FR2491951A1

FR2491951A1 - Procede de dosage de l'activite de l'amylase

Info

Publication number: FR2491951A1
Application number: FR8119160A
Authority: FR
Inventors: Hideo Misaki; Eiji Muramatsu; Hidehiko Ishikawa; Kazuo Matsuura
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1980-10-14
Filing date: 1981-10-12
Publication date: 1982-04-16
Also published as: JPS6337640B2; GB2088052A; DE3140411A1; IT8168329A0; IT1172856B; GB2088052B; US4427771A; FR2491951B1; JPS5768798A

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE DOSAGE DE L'ACTIVITE D'AMYLASE QUI IMPLIQUE DE DOSER LE SUBSTRAT DECOMPOSE PAR L'ENZYME AMYLASE EN UTILISANT UN POLYMERE DE GLUCOSE AYANT UN RESIDU GLUCOSE TERMINAL REDUCTEUR MODIFIE OU UN POLYMERE DE GLUCOSE CYCLIQUE (CYCLODEXTRINE) COMME SUBSTRAT.

Description

La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage de l'activité

de l'amylase. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de dosage de l'activité de l'amylase dans un échantillon comme le sérum, la salive ou l'urine qui implique de doser le substrat décomposé par l'enzyme amylase en utilisant un polymère de glucose ayant un résidu gluoose terminal réducteur modifié ou un polymère

de glucose cyclique comme substrat.

Le procédé de dosage de l'activité de l'amylase U connu jusqu'ici se fonde sur l'hydrolyse d'un polymère de glucose substrat comme l'amidon par action de l'amylase

pour former du glucose, du maltose, ou un oligo-saccharide.

Par exemple, un procédé de dosage comprenant la diminution

de viscosité de l'amidon par l'action de l'amylase; l'iodo-

métrie; la réaction du glucose avec la glucose oxydase ou la glucose déahydrogénase et le NAO [NADP), o le glucose est Formé par action de l'alpha-glucosidase sur le maltose qui est produit par action de l'amylase sur l'amidon;

et le procédé de l'amidon bleu ou de la maltose phosphory-

ao lase o l'on a signalé la mesure colorimétrique du pigment

soluble produit par action de l'amylase sur de l'amidon in-

soluble lié à un pigment [brevet japonais na 55-d78U00).

Ces procédés antérieurs ont un certain nombre d'inconvénients, par exemple le caractère inconstant de l'hydrolyse provoquée par-le réactif utilisé et les

conditions réactionnelles appliquées, et l'action d'inhi-

bition provoquae par la coexistence du glucose et du maltose. En outre, dans le procédé de l'amidon bleu il faut effectuer un procédé compliqué de séparation par centrifugation ce qui rend difficile l'automatisation, et dans le procédé de phosphorylase du maltose, quatre étapes enzymatiques sont nécessaires, d'o le coût élevé

et la difficulté des opérations.

On a trouvé, au cours des études en vue d'un dosage précis et automatique de l'amylase, que l'on peut doser l'activité de l'amylase simplement et avec une bonne précision sn estérifiant, éthérifiant ou oxydant le groupe terminal réducteur du polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réducteur pour former un groupe terminal réducteur modifié qui ne peut être un substrat pour la maltose déshydrogénase, et ainsi on soumet le

polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réduc-

teur modifié à un substrat pour le dosage de l'activité de l'amylase. En outre on a trouvé que l'on peut doser de façon intéressante l'amylase en remplaçant le polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réducteur modifié par un polymère de glucose cyclique. D'autres avantages

se sont révélés en déshydrogénant par la maltose déshydro-

génase avec le NAD ou NADP le substrat décomposé produit dans la réaction enzymatique, et on mesure directement ou indirectement le NAD réduit ou le NAOP-réduit formé par un réactif coloré de transport d'hydrogène sous forme réduite. On obtient d'autres avantages en traitent au préalable les échantillons de sérum, de salive ou d'urine

destinés au dosage de l'amylase avec de l'alpha-glycoai-

dase ou une kinase comme l'hexokinase an présence de

Mg++ et d'ATP.

L'invention a pour objet de fournir un. procédé

simplifié, exact et automatique de dosage de l'amylase.

Comme exemple de substrat utilisé dans l'invention,

on peut citer les polymères de glucose ayant un résidu gluco-

se terminal réducteur modifié ou les polymères de glucose cycliques, de préférence de degré de polymérisation

supérieur à 5.

Comme exemples de polymère de glucose ayant des résidus glucose terminaux réducteurs modifies on peut citer l'amylose, l'amylopectine, l'amidon ou l'hydrolysat d'amidon comme l'amidon soluble appelé dextrine o l'on modifie

le résidu glucose terminal réducteur du polymère de glucose.

Le résidu glucose terminal réducteur modifié de l'invention est un résidu ne possédant pas d'activité réductrice. On peut citer en exemple un groupe terminal éthérifié ou estérifié par des procédés classiques ou un résidu d'acide gluconique d'un résidu de glucose oxydé

ou son dérivé estérifié.

On trouvera ci-dessous des exemples de ces

modifications. On fait réagir une solution de polysacchari-

de comme l'amidon soluble avec de l'acide chlorhydrique méthanolique à 4% à 70 C pendant 4 heures, on neutralise et on recueille une fraction correspondant à un poids moléculaire supérieur à 1000 par chromatographie sur colonne à filtration sur gel pour obtenir de l'amidon soluble méthyléthérifié. On ajoute de l'amidon soluble dans l'anhydride acétique C3,5 ml) dans la pyridine sèche et on fait réagir à 0 C pendant la nuit, on précipite en

ajoutant de l'acétone, et on recueille une fraction corres-

pondant à un poids moléculaire supérieur à 1U000O par chromatographie sur colonne avec filtration sur gel pour

obtenir de l'amidon soluble acétylé.

On fait bouillir de l'amidon soluble dans le réactif de Fehling pendant 5 minutes à aO heures, on concentre, on retire les fractions insolubles après

addition de méthanol et on recueille la fraction correspon-

dant à un poids moléculaire supérieur,à 1000 pour obtenir un composé o l'on oxyde le résidu glucose terminal

réducteur en un résidu acide gluconique qui est éventuel-

lement estérifié.

Ces modifications des résidus glucose ne se limitent pas à ce qui précède, et peuvent être appliquées par d'autres procédés classiques, par exemple on remplace la méthyl-éthérification par une éthyl-éthérification et une isopropyl-éthérification, ou on remplace l'acétylation par une propionylation, ou l'on remplace en outre le résidu acide gluconique par un anhydride, par

exemple du type gluconolactone. Cependant, le type gluco-

nolactone est généralement instable, et le résidu acide gluconique est donc préférable. Le degré de polymérisation

du glucose peut ne pas être limité pour un degré de polymé-

risation uniforme ou divers degrés de polymérisation. Comme exemples de polymères de glucose cyclique on peut citer la dextrine de plus de 6 unités glucose obtenue à partir

d'amidon comme 1' U-s <-, 4-, &- ou O -cyclodextrine.

Ces substrats exposés ci-dessus sont hydrolysés par lvamy-

lase dans l'échantillon à 37 C dans un tampon à pH 6-à pour former un substrat décomposé comme le glucose, le maltose ou d'autres oligosaccharides. On dose l'activité de l'amylase dans l'échantillon en mesurant les substrats décomposés ainsi formés, ce qui se fait de préférence par un procédé avec la maltose déshydrogénase et le NAD ou NAOP à 37iC à

pH 6-8.

Un exemple préféré est la maltose déshydrogénase produite en cultivant Bacillus megaterium B-0779 FERM-P no 5662 déposé le 29 juillet 1980 au "Fermentation Research Institute" (of demande de brevet japonais du 29 ao0t 1980

"'Procédé de préparation de maltose déshydrogénase"j.

On a isolé la souche Bacillus megaterium B-0779 à partir d'un échantillon de sol provenant d'un champ de pastèques d' Ukihashi, Ohito-cho, Tagatagun, Shizuoka-ken, Japon, et elle possède les propriétés taxinomiques suivantes: A. Caractères culturaux: Ca] Milieu nutritif de gélose en biseau: bonne croissance, droite, opaque, de couleur terne, blanc grisâtre à grise. Pas de formation de

pigment soluble.

[b) Milieu nutritif sur plaque de gélose: colonies; rondes,

à bords ridés et à surface ondulée.

Cc] Milieu liquide paptoné: Faible croissance, uniformément

trouble, puis précipitation floconneuse.

B. Caractère morphologique:

Chalnes tordues, uniques, doubles ou courtes.

Grand bâton droit, à bords ronds, de 1,0-1,5 x,0-3,0 Y, rarement 1,0-1,5 x 1,5 x 7,0 Y. Formation de capsule. Pas de motilité. Spores difficiles à identifier avec centre ou partie près du bord dans les cellules. C. Propriétés biochimiques et physiologiques: Coloration de Gram: +

Coloration résistant aux acides: -

Test OF: 0 [oxydant)

Croissance anaérobie: -

Liquéfaction de la gélatine: + Hydrolyse de l'amidon: Hydrolyse de la caséine: (+] Hydrolyse de l'esculine: Catalase: + Oxydase: C+) Lécithinase: Uréase: milieu SSR: Milieu de Christenssen: Formation d'H2S: Test VP, MR: Formation de phosphatase: Résistance au lysozyme: Formation d'indole: Réduction du nitrate: + Utilisation du citrate [milieu de Simons]: + Formation d'acide à partir d'hydrates de carbone [pas de formation de gaz]: Formation d'acide: LC+) arabinose, cellobiose, fructose, glucose, glycérol, inuline, maltose,

raffinose, saccharose, tréhalose, xylose.

Pas de formation d'acides: adonitol, dulcitol, meso-

érythritol, fucose, galactose, inositol, lactose, mannose,

mélézitose, mélibiose, LC+])-

rhamnose, salicine, L-sorbose,

sorbitol, amidon.

Teneur en G + C de l'ADN: 40,1%.

Comme on l'a expliqué ci-dessus, on identifia l'appartenance de la souche B-0779 au genre Bacillus d'après les caractéristiques suivantes: grampositive, catalase et oxydase positive, -grands bacilles aérobies IS sporulants, pas de formation d'ac6todne, non résistant au lysozyme, pas de production de lécithinase, at formation

d'acide à partir d'arabinose, de mannitol et de xylose.

CBergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7e éd.

C1957) et 8e éd. (1974), Manuel for the identification of 0 Medicinal Bacteriology (1974) et Agriculture Handbook,

p 475 The genus Bacillus).

En outre, la souche est rapportée à Bacillus megaterium sur la base d'une comparaison détaillée comme il est montré au Tableau 1, et est désignée Bacillus

megaterium B-0779.

Souche Bacillus megaterium B-0779 CAgriculture Handbook 427 "The genus Bacillus) Coloration de Gram + + Capsule + d Taille des cellules 1,0-1s5 x 1,2-1,5 x

2,0-3,0,0-5,0

Croissance anaérobie -

Lécithinase -

Uréase - -

Résistance au lysozyme -

Formation d'acétoine -

Formation de phosphatase -

Arabinose [acide) + d Mannitol Cacide) + + S15 Xylose Cacide] + d On peut obtenir la maltose déshydrogénase de l'invention en cultivant le microorganisme producteur de

maltose déshydrogénase de l'invention dans un milieu clas-

sique pour la production d'antibiotiques ou d'enzymes. La

culture peut s'effectuer en milieu solideou liquide.

La culture aérobie submergée est préférable pour la production industrielle. La source nutritive du milieu

est le milieu classique pour la culture des microorganismes.

Les sources nutritives sont des sources d'azote assimilables comme la liqueur de mais macérée, la peptone, la caséine, la poudre de soja, l'extrait de levure ou les extraits de viande. Les sources de carbone sont des sources de carbone assimilables comme la mélasse, le glucose, le glycérol,

le saccharose ou la dextrine. On peut ajouter un sel inor-

-1ganique comme le chlorure de sodium, le chlorure de potas-

sium, le sulfate de magnésium, le phosphate diacide de potassium ou le phosphate acide de potassium. On peut Faire varier la température de culture selon la croissance des microorganismes et la production de maltose déshydrogénase, et elle se situe de préférence à 25-30UC. La durée de la

culture dépend des conditions et est généralement de 3U-

7a heures. La culture doit être terminée au stade de produc- tion maximum de l'enzyme. La maltose déshydrogénase de

l'invention est contenue dans les cellules cultivées.

Comme exemple d'extraction de l'tenzyme, on peut

citer le traitement des cellules humides cultivées et iso-

lées par du lysozyme dans un tampon Tris-HCl, un traitement aux ultrasons ou une extraction sous pression

pour obtenir une solution brute de maltose déshydrogénase.

On traite les solution enzymatique brute par des procédés connus d'isolement et de purification enzymatiques pour

obtenir l'enzyme purifiée. On peut appliquer une précipits-

tion avec des solvants organiques comme l'acétone, le méthanol ou l'éthanol, et un relargage avec du sulfate

dtammonium, du chlorure de sodium ou du sulfate d'aluminium.

On peut obtenir une purification plus poussée par chromato-

graphie d'adsorption en utilisant un échangeur d'ions comme

la diéthylaminoéthylcellulose, le gel de diéthylamino-

&thyl-dextran et le gel de triéthylaminoéthyl-dextran ou un agent de filtration sur gel comme le gel de dextran et

le gel de polyacrylamide, et une lyophilisation pour obte-

nir la poudre de maltose déshydrogénase purifiée.

Le procédé de dosage et les propriétés biochi-

miques de la maltose déehydrogénase ainsi obtenue sont les suivants: [lU Procédé de dosage: Mélange réactionnel C1,00 ml] composé comme suit: Tampon Tris-HCl 0,2 M CpH 7,5) 0,4 ml Sérum-albumine de boeuf à 1% 0,1 ml Bleu de nitrotétrazolium à 0,E5% CNTB) 0,1 ml Triton X-100 à 1% 0,1 ml NAOP 10 mM 0,1 ml Méthosulfate de phénazine à 0,05% CPMS) O,0U ml Maltose I M 0,1 ml Eau distillée 0,08 ml Total 1,00 ml

On fait pré-incuber ce mélange à 37 OC pendant 3 minutes.

On ajoute la solution enzymatique [0,05 ml]) au mélange

réactionnel et on fait incuber à 37 G pendant 10 minutes.

On arrête l'addition en ajoutant HCl 0,1 N Ca,0 ml) et on mesure par colorimétrie la quantité de NTBHk à 550 nm Cdensité optique: As=. On ajoute de l'eau (0,05 ml]

comme témoin et on mesure à 550 nm (Ab).

La réaction enzymatique de ce qui précède est la suivante: maltose + NAD(P) -) GGL*' + NAD(P)H + H

NAD(P)H + NTB + H+ PMS NAD(P) + NTPH2

o20 *GGL: O-a-D-glucopyranosyl (1 -4)-6-gluconolactone Une unité est définie par la formation d'1 micromole de NTBH en une minute et l'activité enzymatique est

calculée par l'équation suivante.

activité [unités/ml) =[As -Ab] x 3,U05 1a,4 x 10 x 0,05

= [As - Ab] x 0,49.

[2] Spécificité du substrat: On remplace le maltose dans le procédé de dosage ci-dessus par les substrats du Tableau d [chacun 0,1 M,

0,1 ml) et on dose selon le procédé de dosage.

Tableau 2.

Substrat Activité relative {() maltose 100 xylose 0;9 ribose 2;5 glucose 15 galactose 3X9 mannose 2,8 fructose 2,9 saccharose O lactose 98 cellobiose 44 raffinose 0 maltotriose 53 maltopen ose 11 inositol 0 sorbitol 0O mannitol 0 glycérol 0 - amidon soluble à 0,5% 0,7

Comme le montre le Tableau 2, la maltose déshydro-

génase de l'invention a une spécificité de substrat sur le

maltose et le lactose.

1 1 [33 Coenzymes: Le NAOP dans le procédé de dosage ci_dessus est remplacé par le NAU sans addition, et l'on mesure l'activité selon le procédé de dosage. Le résultat est donné au Tableau 3. La maltose déshydrogénase de l'invention nécessite

du NAOP ou du NAD comme coenzyme.

Tableau 3

Tabl eau 3 Coenzyme Activité relative [X]

NADP 100

NAD 45

pas dtadditicn O [4] Action de l'enzyme: L'enzyme catalyse une réaction de formule KID(P)tM %fDU)5 o du GGL et du NAUCP] réduit est Formé à partir du maltose

et du coenzyme NAOCP).

CS) pH optimum: Maltose I M NAOP 10 mM Tampon 0,2 M à divers pH Eau distillée Total 0,1 ml 0,1 ml 0,3 ml 2,$ ml 3,0 ml

On fait pré-incuber le mélange réactionnel ci-

dessus à 37 C pendant 3 minutes. On y ajoute une solution enzymatique (1 U/ml, 0,03 mi) et on Fait incuber à 37 C pendant 10 minutes. On mesure l'augmentation du N4AUP réduit à 340 nm pour déterminer le pH optimum. La figure 1 donne le résultat, o o-o: tampon diméthylglutarate-O,2 M (pH 4, 5-7,2),-a: tampon phosphaté

0,2 M (pH 6,1-7,4) et au-0 tampon Tris-HC1 0,2 M (pH 7,9-

9,3]. Le pH optimum de la maltose déshydrogénase de

l'invention est d'environ 7,5.

[6) Température optimum: On chauffe le mélange réactionnel [1,00 ml] donné dans le procédé de dosage C1) ci-dessus à diverses températures réglées à 25-55C pendant 3 minutes. Un y ajoute une solution enzymatique C0,05 U/ml, 0,05 ml)f- et

on Fait incuber à la température fixée pendant 10 minutes.

On ajoute HOl 0,1 N [2,0 ml) pour arrêter la reéaction enzymatique, puis on mesure l'augmentation de la quantité de NTBH, par densité optique à 550 nm. Le résultat est donné dans la figure 2. La température optimum de la maltose

déshydrogénase de l'invention est deenviron 45C.

[7) Stabilité du pH: On fait pr6-incuber à 371C pendant S0 minutes un mélange de solution enzymatique [10 U/ml, 0,1 ml), de chaque solution tampon (0,1 ml, à divers pH] et d'eau distillée [0,8 ml]. On refroidit immédiatement le mélange

réactionnel dans de l'eau glacée et on dose l'activité enzy-

matique selon le procédé de dosage ci-dessus. Le résultat est donné dans la Figure 3. Dans la figure;o-o: tampon diméthylglutarate-NaOH 0,2 M (pH 4-6,6], 0-e: tampon phosphaté 0,2 M (pH 6,3-7,4), Cú3: tampon Tris-HC1 0, c M

(pH 7,6-8,6), et Ze--: tampon glycine-NaOH 0,Z M CpH 8,7-9,5).

La stabilité du pH de la maltose déshydrogénase de l'inven-

tion est de pH 7-8,5 à 37 C pour un traitement de '0 minu-

tes. (8) Stabilité thermique: On Fait pré-incuber à diverses températures réglées à 37-60 C pendant 10 minutes un mélange de solution enzymatique (10 U/ml, 0,1 ml] de tampon Tris-HC1 O, M

(pH 7,5, 0,1 ml] et d'eau distillée C0,8 ml). Après traite-

ment, on refroidit le mélange réactionnel dans de l'eau glacée puis on dose l'activité enzymatique selon le procédé de dosage ci-dessus. Le résultat est donné en figure 4. La maltose déshydrogénase de l'invention a une stabilité thermique inférieure à 37 C à pH 7,5 pour un traitement

de 10 minutes.

)9] Poids moléculaire: Environ 93 000 (procédé de filtration sur gel

utilisant du Séphacryl S-a00 (marque déposée).

(10) Point iso-électrique: Environ pH 5,1 ([électrophorèse utilisant un

support ampholyte).

[(11) Valeur du Km:

Km = 3,4 x 10' M C pour le maltose].

(12) EFFet de l'ion métallique, de PCMB et EUTA: Tampon Tris-HCl 0,, M CpH 7,5) 0,4 ml NTB à 0,5% 0,05 ml Triton X-100 à a% O,05 ml Maltose 1 M U,1 ml NAOP 10 mM 0,1 ml PMS à 0,05X% 5u ml Ion métallique, solution de PLMB ou LUTA 0,i ml cau distillée 01( ml

Total: 1,00 ml.

On fait pré-incuber le mélange réactionnel ci-dessus à

37 C pendant 3 minutes. On y ajoute la solution anzy-

matique 0C,05 U/ml, 0,05 ml) et on fait incuber à 37 C pendant 10 minutes, puis on arrête la réaction enzymatique en ajoutant de l'HCl 0,1 N C2,u ml). On mesure la densité optique à 550 nm pour observer lseffet de chaque ion métallique, de POMB et EDTA. Le résultat est donné au

tableau 4.

Ion métallique, EOTA ou PCMB

Tableau 4

Activité Ion métallique, relative EOTA ou PCMB r% Activité relative CU) Cpas d'addition] KCl 01 M NaCl 0,1 M NH4Cl 0,1 M LiCl 0,1 M CaCl2 0,01 M MgCl2 0,01 M BaCl2 0,01 M MnCi2 0,01 M CoCl ZnCla CuCle NaN3 PCMB EOTA EUTA EDTA

0,01 M

0,001 M

0,01 M

0y0004 M

0,01 M

0,U01 M

0,0001 M

[13) Effet des agents tensioactiFs: Maltose I M NAOP 10 mM Tampon TrisHCl 0,2 M CpH 7,5) Agent tensio-actif Eau distillée Total o 0,1 ml 0,1 ml 0,4 ml 0,1 ml e,3 ml 3,0 ml

On fait pré-incuber le mélange réactionnel ci-

dessus à 37 C pendant 3 minutes. On y ajoute une solution enzymatique C1U/ml, 0,05 ml) et on fait incuber à 37 C pendant 10 minutes. On mesure l'augmentation de la densité optique à 340 nm causée par une diminution du NAOP pour déterminer l'effet de l'agent tensioactif. Le résultat

est donné au Tableau 5.

Tableau 5

Agent tensioactiF C[%) Activité relative [X] Témoin I UO Triton X-100 [0, 13 98

" [0,5] 105

3 [1) 107

Adekatol SO-145 [marque déposée) o0,1s) 105 et [0,5) i D 1U,, E1) tOW

lu t, Cl) 1.

Dodécyl-sulfate de sodium [0,1) 6

ú0,5) 0,5

[1) 1

Laurylbenzène sulFate de sodium [O 1) U,5 if [0,5 "e [t) I Tween-60 (marque déposée) [0, 1) 9

" [0,S)9U,5)

Tween-80 (0,1)]

M0 " [0,5) 100

Cation UT [marque déposée) ú0,1) 100

" [0ú5) 100

Chlorure de cétyltriméthylammonium [0t,1 7

" [0,5) 4

Désoxychlorate de sodium C0,1) lis "t ú[0,5) 1.7 Les propriétés biochimiques ci-dessus indiquent que llenzyme de l'invention a des spécificités de substrat Faibles sur le lactose, le cellobiose et le maltotriose, et une activité de Forte spéciFicité sur le maltose. Ces spécificités de substrat et d'autres actions enzymatiques et autres propriétés indiquent que l'enzyme se rattache à

la maltose déshydrogénase antrbeuremen:toonnue CINAUCP)-

Dependent Maltose Dehydrogenase; Agr. Biol. Chem., 44C1),

41-.47 C1980)).

La maltose déshydrogénase utilisées dans l'inven-

tion ne se restreint pas à l'enzyme exposée ci-dessus.

Ainsi, on peut également utiliser la maltose déshydrogénase

obtenue en cultivant une souche Corynebacterium sp.

n 93-1 CAgr. Biol. Chem., 44(t1), 41-47 (1980).

Comme on 1' a expliqué ci-dessus, le substrat décomposé comme le maltose, le glucose, l'oligosaccharide

comme le maltotriose et le maltopentoset peut être déshydro-

géné pour former du NAD ou du NAUP réduit.

Le NAO réduit ou NADP réduit ainsi formé peut être directement mesuré par absorption à 340 nm pour le dosage de l'activité d'amylase, ou l'on fait réagir du NAO ou du NADP réduit avec un réactif coloré pour le transport de l'hydrogène et on transfère l'hydrogène à l'autre système de

transport que l'on mesure indirectement pour déterminer l'ac-

tivité d'amylase.

Comme exemples du système indirect de dosage du réactif coloré transporteur d'hydrogène on peut citer, par exemple, des réactifs comprenant le sel de tétrazolium et

la diaphorase, ou le sel de tétrazolium et le phénazine-

méthosulFate.

On mesure le produit réactionnel obtenu par

colorimétrie d'abosrption à 550 nm.

Les exemples préférés pour le système de dosage de l'amylase sont un mélange réactionnel comprenant un tampon Tris-HC1 0,2 M (0,4 partie), de la sérumalbumine de boeuf à 1% [01 partie), du NTB à O0,5% (0,1 partie), du Triton X-100 à 1% [0,1 partiel, du NADCP] 10 mM C0,1 partie), du PMS à 0,05% [0,02 partie), une solution substrat à 10% (0,1 partie), de la maltose déshydrogénase à é0O U/ml (0,05 partie) et de l'eau distillée C0, 03 partie), ou un 1l mélange comprenant un tampon Tris-HCl O,Z M [0,3 partie)], du NAOCP] 10 mM C0,1 partie], une solution substrat à 10X C0,1 partie], de la maltose déshydrogénase à 0O U/ml

[0,05 partie) et de l'eau distillée [0,45 partie).

Généralement on mélange une partie de ces mélan- ges réactionnels aveo de 0,01 à 0,5 partie d'échantillon et on Fait incuber à 37aC pendant une durée appropriée, par exemple 5 minutes. Après la Fim de la réaction, on

mesure la densité optique du mélange par un procédé classi-

que.

Les échantillons à doser sont le sérum, l'urine

et la salive que l'on dilue éventuellement aux fins de dosage.

On ajoute quelqueFois aux échantillons du glucose ou du maltose. On peut enlever le maltose en le décomposant en glucose avec de l'alphagluoosidaseg et on phosphoryle le glucose par uns kinase comme l'hexmkinase ou lm glucokinase

en présence dATP, Mg de préférence MgCl en glucose.

6-phosphate. On phosphoryle également le maltose avec la maltose phosphorylase. Par ce traitement, on transfère a0 le glucose et le maltose qui coexistaient antérieurement à des composés qui ne modifient pas l'oxygène soluble dans

l'échantillon et le dosage de l'activité d'amylase.

Comme il a été expliqué ci-dessus, l'invention concerne un procédé de dosage de l'activité dtamylase, as p. ex. d' X - ou de 3-amylase dans un échantillon, qui implique de décomposer le substrat comme un polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réducteur modifié ou un polymère de glucose cyclique par action d'une activité d'amylase dans l'échantillon, de préférence en Faisant réagir ledit substrat décomposé avec de la maltose

déshydrogénase et du NAD ou du NAUP, et de mesurer quantita-

tivement directement ou indirectement le NAD réduit ou le

NADP réduit formé. On peut réaliser de préférence l'inven-

tion avec un traitement additionnel en transformant le glucose ou le maltose coexistant au préalable en

* glucose-6-phosphate par une kinase en présence d'alpha-

glucosidase, de Mg et d'ATP.

Le procédé de dosage de l'activité d'amylase de l'invention est un procédé simple et précis qui peut être réalisé avec un nécessaire comprenant les réactifs

ci-dessus, et peut être appliqué pour un dosage automatique.

Les exemples suivants précisent l'invention mais

ne sont pas conçus comme limitatifs.

Exemple 1

Tampon Tris-HCl 0,2 M [pH 7,4) 0,4 ml Sérum-albumine de boeuf à 1% 0,1 ml NTB à 0,25% 0,1.ml Triton X-100 à 1% 0,1 ml NADP 10 mM 0,1 ml PMS à 0,05% 0,02 ml Amidon soluble oxydé à 10%* 0,1 ml Maltose déshydrogénase à 00 U/ml* 0,05 mi Eau distillée 0,03 ml Total 1,0 ml o20 Polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réducteur modifié (résidu acide gluconiqwe) obtenu dans

l'exemple 9 Chydrolysat d'amidon oxydé).

Produit selon l'exemple 12.

On fait pré-incuber le mélange réactionnel ci-

dessus (1,0 ml) à 37 OC pendant 3 minutes. On y ajoute de la salive [20 microlitres, diluée 300 fois) et on fait incuber à 37 C pendant U,,5, 5, 10, d0 et minutes, respectivement. Après la réaction, on ajoute de l'HCl 0,1 N [2,0 ml) et on mesure le mélange à 550 nm

par colorimétrie.

Le résultat est donné dans la figure 5, o l'on obtient une bonne linéarité en-dehors des 2,s5 minutes

de latence initiale.

Exemple 2

On Fait pré-incuber à 37 C pendant 3 minutes

le même mélange réactionnel [1,0 ml) que décrit dans l'exem-

ple 1. On y ajoute de la salive diluée 10UO fois, à raison de 0, 10, 20, 30, 40 et 50 microlitres, respectivement, et on Fait incuber à 37 C pendant 10 minutes. Après incubation,

on ajoute de l'HCl 0,1 N [2,0 ml) et on dose par colori-

métrie à 550 nm.

Le résultat est donné en Figure 6 o l'on obtient

une bonne linéarité.

Exemple 3

Mélange réactionnel I: Tampon Tris-HCl 0,2 M [pH 7,5) 0,2 ml Sérumalbumine de boeuf à 1% 0,1.ml NTB à 0,25% 0,1 ml Triton X-100 à 1% 0,1 ml NAOP 10 mM 0,1 ml Alpha-glucosidase [200 U/ml) o,1 ml Hexokinase [100 U/ml] 0,1 mi MgC12 100 mM 0,05 ml PMS à 0,05% 0,02 ml Total 0,87 ml Mélange réactionnel II: Amidon soluble oxydé à 10% 0,1 ml Maltose déshydrogénase à dU00 U/ml 0,05 ml EDTA 200 mM 005 m Total 0,2 ml *Polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réducteur modiFié [résidu acide gluconique) obtenu dans

l'exemple 9 [amidon soluble oxydé]).

On fait pré-incuber à 37 C le mélange réactionnel I (0,8 ml). On y ajoute du sérum [50 microlitres) et on fait incuber à 37 C pendant 5 minutes pour retirer le glucose et le maltose coexistants. On y ajoute le mélange S réactionnel II [0,a ml]), et on fait incuber à 37 C pendant

0, 2,5, 5, 10, 15, a0 et 25 minutes, respectivement.

Après chaque temps de réaction, on ajoute de l'HC1 0U,1 N

[2,0 ml] et on mesure par colorimétrie à 550 nm.

On utilise comme témoin le mélange réactionnel

I' qui ne contient pas d'hexokinase. Le résultat est donné en figure 7 o o-o: mélange

réactionnel I et II, *-: mélange réactionnel I' et II.

Comme le montre la figure 7, le procédé de dosage utilisant

le mélange réactionnel I et II donne de bons résultats.

Exemple 4

Mélange réactionnel I: Tampon Tris-HC1 0,2 M [pH 7,5) 1$2 ml NADP 10 mM 0, 3 ml Alpha-glucosidase [ZO0 U/ml] 0,1 ml Hexokinase (10 U/ml] 0,1 ml MgCl2 100 mM 0,15 ml Eau distillée 0,55 ml Total: 2,4 ml Mélange réactionnel II: Amidon soluble oxydé à 10% 0,3 ml Maltose déshydrogénase à eOO U/ml 0,05 ml EDTA 200 mM 0,15 ml Total: 0,5 ml

*Polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réduc-

teur modifié [résidu acide gluconique) obtenu dans l'exemple

9 [amidon soluble oxydé).

On Fait pré-incuber à 37 C le mélange réactionnel I (2,4 ml]. On y ajoute du sérum (50 microlitres, dilué

1/5-5/5 Fois) et on fait incuber à 37 C pendant 5 minutes.

On y ajoute le mélange réactionnel II o0,5 ml] et on fait incuber à 37 C pendant exactement 20 minutes, et on mesure

à 340 nm.

On utilise comme témoin le mélange réactionnel I' qui ne contient pas d'hexokinase. Le résultat est donné en figure 8 o o-o: mélange réactionnel I et 11, h: mélange réactionnel I' et II. On obtient un résultat

préférable en dosant avec le mélange réactionnel I et II.

Exemple 5

On remplace le substrat dans le mélange réaction-

nel II de l'exemple 3 par une solution à 10% [0,3 ml] de

polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réduc-

teur modifié [résidu glucose méthyl-éthérifié]) obtenu dans l'exemple 10 pour préparer le mélange réaotionnel Il, et on traite le reste de la même manière que dans l'exemple 3. On obtient un résultat montrant une bonne linéarité

dans la durée et le dosage comme la montre la figure 7.

L'absorption optique au bout de 10 minutes de

réaction est de 0,52.

Exemple 6

Un remplace le substrat dans le mélange réac-

tionnel II dans l'exemple 4 par une solution à '10 (0,3 ml) de polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réducteur modifié [résidu glucose méthyl-éthérifié]) obtenu dans l'exemple 10 pour préparer le mélange réactionnel II, et on traite le reste de la même manière que dans l'exemple 4 en utilisant du sérum dilué 5/5 Fois. L'absorption optique

est de 1,06 ce qui témoigne d'un bon résultat.

Exemple 7

On remplace le substrat dans le mélange réac-

tionnel II de l'exemple 3 par une solution à 10% C0,3 ml) de polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réducteur modifié [résidu glucose acétylé) obtenu dans l'exemple 11 pour préparer le mélange réactionnel II, et

on traite le reste de la même manière que dans l'exemple 3.

On obtient une bonne linéarité pour toutes les durées de

réaction comme dans la figure 7.

Exemple 8

On remplace le substrat du mélange réactionnel II dans l'exemple 3 par une solution à 5% C0,3 ml] de gamma-cyclodextrine pour préparer le mélange réactionnel II, et on traite le reste de la même manière que dans l'exemple 3. L'absorption optique au bout de 30 minutes de réaction

est de 0,12.

Exemple 9

On verse de l'amidon soluble Cs5U g) dissous dans

l'eau C200 ml] dans le réactif de Fehling C1 litre, conte-

nant CuSO4.SH20O, 35 g, tartrate de sodium-potassium, 173 g, et hydroxyde de sodium, 65 g) et on fait bouillir pendant 20 minutes. On concentre le mélange réactionnel sous vide jusqu'à 300 ml. On y ajoute du méthanol C100 ml)

et on retire le précipité. On concentre la solution surna-

geante jusqu'à 100 ml que l'on introduit dans une colonne [7 x 100 cm] de Sephadex G-100 [marque déposée]. On recueille l'éluat correspondant à un poids moléculaire supérieur à 1000 et on le lyophilise pour obtenir un

polymère de glucose (33,6 g] ayant un résidu glucose termi-

nal réducteur modifié (résidu acide gluconique) [on oxyde le résidu glucose terminal réducteur dans l'amidon soluble

en résidu acide gluconique].

Exemple 10

On fait réagir à 70 C pendant 6 h de l'amidon soluble [20 g] en suspension dans HCl méthanolique à 4% (400 ml]. On neutralise le mélange réactionnel avec NaUH 5 N, on le dessale et on concentre sous vide. On introduit le concentré dans une colonne (5 x 100 cm) de Sephadex G-25 (marque déposée]. On recueille l'éluat correspondant à un poids moléculaire supérieur à 1000, on concentre sous vide et on lyophilise pour obtenir un polymère de glucose [8,3 g9) ayant un résidu glucose terminal réducteur modifié de

résidu terminal réducteur méthylé dans l'amidon soluble.

ixemple 11 On fait réagir à UO C pendant la nuit de l'amidon

soluble (20 g] dans la pyridine sèche (200 ml) et l'anhy-

dride acétique (3s,5 ml). On y ajoute de l'acétone C1 litre).

On dissout dans l'eau le précipité lavé à l'acétone (200 ml] et on l'introduit dans une colonne (5 x 100 cm] de Sephadex G-25 (marque déposée]. On recueille!léluat correspondant à un poids moléculaire supérieur à 1000 et on lyophilise pour obtenir un polymère de glucose (10, 3 g) ayant un

résidu glucose terminal réducteur modifié de résidu termi-

nal réducteur acétylé dans l'amidon soluble.

Exemple 12

On inocule à un milieu (100 ml] comprenant de la dextrine à 1%, de la poudre d'extrait de levure à 1%, K HPO à 0,1%, KOl à 0,05% et MgSO 7H O à, U05% 2 4 MgSOa. 2 [stérilisé à 120C pendant 20 minutes, pH 7,a] dans un erlenmeyer de 500 ml Bacillus megaterium B-0779 FERM-P n0 5662 prélevé à l'aide d'une anse dans un bouillon de gélose en biseau et on cultive en agitant à 2E8 C pendant 24 heures. On transfère la culture d'ensemencement ainsi préparée dans un milieu (20 litres) comprenant de la dextrine à 1%, de la poudre d'extrait de levure à 1%, ES K HPO4 à 0,1%, KC1 à 0,05%, MgS04.7HaOu à 0,05%X et du silicon SA G-471 [marque déposée) [antimousse), à 0,1% [préalablement stérilisé à 120 C pendant U20 minutes, pH 7,2) dans une cuve de 300 litres, et on cultive de manière submergée à 28 C pendant 45 h, 300 tpm, avec une aération de 15 m3/minute. On recueille les cellules

cultivées par centrifugation à 50U00 tpm pendant 10 minutes.

On traite les cellules humides avec une solution de lysozyme à 0,1% et de l'EOTA 5 mM dans un tampon Tris-HC1 [pH 7,5, 4 litres] à 37 C pendant 60 minutes. On centrifuge la solution de cellules solubilisées [5000 tpm, 10 minutes) pour séparer le surnageant [11,8 U/ml), 3,2 litres). On ajoute à la solution surnageante du sulfate dlammonium jusqu'à 80% de saturation et on centrifuge 15 U000O tpm,

minutes). On dissout le précipité dans un tampon Tris-

HC1 10 mM CpH 7,5, 220 ml) et on centrifuge [15 000 tpm, minutes). On ajoute à la solution surnageante [UO ml, 123,5 U/ml) du chlorure de calcium à 10% C(0 ml) et on centrifuge à nouveau ú15 000 tpm, 10 minutes). On;ajoute du sulfate d'ammonium au surnageant [200 ml, 85 U/ml) et on recueille des Fractions de sulfate d'ammonium saturé à 51-63% et on centriFuge ú15 000 tpm, 1U minutes). On dissout le précipité dans un tampon Tris-HC1 10 mM [pH 7,5, 20 ml, 417 U/ml) et on l'introduit dans une

colonne de Sephadex G-25 [marque déposée].

On lyophilise l'éluat pour obtenir la maltose

déshydrogénase purifiée [370 mg, 20 U/mg].

4. Brève légende des dessins: Fig. 1: pH optimum [exemple 12]; Fig. 2: température opt.; Fig. 3: stabilité du pH; Fig. 4: stabilité thermique; Fig.5-6:dosage de l'activité d'amylase dans la salive, et

Fig. 7-8:dosage de l'activité d'amylase dans le sérum.

2EG

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de dosage de l'activité d'amylase qui implique de doser le substrat décomposé par l'enzyme amylase en utilisant un polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réducteur modifié ou un polymère de glucose

cyclique [cyclodextrine) comme substrat.

2. Procédé de dosage selon la revendication 1 o ledit dosage de substrat décomposé est soumis à un-traitement

avec de la maltose déshydrogénase et du NAD ou du NADP.

3. Procédé de dosage selon les revendications;l..ou -2 o

ledit substrat est un polymère de glucose ayant un résidu

glucose terminal réducteur modifié de degré de polymérisa-

tion du glucose supérieur à 5 ou un polymère de glucose cylique. 4. Procédé de dosage selon la revendication 3 o ledit substrat est un polymère de glucose ayant un résidu glucose terminal réducteur modiFie de polymère de glucose comprenant

de l'amylose, de l'amylopectine, de l'amidon ou des hydro-

lysats d'amidon.

5. Procédé de dosage selon l'une des revendications 1, 2, 3 ou

4 o ledit résidu glucose terminal réducteur modifié est un terminal réducteur éthérifiéo

6. Procédé de dosage selon l'une des revendications 1, 2,3 ou 4

o ledit résidu glucose terminal réducteur modifié est un

résidu terminal réducteur estérifié.

7. Procédé de dosage selon l'une des revendications 1, 2, 3 ou

4 o ledit résidu terminal réducteur modifié est un résidu

gluconolactone ou acide gluconique ou ses dérivés.

e7

8. Procédé de dosage selon l'une des revendications 2,3,4,5,6

ou 7 o ledit dosage s'effectue en mesurant une quantité

de N4A réduit ou de NADP réduit.

9. Procédé de dosage selon l'une des revendications 2,3,4,5,6

ou 7 o ledit dosage s'eFFectue par dosage colorimétrique comprenant une réaction de NAD réduit ou de NADP réduit avec un réactif colorimétrique pour le transport d'hydrogène

sous Forme réduite.

-* 10. Procédé- de dosage selon la revendication 9, o ledit - 10 réactif colorimétrique pour le transport d'hydrogène sous

forme réduite est un réactif comprenant un sel de tétra-

zolium et de la diaphorase.

Il. Procédé de dosage selon la revendication 9 o ledit réactif colorimétrique pour le transport d'hydrogène sous

forme réduite est un réactif comprenant un sel de tétra-

zolium et du phénazineméthosulfate.

12. Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 à 11

o l'on effectue ledit dosage en dosant l'activité d'amylase

dans l'échantillon qui est pré-traité avec de l'alpha-

++

glucosidase ou une kinase en présence de Mg et d'ATP.

13. Procédé de dosage selon la revendication 12 o ladite

kinase est l'hexokinase.

14. Procédé de dosage selon la revendication 2 o ladite maltose déshydrogénase est une enzyme produite en cultivant

un microorganisme producteur de maltose déshydrogénase appar-

tenant au genre Bacillus dans un milieu nutritif et en

isolant l'enzyme de la masse cultivée.

15. Procédé de dosage selon la revendication 14 o ledit

microorganisme producteur de maltose deéshydrogénase appar-

tenant au genre Bacillus est un microorganisme appartenant

à Bacillus meiaterium.

16. Procédé de dosage selon la revendication 15 o ledit Bacillus megaterium est une souche Bacillus megaterium

B-0779 FERM-P n 5662.