JPH0364105B2 - - Google Patents
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- JPH0364105B2 JPH0364105B2 JP56116288A JP11628881A JPH0364105B2 JP H0364105 B2 JPH0364105 B2 JP H0364105B2 JP 56116288 A JP56116288 A JP 56116288A JP 11628881 A JP11628881 A JP 11628881A JP H0364105 B2 JPH0364105 B2 JP H0364105B2
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アクロモバクター属の微生物を培養
することにより酵素コレステラーゼ（E.C.3，１，
１，13）（COMPREHENSIVE−BIO−
CHEMISTRY，Vol、13、“ENZYME
NOMENCLATURE”、P194−195（1973）にお
いて３，１，１，13の番号の下コレステロールエ
ステラーゼと命名されている酵素）を製造する方
法およびその酵素自身を用いて脂肪酸のコレステ
ロールエステルを加水分解することに関する。人
体の必須成分であるコレステロールは、あらゆる
組成の細胞膜の構成および多数のホルモンの形成
における基本化合物である。良く知られているよ
うに、血液中に存在する全コレステロールの測定
は臨床診断で非常に重要であり、それは血清中に
主として脂肪酸でエステル化された形で存在する
ので、それを遊離させて測定するために酵素コレ
ステラーゼが必要である。フーザリウム（アマ立
枯病菌）、ノカルジア、プソイドモナス、酵母菌
およびストレプトミセス属からの酵素を用いてコ
レステロールエステルを加水分解する酵素法を記
載している文献はほんの二三しかない。何となれ
ば、その酵素は動物組織から得られるからであ
る。
することにより酵素コレステラーゼ（E.C.3，１，
１，13）（COMPREHENSIVE−BIO−
CHEMISTRY，Vol、13、“ENZYME
NOMENCLATURE”、P194−195（1973）にお
いて３，１，１，13の番号の下コレステロールエ
ステラーゼと命名されている酵素）を製造する方
法およびその酵素自身を用いて脂肪酸のコレステ
ロールエステルを加水分解することに関する。人
体の必須成分であるコレステロールは、あらゆる
組成の細胞膜の構成および多数のホルモンの形成
における基本化合物である。良く知られているよ
うに、血液中に存在する全コレステロールの測定
は臨床診断で非常に重要であり、それは血清中に
主として脂肪酸でエステル化された形で存在する
ので、それを遊離させて測定するために酵素コレ
ステラーゼが必要である。フーザリウム（アマ立
枯病菌）、ノカルジア、プソイドモナス、酵母菌
およびストレプトミセス属からの酵素を用いてコ
レステロールエステルを加水分解する酵素法を記
載している文献はほんの二三しかない。何となれ
ば、その酵素は動物組織から得られるからであ
る。
本発明者らにより選択されたアクロモバクター
属に関する新しい微生物から酵素コレステラーゼ
を製造する方法が見い出されたが、この方法が本
発明の要旨をなす。
属に関する新しい微生物から酵素コレステラーゼ
を製造する方法が見い出されたが、この方法が本
発明の要旨をなす。
本発明による方法の重要な利点は、以下に述べ
る培養条件下で上記の微生物により製造される酵
素は細胞外であり、したがつてそれを抽出する必
要がなく、濃縮するだけでよいという事である。
さらに、前記微生物はバクテリアとしてかびおよ
び放線菌より短い複製時間を有し、これは重要な
作業上の利点をなす。
る培養条件下で上記の微生物により製造される酵
素は細胞外であり、したがつてそれを抽出する必
要がなく、濃縮するだけでよいという事である。
さらに、前記微生物はバクテリアとしてかびおよ
び放線菌より短い複製時間を有し、これは重要な
作業上の利点をなす。
タイバ川の土手の植物性崩壊物から単離された
この微生物は、アクロモバクターデリカチユラス
（Achrombacter delicatulus）SM−1307として
分類され、ペオリア（J11）、アメリカ合衆国農務
省、北部地方センター（Northern Regional
Research Center）にNRRL.B.−12115として寄
託されている。尚、上記寄託機関は1981年１月31
日にブダペスト条約に基づく国際寄託機関として
の地位を取得し、その際上記の微生物は上記の受
託番号を該寄託機関によつて付与された。
この微生物は、アクロモバクターデリカチユラス
（Achrombacter delicatulus）SM−1307として
分類され、ペオリア（J11）、アメリカ合衆国農務
省、北部地方センター（Northern Regional
Research Center）にNRRL.B.−12115として寄
託されている。尚、上記寄託機関は1981年１月31
日にブダペスト条約に基づく国際寄託機関として
の地位を取得し、その際上記の微生物は上記の受
託番号を該寄託機関によつて付与された。
その培養、形態学および生理学的特徴は次よう
である。
である。
Ａ 培養特徴
(1) 固体培養基
(a) 栄養寒天培地上：30℃で24時間培養後、
直径２mmのコロニーで、７日間の熟成後起
伏傾向の全縁を有するコロニーである。湿
つたクリーム状の堅さを有しおよびわずか
に透明な凸状の灰色がかつたコロニー。寒
天培地上で群をなさない。
直径２mmのコロニーで、７日間の熟成後起
伏傾向の全縁を有するコロニーである。湿
つたクリーム状の堅さを有しおよびわずか
に透明な凸状の灰色がかつたコロニー。寒
天培地上で群をなさない。
(b) 寒天−ゼラチン上：明るく、軟らかなゼ
ラチン状コロニー。
ラチン状コロニー。
(2) 液体培養基：
(a) 塩液＋酵母エキス：クリーム状濁り、沈
殿物がほとんどない。
殿物がほとんどない。
(b) ペツトン含有水：30℃で24時間後に良好
な濁り。沈殿および表面皮膜は見られな
い。
な濁り。沈殿および表面皮膜は見られな
い。
Ｂ 形態学的特徴
(1) 平均長さ2μｍのグラム陰性杆菌。
(2) 運動性は陽性（懸滴観察）。
(3) 鞭毛状繊毛。極における緻密化は観察され
ない。
ない。
Ｃ 生理学的特徴
(1) 最適成長温度25〜30℃。20℃で良く成長す
る。42℃で成長しない。
る。42℃で成長しない。
(2) 寒天を攻撃しない。
(3) グルコースから酸または気体を生じない。
(4) 尿素を利用しない。
(5) チトクロームＣオキシダーゼを有しない。
(6) 硝酸塩を亜硫酸塩に還元する。
(7) OX／Ｆテストで不活性である。
(8) トリプトフアンからインドールを生じな
い。
い。
(9) メチルレツドに対して、陰性。
(10) 触媒作用が陽性。
(11) ラクトースから酸または気体を生じな
い。
い。
(12) ゼラチンを液化する。
(13) トリマスミルク：７日後わずかに酸性
化。
化。
識別目的のために用いた方法は、B.M.
MITRUKAおよびM.J.BONNERらの
「Methods of detection and identification of
bacteria」（CRC PRESS INC.（1976））および
「Bergey Manual of Determinative
Bacteriology」（第７版）に記載されている方法
であつた。
MITRUKAおよびM.J.BONNERらの
「Methods of detection and identification of
bacteria」（CRC PRESS INC.（1976））および
「Bergey Manual of Determinative
Bacteriology」（第７版）に記載されている方法
であつた。
本発明による菌株は、撹拌された発酵器を用い
る深部培養により好気性条件下で培養することが
出来る。
る深部培養により好気性条件下で培養することが
出来る。
液体培地は、同化性炭素源、窒素源およびミネ
ラル塩を含有する。使用出来る炭素源として、ア
ミノ酸、グルコース、オレイン酸、リノール酸、
コレステロールエステルおよび酢酸ナトリウムが
挙げられる。使用出来る窒素源として、有機およ
び無機窒素化合物たとえば肉エキス、酵母エキ
ス、ペプトン、トリプタン、アミノ酸、加水分解
カゼイン、大豆粉、硝酸塩およびNH4 +の塩を挙
げることが出来る。
ラル塩を含有する。使用出来る炭素源として、ア
ミノ酸、グルコース、オレイン酸、リノール酸、
コレステロールエステルおよび酢酸ナトリウムが
挙げられる。使用出来る窒素源として、有機およ
び無機窒素化合物たとえば肉エキス、酵母エキ
ス、ペプトン、トリプタン、アミノ酸、加水分解
カゼイン、大豆粉、硝酸塩およびNH4 +の塩を挙
げることが出来る。
適当な培地はたとえば下記組成を有する。
酵母エキス １−５ｇ／
大豆粉 １−５ｇ／
K2HPO4
NaNO3、MgSO4１ｇまでの微量
培地のPH範囲は６〜８、好ましくは6.8〜7.2で
ある。温度範囲は、20〜37℃、好ましくは28〜32
℃である。
ある。温度範囲は、20〜37℃、好ましくは28〜32
℃である。
接種前に、コレステリルオレエートおよび天然
植物油を培地に添加して酵素を製造する。アクロ
モバクターデリカチユラスSM1307菌株から産生
されるコレステラーゼによる培養基中の前記エス
テルの加水分解は、本発明のもう一つの要旨をな
す。
植物油を培地に添加して酵素を製造する。アクロ
モバクターデリカチユラスSM1307菌株から産生
されるコレステラーゼによる培養基中の前記エス
テルの加水分解は、本発明のもう一つの要旨をな
す。
誘導時間は24〜72時間、好ましくは40〜48時間
である。
である。
発酵中または発酵が終つた後集められた培地肉
汁はそのまゝ使用することが出来る。
汁はそのまゝ使用することが出来る。
別法として、過したまたは遠心分離した培地
肉汁の上澄み液を使用することが出来る。
肉汁の上澄み液を使用することが出来る。
最後に、高分子化合物と組合せてマトリツクス
と化学結合またはイオン結合を形成して酵素を固
定化して技術的および経済的改良をさらに加える
ことが出来る。
と化学結合またはイオン結合を形成して酵素を固
定化して技術的および経済的改良をさらに加える
ことが出来る。
下記の例により、本発明に関する操作方法をさ
らに説明するが、それらの例は限定的なものでな
い。
らに説明するが、それらの例は限定的なものでな
い。
例 １
下記化合物を脱イオン水に添加して培地肉汁を
調製した： NaNO3 ２ｇ／ K2HPO4 ２ｇ／ KCl 0.5ｇ／ MgSO4・7H2O 0.5ｇ／ 酵母エキス 10ｇ／ コレステリルオレエート ５ｇ／ 前記肉汁のPHを希HClで7.0に調節した。この
培地を250mlのフラスコに、各フラスコに50mlの
肉汁を添加して分配した。フラスコは116℃で30
分滅菌した。
調製した： NaNO3 ２ｇ／ K2HPO4 ２ｇ／ KCl 0.5ｇ／ MgSO4・7H2O 0.5ｇ／ 酵母エキス 10ｇ／ コレステリルオレエート ５ｇ／ 前記肉汁のPHを希HClで7.0に調節した。この
培地を250mlのフラスコに、各フラスコに50mlの
肉汁を添加して分配した。フラスコは116℃で30
分滅菌した。
30℃で48時間成長させてあつた200×20mm管中
の栄養寒天培地20mlのパテイナ（patina）を10ml
の生理溶液で洗浄して得たアクロモバクターデリ
カチユラスSM−1307菌株の懸濁液１mlを上記フ
ラスコに接種した。
の栄養寒天培地20mlのパテイナ（patina）を10ml
の生理溶液で洗浄して得たアクロモバクターデリ
カチユラスSM−1307菌株の懸濁液１mlを上記フ
ラスコに接種した。
発酵フラスコを、軌道撹拌（180−200r.p.m）
下で30℃で培養した。
下で30℃で培養した。
培養して48時間後培地肉汁を集め、そのまゝ酵
素活性についてテストした。１mlの培地肉汁は
0.2酵素単位を有した。
素活性についてテストした。１mlの培地肉汁は
0.2酵素単位を有した。
酵素活性は次の方法で測定した。
PH6.7の0.1M燐酸塩緩衝液で適宜希釈した培地
肉汁１mlを、0.5％のトライトンＸ−100を含有す
るPH6.7の0.1M燐酸塩緩衝液に0.3マイクロモル／
mlのコレステリルオレエートを溶解した溶液５ml
に添加した。反応は撹拌された水浴中で37℃で10
分間行い、反応混合物から取り出したサンプルを
３分間沸騰させて停止させた。コレステリルオレ
エートを加水分解することにより生成したコレス
テロールの濃度を、比色法により測定した。この
方法では、遊離コレステロールを、コレステロー
ルオキシダーゼで酸化してコレスト−４−エン−
３−オンとする。同時に過酸化水素が生成し、こ
のものは４−アミノアンチピリンおよびフエノー
ルとペルオキシダーゼの存在下で酸化的に反応し
て500ｍμで最大吸収を有する色原体を生じる。
肉汁１mlを、0.5％のトライトンＸ−100を含有す
るPH6.7の0.1M燐酸塩緩衝液に0.3マイクロモル／
mlのコレステリルオレエートを溶解した溶液５ml
に添加した。反応は撹拌された水浴中で37℃で10
分間行い、反応混合物から取り出したサンプルを
３分間沸騰させて停止させた。コレステリルオレ
エートを加水分解することにより生成したコレス
テロールの濃度を、比色法により測定した。この
方法では、遊離コレステロールを、コレステロー
ルオキシダーゼで酸化してコレスト−４−エン−
３−オンとする。同時に過酸化水素が生成し、こ
のものは４−アミノアンチピリンおよびフエノー
ルとペルオキシダーゼの存在下で酸化的に反応し
て500ｍμで最大吸収を有する色原体を生じる。
着色サンプルの光学濃度は、DB−GTベツク
マングリツド分光光度計で測定した。この場合、
キユベツトは500ｍμの波長で0.1dｍの光学通路
を有した。
マングリツド分光光度計で測定した。この場合、
キユベツトは500ｍμの波長で0.1dｍの光学通路
を有した。
１単位を、前述したテスト条件下で１分間当り
１マイクロモルのコレステロールを生成する酵素
として定義すると、培地肉汁１ml当りの酵素単位
数は、下式により計算される。
１マイクロモルのコレステロールを生成する酵素
として定義すると、培地肉汁１ml当りの酵素単位
数は、下式により計算される。
Ｕ／肉汁ml＝４×６×（E10−E0）／5.45×0.1
×Ｄ 〔式中、 E10＝10分後に取り出されたサンプルの光学濃
度 E0＝０分で取り出されたサンプルの光学濃度
5.45＝１マイクロモル／mlのコレステロール溶液
の光学濃度 Ｄ＝酵素希釈〕 例 ２ 下記化合物を脱イオン水に添加し、塩酸でPH
6.7に調節して培地肉汁を調製した： NaNO3 ２ｇ／ K2HPO3 ２ｇ／ KCl 0.5ｇ／ MgSO4・7H2O 0.5ｇ／ 酵母エキス 10ｇ／ オリーブ油 ５ｇ／ 例１と同様に調製した前記肉汁中のアクロモバ
クターデリカチユラスSM−1307菌株の培地を、
30℃で軌道撹拌下（180r.p.m）で培養した。培養
して72時間後培地肉汁を集め、そのまゝコレステ
ラーゼ活性をテストした。１mlの培地肉汁は0.4
酵素単位を有した。
×Ｄ 〔式中、 E10＝10分後に取り出されたサンプルの光学濃
度 E0＝０分で取り出されたサンプルの光学濃度
5.45＝１マイクロモル／mlのコレステロール溶液
の光学濃度 Ｄ＝酵素希釈〕 例 ２ 下記化合物を脱イオン水に添加し、塩酸でPH
6.7に調節して培地肉汁を調製した： NaNO3 ２ｇ／ K2HPO3 ２ｇ／ KCl 0.5ｇ／ MgSO4・7H2O 0.5ｇ／ 酵母エキス 10ｇ／ オリーブ油 ５ｇ／ 例１と同様に調製した前記肉汁中のアクロモバ
クターデリカチユラスSM−1307菌株の培地を、
30℃で軌道撹拌下（180r.p.m）で培養した。培養
して72時間後培地肉汁を集め、そのまゝコレステ
ラーゼ活性をテストした。１mlの培地肉汁は0.4
酵素単位を有した。
例 ３
例２の組成を有する培地肉汁を調製した。例１
と同様に調製した前記肉汁中のアクロモバクター
デリカチユラスSM−1307菌株の培地を、30℃で
軌道撹拌（180r.p.m.）下で培養した。培養して
72時間後培地肉汁を集め、遠心分離にかけ、上澄
み液のコレステラーゼを用いて、人間の血清サン
プル中に存在する全コレステロールを測定した。
この目的にたいして、下記試薬を調製した： コール酸ナトリウム ６ｍＭ トライトンＸ−100 15ｇ フエノール 7.5ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.5ｍＭ ペルオキシダーゼ 16400U〔カタログ中のボーエ
リンガー（Boehringer）
No.127361〕 0.1M燐酸ナトリウム緩衝液、PH7.0 1000ml コレステロールは次の方式で測定した： 50μの人間の血清および0.25mlの培地肉汁を
2.5mlの試薬に添加した。反応は、１cmの光学通
路を有するガラスキユベツトで直接行われ、DB
−GTベツクマングリツド分光光度計で波長500
ｍμで直接色原体を発生させ、これは血清中に存
在するコレステロールの完全変換まで行つた。こ
れらの条件下で、0.500の最終光学濃度が得られ、
これは、テストした人間血清サンプル100ml当り
全コレステロール164mgに相当した。
と同様に調製した前記肉汁中のアクロモバクター
デリカチユラスSM−1307菌株の培地を、30℃で
軌道撹拌（180r.p.m.）下で培養した。培養して
72時間後培地肉汁を集め、遠心分離にかけ、上澄
み液のコレステラーゼを用いて、人間の血清サン
プル中に存在する全コレステロールを測定した。
この目的にたいして、下記試薬を調製した： コール酸ナトリウム ６ｍＭ トライトンＸ−100 15ｇ フエノール 7.5ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.5ｍＭ ペルオキシダーゼ 16400U〔カタログ中のボーエ
リンガー（Boehringer）
No.127361〕 0.1M燐酸ナトリウム緩衝液、PH7.0 1000ml コレステロールは次の方式で測定した： 50μの人間の血清および0.25mlの培地肉汁を
2.5mlの試薬に添加した。反応は、１cmの光学通
路を有するガラスキユベツトで直接行われ、DB
−GTベツクマングリツド分光光度計で波長500
ｍμで直接色原体を発生させ、これは血清中に存
在するコレステロールの完全変換まで行つた。こ
れらの条件下で、0.500の最終光学濃度が得られ、
これは、テストした人間血清サンプル100ml当り
全コレステロール164mgに相当した。
以下、本発明の方法で製造される酵素コレステ
ラーゼ（コレステロールエステラーゼ）がどのよ
うなものか説明する。
ラーゼ（コレステロールエステラーゼ）がどのよ
うなものか説明する。
(イ) 作用及び基質特異性
(1) コレステロールエステルの加水分解コレス
テロールエステル＋H2O→コレステロール
＋脂肪酸 (2) 脂肪酸とコレステロールとのエステル結合
コレステロール＋脂肪酸→コレステロールエ
ステル (ロ) 至適PH 加水分解における至摘PHは6.6〜6.7エステル
化における至適PHは6.2 (ハ) 力価の測定法 上記例１および３において説明した方法に準
ずる。
テロールエステル＋H2O→コレステロール
＋脂肪酸 (2) 脂肪酸とコレステロールとのエステル結合
コレステロール＋脂肪酸→コレステロールエ
ステル (ロ) 至適PH 加水分解における至摘PHは6.6〜6.7エステル
化における至適PHは6.2 (ハ) 力価の測定法 上記例１および３において説明した方法に準
ずる。
(ニ) 精製方法
標準クロマトグラフイー法或いはアフイニテ
イークロマトグラフイー法を適宜使用しうる。
イークロマトグラフイー法を適宜使用しうる。
(ホ) 阻害
フエニルメチルスルホニル・フルオリド及び
ｐ−クロロメルクリベンゾエートにより阻害さ
れる。
ｐ−クロロメルクリベンゾエートにより阻害さ
れる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ NRRL.B.−12115で確認されるアクロモバク
ターデリカチユラス属の微生物を培養し、酵素コ
レステラーゼを生成させ、これを採取することを
特徴とする、酵素コレステラーゼの製造方法。 ２ 微生物が、６〜８、好ましくは6.8〜7.2のPH
で培養される、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 ３ 微生物が20〜37℃、好ましくは28〜32℃で培
養される、特許請求の範囲第１項または第２項に
記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT23656/80A IT1132230B (it) | 1980-07-24 | 1980-07-24 | Procedimento per la produzione dell'enzima colesterolo-esterasi e per idrolisi degli esteri con acidi grassi del colesterolo mediante l'impiego dell'enzima stesso |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5754587A JPS5754587A (en) | 1982-04-01 |
| JPH0364105B2 true JPH0364105B2 (ja) | 1991-10-03 |
Family
ID=11208924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56116288A Granted JPS5754587A (en) | 1980-07-24 | 1981-07-24 | Production of enzyme cholesterase and hydrolysis of cholesteral ester of fatty acid by said enzyme |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4387163A (ja) |
| JP (1) | JPS5754587A (ja) |
| AR (1) | AR227056A1 (ja) |
| AT (1) | AT374827B (ja) |
| BE (1) | BE889728A (ja) |
| CA (1) | CA1166986A (ja) |
| CH (1) | CH654025A5 (ja) |
| DE (1) | DE3127979C2 (ja) |
| DK (1) | DK148827C (ja) |
| ES (2) | ES8301501A1 (ja) |
| FI (1) | FI70924C (ja) |
| FR (1) | FR2487375A1 (ja) |
| GB (1) | GB2080311B (ja) |
| IE (1) | IE51745B1 (ja) |
| IT (1) | IT1132230B (ja) |
| NL (1) | NL8103522A (ja) |
| NO (1) | NO158948C (ja) |
| PT (1) | PT73420B (ja) |
| SE (1) | SE446405B (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4767735A (en) * | 1987-02-02 | 1988-08-30 | Cosden Technology, Inc. | Catalyst pretreatment process |
| US5098969A (en) * | 1987-09-21 | 1992-03-24 | Quantum Chemical Corporation | Propylene polymerization using modified silica based catalyst |
| US5143883A (en) * | 1987-09-21 | 1992-09-01 | Quantum Chemical Corporation | Modified silica based catalyst |
| US5034365A (en) * | 1990-05-09 | 1991-07-23 | Quantum Chemical Corporation | Silica supported polymerization catalyst |
| US5145821A (en) * | 1990-05-09 | 1992-09-08 | Quantum Chemical Corporation | Silica supported polymerization catalyst system |
| US5238891A (en) * | 1989-06-15 | 1993-08-24 | Phillips Petroleum Company | Olefin polymerization catalyst and process |
| US5037789A (en) * | 1990-03-23 | 1991-08-06 | Quantum Chemical Corporation | Non-supported catalyst |
| US5232998A (en) * | 1990-05-09 | 1993-08-03 | Quantum Chemical Corporation | Olefin polymerization using silica supported catalyst |
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