１と同様の培地、条件により、シュードモナス・フルオレッセンスＡ−６５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４６３）を培養し、約３００ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は、凍結で保存した。次に、これらの菌体から実施例１と同様にして粗抽出液を得た。この粗酵素液を２ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦカラム（ファルマシア社製）に通じ、０〜０．６ＭＫＣｌのリニアグラジエントにより溶出せしめると、ＫＣｌ濃度０．２０〜０．２５Ｍの近くでソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。続いて、得られた画分に硫酸アンモニウムを２０％となるように加え、２０％硫酸アンモニウム、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラム（東ソー社製）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウムの濃度を徐々に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウム濃度２％〜１％付近にソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。この活性画分を透析した後、２ｍＭＥＤＴＡおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したレッドセファロースカラム（ファルマシア社製）に通じ、２ｍＭＮＡＤＨにより段階的に溶出して、ソルビトール脱水素酵素活性画分を得た。このようにして得られたソルビトール脱水素酵素の収率は約１７％で、酵素蛋白質１ｍｇ当たり約２５単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とすると約１,１３０倍であった。また、得られたソルビトール脱水素酵素は、上述の理化学的性質を有していた。
【００３０】
参考例１
実施例１で精製したフラビモナス・オリジハビタンスＡ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素を用いて、以下の成分のソルビトール定量用試薬を調製した。
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０） １００ｍＭ
ＮＡＤ+（オリエンタル酵母工業（株）製） ２．５ｍＭ
本酵素 ２．５Ｕ／ml
このソルビトール定量用試薬０．８ｍｌを、３７℃で５分間プレインキュベーションした後、Ｄ−ソルビトール標品（ナカライ（株）製、１級）を用いて５、２５、４０、１２５、２５０、４００、７５０μＭに調整した試料各０．２ｍｌを添加し、島津社製分光光度計（ＵＶ−２６５型）内で３７℃で３０分間反応を行い、３０分後の３４０ｎｍの吸光度を求め、試料の代わりに蒸留水を用いたブランク値を差し引いた、該吸光度変化量（ΔＯＤ）を求めた。この吸光度変化量とＮＡＤ+の分子吸光係数（６２２０Ｍ-1ｃｍ-1）から計算された濃度と、Ｄ−ソルビトール含有量との間には直線的な相関があった。図１３に、実際のＤ−ソルビトール濃度と、上記試薬により測定されたＤ−ソルビトール濃度の相関を表した散布図を示す。最小二乗法により線形近似した回帰曲線の式は、ｙ＝−０．９８ｘ＋２．１（ｒ＝０．９９８）となり、ｘの係数および相関係数（ｒ）がほぼ１に等しいことから、上記試薬により試料中のＤ−ソルビトールを正確に定量できることがわかる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のソルビトール脱水素酵素は、基質特異性および基質親和性に優れており、ソルビトールの測定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素の３０℃における至適ｐＨを示すグラフである。
【図２】Ａ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素の３０℃における至適ｐＨを示すグラフである。
【図３】Ａ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素の３０℃における至適ｐＨを示すグラフである。
【図４】Ａ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素の４℃における安定ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図５】Ａ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素の４℃における安定ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図６】Ａ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素の４℃における安定ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図７】Ａ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における作用適温の範囲を示すグラフである。
【図８】Ａ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における作用適温の範囲を示すグラフである。
【図９】Ａ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における作用適温の範囲を示すグラフである。
【図１０】Ａ−５２０株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における熱安定性を示すグラフである。
【図１１】Ａ−６５４株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における熱安定性を示すグラフである。
【図１２】Ａ−９８９株由来のソルビトール脱水素酵素のｐＨ８．０における熱安定性を示すグラフである。
【図１３】本発明のソルビトール脱水素酵素を用いて作製したＤ−ソルビトール定量用試薬による、Ｄ−ソルビトール濃度の測定結果を示す図である。
Claims (6)
- 以下の理化学的性質を有するソルビトール脱水素酵素。
（１）作用：ＮＡＤ＋の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ＋を生成する。
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax/Ｋｍを１００としたときの、ガラクチトールに対するＶmax/Ｋｍは２８．９付近で、Ｌ−イジトールに対するＶmax／Ｋｍは１．９９付近であり、Ｄ−アラビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトール、Ｄ−グルコースには反応しない。
（３）ソルビトールに対するＫｍ：２．５ｍＭ付近である。
（４）至適ＰＨ：１０〜１１
（５）ｐＨ安定性：５〜１０．５
（６）至適温度：４０℃付近
（７）熱安定性：ｐＨ８．０の条件下３５℃で１時間処理した後も８０％以上の活性を保持。
（８）分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた分子量は６８，０００付近であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量は２６，０００付近である。 - 以下の理化学的性質を有するソルビトール脱水素酵素。
（１）作用：ＮＡＤ＋の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ＋を生成する。
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax/Ｋｍを１００としたときの、ガラクチトールに対するＶmax/Ｋｍは３６．８付近で、Ｌ−イジトールに対するＶmax／Ｋｍは２．７８付近であり、Ｄ−アラビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトール、Ｄ−グルコースには反応しない。
（３）ソルビトールに対するＫｍ：５．９ｍＭ付近である。
（４）至適ＰＨ：９．５〜１０．５
（５）ｐＨ安定性：５〜１０
（６）至適温度：４０℃付近
（７）熱安定性：ｐＨ８．０の条件下３０℃で１時間処理した後も６０％以上の活性を保持。
（８）分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた分子量は５２，０００付近であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量は２８，０００付近である。 - 以下の理化学的性質を有するソルビトール脱水素酵素。
（１）作用：ＮＡＤ＋の存在下、Ｄ−ソルビトールを脱水素的に酸化し、Ｄ−フルクトースを生成する。また、本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ＋を生成する。
（２）基質特異性：Ｄ−ソルビトールに対するＶmax/Ｋｍを１００としたときの、ガラクチトールに対するＶmax/Ｋｍは３１．９付近で、Ｌ−イジトールに対するＶmax／Ｋｍは１．５５付近であり、Ｄ−アラビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトール、Ｄ−グルコースには反応しない。
（３）ソルビトールに対するＫｍ：３．５ｍＭ付近である。
（４）至適ＰＨ：１０〜１１
（５）ｐＨ安定性：７〜１０
（６）至適温度：４０℃付近
（７）熱安定性：ｐＨ８．０の条件下３５℃で１時間処理した後も８０％以上の活性を保持。
（８）分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーによって求めた分子量は３８，０００付近であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたサブユニットの分子量は２６，０００付近である。 - 請求項１に記載したソルビトール脱水素酵素の生産能を有することを特徴とするフラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）Ａ−５２０株に属する微生物。
- 請求項２又は３に記載したソルビトール脱水素酵素の生産能を有することを特徴とするシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）Ａ−９８９株若しくはＡ−６５４株に属する微生物。
- 請求項４又は５に記載したソルビトール脱水素酵素生産能を有する微生物を培地にて培養し、培養物からソルビトール脱水素酵素を採取することを特徴とするソルビトール脱水素酵素の製造方法。
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