JPH03133376A - ザルコシンオキシダーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ザルコシンオキシダーゼ（以下、ＳＡＯと略
記する。）の製造法に関するものであり。

重要な臨床検査項目の一つである血清及び尿中のクレア
チニンあるいはクレアチンの酵素的な定量に利用される
有用なＳＡＯの製造法を提供するものである。

（従来の技術） ＳＡＯは、ザルコシンに作用してグリシン、ホルムアル
デヒド及び過酸化水素とに酸化分解する反応を触媒する
。本酵素を、クレアチニナーゼ及びクレアチナーゼと共
に、血清あるいは尿に作用させると、血清あるいは尿中
のクレアチニンあるいはクレアチンからザルコシンが生
成され、ザルコシンから、さらにＳＡＯの作用により過
酸化水素が生成されるので、この過酸化水素を公知の方
法で定量することにより、血清あるいは尿中のクレアチ
ニンあるいはクレアチンを簡便かつ特異的に定量するこ
とができる。そのため、このような酵素的定量法は、従
来の非特異的な化学的定量法に代わるものとして臨床検
査分野での需要が高まってきている。

ＳＡＯは、各種動物のミトコンドリアや各種の微生物に
存在することが知られており、これらの微生物を培養し
てＳＡＯを製造する方法が提案されている。すなわち、
アースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏ−ｂａｃｔｏｒ）　（
特公昭５８−４０４７０号公報）、バチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）　（特公昭６０−２９４７３号公報）。

シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　（特公昭
６２−１９１５３号公報）、シリンドロカルボン（ｃｙ
ｌｉｎｄｒｏ−ｃａｒｐｏｎ）　（特公昭６２−４３６
７０号公報）及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）　（特開昭６３−２０９５８５号公報）等の
微生物を培養してＳＡＯを採取する方法である。

また、耐熱性の高いＳＡＯを、バチルス属に属する細菌
を培養して製造すること（特開昭６１−１６２１７４号
公報）及び組換えＤＮＡ技術を駆使して耐熱性ＳＡＯを
製造する方法（特開昭６３５９８８５号公報）も報告さ
れている。

（発明が解決しようとする課題） ＳＡＯ産生微生物としてこれまで知られているものは、
培養に長時間を要し、なおかつ得られた培養物中の酵素
含有量が低く、従って酵素の生産性が低いという実用上
大きな問題があった。

例えば、アースロバフタ−では培養に４０時間を要し、
得られた微生物菌体中のＳＡＯ含有量は。

０．４万ユニット／Ｋｇ　（特公昭５８−４０４７０号
公報）であり、またストレプトミセスでは６０時間もの
長時間を要しながら、培養液中のＳＡＯ含有量は、７４
ユニツト／ｌ（特開昭６３−２０９５８５号公報）に過
ぎない。最も高い生産性を示すものでも、バチルス属に
属する微生物が１８時間の培養で１４．５万ユニツ）　
／　Ｋ　ｇを生産すると報告されている（特開昭６１−
１６２１７４号公報）に過ぎない。

このように、上記した微生物によるＳＡＯの製造法は生
産性が低いので、最近では組換えＤＮＡ技術を用いた方
法も試みられているが、この方法においても１組換え微
生物の創製や培養など、実用上問題点が多い。

本発明は、実用的な生産性が得られるＳＡＯの製造法を
提供することを目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明者は、クレアチニンあるいはクレアチンの酵素的
測定法に使用可能な酵素化学的性質を有するＳＡＯを大
量に含有し、かつ培養に長時間を要さない微生物菌株を
自然界に求め鋭意検討した結果、新たに土壌より分離し
たバチルス属に属する一菌株が優れた酵素生産性を示す
ことを見出し。

本発明に到達した。

すなわち９本発明は、バチルス属に属するＵＴＫ３０４
４株を培養し、培養物から下記の理化学的性質を有する
ザルコシンオキシダーゼを採取することを特徴とする。

下記の理化学的性質を有するザルコシンオキシダーゼの
製造法を要旨とするものである。

（ａ）　　作用： ザルコシン＋Ｈ２０＋　０２ −グリシン＋ホルムアルデヒド＋Ｈ２０□ら）至適ｐＨ
：　ｐＨ７，５〜８．０ （ｃ）　　熱安定性：ｐＨ７，５の緩衝液中で５０℃。

６０分の処理後も約１００％の活性を保持する。

（ｄ）　　分子量：約７２．０００　（ゲル濾過法によ
る）以下１本発明の詳細な説明する。

本発明に使用されるバチルスＵＴＫ３０４４株は、滋賀
県琵琶湖東岸の土壌より新たに分離した菌株であり、そ
の菌学的性質は下記のとおりである。なお９本菌株は一
般的な細菌用培地である肉汁に生育しないため、ＢＨＩ
（プレインハートインフュージョン）培地を使用した。

１、形態 ・細胞の大きさ及び形：約ＩＸ３μの短桿菌・細胞の多
形性の有無：無 ・運動性の有無：周鞭毛で運動する ・胞子の有無：内生胞子をつくり、胞子によって菌体は
ほとんど膨張しない。

・ダラム染色性：陽性 ・抗酸性：無 ２、各培地における生育状態 ・ＢＨＩ寒天平板培養（４０℃、２日間）コロニーは直
径４〜５ｍｍの円形１表面は平滑、乳白色で均質、光沢
はなく周縁は金縁、培地は着色しない。

・ＢＨＩ液体静置培養（４０℃、２日間）全体にわずか
に濁り、沈渣を生成する。

膜の生成等２表面での生育は認められず。

・ＢＨＩゼラチン穿刺培養（４０℃、７日間）全体にわ
ずかに濁り、沈渣を生成する。

表面近くでの生育は旺盛である。ゼラチンを液化せず。

３、生理的性質 ・硝酸の亜硝酸への還元：陽　性 ・脱窒反応　　　　　　：陰　性 ・ＭＲテスト：ブドウ糖、ペプトン培地に生育せず。

Ｖ−Ｐテスト：　〃 インドールの生成 硫化水素の生成 デンプンの加水分解 クエン酸の利用 色素の生成 陰性 陰性 陰性 陰性 な　　し ・ウレアーゼ　　　　　：陽　性 ・オキシダーゼ　　　　：陽　性（弱）・カタラーゼ　
　　　　：陽　性 ・生育の範囲：温度　１０〜４５℃ ｐＨｆ３．０〜９．５ ・酸素に対する態度：好気性（嫌気的には生育しない） ・Ｏ−Ｆテスト：糖を利用しないため不明・糖の資化性
： Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−マンノース Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラクトース 麦芽糖 ショ糖 乳糖 トレハロース Ｄ−ソルビット Ｄ−マンニット　　　　　　〃 イノジット　　　　　　　〃 グリセリン　　　　　　〃 デンプン　　　　　　　　　〃 ４、その他の諸性質 ・カゼインの加水分解　　：陰　性 ・酢酸、コハク酸、プロピオン酸の利用：〃・チロシン
の分解　　　　二　〃 ・　フェニルアラニンの脱ア　ミ　ン　化　　　：　　
　〃・　ジヒドロキシアセトンの生成二〃 ・ＮａＣｌ！、ＫＣｌ１要求性：　〃 ・　アラントイン、　尿酸要求性　　　　　：　　　〃
・ＮａＣｆ存在下での生育 ２％十 ５％　　＋ ７％十 １０％ ・栄養要求性：ビタミンを要求する。

以上の菌学的諸性質より１本菌株をバージエイマニュア
ル　才ブ　システマテイック　バクテリオロジ−（Ｂｅ
ｒｇｅｙ　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　　１９８４年で検索
した。その結果。

本菌株の性質に全く一致する記載は見当たらなかった。

すなわち９本菌株は、好気性、ダラム陽性。

桿菌で内生胞子を作ることからバチルス属に属すると考
えられ、さらに、Ｖ−Ｐブロス及び糖からの酸の生成を
調べる培地に生育しないことから。

バチルス　ファステイデイオサス（１３，ｆａｓｔｉｄ
ｉｏｓｕｓ）に最も近いと考えられた。しかしながら。

本菌株とバチルス　ファステイデイオサスとは。

アラントインと尿酸の要求性及び栄養要求性等の点で異
なっていた。従って１本菌株は、バチルスファスティデ
ィオサスに属するものとは認め難く。

バチルス属に属する新種であるとするのが適当と考えら
れ１本菌株を、バチルスＵＴＫ３０４４株と命名した。

また本菌株は１通産省工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第１０８４９号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０８
４９）として寄託されている。

本発明の製造方法は、上記した新菌株バチルスＵＴＫ３
０４４株を培養するものであり、バチルスＵＴＫ３０４
４株を用いて１本菌株が良好に生育する様に培養しさえ
すればよい。バチルスＵＴＫ３０４４株の培養に用いら
れる培地組成としては９本菌株が生育可能なものであれ
ばいかなるものでもよく、炭素源、窒素源、無機塩、そ
の他の栄養素を含む合成培地あるいは天然培地のいずれ
でも使用できる。炭素及び窒素源としては９例えば、ク
レアチニン、クレアチン、ザルコシン、肉エキス、ペプ
トン、コーンステイープリカー、大豆粉等が使用できる
。無機塩としては１例えば。

ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、
コバルト等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩等が使用できる
。ビタミン源としては、酵母エキスの添加が好適である
。培養温度としては１通常３０〜５０℃の範囲であれば
よく、好適には４０℃付近で行えばよい。培養液のｐＨ
範囲としては。

ｐＨ６，５〜８．０が好ましく、さらに好適にはｐＨ７
，０〜７．５の範囲である。このような条件下で５〜１
８時間振盪又は通気攪拌培養を行うと、菌の生育に伴い
、培養物中にＳＡＯが効率よく生産される。

前記したように、バチルス属に属するＳＡＯ生産菌を培
養してＳＡＯを得る方法は、既に公知であるが１本発明
において用いられる微生物は、バチルス属に属するもの
の新種の菌株であるバチルスＵＴＫ３０４４株であり１
本菌株を用いることにより、従来には考えられないほど
の生産性が達成されたものである。すなわち、新菌株で
あるバチルスＵＴＫ３０４４株を用いることで、約１０
時間の培養時間で２０万ユニツ）　／　Ｋ　ｇ以上の含
有量を示す菌体を取得することが可能になるのである。

さらに驚くべきことに、バチルスＵＴＫ　３０４４株の
培養により採取されるＳＡＯは、既に公知であるバチル
ス属に属する微生物より採取されるＳＡＯとは、理化学
的性質の異なる全く別のものであり、又、バチルス属以
外の微生物から採取されるいかなるＳＡＯとも理化学的
性質を異にする新規なＳＡＯであることが明らかになっ
た。

以下９本発明の製造法で得られるＳＡＯの理化学的諸性
質を記載する。

（ａ）作用 前記した通り。

（ｂ）　　基質特異性 （ｃ）　　至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 反応の至適ｐＨは前記した通り７．５〜８．０゜安定ｐ
Ｈは７〜１０の範囲である。

（ｄ）　　力価の測定法 ５０ｍＭ）リス塩酸バッファー（ｐ　Ｈ７，５）。

３ｍＭ４−アミノアンチピリン、０．０４Ｖ／Ｖ％フェ
ノール、２００ｍＭザルコシン及び１０ユニツ）　／　
ｍ　Ｒパーオキシダーゼを含む溶液を３０℃に加温した
後、酵素溶液を添加し、４８０ｎｍにおける吸光度の増
加を測定し、１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生
成する酵素量を１ユニツトとした。

（ｅ）　　作用適温の範囲 ザルコシンから生成するホルムアルデヒドを比色定量す
る方法により求めた作用適温は。

５０〜６０℃の範囲である。

（ｆ）　　熱安定性 ０、１　Ｍ　）リスー塩酸バッファー（ｐＨ７，５）中
で、５０℃、６０分処理後、１００％の活性を保持し、
５５℃、６０分処理後では５０％以上の活性が残存する
。

（□□□阻害、活性化及び安定化 このような作用をもつ物質は、今のところ不明である。

（５）精製方法 後述した通り。

（ｉ）　　分子量 前記した通り。さらに、ＳＤＳ電気泳動法により約３７
．０００の分子量を示し９本酵素は。

分子量的に同一なサブユニットからなる二量体構造を有
して−いる。

（ｊ）　　結晶構造及び元素分析 結晶は得られていない。元素分析はまだ測定していない
ため不明である。

（９）その他 本酵素は、２８０，３７５，４５０ｎｍに吸収極大を有
することから、フラビン・アデニン・ジヌクレオチド（
Ｆ　Ａ　Ｄ）を含有している。

本発明の製造法で得られるＳＡＯは、特に分子構造の点
で公知のいずれのＳＡＯとも異なり、新規なＳＡＯであ
る。すなわち、これまで知られているＳＡＯの分子構造
は、単量体構造か、又は互いに分子量の異なるサブユニ
ットからなる二量体あるいは四量体構造である。ところ
が１本発明の製造法で得られるＳＡＯは１分子量的に同
一のサブユニット２個から構成されており、これまで知
られているＳＡＯとは全く異なる分子構造を有している
。

上記培養により得られたバチルスＵＴＫ３０４４株の菌
体からのＳＡＯの取得方法としては１周知の方法を使用
すればよい。本酵素は、細胞内に存在するため、培養液
から菌体を濾過あるいは遠心分離等の方法により集めた
後１例えば、自己消化、溶菌酵素処理１機械的処理、超
音波処理等の方法により菌体を破砕して酵素を可溶化さ
せる。

このようにして得られた酵素含有液より、菌体破砕残渣
等の不溶物を遠心分離処理等によって除き、ＳＡＯの溶
液を得る。さらに９本酵素は、必要に応じて酵素精製の
常法に従って９例えば、除核酸、塩析操作、有機溶剤処
理又はイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィー、ゲルクロマトグラフィー等のカラムクロマト
グラフィーを組合わせて行うことにより、精製酵素を得
ることができる。

（実施例） 以下１本発明を実施例により具体的に説明する。

なお、実施例中のＳＡＯ活性は、前記した方法により測
定した。

また、実施例中の％は、Ｗ／Ｖ％である。

実施例１ ０．５％クレアチニン、０．１％ＫＨ，ＰＯ，，０，１
％Ｎ　ａ　２ＨＰ　Ｏ−・１２Ｈ２０，０，０５％Ｍ　
ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２０及び０．０５％粉末酵母エキス
からなる培地（ｐＨ７，０＞２００ｍｊ２を５００ｍ！
容三角フラスコに入れ、これに、バチルスＵＴＫ３０４
４株（微工研菌寄第１０８４９号）を接種し、４０℃に
て約１４時間回転振盪培養して種菌を得た。

３ｊ２容ジャーファーメンタ−中であらかじめ殺菌した
。上記と同じ組成の培地１，８１に種菌を接種し、４Ｎ
−塩酸にてｐＨを７．５以下に保ちつつ。

ｌｖｖｍ、　　４０　Ｏｒｐｍ、　　４０℃にて通気攪
拌培養を約５時間行った。菌濃度が、６６０ｎｍの濁度
で表示して１．０を越えた時点で攪拌数を３００　ｒｐ
ｍとし、菌濃度が４．５に達した時点で培養を終了し。

培養液を３０℃以下に冷却し、遠心分離により菌体を集
めた。

このようにして得られた培養液中のＳＡＯ含有債は、湿
重量ＩＫｇの菌体当たりに換算すると。

約３０万ユニツトであった。

次に、得られた菌体を、Ｑ、２ｍｇ／ｍβリゾチームを
含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、３
７℃で３０分放置後遠心分離により粗抽出液を得た。こ
れに最終濃度が０．２％になるようにプロタミン溶液を
添加し、生じた沈殿を遠心分離除去し、除核酸液を得た
。この液に固型硫安を添加し、硫安濃度が６０〜７０％
飽和の範囲で塩析されてくる沈殿物を集め、５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，５＞に溶解し、タンパク濃度及び
酵素活性を測定し、粗抽出液の値と比較したところ。

ＳＡＯは約２０倍に精製されていた。

このＳＡＯの理化学的諸性質を調べたところ。

前記した通りの性質を有していた。

実施例２ クレアチニンの代わりにクレアチンを０．３％含む以外
は、実施例１と同様の培地組成を用い、培地１８βを含
む３０Ａ容ジャーファーメンタ−にフラスコ培養により
得られた種菌２１を接種し。

ｐＨ７，（１〜７．５．０．２５ｖｖｍ、　　２０　Ｏ
ｒｐｍ、　　４０℃にて通気攪拌培養した。約６時間経
過後、菌濃度（６６０ｎｍの濁度）が３．０に達した時
点で培養液を冷却し、遠心分離により菌体を集めた。

このようにして得られた培養液中のＳＡＯ含量は、湿重
量ＩＫｇの菌体当りに換算すると、約２５万ユニツトで
あった。

次に、得られた菌体を、超音波にて破砕後、遠心分離に
より得られた無細胞抽出液５００ｍｌを８００ｍ１のＤ
ＥＡＥセファセルカラムにチャージし、バッファー中の
ＫＣ１濃度を徐々に高めて活性画分を溶出した。活性画
分を集めて６０％飽和となるように固型硫安を添加し、
沈澱物を遠心分離により除去した後、上澄みを濃縮し、
ウルトロゲルＡＣＡ３４ゲルクロマトグラフィーにより
分画し、粗抽出液と比較して１０７倍に精製されたＳＡ
Ｏを得た。

精製されたＳＡＯは、黄色く着色しており、ディスクゲ
ル電気泳動の結果、はぼ均一に精製されていることがわ
かった。活性の収率は約２０％であった。

（発明の効果） 本発明の製造法によれば９重要な臨床検査項目の一つで
ある血中及び尿中のクレアチニン、クレアチン量の定量
用酵素として極めて有用なザルコシンオキシダーゼを実
用的なレベルで生産でき。

本酵素の増大する需要に対応できる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属に属するＵＴＫ３０４４株を培養し、
   培養物から下記の理化学的性質を有するザルコシンオキ
   シダーゼを採取することを特徴とする、下記の理化学的
   性質を有するザルコシンオキシダーゼの製造法。 （ａ）作用： ザルコシン＋Ｈ＿２Ｏ＋Ｏ＿２ →グリシン＋ホルムアルデヒド＋Ｈ＿２Ｏ＿２（ｂ）至
   適ｐＨ：ｐＨ７．５〜８．０ （ｃ）熱安定性：ｐＨ７．５の緩衝液中で５０℃、６０
   分の処理後も約１００％の活性を保持する。 （ｄ）分子量：約７２，０００（ゲル濾過法による）