JP2926249B2

JP2926249B2 - アルギン酸リアーゼの製造法

Info

Publication number: JP2926249B2
Application number: JP2003390A
Authority: JP
Inventors: 義次金子; 善政米本; 謙一岡山; 幸作村田; 光木村
Original assignee: Otsuka Chemical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Chemical Co Ltd
Priority date: 1990-01-29
Filing date: 1990-01-29
Publication date: 1999-07-28
Anticipated expiration: 2014-07-28
Also published as: JPH03224484A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、アルギン酸リアーゼの製造法に関する。

従来技術とその課題コンブ、ワカメ、ヒジキ等の褐藻類の構成多糖である
アルギン酸は、従来から食物繊維として注目されてい
る。またアルギン酸のカリウム塩は、Ｋ−Naイオン交換
能を有し、体内のNaを排泄する作用があると言われてい
る。かかる特性を有するアルギン酸を食品に適用できれ
ば、食品の生理的機能を高め得ることは明らかである。
しかるに、アルギン酸は水に溶解すると高粘性を示すた
め、一般の食品に適用することは非常に困難である。ア
ルギン酸リアーゼでアルギン酸を低分子化すれば、アル
ギン酸水溶液の粘度を低下させ得ることが予測される。

従来、アルギン酸リアーゼは、シュードモナス（Pseu
domonas）、ビブリオ、フラボバクテリウム（Flavobact
erium）等に属する細菌の培養物から得られている。し
かしながら、これらの細菌はアルギン酸リアーゼ生産能
が非常に低いため、工業的規模でアルギン酸を低分子化
するのに十分な量のアルギン酸リアーゼを得るには、多
大なコストが必要となり、実質的には不可能である。

課題を解決するための手段本発明者は、上記従来技術の課題を解決すべく日本各
地の土壌、池、川、下水、水田等からサンプルを採取
し、アルギン酸分解能を有する微生物の検索を行なった
結果、アルギン酸分解活性を有する特定の３種の細菌を
混合培養する場合には、該３種の細菌が相乗的に作用し
て、非常に高い収量でアルギン酸リアーゼを得ることが
でき、工業的規模でアルギン酸を低分子化するのに必要
な量のアルギン酸リアーゼを容易に供給できることを見
出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、アルギン酸分解能を有する、フラ
ボバクテリウム・スピリチボラム、アルカリゲネンス・
デニトリフィカンス及びバチルス・ラテロスポラスを混
合培養し、培養物からアルギン酸リアーゼを採取するこ
とを特徴とするアルギン酸リアーゼの製造法に係る。

本発明方法では、まず、アルギン酸分解能を有する特
定の３種の細菌、すなわちフラボバクテリウム・スピリ
チボラム（Flavobacteriumu spiritivorum）、アルカリ
ゲネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrific
ans）及びバチルス・ラテロスポラス（Bacillus latero
sporus）を混合培養する。

フラボバクテリウム・スピリチボラムとしては、例え
ば、フラボバクテリウム・スピリチボラムOTC−３を例
示できる。該菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている（微工研菌寄第11191号）。該菌の菌学
的性質を以下に挙げる。

（ａ）形態（１）細胞の形及び大きさ：通常0.5μｍ×1.0μｍ程度（２）細胞の多形性の有無：無し、単独である。

（３）運動性の有無：無し（４）胞子の有無：無し（５）グラム染色性：陰性（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養 35℃、24時間の培養で、直径１〜2mmの凸形コロニ
ー、表面は滑らかで黄色。

（２）肉汁寒天斜面培養 35℃、24時間の培養で、糸状、周縁は滑らかで光沢有
り、生育は普通。

（３）肉汁液体培養 35℃、24時間で生育し、生育は普通。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 35℃、24時間で生育し、生育は普通。液化は漏斗状。

（５）リトマスミルク培養 35℃の培養で凝固せず、色調は青紫色で変化なし。

（ｃ）生理学的性質（１）硝酸塩の還元：陰性（２）脱窒反応：陰性（３）MRテスト：陰性（４）VPテスト：陰性（５）インドールの生成：陰性（６）硫化水素の生育：陰性（７）デンプンの加水分解：陰性（８）クエン酸の利用：陰性（９）無機窒素源の利用：陰性（10）色素の生成：陰性、黄色（11）ウレアーゼ：陰性（12）オキシダーゼ：陽性（13）カタラーゼ：陽性（14）生育の範囲： 18〜37℃ （15）酸素に対する態度：好気的（16）OFテスト：陰性（17）糖類から酸の生育：陽性…グルコース、マルトース、サッカロース、キシロ
ース、ガラクトース、ラクトース、マンニトール、アラ
ビノース、フラクトース陰性…デンプン、イノシトール以上の結果から、フラボバクテリウム・スピリチボラ
ムOTC−３は、ラムノースからの酸の生成及びウレアー
ゼ反応陰性の点で従来のものとは異なっており、新種で
あることが確認された。

アルカリゲネス・デニトリフィカンスとしては、例え
ば、アルカリゲネス・デニトリフィカンスOTC−４を例
示できる。該菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている（微工研菌寄第11192号）。該菌の菌学
的性質を以下に挙げる。

（３）運動性の有無：有り、周鞭毛を有する。

（４）胞子の有無：無し（５）グラム染色性：陰性（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養 35℃、48時間の培養で、直径１〜2mmの凸形コロニ
ー、表面は滑らかで白色。

（２）肉汁寒天斜面培養 35℃、48時間の培養で、糸状、周縁は滑らかで光沢有
り、生育は普通。

（３）肉汁液体培養 35℃、48時間で生育し、生育は普通。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 35℃、48時間で生育するが、生育は劣り、液化はしな
い。

（ｃ）生理学的性質（１）硝酸塩の還元：陰性（２）脱窒反応：陰性（３）MRテスト：陰性（４）VPテスト：陰性（５）インドールの生成：陰性（６）硫化水素の生育：陰性（７）デンプンの加水分解：陰性（８）クエン酸の利用：陰性（シモンズクエン酸培地）陽性（クリステンゼン培地）（９）無機窒素源の利用：陰性（10）色素の生成：陰性（11）ウレアーゼ：陰性（12）オキシダーゼ：陽性（13）カタラーゼ：陽性（14）生育の範囲： 20〜37℃ （15）酸素に対する態度：好気的（16）OFテスト：陰性（17）糖類から酸の生育：陽性…− 陰性…グルコース、マルトース、サッカロース、キシロ
ース、ガラクトース、ラクトース、マンニトール、アラ
ビノース、フラクトース（18）グルコネイトの資化性：陰性（19）アルギニンの分解：陽性以上の結果から、アルカリゲネス・デニトリフィカン
スOTC−４は、グルコネイトの資化性及びアルギニンの
分解性の点で従来のものとは異なっており、新種である
ことが確認された。

バチルス・ラテロスポラスとしては、例えば、バチル
ス・ラテロスポラスOCT−５を例示できる。該菌は、工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（微工
研菌寄第11193号）。該菌の菌学的性質を以下に挙げ
る。

（ａ）形態（１）細胞の形及び大きさ：通常1.0μｍ×2.0μｍ程度（２）細胞の多形性の有無：無し、単独である。

（３）運動性の有無：有り、周鞭毛を有する。

（４）胞子の有無：有り、球状で0.5μｍ×１μｍ、末端か準末端。

（５）グラム染色性：陽性（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養 35℃、24時間の培養で、直径２〜3mmの台形コロニー
表面は粗く白い。

（２）肉汁寒天斜面培養 35℃、24時間の培養で、糸状、周縁は粗く、光沢無
し、生育は普通。

（３）肉汁液体培養 35℃、24時間で生育し、生育は普通。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 35℃、24時間で生育するが、生育は普通。液化は漏斗
状。

（５）リトマスミルク培養 35℃の培養で凝固せず、色調は赤紫色に変化。

（ｃ）生理学的性質（１）硝酸塩の還元：陰性（２）脱窒反応：陰性（３）MRテスト：陰性（４）VPテスト：陰性（５）インドールの生成：陰性（６）硫化水素の生育：陰性（７）デンプンの加水分解：陰性（８）クエン酸の利用：陰性（９）無機窒素源の利用：陰性（10）色素の生成：陰性（11）ウレアーゼ：陰性（12）オキシダーゼ：陽性（13）カタラーゼ：陽性（14）生育の範囲： 10〜40℃ （15）酸素に対する態度：好気的（16）OFテスト：陰性（17）糖類から酸の生育：陽性…グルコース、フラクトース、ラクトース、マンニ
トール陰性…ガラクトース、アラビノース、キシロース、サッ
カロース、デンプン以上の結果から、バチルス・ラテロスポラスOTC−５
は公知種であると確認された。

混合培養は、通常の細菌の培養を同様に行なうことが
でき、液体培地中にて通気撹拌下を行なうのが好まし
い。

培養に用いられる培地は、アルギン酸類を必須成分と
する。アルギン酸類としては、例えば、アルギン酸、そ
の塩、エステル等を挙げることができる。アルギン酸の
添加量は特に制限されないが、通常0.1〜0.5％程度とす
ればよい。更に、本発明で使用する培地には、アルギン
酸類以外に、細菌の培養に用いられる通常の炭素源、窒
素源、無機塩類等が含まれていてもよい。炭素源として
は、例えばグルコース、シュクロース、フラクトース、
ラクトース、スターチ、グリセロール等を、窒素源とし
ては、例えば、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリ
カー、酵母エキス等の有機窒素化合物は硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム等の無機窒素化合物を、無機塩類
としては、例えば、リン酸１カリウム、リン酸２カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等を挙げること
ができる。

上記３菌種の培地への接種割合は特に制限されない
が、通常同量ずつ接種するのがよい。

培養は、30〜35℃程度の温度下及び7.0〜7.4程度のpH
条件下に行なわれ、通常24〜48時間程度で終了する。

得られる培養物を公知の手段に従って精製することに
より、アルギン酸リアーゼを採取することができる。例
えば、遠心分離にて培養物から菌体を分取し、これを超
音波破砕機、加圧ミル等で破砕抽出した後、DEAE−セル
ロース、セファデックスG150、ヒドロキシルアパタイト
等を用いたカラムクロマトグラフィー等によって精製す
ればよい。

かくして得られる酵素は、下記理化学的性質を有して
いる。

（１）作用アルギン酸類を、非還元末端のC₄−C₅間に２重結合を
有する糖に分解し、最終的に４−デオキシ−５−ケトウ
ロン酸に分解する。

（２）基質特異性アルギン酸類、すなわち、アルギン酸及びその塩、エ
ステルに作用する。詳細を下記第１表に示す。

（３）至適pH 本酵素の至適pHは8.0である。

（４）安定pH 本酵素の安定pHは7.0〜8.0である。

（５）至適温度本酵素の至適温度は40℃である。

（６）金属イオン及び阻害剤の影響本酵素は、水銀、PCMBによって阻害されることから、
本酵素がSH酵素であることが示唆される。詳細を下記第
２表に示す。

（７）分子量本酵素は２種のアイソザイム（アルギン酸リアーゼP₁
及びアルギン酸リアーゼP₂）を含んでいる。

アルギン酸リアーゼP₁及びP₂の酵素液40μｌを、それ
ぞれ10％SDS−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、染
色液（エタノール45％、酢酸10％、H₂O45％、コマジー
ブリリアントブルーＲ−250 0.25％）中にて、37℃で３
時間振盪し、脱色液（エタノール25％、酢酸７％）で数
回脱色した後、分子量を決定した。この結果、P₁は分子
量18000と34000のサブユニットからなる分子量52000の
蛋白であり、P₂は分子量34000と46000の２つのサブユニ
ットからなる分子量80000の蛋白であることが判った。

以上の結果から、本発明方法により得荒れる酵素がア
ルギン酸リアーゼであることが確認された。

アルギン酸リアーゼによるアルギン酸類の分解は、通
常の方法に従って行なわれる。例えば、アルギン酸類の
水溶液に酵素を添加すれば良い。前記水溶液中のアルギ
ン酸類の濃度は特に制限されないが、通常0.1〜２重量
％程度、好ましくは0.1〜0.5重量％程度とすればよい。
アルギン酸リアーゼの添加量も特に制限されないが、通
常アルギン酸類1gに対して0.1〜1U程度、好ましくは0.1
〜0.5U程度とすればよい。反応温度はアルギン酸リアー
ゼが作用し得る温度であればよく、通常25〜40℃程度の
温度下に行なわれる。

発明の効果本発明によれば、上記特定の３種の細菌を混合培養す
ることにより、アルギン酸リアーゼを非常に高い収率で
得ることができ、工業的規模でアルギン酸を低分子化す
るのに必要な量のアルギン酸リアーゼを容易に供給でき
る。

実施例以下に実施例及び比較例を挙げ、本発明を一層明瞭な
ものとする。

なお、アルギン酸リアーゼの活性は、アルギン酸にア
ルギン酸リアーゼを作用させて得られる非還元末端のC₄
−C₅間に２重結合を有する糖が235nmに特異的な吸光度
上昇を示すことを利用して測定した。すなわち、0.2％
アルギン酸ナトリウム水溶液0.5ml、100mMトリス−塩酸
緩衝液（pH7.5）0.5ml及び酵素液0.01mlを混合し、25℃
で５分間反応させた後、反応を停止させ、235nmの吸光
度を測定する。本酵素の１単位（Ｕ）は、１分間に235n
mの吸光度を「１」上昇させる酵素量をいう。

実施例１フラボバクテリウム・スピリチボラムOTC−３、アル
カリゲネス・デニトリフィカンスOTC−４及びバチルス
・ラテロスポラスOTC−５を、オートクレーブで殺菌し
た液体培地（アルギン酸ナトリウム0.20％、（NH₄）₂SO
₄ 0.10％、MgSO₄・７H₂O 0.01％、KH₂PO₄ 0.10％、Na₂H
PO₄・12H₂O 0.40％、及び酵母エキス0.05％を含む、pH
7.2）10lに接種し、30℃で24時間振盪培養した。

得られた培養液を遠心分離し、菌体40gを得た。これ
を5mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.5）40mlに懸濁し、90KH
Z、５分の超音波破砕処理を施した後、遠心分離（25000
×ｇ、30分）して上清液78mlを得た。これを、DEAE−セ
ルロース〔商標名、和光純薬（株）製〕カラム（9.5cm
×55cm、グラジエント:0.6M KCl）で精製し、活性分画2
0mlを得た。該活性画分を、セファデックス−Ｇ−150
（商標名、ファルマシア社製）カラム（1.2cm×115cm、
溶出液:10mMトリス・塩酸緩衝液、pH7.5）で精製し、ア
ルギン酸リアーゼの酵素液620ml（4965単位）を得た。
引続きヒドロキシ−アパタイト〔商標名、東洋曹達
（株）製〕カラム（0.6cm×22cm、グラジエント:500mM
リン酸Ｋ緩衝液、pH7.5）で精製し、アルギン酸リアー
ゼP₁を主に含む酵素液11ml（506単位）及びアルギン酸
リアーゼP₂を主に含む酵素液10ml（1825単位）を得た。

実施例２及び比較例１〜６フラボバクテリウム・スピリチボラムOTC−３（Strai
n 3）、アルカリゲネス・デニトリフィカンスOTC−４
（Strain 4）又はバチルス・ラテロスポラスOTC−５（S
train 5）を単独で或いはそれらの中の２種又は３種を
混合して用い、培養時間を48時間とする以外は、実施例
１と同様にして培養及び精製を行ない、アルギン酸リア
ーゼを得た。得られた酵素の総活性を、３種を混合して
用いた場合の酵素活性を100とする相対活性で表わし
た。下記第３表に示す。

以上の結果から、３種の菌株を混合培養した時に、ア
ルギン酸リアーゼが非常に高い収率で得られることが判
る。

実施例１アルギン酸ナトリウムの0.4％水溶液100mlに、アルギ
ン酸リアーゼを添加し、35℃で酵素反応させ、前記水溶
液の粘度の経時変化を調べた。結果を第１図に示す。第
１図において、Ａはアルギン酸リアーゼを加えない場
合、Ｂはアルギン酸リアーゼを1.0g/mlの割合で添加し
た場合、およびＢはアルギン酸リアーゼを2.0g/mlの割
合で添加した場合をそれぞれ示す。

第１図から、酵素添加後５分でアルギン酸ナトリウム
水溶液の粘性が1/4に低下し、約12時間で水と同程度の
粘性になることが判る。

また、上記Ｂの場合の酵素反応液から経時的にサンプ
ルを採取し、薄層クロマトグラムを行なった（展開溶
媒;n−ブタノール：酢酸：水＝50:12:25、薄層プレー
ト：シリカゲル・70プレート、商品名、和光純薬（株）
製）。結果を第２図に示す。第２図から、アルギン酸ナ
トリウムが経時的に分解されていることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルギン酸ナトリウム水溶液にアルギン酸リ
アーゼを添加した時の、該水溶液の粘度の経時変化を示
すグラフである。第２図は、アルギン酸ナトリウム水溶
液にアルギン酸リアーゼを添加し、経時的に採取したサ
ンプルを薄層クロマトグラムにかけた時の溶出パターン
を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者村田幸作京都府京都市山科区北花山中道町848 (72)発明者木村光京都府京都市下京区若宮通り六条上ル81 (56)参考文献ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，49（４）（1985），ｐ．1019− 1021 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/88 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】アルギン酸分解能を有する、フラボバクテ
リウム・スピリチボラム、アルカリゲネス・デニトリフ
ィカンス及びバチルス・ラテロスポラスを混合培養し、
培養物からアルギン酸リアーゼを採取することを特徴と
するアルギン酸リアーゼの製造法。
【請求項２】フラボバクテリウム・スピリチボラムが、
フラボバクテリウム・スピリチボラムOTC−３である請
求項の方法。
【請求項３】アルカリゲネス・デニトリフィカンスが、
アルカリゲネス・デニトリフィカンスOTC−４である請
求項の方法。
【請求項４】バチルス・ラテロスポラスが、バチルス・
ラテロスポラスOTC−５である請求項の方法。