JPH0561911B2

JPH0561911B2 -

Info

Publication number: JPH0561911B2
Application number: JP29543085A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Sakai; Susumu Matsui; Junko Akyoshi; Akira Oohayashi
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1985-12-26
Filing date: 1985-12-26
Publication date: 1993-09-07
Also published as: JPS62155086A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明はα−Ｌ−フコシダーゼの製造法に関す
る。さらに詳しくは細菌を培養して、その培養物
よりα−Ｌ−フコシダーゼを製造する方法に関す
る。〔従来の技術〕 α−Ｌ−フコシダーゼはα−Ｌ−フコシドに作
用して、Ｌ−フコースを遊離する酵素で、細菌、
カビ、植物、軟体動物、哺乳類などに広く分布し
ている。高等動物由来の複合糖鎖の非還元末端、
または枝分れ部分には、α−Ｌ−フコシル基が頻
繁に見いだされ、これらの糖鎖の構造と機能の解
明には、α−Ｌ−フコシダーゼの使用が強力な手
段となる。従来より、アスペルギルス属（ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー第245巻、第
299頁、1970年）、クロストリデイウム属（ジヤー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第
245巻、第1659頁、1970年）などの微生物がα−
Ｌ−フコシダーゼを生産することが知られてい
る。しかしこれらの菌株の生産するα−Ｌ−フコ
シダーゼはブタ顎下腺ムチンや2′−フコシルラク
トースなどの複合糖質には作用するが、ｐ−ニト
ロフエニル−α−Ｌ−フコシドには全く作用しな
い。そのため、α−Ｌ−フコシダーゼを生産する
場合、培養および精製工程における酵素活性測定
が非常に繁雑となる。また、動物起源ではサザエ
（アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・ア
ンド・バイオフイジクス第145巻、第50頁、1971
年）、ボウシユウボラ（ジヤーナル・オブ・バイ
オケミストリー第70巻、第75頁、1971年）にアグ
リコン特異性の広いα−Ｌ−フコシダーゼが見い
出されている。これら巻貝の酵素はムチン型糖タ
ンパク質、糖ペプチド、糖脂質などの天然基質の
みならず、ｐ−ニトロフエニル−α−Ｌ−フコシ
ドのごとき合成基質にも作用する。しかし、サザ
エ、ボウジユウボラのような動物由来の酵素を工
業生産する場合原料の安定供給の面から不利であ
り、微生物酵素の開発が望まれる。〔発明が解決しようとする問題点〕最近、フサリウム属に属する微生物がα−Ｌ−
フコシダーゼを生産することが報告された（日本
農芸化学会昭和60年度大会講演要旨集、第685
頁）。この酵素は天然基質のみならず、ｐ−ニト
ロフエニル−α−Ｌ−フコシドにも作用し、従来
の微生物起源のα−Ｌ−フコシダーゼとは異なる
タイプの酵素である。しかし、酵素の反応至適PH
が酸性側にあることから、細胞に障害を与えるこ
となく糖鎖の構造と機能を解明するためには満足
なものではない。そこで、中性付近に至適PHを有
するα−Ｌ−フコシダーゼを高収率で有利に工業
生産するためには、さらに優れたα−Ｌ−フコシ
ダーゼを生産する微生物の検索が望まれる。従つて本発明の目的は、上記現状に鑑みｐ−ニ
トロフエニル−α−Ｌ−フコシドに作用し、かつ
中性付近に至適PHを有するα−Ｌ−フコシダーゼ
を工業的に安価に製造する方法を提供することに
ある。〔問題点を解決するための手段〕本発明を概説すれば、本発明はα−Ｌ−フコシ
ダーゼの製造法に関するものであつて、コリネバ
クテリウム属またはフラボバクテリウム属に属
し、α−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有する微生物
を培養し、培養物からα−Ｌ−フコシダーゼを採
取することからなる。本発明で用いられるコリネバクテリウム属また
はフラボバクテリウム属に属する細菌はα−Ｌ−
フコシダーゼを培養物中に著量生産することが可
能で、また、後述するごとく非常に精製が容易で
あり、かつ優れた性質を有している。以下、本発明について詳細に説明する。まず、本発明に使用される菌株としては、コリ
ネバクテリウム属またはフラボバクテリウム属に
属するα−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有する菌株
であればいかなる菌株でもよく、またこれらの菌
株の変異株でもよい。そして、コリネバクテリウ
ム属に属しα−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有する
菌株の具体例としては、例えば、コリネバクテリ
ウム（Corynebacyerium）sp.FS−0077が挙げら
れる。本菌は、滋賀県内の土壌中より本発明者ら
が新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は
次のとおりである。ａ形態的性質顕微鏡的観察（肉汁寒天培地上で30℃で培養） (1) 細胞の形および大きさ：通常細胞の大きさは0.3〜0.5×３〜5μm。直線
状あるいは若干彎曲した桿菌であり、片端あるい
は両端がクラブ状に曲がつたものもあり、多形成
である。 (2) 運動性の有無：なし (3) 周鞭毛の有無：なし (4) グラム染色性：陽性 (5) 胞子の有無：なし (6) 抗酸性：陰性ｂ各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養： 30℃の培養で、直径２〜４mmの凸円形コロニー
を形成する。表面および周縁はなめらかである。
コロニーの色は白黄色不透明で光沢がある。 (2) 肉汁寒天斜面培養： 30℃培養で拡幅によく生育する。 (3) 肉汁液体培養： 30℃静置培養で皮膜の形成はないが、沈殿物の
形成がある。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養： 20℃静置培養で表面および穿刺線に沿つて生育
し、ゆつくりとゼラチンを液化する。 (5) リトマスミルク培養： 30℃静置培養でミルクのアルカリ化が見られ
る。ｃ生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陽性 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陽性 (7) デンプンの加水分解：極少量あるいは分解し
ない (8) クエン酸の利用：陽性 (9) 無機窒素源の利用：陽性（アンモニウム塩お
よび硝酸塩） (10) 色素の生成：陰性 (11) ウレアーゼ：陰性 (12) カタラーゼ：陽性 (13) オキシダーゼ：陰性 (14) 最適生育条件：22℃〜37℃、PH７〜8.5 (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) OFテスト：陰性 (17) ビタミン要求性：陰性 (18) 炭素源の利用：Ｌ−フコース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−ガラク
トース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラクトース、
Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、マルトー
ス、ラクトース、グリセロール、シユクロース、
デキストリンなど (19) DNAのGC含量：58％（Tm法による）上記したごとく、本菌はその性状より、バージ
ース・マニユアル・オブ・デターミネイテイブ・
バクテリオリジー（Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology）第８版（1974年）
と対比すると、コリネバクテリウム属に属するも
のと認められる。よつて、本菌株をコリネバクテ
リウム（Corynebacterium） sp.FS−0077と称
することとした。なお、本菌株は工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研条寄第1234号（旧受託
番号：微工研菌寄第8545号）として寄託されてい
る。また、フラボバクテリウム属に属し、α−Ｌ−
フコシダーゼ生産能を有する菌株の具体例として
は、例えば、フラボバクテリウム・フアルギニユ
ーム（Flavobacterium fatugieum）IAM1493が
挙げられる。本発明において培地に加える栄養源は使用する
菌株が利用し、α−Ｌ−フコシダーゼを生産する
ものであればよく、炭素源としては、例えばグリ
セロール、グルコース、シユクロース、マルトー
ス、ラクトース、Ｌ−フコースなどが利用でき、
窒素源としては酵母エキス、ペプトン、コーンス
テイープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩
化アンモニウムなどが適当である。その他にリン
酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩など
の無機質および金属塩類を加えてもよい。なお、
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは誘導酵素である
故、Ｌ−フコースを培地に添加すれば著しく酵素
生産量が増大する。例えばＬ−フコース0.1％添
加により無添加に比べて約50倍の本発明によるα
−Ｌ−フコシダーゼが生産される。 α−Ｌ−フコシダーゼ生産菌を培養するにあた
り、生産量は培養条件により大きく変動するが、
一般に培養温度は20〜35℃、培地のPH５〜7.5が
良く、15〜48時間の通気撹拌培養で本発明による
α−Ｌ−フコシダーゼの生産は最高に達する。培
養条件は使用する菌株、培地組成などに応じ、α
−Ｌ−フコシダーゼの生産量が最大になるように
設定するのは当然である。本発明の菌によつて生産されたα−Ｌ−フコシ
ダーゼは主に菌体内に存在するので、培養物を固
液分離し、得られた湿菌体から通常用いられる超
音波処理、フレンチプレス、ダイナミルなどの
種々の破壊手段を用いて菌体を破壊すると、ある
いはリゾチームのごとき細胞壁溶解酵素を用いて
菌体細胞壁を溶解すると無細胞抽出液が得られ
る。次いでこの抽出液から通常用いられる精製手
段により精製酵素標品を得ることができる。例え
ば、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロ
マト、疎水結合カラムクロマト、ゲル過、凍結
乾燥などにより、精製を行ない、ポリアクリルア
ミドゲルデイスク電気泳動的に単一な精製α−Ｌ
−フコシダーゼを得ることができる。本発明により得られるα−Ｌ−フコシダーゼの
酵素化学的および理化学的性質は次のとおりであ
る。 (1) 作用： α−Ｌ−フコシドＬ−フコース本酵素は上記反応式のごとく、α−Ｌ−フコシ
ドに作用して、Ｌ−フコースを遊離する。 (2) 基質特異性：合成基質ではｐ−ニトロフエニル−α−Ｌ−フ
コシドのみに作用し、ｐ−ニトロフエニル−β−
Ｌ−フコシド、ｐ−ニトロフエニル−α−Ｌ−フ
コシドなどには全く作用しない。また、天然基質
では人乳由来の2′−フコシルラクトースやブタ顎
下腺ムチンなどの複合糖質に作用する。 (3) 至適PHおよびPH安定性：本酵素の至適PHは第１図の曲腺で表わされるご
とくPH8.5付近に極めて高い活性を有しいる。本
酵素を25℃においてそれぞれのPHで60分間処理し
たときのPH安定性を第３図に示した。第３図より
明らかなように本酵素はPH5.5〜9.5の間で安定で
ある。 (4) 至適温度および熱安定性：本酵素の至適温度は第２図の曲線で表わされる
ごとく34℃に至適温度を有している。本酵素をPH
8.0においてそれぞれの温度で60分間処理したと
きの熱安定性を第４図に示した。本酵素は26℃ま
で安定であつたが、50℃でも約70％の残存活性を
示した。 (5) 分子量：本酵素の分子量はセフアクリルＳ−200（フアル
マシア製）によるゲル過法では約43000であつ
た。 (6) 等電点：フアルマライト（PH３〜10、フアルマシア製）
を用いた等電点電気泳動法により求めた本酵素の
等電点は3.8±0.1であつた。 (7) 金属イオンの影響：本酵素は第１表に示すように、Ag⁺、Hg²⁺お
よびCu²⁺などにより強力に阻害された。第１表金属塩（1mM）相対活性（％）無添加 100 Ag⁺ ０ Hg²⁺ ０ Cu²⁺ ０ Zn²⁺ 90 Ni²⁺ 94 Mn²⁺、Mg²⁺、Na⁺またはCa⁺ 100 (8) Km値：ラインウイバー・バーク（Lineweaver−
Burk）ブロツトにより本酵素のｐ−ニトロフエ
ニル−α−Ｌ−フコシドに対するKm値を求めた
ところ、4.5×10^-5Ｍであつた。 (9) 酵素活性測定法： α−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定は次のように
して求めた。即ち10mMp−ニトロフエニル−α
−Ｌ−フコシド0.1ml、100mMリン酸緩衝液（PH
8.0）1.3mlおよび適当に希釈した酵素液0.1ml、反
応液量1.5mlで35℃、10分間反応させた後、
0.25M Na₂CO₃1.5mlを添加して反応を停止させ、
405nmの吸光度を測定する（0.D.サンプル）。別
に対照として酵素溶液の代りに蒸留水0.1ml加え、
同様の操作によつて吸光度を測定し（0.D.ブラン
ク）Δ0.D.₄₀₅（0.D.サンプル−0.D.ブランク）を求
めた。α−Ｌ−フコシダーゼ活性は下記の計算式
によつて求められる。単位／ml＝Δ0.D.（0.D.サンプル−0.D.ブランク）×3.
0（ml）／17.8×10（分）×0.1（ml）×ｄ×df 17.8：ｐ−ニトロフエニルのミリモル分子吸光係
数ｄ：光路長（cm） df：希釈率〔実施例〕以下に本発明によるα−Ｌ−フコシダーゼの製
造方法を実施例をもつて示すが、本発明が以下の
実施例の範囲のみに限定されるものではない。な
お、％は他に特記せぬ限りｗ／ｖ％である。実施例１コリネバクテリウムsp.FS−0077（微工研条寄
第1234号）を、酵母エキス0.5％、ペプトン1.0
％、KH₂PO₄ 0.3％およびMgSO₄・7H₂Ｏ 0.1
％、PH7.0からなる培地100mlを分注して殺菌
（120℃、20分間）した500mlの三角フラスコに接
種し、30℃で24時間培養して種培養液とした。Ｌ
−フコース0.1％、ペプトン0.5％、KH₂PO₄ 0.3
％、MgSO₄・7H₂Ｏ 0.1％および消泡剤（日本
油脂社製CB−442）0.01v／ｖ％、PH7.0からなる
培地15を30容のジヤーフアーメンターに入
れ、120℃で20分間殺菌した。冷却後、上記の種
培養液100mlを接種し、30℃で40時間、毎分15
の通気量と毎分250回転の撹拌速度の条件で培養
した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を
集め、50mMリン酸緩衝液（PH8.0）500mlに懸濁
した後、超音波処理で菌体を粉砕した。菌体破砕
液を遠心分離して上澄液550mlを得た。この上澄
液のα−Ｌ−フコシダーゼ活性は26.5単位／mlで
あつた。この上澄液をあらかじめ50nMリン酸緩
衝液（PH8.0）で緩衝化したDEAE−セフアロー
スCL−6B（フアルマシア社製）のカラム（直径
5.0cm×長さ10cm）に吸着させ、吸着物を150mM
リン酸緩衝液（PH8.0）で洗浄後、300mMリン酸
緩衝液（PH8.0）で溶出して活性画分を集めた。
次にこの活性画分を限外過で濃縮、脱塩後、
50mMリン酸緩衝液（PH8.0）で緩衝化した
DEAE−セフアロースCL−6Bのカラム（直径2.5
cm×長さ10cm）に再び吸着させ、上記と同様な方
法で溶出して得た活性画分に塩化ナトリウムを添
加し4M濃度とした。これをあらかじめ4M塩化ナ
トリウム含有100mMリン酸緩衝液（PH8.0）で緩
衝化したフエニルセフアロースCL−4B（フアル
マシア社製）のカラム（直径2.5cm×長さ20cm）
に吸着させ、吸着物を4M塩化ナトリウム含有
10mMリン酸緩衝液（PH8.0）で洗浄後、3M塩化
ナトリウム含有10mMリン酸緩衝液（PH8.0）で
溶出し、活性画分を集めた、この活性画分をコロ
ジオン膜で濃縮後、あらかじめ100mMリン酸緩
衝液（PH8.0）で緩衝化したセフアロースCL−6B
（フアルマシア社製）のカラム（直径2.5cm×長さ
90cm）でゲル過を行ない、得た活性画分に安定
剤としてEDTA最終濃度1mMになるように加え
て凍結乾燥し、精製酵素粉末780mgを得た。この
粉末の比活性は9.59単位／mgであつた。この酵素
粉末はポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳動
的に単一であつた。以上の精製工程を第２表に示
す。

〔発明の効果〕

本発明により、複合糖鎖の構造と機能の解明に
有用なα−Ｌ−フコシダーゼの新たな工業的生産
に適した製造法が提供された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により得られるα−Ｌ−フコシ
ダーゼのPHと活性の関係を表わすグラフであり、
第２図は温度と活性の関係を表わすグラフであ
り、第３図はα−Ｌ−フコシダーゼを25℃におい
て、それぞれのPHで60分間処理した後のPHと活性
の関係を表わすグラフであり、第４図はPH8.0に
おいてそれぞれの温度で60分間処理した後の温度
と活性の関係を表わすグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１コリネバクテリウム属またはフラボバクテリ
ウム属に属するα−Ｌ−フコシダーゼ生産菌を培
養し、培養物よりα−Ｌ−フコシダーゼを採取す
ることを特徴とするα−Ｌ−フコシダーゼの製造
法。