JPS584551B2 - コリン酸化酵素の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコリン酸化酵素（以下ＣＯと略する）を製造す
る方法に関する。

リン脂質の構成成分の一つであるコリンのＣＯによる酵
素的是量法は、従来の化学的定量法に代わるものとして
、更にはホスホリパーゼＤとの共役反応でリン脂質の定
量、コリンエステラーゼとの共役ｋよるア毛チルコリン
の定量、コリンエステラーゼ活性測定への応用等と相俟
って臨床診断分野での利用が考えられ、その意義は極め
て大きく、近年多犬の注目を集めている。

古くより、コリンをベタインに変換する酵素としては、
動物臓器（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー第２３９巻、１６０５頁、１９５９年）や微生物
（アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー
第３９巻、１０５頁１９７５年）由来のコリン脱水素酵
素が知られている。

この場合は、この酵素の作用によって生ずる水素の受容
体の存在を必要とする。

他方、コリンの酸化分解において分子状酸素の消費を伴
なう、いわゆるＣＯの存在の指摘は、従来より動物臓器
（バイオケミカル・ジャーナル、第３１巻、８６９頁、
１９３７年）（バイオケミカル・ジャーナル、第３２巻
、１０２４頁、１９３８年）や微生物ではアルスロバク
ター属やシュードモナス属（アーカイブス・オブ・マイ
クロビオロジイ第７１巻、２３５頁、１９７０年）一つ
いてなされており、特にアルスロバクター属に属する細
菌のＣＯについては近年更に具体的にして詳細な報告が
ある（第１９回脂質研究会講演要旨集、２３頁１９７７
年）。

本発明者等は、コリンに作用してこれをベタインに酸化
する過程において、化学量論的に対応して分子状酸素を
消費し過酸化水素を生成するＣＯ生産菌を見出すべく広
く自然界より分離検索した結果、明石市下の土壌より分
離したアルカリゲネス属に属する細菌であるＡＫ−２が
このようなＣＯを生産することを発見した。

本菌の生産するＣＯはコリン→ベタインアルデヒド→ベ
タインの反応を触媒し、前段および後段いずれの反応の
場合も１分子の酸素の消費と１分子の過酸化水素の生成
があり、コリン→ベタインの反応においては結局、２分
子の酸素の消費および過酸化水素の生成がある。

それ故、消費される酸素の量あるいは生成する過酸化水
素の量を公知の方法で定量することにより、存在するコ
リン量の測定が可能で、他の酵素の共存下で、リン脂質
、アセチルコリン、コリンエステラーゼ活性測定等の臨
床診断用試薬としてめ利用が考えられる。

このＣＯ生産菌ＡＫ−２は次のような菌学的性質を有す
る。

Ａ 形態 （１）肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は桿状であり、
０．５ −０．８ × １−３μの大きさで、通常単独
であるが、まれに２−４連をなす。

時に伸長した細胞もみられるが細胞の多形性はない。

（２）運動性あり、鞭鞭毛も有する。

（３）胞子形成なし （４）ダラム染色性は陰性 （５）抗酸性は陰性 Ｂ 生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 半透明灰白色又は灰黄色で、やや光沢を有する円形のや
や隆起したコロニーを生じ、周縁は円形で拡散性色素は
生産しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 生育は良好で、灰白色または灰黄色で拡幅状をなす。

（３）肉汁液体培地培養 生育は良好で表面に膜を形成することなく培地はやや濁
り、下層に白色の菌体を沈澱する。

（４）肉汁寒天穿刺培養 上面および穿刺孔中に生育する。

（５）肉汁ゼラチン穿刺培養 表面に生育しわずかに液化する。

（６）リトマスミルク 培養と共にｐＨはゆっくりアルカリ性となる。

わずかにリトマスを還元するが液化、凝固はしない。

Ｃ 生埋的性質 （１）硝酸塩の還元：陰性 （２）脱窒素反応：陰性 （３）ＭＲテスト：陰性 （４）ＶＰテスト：陰性 （５）インドールの生成：陰性 （６）硫化水素の生成：陰性 （７）デンプンの加水分解：陽性（微弱）（８）クエン
酸の利用：陽性 （９）無機窒素源の利用：硝酸塩 陰性アンモニ
ウム塩 陽性 （１０）色素の生成：キングＡ培地およびＢ培地では色
素の生産はなし、肉汁寒天、肉汁ゼラチン、ポテトデキ
ストロース培地では水溶性色素の生成は認められない。

（１１） ウレアーゼ：陰性 （１２） オキシダーゼ：陽性 （１３）カタラーゼ：陽性 （１４）生育ｐＨ：５〜９、特にｐＨ６．５〜７．５で
よく生育する。

（１５）生育温度：１５〜４０℃、特に２５〜３０℃で
最もよく生育する。

（１６）好気性および嫌気性：好気性 （１７）Ｏ−Ｆテスト：陰性 （１８）糖の利用：ビューライフノン培地を用いて糖の
利用を調べた。

下記いずれの糖からもガスの発生および酸の生成は認め
られない。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース
、麦芽糖、シヨ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−マンニト
ール、Ｄ−ソルビトール、イノシトール、グリセロール
、可溶性澱粉。

Ｄ その他の性質 （１）３−ケトラクトースの生成：陰性 上記の菌学的性質を「パージエイのマニュアル・オブ・
デイターミネイティブ・バクテリオロジー（第８版、１
９７４年）」を参照して検討すると３一ケトラクトース
を生成せず、アミノ酸、アンモニア態窒素を利用するの
でアグロバクテリウム属に属さない。

クエン酸を利用するのでリゾビウム属ではない。

更に本菌は好気的に生育し、嫌気的には生育せず、水溶
性および非水溶性の顕著な色素を生成しないので、フラ
ボバクテリウム、クロモバクテリウム属にも属さず、ア
ルカリゲネス属に属するものと判定される。

なお本菌は工業技術院微生物工業研究所に微工研菌寄４
１０５号として寄託されている。

アルカリゲネスＡＫ−２（微工研菌寄４１０５号）を用
いてＣＯを製造する方法について説明すると、本菌はコ
リンを含む栄養培地で液体培養することによりＣＯを菌
体内に蓄積するので、公知の方法で精製、乾燥すること
により、酵素粉末を得ることが出来る。

更に具体的に説明すると、本菌を適当な培地、例えば適
当な窒素源、無機塩類、有機促進物質と酵素生産を誘導
せしめるためにコリンを含む培地で培養し、ＣＯを蓄積
せしめるのであるが、ここで窒素源にはペプトン、酵母
エキス、肉エキス、コーンステイープリカーなどの有機
窒素源が有効である。

無機塩類としてはリン酸、カリウム、硫酸マグネシウム
などが用いられる。

コリンとしては工業的に製造されているいずれの塩でも
使用できる。

有機促進物質としては、酵母エキスやペプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカーなどがよい。

培地のｐＨは中性付近とし、通気攪拌などの好気的培養
を２５〜３５℃で１〜２日間行ないＣＯを菌体内に生産
蓄積せしめる。

ＣＯの菌体がらの抽出には、菌体磨砕、超音波処理、自
己消化などの公知の方法によって無細胞酵素液としたの
ち、硫酸アンモニウム塩析、あるいはアセトン、アルコ
ール等を用いる溶媒沈澱などの公知の方法で酵素標品を
得る。

更に高度に精製された酵素標品を得るには、イオン交換
を応用したクロマトグラフイーおよび分子篩を用いれば
よい。

本発明で得られる酵素の性質は次のとおりである。

Ａ 酵素化学的性質 （１）至適ｐＨ ｐＨ８．０〜８．５（第１図参照
）（２）ｐＨ安定性 ｐＨ７．０〜９．０（第２図参照
）（３）至適温度 ４０℃ （第３図参照）（
４）熱安定性 ３５℃付近まで安定であるがそれ以上
になると急激に失活 する。

（第４図参照）Ｂ 作用 コリンが基質の場合には２分子の分子状酸素が消費され
、２分子の過酸化水素が生成する。

ベタインアルデヒドが基質の場合には、１分子の分子状
酸素の消費で１分子の過酸化水素が生成される。

Ｃ 基質特異性 コリン類似物質に対する作用を比較したところ表１に示
す如くコリンに対して特異性が高いことがわかる。

Ｄ 酵素活性測定法 コリン酸化酵素をコリンに作用せしめ、生じた過酸化水
素を測定することにより酵素活性が測定できる。

即ち生成する過酸化水素を０−アミンフェノールの存在
でベルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で分解し、同時にＯ−ア
ミンフェノールを定量的に酸化せしめ、生成する色素量
を４ ８ ０ ｎｍで比色定量することによりＣＯの酵
素力価を求める。

酵素反応液の組成および反応条件は以下のとおりである
。

（１） 反応液の組成 ０．２Ｍ塩化コリン水溶液 １．０ｍｌ０．２
Ｍリン酸緩衝液（ ｐＨ ７．５ ） １．Ｏ
ｍｌＰＯＤ水溶液（１５プルプロガリン単 １．０ｍ
ｌ位／ｍｌ） ０．００１Ｍ．Ｏ −アミンフェノール塩 １．０ｍ
ｌ酸塩水溶液 酵素液（０．００４ 〜０．０１５単位／ｍｌ） ０
． ５ ｍｌ（２）反応条件 ３７℃１５分間反応する。

反応停止は１Ｎ塩酸０． ５ｍｌ添加で行ない、生成し
た色素を４ ８ ０ ｎｍで比色定量する。

（３）酵素力価 酵素力価の表示は、１分間に１μモルのコリリンを分解
する酵素量を１単位とする。

Ｅ 酸素消費量および過酸化水素生成量の定量コリンお
よびベタインアルデヒドを本酵素で分解する際に消費さ
れる酸素の定量はワルブルグ検圧計を用いて通常の方法
により行ない生成する過酸化水素の定量は公知フェノー
ル−４−アミノアンチピリン発色系で行なった。

本発明の実施例を次に示す。

実施例 １ 塩化コリン２％、ペプトン０．４％、酵母エキス０．２
％、硫酸マグネシウム（７水塩）０．２％、Ｋ２ＨＰＯ
４０．２％、ｐＨ７．２なる培地１４ｌを含む３０ｌ容
ジャーファーメンター（６００ｒ．ｐ．ｍ）にアルカリ
ゲネスＡＫ−２微工研菌寄４１０５号を植菌し、３０℃
、２２時間、通気攪拌培養を行なった。

培養後、連続遠心分離で菌体を分別し、湿菌体として３
００ｇを得た。

これを１．５ｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ ｐＨ ７
．５ ）に懸濁後、超音波処理にてＣＯを抽出し、遠心
分離によって不溶物の除去を行ない、得られた上澄液に
まず２５％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、
生じる沈澱物を遠心分離で除去したのち、その上澄液に
更に硫酸アンモニウムを終濃度５５％飽和になる様に加
え、ＣＯを沈澱せしめた。

塩析物をＰ別後、１５０ｍｌの０．０２Ｍリン酸緩衝液
（ ｐＨ ７．５ ）に溶解し、０．０２Ｍリン酸緩衝
液（ ｐＨ ７．５ ）で緩衝化したセファデツクスＧ
−２５を充填したカラム（径４．５、長さ６０ｃｍ）に
通じ、脱塩を行ない、活性区分を集めた。

得られた脱塩酵素液を凍結乾燥した結果、１４０単位／
ｇのＣＯの粉末７グを得た。

実施例 ２ 実施例１と同様の操作で得られた脱塩酵素液を次いで予
め０．０２Ｍリン酸緩衝液（ ｐＨ ７．５ ）で平衡
化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（径４ｃｍ、長さ４
０ｃｍ）に通して、ＣＯを吸着させ、同緩衝液で洗浄し
た後、同緩衝液と０．５Ｍの食塩を溶解した同緩衝液と
で濃度勾配を作り、除々に食塩濃度を上げなからＣＯを
溶出させた。

溶出されたＣＯ活性区分（食塩濃度０．３〜０．４Ｍの
範囲で溶出される）を集め、５０％飽和硫酸アンモニウ
ムによる塩折濃縮後、０．０２Ｍリン酸緩衝液で緩衝化
したセファデツクスＧ−１００、Ｇ−２００の順に通し
て分子篩を行ない、最終的に得られるセファデツクスＧ
−２００分子篩液は次いで凍結乾燥してＣＯ標品２００
ｍｇを得た。

このものの比活性は２１４単位／ｍｇであり、また培養
液からの収率は３０％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素のｐＨ活性曲線を示す。 第２図は本発明酵素のｐＨ安定曲線を示す。 第３図は本発明酵素の温度活性曲線を示す。 第４図は本発明酵素の温度安定曲線を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルカリゲネス属に属し、コリン酸化酵素生産能を
   有する微生物を培養し、培養物よりコリン酸化酵素を採
   取することを特徴とするコリン酸化酵素の製造法。