JP2901231B2 - 新規なビリルビン・オキシダーゼを用いた測定法 - Google Patents
新規なビリルビン・オキシダーゼを用いた測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なビリルビン
・オキシダーゼを用いた測定法および検体中のビリルビ
ンを消去する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ビリルビン・オキシダーゼは、ビリルビ
ンおよび酸素からビリベルジンと水を生成する反応を触
媒する酵素であり、従来より、ミロセシウム属（特開昭
６０−１２０３２号）、バチルス属（特開昭６１−２０
９５８７号）、スエヒロタケ属（特開昭５９−１３５８
８６号）、コプリナス属、トラメテス属、コリオラマ
属、フォリオタ属、プロイロタス属、レンジデス属、フ
シドプシス属（特開昭５９−１９８９７１号）、ナス
科、バショウ科、ユリ科（特開昭６０−７８５８０号）
などが由来する酵素が知られている。 【０００３】ビリルビンは、ヘモグロビンの分解によつ
て血中に形成される黄色物質であり、肝臓で作られる胆
汁の主色素である。血清中には抱合ビリルビン及び遊離
ビリルビンが存在し、血清中の抱合ビリルビンの増加か
ら、肝ミクロゾームにおける抱合から十二指腸までのビ
リルビン運搬系の障害をきたしたことから、また血清中
の遊離ビリルビンの増加からは、種々の原因によって生
ずる溶血性貧血等を生じたことを示し、抱合及び／又は
遊離ビリルビンを定量することは臨床的に極めて重要で
ある。さらに、被検体サンプル中のビリルビンレベルを
積極的に低下させるために、ビリルビン・オキシダーゼ
は非常に有用である。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】上記したような従来公
知のビリルビン・オキシダーゼは、基質特異性が低く、
そのために例えば臨床化学分野で使用するには問題があ
った。即ち、上記した公知の微生物由来のビリルビン・
オキシダーゼは、全てビリベルジンにも基質特異性を有
しており、ビリルビンの分析には適していなかった。ま
た、植物由来の酵素は、原料に季節的な要因をはじめと
する種々の制約があり、工業的には有利とは言えない
し、その基質特異性についてもナス科のものは、ビリベ
ルジン、ヘモグロビンには作用しないことを示してい
る、と述べられているが、その他の基質については何も
開示されておらない。このように、公知のビリルビン・
オキシダーゼは、テトラピロール構造を持つ物質あるい
はフエノール系物質に作用するため、臨床検査分野にお
ける血液生化学検査に用いる場合、夾雑する他の組成物
に大きく影響されるという欠点があった。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、これら従
来公知における酵素の欠点のないビリルビン・オキシダ
ーゼにつき、種々の研究をした結果、静岡県駿東郡長泉
町の土壌より分離した不完全菌でペニシリウム属に属す
る菌株Ｍ５６１３株が、ビリルビンおよび酸素からビリ
ルビンと水を生ずる反応を触媒するビリルビン・オキシ
ダーゼを産生し、かつこのビリルビン・オキシダーゼが
ビリルビンに基質特異性を示し、ビリベルジン、カテコ
ールおよびヘミン等には、基質特異性を示さないという
優れた特性を有する酵素であることを見出した。 【０００６】本発明は、上記知見に基づいて完成された
ものであって、ビリルビンに基質特異性を有し、少なく
とも、ビリベルジン、カテコールおよびヘミンに基質特
異性を有さず、２分子のビリルビンおよび１分子の酸素
から、２分子のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素
反応を触媒するビリルビン・オキシダーゼの使用法に関
するものである。即ち、本発明は、被検体に、ビリルビ
ンに基質特異性を有し、少なくとも、ビリベルジン、カ
テコールおよびヘミンに基質特異性を有さず、２分子の
ビリルビンおよび１分子の酸素から２分子のビリベルジ
ンと２分子の水を生ずる酵素反応を触媒するペニシリウ
ム属に属する該ビリルビン・オキシダーゼ生産菌を培養
して得ることのできるビリルビン・オキシダーゼを作用
せしめ、被検体中のビリルビンを、ビルベルジンに変換
し、生成するビリベルジンの量または消費される酸素の
量を測定してなる被検体中のビリルビン量の測定法に関
するものである。更に本発明は、検体に、ビリルビンに
基質特異性を有し、少なくとも、ビリベルジン、カテコ
ールおよびヘミンに基質特異性を有さず、２分子のビリ
ルビンおよび１分子の酸素から２分子のビリベルジンと
２分子の水を生ずる酵素反応を触媒するペニシリウム属
に属する該ビリルビン・オキシダーゼ生産菌を培養して
得ることのできるビリルビン・オキシダーゼを作用せし
め、検体中のビリルビンを消去する方法に関するもので
ある。 【０００７】本発明の新規なビリルビン・オキシダーゼ
生産菌の分類学的性状は以下の通りである。 Ｉ．各培地における生育状態 １．ツァベック寒天培地（Ｃｚ） ２５℃の場合、生育は普通で、７日間で直径３６〜４０
ｍｍ。菌叢は平坦で綿毛状。淡黄色〔ｐａｌｅ ｙｅｌ
ｌｏｗ（Ｍｅｔｈｕｅｎ ３Ａ３）〕。浸出液は出さな
いか、出しても僅かで無色。拡散性色素は出さない。裏
面は灰黄色〔ｇｒｅｙｉｓｈ ｙｅｌｌｏｗ（４Ｃ
５）〕。 【０００８】２．酵母エキス添加ツァベック寒天培地
（ＣＹＡ） ２５℃の場合、生育は速く、７日間で直径４５〜４９ｍ
ｍ。菌叢やや厚く綿毛状。放射状に４〜５条の皺を持
ち、淡赤色〔ｐａｌｅ ｒｅｄ（９Ａ３）〕−緑灰色
〔ｇｒｅｅｎｉｓｈ ｇｒｅｙ（２７Ａ３）〕が混合し
た状態。周辺部は全緑。浸出液は大粒で淡赤色〔ｐａｌ
ｅ ｒｅｄ（９Ａ３）〕。拡散性色素は淡赤色〔ｐａｌ
ｅ ｒｅｄ（９Ａ３）〕。裏面は紫褐色〔ｖｉｏｌｅｔ
ｂｒｏｗｎ（１１Ｅ８）〕。 【０００９】３．麦芽汁寒天培地（ＨＡ） ２５℃の場合、生育は速く、７日間で直径４８〜５１ｍ
ｍ。菌叢は平坦で綿毛状。灰緑色〔ｇｒｅｙｉｓｈ ｇ
ｒｅｅｎ（２９Ｃ３）〕。周辺部は全緑。浸出液および
拡散性色素は出さない。裏面はオリーブ褐色〔ｏｌｉｖ
ｅ ｂｒｏｗｎ（４Ｄ７）〕。 【００１０】II. 生理的諸性状 生育し得るｐＨ １．５〜１０．５ 最適ｐＨ ３．５〜８．５ 生育し得る温度 １７〜３７℃ 最適生育温度 ２８〜３４℃ 【００１１】III.顕微鏡下における形態的特徴 有性世代は認められず、分生子により増殖。分生子柄
は、気中菌糸ないし気中菌糸から生じ、比較的長く、１
００〜２５０×２．０〜２．８μｍ、壁は滑面ないし僅
かに粗面。分生子形成様式はフィアロフォラ型。ペニシ
リンは単輪生ないし散開型。メトレは広角度に散開、１
１〜１５×２．５〜２．８μｍ、２〜３本輪生、滑面な
いし僅かに粗面。フィアリドはトックリ型、７〜１０×
２〜２．５μｍ、４〜７本輪生、分生子は亜球形ないし
楕円形で僅かに洋梨型が混在、２．３〜３．０×２．０
〜２．５μｍ、滑面ないし僅かに粗面。 【００１２】外生的な分生子を形成することから、Ｍ５
６１３株は不完全菌に属する。分生子形成様式はフィア
ロフォラ型で、フィアリドの先端から分生子を形成する
ことからペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に
属する。そこで、”Ｔｈｅｇｅｎｕｓ ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ”Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ．Ｌｏｎｄｏ
ｎ ｐ４３４（１９７９）および”Ａ ｍａｎｕａｌ
ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉａ”Ｔｈｅ ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏ
ｒｅ，ｐ８７５（１９４９）を参照とし、さらに、ペニ
シリウムは単輪生ないし散開状、各培地での生育が速
く、ＣＹＡにおいて裏面が著しく紫褐色となる等の特色
から、ペニシリウム・ジャンシネラム（Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）およびペニシリウ
ム・シンプリシシウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉ
ｍｐｌｉｃｉｓｓｉｕｍｕ）が挙げられるが、ペニシリ
ウム・シンプリシシウムは、分生子柄が４００〜８００
μｍと長い、分生子柄の壁が粗面、裏面が紫褐色とはな
らない等から区別でき、Ｍ５６１３株は、ペニシリウム
・ジャンシネラム（Ｐ．ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）と
同定された。尚、各培地における生育状態の色の表示は
Ｋｏｒｎｅｒｕｐ．Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｗａｎｓｃｈ
ｅｒ．１９７８．Ｍｅｔｈｕｅｎ ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆｃｏｌｏｕｒ．３ｒｄ ｅｄ．Ｅｙｒｅ Ｍｅｔｈ
ｕｅｎ，Ｌｏｎｄｏｎの表示法に従った。 【００１３】なお、本菌株は工業技術院微生物生命工学
技術研究所にペニシリウム ジャンシネラムＭ５６１３
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ
Ｍ５６１３）微工研菌第９１６７号（ＦＥＲＭ Ｐ−
９１６７）として寄託されている。そして、本菌株はブ
タペスト条約に基づく寄託に移管され、微工研条寄第１
６７４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６７４）として寄託され
ている。 【００１４】本発明のビリルビン・オキシダーゼを生産
するに当たっては、このビリルビン・オキシダーゼ生産
菌を酵素などを生産する通常の方法で培養する。培養の
形態は、液体培養でも固体培養でもよいが、工業的には
ビリルビン・オキシダーゼ生産菌の細胞をその生産用培
地に接種し、深部通気攪拌培養を行うのが有利である。
ビリルビン・オキシダーゼを培養するための培地組成
は、微生物とくにペニシリウムの培養に通常用いられる
ものが広く使用される。 【００１５】窒素源として利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばコーン・スチープ・リカー、ペプトン、
カゼイン、大豆粉、酵母エキス、種々の肉エキスなどが
使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であ
ればよく、例えば糖密、グルコース、シュクロース、デ
キストリンなどが使用される。その他馬鈴薯エキスも好
適な培地成分であり、また食塩、塩化カリウム、硫酸マ
グネシウム、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム
等の種々の無機塩が必要に応じて使用される。培養温度
は菌が発育し、ビリルビン・オキシダーゼを生産する範
囲内で適宜変更し得るが、２０〜３７℃、好ましくは２
５〜３０℃、特に２８℃である。培養時間は、条件によ
つて多少異なるが、通常２〜８日、特に４日程度であ
る。しかしながら、ビリルビン・オキシダーゼが最高力
価に達する時期をみはからって適当な時期に培養を終了
するのは当然のことである。 【００１６】培養終了後、該培養物より本酵素を採取す
るには通常の酵素採取手段を用いることができる。な
お、本酵素は、菌体内および培養液相の両方に存在する
が、採取効率等の問題により、通常は、該培養物より菌
体を分別除去した培養液相より得るが、菌体内より酵素
を採取する通常の手段を用いて酵素を採取、培養液相よ
り得たものと合わせて用いてもよい。このようにして得
られた粗酵素液は、さらに公知の蛋白質、酵素などの単
離、精製手段を用いて精製し、精製されたビリルビン・
オキシダーゼが得られる。例えば、粗製のビリルビン・
オキシダーゼ含有液に、アセトン、メタノールなどの有
機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩、硫酸アルミニウ
ムなどによる塩析法などを用い溶液から酵素を沈澱せし
め、粗酵素を回収すればよい。 【００１７】次いで、さらに必要に応じて精製するにあ
たって、この沈澱物を、トリス−塩酸緩衝液などの溶媒
に溶解し、これをカルボキシメチル−セルロース、カル
ボキシメチル−デキストランゲル、スルホプロピル−デ
キストランゲルなどのイオン交換樹脂やデキストランゲ
ルやポリアクリルアマイドゲルなどのゲル濾過剤による
吸着クロマトグラフイーを適宜組み合わせて行って精製
し、次いでこれを凍結乾燥等の手法を用い乾燥し、精製
ビリルビン・オキシダーゼを得る。このようにして得ら
れたビリルビン・オキシダーゼの理化学的性質は以下に
述べる通りである。 【００１８】（１）活性測定法 基質溶液の調製：非抱合非結合型ビリルビン（和光純薬
社製）６ｍｇを１００ｍｌビーカーに取り、５Ｎ Ｎａ
ＯＨ溶液０．５ｍｌで湿らせ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液
１０ｍｌを添加して良く混合し、水７０ｍｌを加えてｐ
Ｈを８．４に調製後、１００ｍｌにメスアップする。 【００１９】酵素溶液の調整：後述の実施例に基づき得
られたビリルビン・オキシダーゼ凍結乾燥品５０ｍｇを
正確に秤り取り、蒸留水６５ｍｌで溶解し、３７℃に調
整した。 活性測定：基質溶液３ｍｌを小試験管に取り３７℃、水
浴中に２分間静置した後、酵素溶液０．１ｍｌ添加し、
反応を開始した。次に、正確に１０分間、３７℃で反応
した後に６８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計を用い
て測定した（Ａ1 ）、酵素溶液０．１ｍｌの代わりに水
０．１ｍｌを添加したものを対照として測定した
（Ａ2 ）。 【００２０】ビリルビン・オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍ
ｌ） １１．９＊1 ：ビリベルジン２塩酸塩（シグマ社製、ｌ
ｏｔ．４３Ｆ−８０２０）８．３ｍｇを１Ｍトリス−塩
酸緩衝液１０ｍｌで溶解し、水７０ｍｌを添加して５Ｎ
ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．４に調整し、１００
ｍｌにメスアップした。これを０．１Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．４）を用いて２、５、１０倍に希釈し、
７５０〜３５０ｎｍの全吸収を分光度計（島津製作所社
製、ＵＶ−２１０Ａ）を用いて測定した。図５に示した
ように、２倍に希釈したビリベルジン溶液の６８０ｎｍ
の吸光度は０．７３、５倍に希釈したものは０．３、１
０倍に希釈したものは０．１５５の値を示した。これら
の結果からビリベルジンの１ｍＭ溶液の６８０ｎｍにお
ける吸光度を１１．９とした。 【００２１】（２）基質特異性：酸素電極計を用いて各
基質に対する特異性を酸素消費速度から検討した。この
時、基質溶液には０．１ｍＭになるようにＨｇＣｌ2 を
添加した。基質は、０．１ｍＭ、酵素は前述の活性測定
に用いた酵素液０．１ｍｌを用いて行った結果、表１に
示す通り、ビリルビン以外の基質は反応を示さなかっ
た。それ故、本発明のビリルビン・オキシダーゼはビリ
ルビンに特異性が非常に高い。 【００２２】 【表１】 【００２３】（３）酵素作用：次の反応を触媒する。 ビリルビン ＋ １／２Ｏ2 → ビリベルジン ＋
Ｈ2 Ｏ 【００２４】（４）熱安定性：０．２Ｍリン酸カリウム
塩緩衝液（ｐＨ６．５）０．５ｍｌに前述の酵素溶液
０．５ｍｌを添加したものを４０〜８０℃各温度で３０
分間づつ加熱し、活性測定法に基づいて残存活性を測定
した。その結果は、図１に示す通り５０℃まで安定であ
った。 【００２５】（５）至適温度：活性測定法における基質
溶液を用いて４０〜７０℃の各温度における本発明のビ
リルビン・オキシダーゼの活性を測定した結果は、図２
に示す通りで、至適温度は５５〜６０℃であった。 【００２６】（６）ｐＨ安定性：前述の酵素溶液０．５
ｍｌに０．２Ｍの各ｐＨ緩衝液を０．５ｍｌづつ添加
し、７０℃で３０分間加温した後、この反応液を０．１
ｍｌを活性測定法に基づいて残存活性を測定し、ｐＨの
影響をしらべた。その結果は、図３に示す通りであり、
〔図中：緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）●−
●、リン酸カリウム塩緩衝液（ｐＨ６〜７）△−△、ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜８）○−○を示す〕、本発
明のビリルビン・オキシダーゼのｐＨ安定性はｐＨ４．
０〜４．５付近と認められた。 【００２７】（７）至適ｐＨ：活性測定法で作成した基
質溶液を５Ｎ ＨＣｌあるいは５Ｎ ＮａＯＨを用いて
ｐＨ７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０に
調整し、これを用いて至適ｐＨの測定を行った。ただ
し、ｐＨの変動によってビリベルジンの吸光度が変化し
ないと仮定した。その結果は、図４に示す通りで、ｐＨ
８．５〜９．０に至適ｐＨを有していた。 【００２８】（８）阻害および活性化：活性測定法に基
づいて基質溶液に金属イオン、ＥＤＴＡ、界面活性剤を
それぞれ１ｍＭ、１ｍＭおよび０．０５％添加し、ビリ
ルビン・オキシダーゼの活性を測定して、無添加時の活
性を１００としたときの相対活性を求めた。その結果
は、表２に示す通りであって、水銀イオン、鉛イオン、
セチルトリメチルアンモニウムクロライドで著しく活性
化され、銅イオン、コバルトイオンで著しく阻害され
た。 【００２９】（９）分子量：５００，０００±５０，０
００（セフアデックスＧ−２００によるゲル濾過法によ
る。分子量マーカ；カタラーゼ、フエリチン及びチログ
ロブリンを使用）。 （１０）等電点：焦点電気泳動装置により測定した結果
は、ｐＨ４．７±０．５に等電点を有する。 【００３０】 【表２】 ＊1 ；セチルトリメチルアンモニウムクロリド ＊2 ；セチルトリメチルアンモニウムブロミド 【００３１】（１１）Ｋｍ値：ビリルビン標品（和光純
薬社製）を２、４、６、８、１０、１５、２０ｍｇと
り、活性測定法の基質溶液の調整に基づいて溶解し、前
述の活性測定に用いた酵素溶液０．１ｍｌを用いてＫｍ
値を測定した結果、本測定条件下でビリルビンに対する
Ｋｍ値は、１．１×１０-4Ｍであった。 以上の諸性質を公知のビリルビン・オキシダーゼと比較
すると、いずれの酵素とも異なることが判る。 【００３２】本発明のビリルビン・オキシダーゼを用い
て被検体中のビリルビン量を測定するには、公知のビリ
ルビン測定法が適応可能である。即ち被検体試料中のビ
リルビンを本発明のビリルビン・オキシダーゼの作用に
よりビリルベルジンに変換せしめ、生成するビリベルジ
ン量または反応において消費される酸素量を測定するこ
とによつて、被検体中のビリルビン量を測定することが
きる。 【００３３】検体中のビリルビンの濃度を測定する場合
において、用いられる本発明ビリルビン・オキシダーゼ
の量は、ビリルビン・オキシダーゼ活性として、０．０
１〜１０単位であるが、測定時間に応じて適宜調節すれ
ばよく、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウ
ム、フェリシアン化カリウム等の反応促進物質およびそ
の他緩衝液、酵素の安定化剤などは、必要に応じて加え
ればよい。 【００３４】また、検体中の抱合型ビリルビンおよび非
抱合型ビリルビンを分別測定する場合においても公知の
方法に、本発明ビリルビン・オキシダーゼを適用すれば
よく、例えば抱合型ビリルビンはｐＨ６未満で分析を行
うことによつて検出でき、総ビルリビン量は、ｐＨ６〜
１０で分析を行うことができ、非抱合型ビリルビンは、
総ビリルビン量から抱合型ビリルビン量を減じることに
よつて求められる。 【００３５】さらに、本発明ビリルビン・オキシダーゼ
を適宜添加することにより、臨床診断における検体中の
ビリルビン以外の他の物質を測定する系、たとえばグル
コース測定において、グルコース・オキシダーゼ−パー
オキシダーゼを用いる系、コレステロール測定におい
て、コステロール・オキシダーゼ−パーオキシダーゼを
用いる系等において、測定物質であるビリルビンを消去
することができる。 【００３６】以下に本発明の実施例および参考例を挙げ
る。ただし、本発明はこれら実施例および参考例に限定
されるものでないことはいうまでもない。 参考例 １ 馬鈴薯の皮むき薄切り２００ｇに蒸留水１リットルを添
加し、１時間煮沸後、布で濾過した上清にブドウ糖２０
ｇ、酵母エキス１．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２．０ｇ、Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇを添加し、溶解後蒸留水を
加え１リットルにした。本培養液１００ｍｌを５００ｍ
ｌ三角フラスコに分注し、１２１℃、２０分間加熱滅菌
した。これにペニシリウム・ジャンシネラム Ｍ５６１
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６７４）の保存寒天斜面培地よ
り１白金耳を接種し、２８℃にて４日間振とう培養し
た。 【００３７】培養液１０ｍｌを２０分間、３℃、１５Ｋ
Ｈｚの音波処理を行い菌体を破壊した。これを５回繰り
返し行い５０ｍｌの粗酵素液を得た（２０ｕ）。これを
２０分間、５℃、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離
した上清を１Ｎ塩酸を用いてｐＨ５．０に調整し、２０
分間、５℃、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し
た。この沈澱を２０ｍＭリン酸カリウム塩緩衝液（ｐＨ
６．５）５０ｍｌで溶解し、２０分間、１５，０００
ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、上清を得た（１１．３
ｕ）。この５ｍｌを２０ｍＭリン酸カリウム塩緩衝液
（ｐＨ６．５）で緩衝化したセファデックスＧ−１００
（２．８×６０ｃｍ）カラムを用いてゲル濾過を行っ
た。これを１０回繰り返し、５０ｍｌの酵素溶液を得た
（７．２ｕ）。これに１００ｍｇのサッカロースを添加
し、常法に基づいて凍結乾燥し、０．０１８ｕ／ｍｇの
凍結乾燥品を３２０ｍｇ得た。 【００３８】実施例 １ 前記活性測定法・基質溶液の調製に従って作成した基質
溶液３ｍｌを、３ｍｌ容石英セルに取り、１０ｍＭ Ｈ
ｇＣｌ2 を３０μｌ添加した。これに実施例１により得
たビリルビン・オキシダーゼ凍結乾燥品を５０ｍｇ正確
に秤り取り、蒸留水６．５ｍｌで溶解したビリルビン・
オキシダーゼ溶液を５０μｌ、及び１００μｌ添加し、
分光光度計（島津製作所社製、ＵＶ−２１０Ａ）にセッ
トし、３７℃で６８０ｎｍにおける吸光度の経時変化を
チャートに描いた（図６）。図６から明らかなように、
５０μｌの酵素液を使用すると６分でビリルビン・オキ
シダーゼの反応は終了し、１００μｌの酵素液を使用す
ると、３．５分で反応は終了した。これから本条件下で
は短時間でビリルビンの測定を、ビリベルジンの生成を
測定することで可能となり、またビリルビンの消去も基
質特異性が高いことから他の粗製物に影響を及ぼしにく
い条件で可能となった。 【００３９】実施例 ２ 人血清を０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、
０．６、０．７ｍｌそれぞれ分取し、ここに０．１Ｍト
リス−塩酸緩衝液を加えて３ｍｌとし、本発明ビリルビ
ン・オキシダーゼ０．１Ｕを添加し、３７℃、３０分間
インキュベートし、その反応液について分光光度計（島
津製作所社製、ＵＶ−２１０Ａ）にセットし、３７℃で
６８０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図７
に示すが、種々の割合に希釈した血清溶液において極め
て良好な直線性が得られた。 【００４０】実施例 ３ 検量線の作成 （１）試液の調整： 緩衝液 ：０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
４） 酵素反応液：０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
４）に本発明ビリルビン・オキシダーゼを０．１Ｕ／テ
ストの割合で添加して調整した。 （２）標準ビリルビン溶液の調整：非抱合型非結合型ビ
リルビン（和光純薬社製）５．９ｍｇを正確に秤り取
り、５Ｎ ＮａＯＨ溶液０．５ｍｌで湿らせ、１Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１０ｍｌで溶かした後、
１００ｍｌにメスアップしたものを、１００μＭビリル
ビン溶液とし、これを０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．４）で希釈して、２、４、６、８、１０、１４μ
Ｍの標準ビリルビン溶液を調整した。 【００４１】（３）上記の標準ビリルビン溶液をそれぞ
れ３ｍｌづつに、上記酵素反応液を添加し、３７℃、３
０分間インキュベートし、その反応液について、分光光
度計（島津製作所社製、ＵＶ−２１０Ａ）にセットし、
３７℃で６８０ｎｍにける吸光度を測定した。その結果
を図８に示すが、極めて良好な直線性を示した。 【００４２】 【発明の効果】本発明のビリルビン・オキシダーゼはビ
リルビンに基質特異性を有し、肝疾患の診断に有利であ
り、また、臨床診断における検体中のビリルビンが他の
物質の測定における阻害となる場合において、ビリルビ
ンの消去に有用であり、更に活性も非常に高いので屎尿
処理水の脱色への利用が期待される。
・オキシダーゼを用いた測定法および検体中のビリルビ
ンを消去する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ビリルビン・オキシダーゼは、ビリルビ
ンおよび酸素からビリベルジンと水を生成する反応を触
媒する酵素であり、従来より、ミロセシウム属（特開昭
６０−１２０３２号）、バチルス属（特開昭６１−２０
９５８７号）、スエヒロタケ属（特開昭５９−１３５８
８６号）、コプリナス属、トラメテス属、コリオラマ
属、フォリオタ属、プロイロタス属、レンジデス属、フ
シドプシス属（特開昭５９−１９８９７１号）、ナス
科、バショウ科、ユリ科（特開昭６０−７８５８０号）
などが由来する酵素が知られている。 【０００３】ビリルビンは、ヘモグロビンの分解によつ
て血中に形成される黄色物質であり、肝臓で作られる胆
汁の主色素である。血清中には抱合ビリルビン及び遊離
ビリルビンが存在し、血清中の抱合ビリルビンの増加か
ら、肝ミクロゾームにおける抱合から十二指腸までのビ
リルビン運搬系の障害をきたしたことから、また血清中
の遊離ビリルビンの増加からは、種々の原因によって生
ずる溶血性貧血等を生じたことを示し、抱合及び／又は
遊離ビリルビンを定量することは臨床的に極めて重要で
ある。さらに、被検体サンプル中のビリルビンレベルを
積極的に低下させるために、ビリルビン・オキシダーゼ
は非常に有用である。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】上記したような従来公
知のビリルビン・オキシダーゼは、基質特異性が低く、
そのために例えば臨床化学分野で使用するには問題があ
った。即ち、上記した公知の微生物由来のビリルビン・
オキシダーゼは、全てビリベルジンにも基質特異性を有
しており、ビリルビンの分析には適していなかった。ま
た、植物由来の酵素は、原料に季節的な要因をはじめと
する種々の制約があり、工業的には有利とは言えない
し、その基質特異性についてもナス科のものは、ビリベ
ルジン、ヘモグロビンには作用しないことを示してい
る、と述べられているが、その他の基質については何も
開示されておらない。このように、公知のビリルビン・
オキシダーゼは、テトラピロール構造を持つ物質あるい
はフエノール系物質に作用するため、臨床検査分野にお
ける血液生化学検査に用いる場合、夾雑する他の組成物
に大きく影響されるという欠点があった。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、これら従
来公知における酵素の欠点のないビリルビン・オキシダ
ーゼにつき、種々の研究をした結果、静岡県駿東郡長泉
町の土壌より分離した不完全菌でペニシリウム属に属す
る菌株Ｍ５６１３株が、ビリルビンおよび酸素からビリ
ルビンと水を生ずる反応を触媒するビリルビン・オキシ
ダーゼを産生し、かつこのビリルビン・オキシダーゼが
ビリルビンに基質特異性を示し、ビリベルジン、カテコ
ールおよびヘミン等には、基質特異性を示さないという
優れた特性を有する酵素であることを見出した。 【０００６】本発明は、上記知見に基づいて完成された
ものであって、ビリルビンに基質特異性を有し、少なく
とも、ビリベルジン、カテコールおよびヘミンに基質特
異性を有さず、２分子のビリルビンおよび１分子の酸素
から、２分子のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素
反応を触媒するビリルビン・オキシダーゼの使用法に関
するものである。即ち、本発明は、被検体に、ビリルビ
ンに基質特異性を有し、少なくとも、ビリベルジン、カ
テコールおよびヘミンに基質特異性を有さず、２分子の
ビリルビンおよび１分子の酸素から２分子のビリベルジ
ンと２分子の水を生ずる酵素反応を触媒するペニシリウ
ム属に属する該ビリルビン・オキシダーゼ生産菌を培養
して得ることのできるビリルビン・オキシダーゼを作用
せしめ、被検体中のビリルビンを、ビルベルジンに変換
し、生成するビリベルジンの量または消費される酸素の
量を測定してなる被検体中のビリルビン量の測定法に関
するものである。更に本発明は、検体に、ビリルビンに
基質特異性を有し、少なくとも、ビリベルジン、カテコ
ールおよびヘミンに基質特異性を有さず、２分子のビリ
ルビンおよび１分子の酸素から２分子のビリベルジンと
２分子の水を生ずる酵素反応を触媒するペニシリウム属
に属する該ビリルビン・オキシダーゼ生産菌を培養して
得ることのできるビリルビン・オキシダーゼを作用せし
め、検体中のビリルビンを消去する方法に関するもので
ある。 【０００７】本発明の新規なビリルビン・オキシダーゼ
生産菌の分類学的性状は以下の通りである。 Ｉ．各培地における生育状態 １．ツァベック寒天培地（Ｃｚ） ２５℃の場合、生育は普通で、７日間で直径３６〜４０
ｍｍ。菌叢は平坦で綿毛状。淡黄色〔ｐａｌｅ ｙｅｌ
ｌｏｗ（Ｍｅｔｈｕｅｎ ３Ａ３）〕。浸出液は出さな
いか、出しても僅かで無色。拡散性色素は出さない。裏
面は灰黄色〔ｇｒｅｙｉｓｈ ｙｅｌｌｏｗ（４Ｃ
５）〕。 【０００８】２．酵母エキス添加ツァベック寒天培地
（ＣＹＡ） ２５℃の場合、生育は速く、７日間で直径４５〜４９ｍ
ｍ。菌叢やや厚く綿毛状。放射状に４〜５条の皺を持
ち、淡赤色〔ｐａｌｅ ｒｅｄ（９Ａ３）〕−緑灰色
〔ｇｒｅｅｎｉｓｈ ｇｒｅｙ（２７Ａ３）〕が混合し
た状態。周辺部は全緑。浸出液は大粒で淡赤色〔ｐａｌ
ｅ ｒｅｄ（９Ａ３）〕。拡散性色素は淡赤色〔ｐａｌ
ｅ ｒｅｄ（９Ａ３）〕。裏面は紫褐色〔ｖｉｏｌｅｔ
ｂｒｏｗｎ（１１Ｅ８）〕。 【０００９】３．麦芽汁寒天培地（ＨＡ） ２５℃の場合、生育は速く、７日間で直径４８〜５１ｍ
ｍ。菌叢は平坦で綿毛状。灰緑色〔ｇｒｅｙｉｓｈ ｇ
ｒｅｅｎ（２９Ｃ３）〕。周辺部は全緑。浸出液および
拡散性色素は出さない。裏面はオリーブ褐色〔ｏｌｉｖ
ｅ ｂｒｏｗｎ（４Ｄ７）〕。 【００１０】II. 生理的諸性状 生育し得るｐＨ １．５〜１０．５ 最適ｐＨ ３．５〜８．５ 生育し得る温度 １７〜３７℃ 最適生育温度 ２８〜３４℃ 【００１１】III.顕微鏡下における形態的特徴 有性世代は認められず、分生子により増殖。分生子柄
は、気中菌糸ないし気中菌糸から生じ、比較的長く、１
００〜２５０×２．０〜２．８μｍ、壁は滑面ないし僅
かに粗面。分生子形成様式はフィアロフォラ型。ペニシ
リンは単輪生ないし散開型。メトレは広角度に散開、１
１〜１５×２．５〜２．８μｍ、２〜３本輪生、滑面な
いし僅かに粗面。フィアリドはトックリ型、７〜１０×
２〜２．５μｍ、４〜７本輪生、分生子は亜球形ないし
楕円形で僅かに洋梨型が混在、２．３〜３．０×２．０
〜２．５μｍ、滑面ないし僅かに粗面。 【００１２】外生的な分生子を形成することから、Ｍ５
６１３株は不完全菌に属する。分生子形成様式はフィア
ロフォラ型で、フィアリドの先端から分生子を形成する
ことからペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に
属する。そこで、”Ｔｈｅｇｅｎｕｓ ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ”Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ．Ｌｏｎｄｏ
ｎ ｐ４３４（１９７９）および”Ａ ｍａｎｕａｌ
ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉａ”Ｔｈｅ ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏ
ｒｅ，ｐ８７５（１９４９）を参照とし、さらに、ペニ
シリウムは単輪生ないし散開状、各培地での生育が速
く、ＣＹＡにおいて裏面が著しく紫褐色となる等の特色
から、ペニシリウム・ジャンシネラム（Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）およびペニシリウ
ム・シンプリシシウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉ
ｍｐｌｉｃｉｓｓｉｕｍｕ）が挙げられるが、ペニシリ
ウム・シンプリシシウムは、分生子柄が４００〜８００
μｍと長い、分生子柄の壁が粗面、裏面が紫褐色とはな
らない等から区別でき、Ｍ５６１３株は、ペニシリウム
・ジャンシネラム（Ｐ．ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）と
同定された。尚、各培地における生育状態の色の表示は
Ｋｏｒｎｅｒｕｐ．Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｗａｎｓｃｈ
ｅｒ．１９７８．Ｍｅｔｈｕｅｎ ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆｃｏｌｏｕｒ．３ｒｄ ｅｄ．Ｅｙｒｅ Ｍｅｔｈ
ｕｅｎ，Ｌｏｎｄｏｎの表示法に従った。 【００１３】なお、本菌株は工業技術院微生物生命工学
技術研究所にペニシリウム ジャンシネラムＭ５６１３
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ
Ｍ５６１３）微工研菌第９１６７号（ＦＥＲＭ Ｐ−
９１６７）として寄託されている。そして、本菌株はブ
タペスト条約に基づく寄託に移管され、微工研条寄第１
６７４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６７４）として寄託され
ている。 【００１４】本発明のビリルビン・オキシダーゼを生産
するに当たっては、このビリルビン・オキシダーゼ生産
菌を酵素などを生産する通常の方法で培養する。培養の
形態は、液体培養でも固体培養でもよいが、工業的には
ビリルビン・オキシダーゼ生産菌の細胞をその生産用培
地に接種し、深部通気攪拌培養を行うのが有利である。
ビリルビン・オキシダーゼを培養するための培地組成
は、微生物とくにペニシリウムの培養に通常用いられる
ものが広く使用される。 【００１５】窒素源として利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばコーン・スチープ・リカー、ペプトン、
カゼイン、大豆粉、酵母エキス、種々の肉エキスなどが
使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であ
ればよく、例えば糖密、グルコース、シュクロース、デ
キストリンなどが使用される。その他馬鈴薯エキスも好
適な培地成分であり、また食塩、塩化カリウム、硫酸マ
グネシウム、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム
等の種々の無機塩が必要に応じて使用される。培養温度
は菌が発育し、ビリルビン・オキシダーゼを生産する範
囲内で適宜変更し得るが、２０〜３７℃、好ましくは２
５〜３０℃、特に２８℃である。培養時間は、条件によ
つて多少異なるが、通常２〜８日、特に４日程度であ
る。しかしながら、ビリルビン・オキシダーゼが最高力
価に達する時期をみはからって適当な時期に培養を終了
するのは当然のことである。 【００１６】培養終了後、該培養物より本酵素を採取す
るには通常の酵素採取手段を用いることができる。な
お、本酵素は、菌体内および培養液相の両方に存在する
が、採取効率等の問題により、通常は、該培養物より菌
体を分別除去した培養液相より得るが、菌体内より酵素
を採取する通常の手段を用いて酵素を採取、培養液相よ
り得たものと合わせて用いてもよい。このようにして得
られた粗酵素液は、さらに公知の蛋白質、酵素などの単
離、精製手段を用いて精製し、精製されたビリルビン・
オキシダーゼが得られる。例えば、粗製のビリルビン・
オキシダーゼ含有液に、アセトン、メタノールなどの有
機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩、硫酸アルミニウ
ムなどによる塩析法などを用い溶液から酵素を沈澱せし
め、粗酵素を回収すればよい。 【００１７】次いで、さらに必要に応じて精製するにあ
たって、この沈澱物を、トリス−塩酸緩衝液などの溶媒
に溶解し、これをカルボキシメチル−セルロース、カル
ボキシメチル−デキストランゲル、スルホプロピル−デ
キストランゲルなどのイオン交換樹脂やデキストランゲ
ルやポリアクリルアマイドゲルなどのゲル濾過剤による
吸着クロマトグラフイーを適宜組み合わせて行って精製
し、次いでこれを凍結乾燥等の手法を用い乾燥し、精製
ビリルビン・オキシダーゼを得る。このようにして得ら
れたビリルビン・オキシダーゼの理化学的性質は以下に
述べる通りである。 【００１８】（１）活性測定法 基質溶液の調製：非抱合非結合型ビリルビン（和光純薬
社製）６ｍｇを１００ｍｌビーカーに取り、５Ｎ Ｎａ
ＯＨ溶液０．５ｍｌで湿らせ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液
１０ｍｌを添加して良く混合し、水７０ｍｌを加えてｐ
Ｈを８．４に調製後、１００ｍｌにメスアップする。 【００１９】酵素溶液の調整：後述の実施例に基づき得
られたビリルビン・オキシダーゼ凍結乾燥品５０ｍｇを
正確に秤り取り、蒸留水６５ｍｌで溶解し、３７℃に調
整した。 活性測定：基質溶液３ｍｌを小試験管に取り３７℃、水
浴中に２分間静置した後、酵素溶液０．１ｍｌ添加し、
反応を開始した。次に、正確に１０分間、３７℃で反応
した後に６８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計を用い
て測定した（Ａ1 ）、酵素溶液０．１ｍｌの代わりに水
０．１ｍｌを添加したものを対照として測定した
（Ａ2 ）。 【００２０】ビリルビン・オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍ
ｌ） １１．９＊1 ：ビリベルジン２塩酸塩（シグマ社製、ｌ
ｏｔ．４３Ｆ−８０２０）８．３ｍｇを１Ｍトリス−塩
酸緩衝液１０ｍｌで溶解し、水７０ｍｌを添加して５Ｎ
ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．４に調整し、１００
ｍｌにメスアップした。これを０．１Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．４）を用いて２、５、１０倍に希釈し、
７５０〜３５０ｎｍの全吸収を分光度計（島津製作所社
製、ＵＶ−２１０Ａ）を用いて測定した。図５に示した
ように、２倍に希釈したビリベルジン溶液の６８０ｎｍ
の吸光度は０．７３、５倍に希釈したものは０．３、１
０倍に希釈したものは０．１５５の値を示した。これら
の結果からビリベルジンの１ｍＭ溶液の６８０ｎｍにお
ける吸光度を１１．９とした。 【００２１】（２）基質特異性：酸素電極計を用いて各
基質に対する特異性を酸素消費速度から検討した。この
時、基質溶液には０．１ｍＭになるようにＨｇＣｌ2 を
添加した。基質は、０．１ｍＭ、酵素は前述の活性測定
に用いた酵素液０．１ｍｌを用いて行った結果、表１に
示す通り、ビリルビン以外の基質は反応を示さなかっ
た。それ故、本発明のビリルビン・オキシダーゼはビリ
ルビンに特異性が非常に高い。 【００２２】 【表１】 【００２３】（３）酵素作用：次の反応を触媒する。 ビリルビン ＋ １／２Ｏ2 → ビリベルジン ＋
Ｈ2 Ｏ 【００２４】（４）熱安定性：０．２Ｍリン酸カリウム
塩緩衝液（ｐＨ６．５）０．５ｍｌに前述の酵素溶液
０．５ｍｌを添加したものを４０〜８０℃各温度で３０
分間づつ加熱し、活性測定法に基づいて残存活性を測定
した。その結果は、図１に示す通り５０℃まで安定であ
った。 【００２５】（５）至適温度：活性測定法における基質
溶液を用いて４０〜７０℃の各温度における本発明のビ
リルビン・オキシダーゼの活性を測定した結果は、図２
に示す通りで、至適温度は５５〜６０℃であった。 【００２６】（６）ｐＨ安定性：前述の酵素溶液０．５
ｍｌに０．２Ｍの各ｐＨ緩衝液を０．５ｍｌづつ添加
し、７０℃で３０分間加温した後、この反応液を０．１
ｍｌを活性測定法に基づいて残存活性を測定し、ｐＨの
影響をしらべた。その結果は、図３に示す通りであり、
〔図中：緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）●−
●、リン酸カリウム塩緩衝液（ｐＨ６〜７）△−△、ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜８）○−○を示す〕、本発
明のビリルビン・オキシダーゼのｐＨ安定性はｐＨ４．
０〜４．５付近と認められた。 【００２７】（７）至適ｐＨ：活性測定法で作成した基
質溶液を５Ｎ ＨＣｌあるいは５Ｎ ＮａＯＨを用いて
ｐＨ７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０に
調整し、これを用いて至適ｐＨの測定を行った。ただ
し、ｐＨの変動によってビリベルジンの吸光度が変化し
ないと仮定した。その結果は、図４に示す通りで、ｐＨ
８．５〜９．０に至適ｐＨを有していた。 【００２８】（８）阻害および活性化：活性測定法に基
づいて基質溶液に金属イオン、ＥＤＴＡ、界面活性剤を
それぞれ１ｍＭ、１ｍＭおよび０．０５％添加し、ビリ
ルビン・オキシダーゼの活性を測定して、無添加時の活
性を１００としたときの相対活性を求めた。その結果
は、表２に示す通りであって、水銀イオン、鉛イオン、
セチルトリメチルアンモニウムクロライドで著しく活性
化され、銅イオン、コバルトイオンで著しく阻害され
た。 【００２９】（９）分子量：５００，０００±５０，０
００（セフアデックスＧ−２００によるゲル濾過法によ
る。分子量マーカ；カタラーゼ、フエリチン及びチログ
ロブリンを使用）。 （１０）等電点：焦点電気泳動装置により測定した結果
は、ｐＨ４．７±０．５に等電点を有する。 【００３０】 【表２】 ＊1 ；セチルトリメチルアンモニウムクロリド ＊2 ；セチルトリメチルアンモニウムブロミド 【００３１】（１１）Ｋｍ値：ビリルビン標品（和光純
薬社製）を２、４、６、８、１０、１５、２０ｍｇと
り、活性測定法の基質溶液の調整に基づいて溶解し、前
述の活性測定に用いた酵素溶液０．１ｍｌを用いてＫｍ
値を測定した結果、本測定条件下でビリルビンに対する
Ｋｍ値は、１．１×１０-4Ｍであった。 以上の諸性質を公知のビリルビン・オキシダーゼと比較
すると、いずれの酵素とも異なることが判る。 【００３２】本発明のビリルビン・オキシダーゼを用い
て被検体中のビリルビン量を測定するには、公知のビリ
ルビン測定法が適応可能である。即ち被検体試料中のビ
リルビンを本発明のビリルビン・オキシダーゼの作用に
よりビリルベルジンに変換せしめ、生成するビリベルジ
ン量または反応において消費される酸素量を測定するこ
とによつて、被検体中のビリルビン量を測定することが
きる。 【００３３】検体中のビリルビンの濃度を測定する場合
において、用いられる本発明ビリルビン・オキシダーゼ
の量は、ビリルビン・オキシダーゼ活性として、０．０
１〜１０単位であるが、測定時間に応じて適宜調節すれ
ばよく、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウ
ム、フェリシアン化カリウム等の反応促進物質およびそ
の他緩衝液、酵素の安定化剤などは、必要に応じて加え
ればよい。 【００３４】また、検体中の抱合型ビリルビンおよび非
抱合型ビリルビンを分別測定する場合においても公知の
方法に、本発明ビリルビン・オキシダーゼを適用すれば
よく、例えば抱合型ビリルビンはｐＨ６未満で分析を行
うことによつて検出でき、総ビルリビン量は、ｐＨ６〜
１０で分析を行うことができ、非抱合型ビリルビンは、
総ビリルビン量から抱合型ビリルビン量を減じることに
よつて求められる。 【００３５】さらに、本発明ビリルビン・オキシダーゼ
を適宜添加することにより、臨床診断における検体中の
ビリルビン以外の他の物質を測定する系、たとえばグル
コース測定において、グルコース・オキシダーゼ−パー
オキシダーゼを用いる系、コレステロール測定におい
て、コステロール・オキシダーゼ−パーオキシダーゼを
用いる系等において、測定物質であるビリルビンを消去
することができる。 【００３６】以下に本発明の実施例および参考例を挙げ
る。ただし、本発明はこれら実施例および参考例に限定
されるものでないことはいうまでもない。 参考例 １ 馬鈴薯の皮むき薄切り２００ｇに蒸留水１リットルを添
加し、１時間煮沸後、布で濾過した上清にブドウ糖２０
ｇ、酵母エキス１．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２．０ｇ、Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇを添加し、溶解後蒸留水を
加え１リットルにした。本培養液１００ｍｌを５００ｍ
ｌ三角フラスコに分注し、１２１℃、２０分間加熱滅菌
した。これにペニシリウム・ジャンシネラム Ｍ５６１
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６７４）の保存寒天斜面培地よ
り１白金耳を接種し、２８℃にて４日間振とう培養し
た。 【００３７】培養液１０ｍｌを２０分間、３℃、１５Ｋ
Ｈｚの音波処理を行い菌体を破壊した。これを５回繰り
返し行い５０ｍｌの粗酵素液を得た（２０ｕ）。これを
２０分間、５℃、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離
した上清を１Ｎ塩酸を用いてｐＨ５．０に調整し、２０
分間、５℃、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し
た。この沈澱を２０ｍＭリン酸カリウム塩緩衝液（ｐＨ
６．５）５０ｍｌで溶解し、２０分間、１５，０００
ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、上清を得た（１１．３
ｕ）。この５ｍｌを２０ｍＭリン酸カリウム塩緩衝液
（ｐＨ６．５）で緩衝化したセファデックスＧ−１００
（２．８×６０ｃｍ）カラムを用いてゲル濾過を行っ
た。これを１０回繰り返し、５０ｍｌの酵素溶液を得た
（７．２ｕ）。これに１００ｍｇのサッカロースを添加
し、常法に基づいて凍結乾燥し、０．０１８ｕ／ｍｇの
凍結乾燥品を３２０ｍｇ得た。 【００３８】実施例 １ 前記活性測定法・基質溶液の調製に従って作成した基質
溶液３ｍｌを、３ｍｌ容石英セルに取り、１０ｍＭ Ｈ
ｇＣｌ2 を３０μｌ添加した。これに実施例１により得
たビリルビン・オキシダーゼ凍結乾燥品を５０ｍｇ正確
に秤り取り、蒸留水６．５ｍｌで溶解したビリルビン・
オキシダーゼ溶液を５０μｌ、及び１００μｌ添加し、
分光光度計（島津製作所社製、ＵＶ−２１０Ａ）にセッ
トし、３７℃で６８０ｎｍにおける吸光度の経時変化を
チャートに描いた（図６）。図６から明らかなように、
５０μｌの酵素液を使用すると６分でビリルビン・オキ
シダーゼの反応は終了し、１００μｌの酵素液を使用す
ると、３．５分で反応は終了した。これから本条件下で
は短時間でビリルビンの測定を、ビリベルジンの生成を
測定することで可能となり、またビリルビンの消去も基
質特異性が高いことから他の粗製物に影響を及ぼしにく
い条件で可能となった。 【００３９】実施例 ２ 人血清を０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、
０．６、０．７ｍｌそれぞれ分取し、ここに０．１Ｍト
リス−塩酸緩衝液を加えて３ｍｌとし、本発明ビリルビ
ン・オキシダーゼ０．１Ｕを添加し、３７℃、３０分間
インキュベートし、その反応液について分光光度計（島
津製作所社製、ＵＶ−２１０Ａ）にセットし、３７℃で
６８０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図７
に示すが、種々の割合に希釈した血清溶液において極め
て良好な直線性が得られた。 【００４０】実施例 ３ 検量線の作成 （１）試液の調整： 緩衝液 ：０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
４） 酵素反応液：０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
４）に本発明ビリルビン・オキシダーゼを０．１Ｕ／テ
ストの割合で添加して調整した。 （２）標準ビリルビン溶液の調整：非抱合型非結合型ビ
リルビン（和光純薬社製）５．９ｍｇを正確に秤り取
り、５Ｎ ＮａＯＨ溶液０．５ｍｌで湿らせ、１Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１０ｍｌで溶かした後、
１００ｍｌにメスアップしたものを、１００μＭビリル
ビン溶液とし、これを０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．４）で希釈して、２、４、６、８、１０、１４μ
Ｍの標準ビリルビン溶液を調整した。 【００４１】（３）上記の標準ビリルビン溶液をそれぞ
れ３ｍｌづつに、上記酵素反応液を添加し、３７℃、３
０分間インキュベートし、その反応液について、分光光
度計（島津製作所社製、ＵＶ−２１０Ａ）にセットし、
３７℃で６８０ｎｍにける吸光度を測定した。その結果
を図８に示すが、極めて良好な直線性を示した。 【００４２】 【発明の効果】本発明のビリルビン・オキシダーゼはビ
リルビンに基質特異性を有し、肝疾患の診断に有利であ
り、また、臨床診断における検体中のビリルビンが他の
物質の測定における阻害となる場合において、ビリルビ
ンの消去に有用であり、更に活性も非常に高いので屎尿
処理水の脱色への利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のビリルビン・オキシダーゼの熱安定性
を示すものである。 【図２】本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適温度
を示すものである。 【図３】本発明のビリルビン・オキシダーゼのｐＨ安定
性を示すものである。 【図４】本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適ｐＨ
を示すものである。 【図５】ビリベルジンの吸収曲線を示すものである。 【図６】本発明のビリルビン・オキシダーゼの反応経過
を示すものである。 【図７】本発明の酵素を用いて血液試料量と活性の相関
図を示すものである。 【図８】ビリルビンの検量線である。
を示すものである。 【図２】本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適温度
を示すものである。 【図３】本発明のビリルビン・オキシダーゼのｐＨ安定
性を示すものである。 【図４】本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適ｐＨ
を示すものである。 【図５】ビリベルジンの吸収曲線を示すものである。 【図６】本発明のビリルビン・オキシダーゼの反応経過
を示すものである。 【図７】本発明の酵素を用いて血液試料量と活性の相関
図を示すものである。 【図８】ビリルビンの検量線である。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．被検体に、ビリルビンに基質特異性を有し、少なく
とも、ビリベルジン、カテコールおよびヘミンに基質特
異性を有さず、２分子のビリルビンおよび１分子の酸素
から２分子のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素反
応を触媒するペニシリウム属に属する該ビリルビン・オ
キシダーゼ生産菌を培養して得ることのできるビリルビ
ン・オキシダーゼを作用せしめ、被検体中のビリルビン
を、ビルベルジンに変換し、生成するビリベルジンの量
または消費される酸素の量を測定してなる被検体中のビ
リルビン量の測定法。 ２．検体に、ビリルビンに基質特異性を有し、少なくと
も、ビリベルジン、カテコールおよびヘミンに基質特異
性を有さず、２分子のビリルビンおよび１分子の酸素か
ら２分子のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素反応
を触媒するペニシリウム属に属する該ビリルビン・オキ
シダーゼ生産菌を培養して得ることのできるビリルビン
・オキシダーゼを作用せしめ、検体中のビリルビンを消
去する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8189379A JP2901231B2 (ja) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | 新規なビリルビン・オキシダーゼを用いた測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8189379A JP2901231B2 (ja) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | 新規なビリルビン・オキシダーゼを用いた測定法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62144964A Division JP2578430B2 (ja) | 1987-06-10 | 1987-06-10 | 新規なビリルビン．オキシダーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0919298A JPH0919298A (ja) | 1997-01-21 |
| JP2901231B2 true JP2901231B2 (ja) | 1999-06-07 |
Family
ID=16240338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8189379A Expired - Fee Related JP2901231B2 (ja) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | 新規なビリルビン・オキシダーゼを用いた測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2901231B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1146795A (ja) * | 1997-08-04 | 1999-02-23 | Iatron Lab Inc | 酸化酵素含有分析用試薬 |
| JP3912353B2 (ja) * | 2002-11-18 | 2007-05-09 | 村田機械株式会社 | 画像形成装置 |
-
1996
- 1996-07-18 JP JP8189379A patent/JP2901231B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0919298A (ja) | 1997-01-21 |
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