JPH0260313B2 - - Google Patents

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JPH0260313B2
JPH0260313B2 JP56146019A JP14601981A JPH0260313B2 JP H0260313 B2 JPH0260313 B2 JP H0260313B2 JP 56146019 A JP56146019 A JP 56146019A JP 14601981 A JP14601981 A JP 14601981A JP H0260313 B2 JPH0260313 B2 JP H0260313B2
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uricase
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Oribieri Roberuto
Fuasuchetsuchi Eugenio
Chufuorotsuchi Pieruruiji
Deegen Ruutobihi
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EE ENU I ENTE NATSUIONAARE IDOROKARUBURI
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EE ENU I ENTE NATSUIONAARE IDOROKARUBURI
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/62Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving uric acid
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/265Micrococcus
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、臨床診断において血清又は尿中の尿
酸の測定に用いることのできる高活性のウリカー
ゼ酵素(EC1.7.3.3.)の製造方法に関する。 ウリカーゼは尿酸のアラントインへの酸化を触
媒する酵素であり、ヒトのような高等哺乳動物の
組織中には存在せず、低級哺乳動物の組織、特に
内奥部器管に存在し、又二、三の微生物内に多量
又は少量存在する。本発明において、ウリカーゼ
が、該酵素の製造者としては従来知られておら
ず、更に、公知種の他の微生物と比較して低濃度
の尿酸を含有する培地中で多量のウリカーゼを製
造する利点を有する微生物であるミクロコツカ
ス・ロゼウス(Micrococcus roseus)によつて
製造されることが此の度見い出され、これが本発
明の第一の目的である。更に、驚くべきことに、
ミクロコツカス・ロゼウスNRRL B12196によつ
て製造されたウリカーゼの活性の最適条件は、他
の細菌から製造されたウリカーゼと異なり、生理
液のPH値に近いことが見い出され、このことは、
尿酸を測定すべき生物学的試料のPH調製を必要と
せず、従つて被験試料と化学的修正に伴う危険性
が除去されるので有利である。この微生物はモン
テロトンド地域(ローマ)の耕作用地から単離さ
れたものであり、下記の形態学的並びに生物学的
性質を有する。 微視的形態 一つより多くの平面上に分裂することにより、
直径1乃至2.5ミクロンで不動のグラム陽性の球
状物、立方形の塊状物、または不規則の集合体を
形成し、これらは、場合によつて対を形成してい
るか又は孤立している。 巨視的形態 栄養寒天培地上のコロニー:隆起した、連続周
縁、バラ色、平滑な表面、1〜2mm直径。 栄養寒天斜面培地:薄バラ色色調のさび色、平
滑、艶有り。 生化学的性質 グルコース培養液中での成長:ムコイド状沈澱を
生じて僅かに濁つており、少しバラ色を帯びて
おり、PH=6.5。 45℃よりも10℃において成長し、25℃〜35℃
が最適である。 グルコース培養液のNaCl濃度が、5%及び
10%において成長し、15%においては成長しな
い。 シモンズクエン酸塩寒天培地上では成長しな
い。 糖からの好気性条件下での酸生成〔パープル培養
液ベースイDIFCO)〕:キシロース、グリセロー
ル、マンニトール、ラクトール、マルトース、
ソルボース、リボース、アラビノース、ラフイ
ノース、セロビオースは陰性、グルコース、ス
クロース、フラクトースは僅かに遅れた酸性比
(7〜10日)。 アルギニン加水分解:陰性 デンプン加水分解:陽性 ゼラチン加水分解:陰性 ウレアーゼ:陽性 H2S:陰性 カタラーゼ:陽性 ニトラターゼ:陽性 インドール:陰性 アセトイン:陰性 メチルレツド:陰性 レシチナーゼ:陰性 リパーゼ:(バター及びオリーブ油):陰性 これらのデータを、バージーズ・マニユアル・
オブ・ダイターミナテイヴ・バクテリオロジー
(Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology)(版)中の記載と対比すると、
本発明による微生物は、ミクロコツカス科、ミク
ロコツカス属、ロズウス種に属するものであるこ
とが判る。これは、米国、イリノイ州、ペオリア
の北部領域研究センター(Northerin Reginnal
Research Center)にNRRL B12196の番号で寄
託されている。尚、上記寄託機関は1981年1月31
日にブタペスト条約に基づく国際寄託機関として
の地位を取得し、その際上記の微生物は上記の受
託番号を該寄託機関によつて付与された。 ミクロコツカス・ロゼウスNRRL B−12196
の培養は好気的に、通常の方法、例えば表面培養
或はより好ましくは、撹拌された醗酵器を用いて
深部培養により行うことができる。培地は固体或
は液体の何れでもよく、資化性炭素、窒素源、リ
ン源並びに鉱物塩及びビタミン類を含有する。 培養は10℃〜40℃、好ましくは25℃〜35℃の範
囲の温度において、10〜48時間、好ましくは20〜
30時間PH6〜9、好ましくは7〜8において行わ
れる。 炭素源としては、例えば、グルコース、乳酸
塩、酢酸塩、スクロース、フマール酸塩、尿酸、
コーン・ステイープ・リカー、グルセロール等を
用いることができる。 窒素源としては、例えば、肉加水分解物、カゼ
イン又は大豆加水分解、アンモニア塩、尿素、硫
酸塩、尿酸等が挙げられる。 細菌ペーストからのウリカーゼの抽出及び必要
に応じて行われる精製は酵素学上の常法に従つて
行われる。ミクロコツカス・ロゼウスNRRL B
−12196から抽出されたウリカーゼは重合体マト
リツクスに、マトリツクスとの化学結合又はイオ
ン型結合の形成により、或は単なる物理的固定化
により固定化することができ、有利である。 以下、本発明の実施態様を説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。 例 1 下記組成を有する培養液を調製した: 酵母エキス 15g/ 尿 酸 2g/ PHをNaOHで7.2に調整し、培地を500mlのフラ
スコに各々200mlずつ分注した。116℃で30分間殺
菌後、これに、同一培地を2%の寒天と共に含有
する斜面培地で得られたNRRL B−12196菌株
の培養物を接種し、30℃で200RPMの速度で環状
撹拌させながら24時間培養の行つた。細胞を次い
で遠心分離によつて採集し、200mlの培養液から
3gのペースト(湿重量)を得た。このようにし
て得られた細胞ペーストを60mlのリン酸塩緩衝液
(0.1M;PH=8.5)中にスラリー化させ、フレン
チ・プレシヤー・セル・プレス(French
Pressure Cell Press)を完全な細胞崩壊物が得
られるまで通過させた。このようにして得られた
エキス中の酵素活性を測定したところ1gの湿順
菌体中に100ウリカーゼ単位が含まれていた。 ウリカーゼの定量 ウリカーゼ活性は、マーラー等の方法
〔Mahleret al、J.Biol、Chem.(1955)216、625〕
を下記の如く修正した方法により283nm(ナノ
メートル)における尿酸の放出(discharge)を
分光光度計により追跡して測定した。20mgの尿酸
を100mlのリン酸緩衝液(0.1M、PH=8.5)中に
含む溶液7mlを50ml容の小さなフラスコに入れ、
30℃において撹拌温浴上で反応させた。反応開始
は少量の酵素エキスを添加して行われた。エキス
添加直後及び反応10分後に反応混合物の0.5ml試
料を抜き出し、4mlの0.1MHClに添加した。 このようにして得られた溶液の吸光度を283n
mにおいて読み取つた。 ウリカーゼ単位は上記試験条件下において毎分
1マイクロモルの尿酸を分解することのできる酵
素の量と定義される。 例 2 ミクロコツカス・ロゼウスNRRL B−12196
菌体のエキスを例1と同様にして調製した。 このエキスを遠心分離にかけ、上澄液について
前記方法に従つて、反応混合液として各種PHの
0.1Mリン酸塩溶液にした尿酸を用いてウリカー
ゼ活性を測定した。又、同時に、ミクロコツカ
ス・ロゼウスの培養条件と同一条件で培養したバ
チルス・フアスチジオサスの培養液から得られた
酵素エキスの活性も測定された。表1に結果を示
す。表中、二つの微生物のPH9におけるエキスの
活性を100と推定した。 【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 ミクロコツカス・ロゼウスに属するNRRL
    B−12196菌株を培養し、培養物からウリカーゼ
    を採取することを特徴とする、ウリカーゼの製造
    方法。 2 培養温度が10℃〜40℃の範囲にある、特許請
    求の範囲第1項記載のウリカーゼの製造方法。 3 培養温度が好ましくは25℃〜35℃の範囲にあ
    る、特許請求の範囲第2項記載のウリカーゼの製
    造方法。 4 培地のPHが6〜9の範囲にある、前記のいず
    れかの特許請求の範囲に記載のウリカーゼの製造
    方法。 5 培地のPHが好ましくは7〜8の範囲にある、
    特許請求の範囲第4項記載のウリカーゼの製造方
    法。 6 培養を好気性条件下において、資化性炭素
    源、窒素源、リン源及び鉱物塩を含有する培地の
    存在下で行う、前記のいずれかの特許請求の範囲
    に記載のウリカーゼの製造方法。
JP56146019A 1980-09-19 1981-09-16 Production of uricase Granted JPS57115177A (en)

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CA (1) CA1160170A (ja)
CH (1) CH650528A5 (ja)
DE (1) DE3137049C2 (ja)
DK (1) DK148360C (ja)
ES (1) ES8302088A1 (ja)
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GB (1) GB2084157B (ja)
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IT (1) IT1141061B (ja)
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ES506360A0 (es) 1983-01-01
GB2084157A (en) 1982-04-07
DK387181A (da) 1982-03-20
IT8024757A0 (it) 1980-09-19
AT375398B (de) 1984-07-25
NO159862C (no) 1989-02-15
NL8104319A (nl) 1982-04-16
FI812868L (fi) 1982-03-20
DE3137049A1 (de) 1982-04-08
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ES8302088A1 (es) 1983-01-01
AR226750A1 (es) 1982-08-13
PT73696B (en) 1982-12-10
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IT1141061B (it) 1986-10-01
DE3137049C2 (de) 1983-01-20
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FI70592C (fi) 1986-09-24
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