NL8103522A

NL8103522A - Werkwijze voor de vorming van het enzym cholesterase en voor het hydrolyseren van cholesterol-esters van vetzuren met behulp van dit enzym.

Info

Publication number: NL8103522A
Application number: NL8103522A
Authority: NL
Original assignee: Eni Ente Naz Idrocarb
Priority date: 1980-07-24
Filing date: 1981-07-24
Publication date: 1982-02-16
Also published as: CA1166986A; DE3127979A1; FR2487375B1; FR2487375A1; FI70924B; JPH0364105B2; PT73420B; DK326681A; ES8301501A1; SE446405B; ES8306504A1; GB2080311A; IT8023656A0; AT374827B; DK148827B; NO812519L; US4390454A; JPS5754587A; US4387163A; PT73420A

Description

813176/vdv/fflk

Korte aanduiding: Werkwijze voor de vorming van het enzym cholesterase en voor het hydrolyseren van cholesterol-esters van vetzuren met behulp van dit enzym· 5 De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de vorming van het enzym cholesterase (E.C.3.1*1.13) door kweken van een micro-organisme van het geslacht Achromobacter, alsmede op een werkwijze voor de hydrolyse van cholesterolesters van vetzuren met behulp van dit enzym. Cholesterol, een wezenlijk bestanddeel van het menselijk organis-10 me, is een basisverbinding in de samenstelling van celmembranen van alle weefsels en bij de vorming van talrijke hormonen. Zoals bekend is de bepaling van de totale hoeveelheid cholesterol in het bloed zeer belangrijk bij klinische diagnose en omdat cholesterol in het serum in hoofdzaak in de vorm van zijn vetzuuresters aanwezig is, is voor het vrijmaken 15 en de daaropvolgende analyse het enzym cholesterase noodzakelijk. Werkwijzen voor de hydrolyse van cholesterolesters met enzymen van micro-organismen van de geslachten Fusarium, Nocardia, Pseudomonas, Saccharo-myces en Streptomyces zijn in slechts enkele publikaties beschreven, omdat het enzym uit dierlijke weefsels wordt gewonnen.

20 Men heeft nu een werkwijze gevonden voor de bereiding van het enzym cholesterase uit een nieuw micro-organisme behorende tot het geslacht Achromobacter.

Een belangrijk voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is dat het door dit micro-organisme onder de hierna aangegeven 25 kweekomstandigheden gevormde enzym exocullulair is, zodat het niet geëxtraheerd maar alleen geconcentreerd behoeft te worden.

Bovendien bezit dit micro-organisme als bacterie een kortere vermenigvuldigingstijd dan schimmels en Actinomycetes, wat een aanzienlijk voordeel betekent.

30 Dit micro-organisme is geïsoleerd uit groenteresten aan de oever van de Tiber en is ingedeeld als Achromobacter delicatulus SM-1307 en ingeschreven bij het Northern Regional Center, ÏÏ.S. Department of Agriculture, Peoria (J 11) onder het nummer NRRL. B.-12115· De morfologische, fysiologische en kweekeigenschappen zijn als volgt.

35 A - KWEEKEIGENSCHAPPEN.

1) Vast medium: a) op agarvoedingsbodem: kolonies met een diameter van 2 mm na 2k uren broeden bij 30°C, met gave randen die na 7 dagen neigen tot krullen. Convexe enigszins heldere, niet geheel witte kolonies met een voch-*K) tige, roomachtige consistentie, Op een agar-medium geen uitzwerming.

8103522

I»--. W

-2- b) op agar-gelatine: heldere, zachte gelatine-achtige kolonies.

2) Vloeibaar medium: a) Op een zouthoudende bouillon en gistextract: crème-achtige troebelheid met weinig sedi^ment.

5 b) Op pepton-houdend water: goede troebelheid na 2k uren bij 30°C.

Geen zichtbaar sediment en oppervlaktevlies.

B- MORFOLOGISCHE EIGENSCHAPPEN

1) Gram-negatief staafje met een gemiddelde lengte van 2^tm.

2) Positieve mobiliteit (waarneming in een hangende druppel).

10 3) Peritriche trilharen. Geen verdichting aan de polen.

C - FYSIOLOGISCHE EIGENSCHAPPEN

1) Optimale groeitemperatuur tussen 25° en 30°C. Voldoende groei bij 20°C. Geen groei bij k2°C.

2) Agar wordt niet ontleed.

15 3) Geen omzetting van glucose in zuur of gas.

k) Geen gebruik van ureum.

5) Bevat geen cytochrome-C oxidase.

6) Reduceert nitraten tot nitrieten.

7) Is inert bij de OX/F-test.

20 8) Vormt geen indool uit tryptofan.

9) Negatieve methylroodreactie.

10) Positieve katalyse.

11) Vormt geen zuur of gas uit lactose.

12) Maakt gelatine vloeibaar.

25 13) lakmoesmelk: geringe verzuring na 7 dagen.

Voor de identificatie werden de methoden toegepast beschreven in "Methods of detection and identification of bacteria" door B.M. Mitruka en M.J. Bonner, CRC Press Ine* 1976, en in "Bergey Manual of Determinative Bacteriology" 7de uitgave.

3) Men kan de stam volgens de uitvinding onder aerobe om standigheden bij ondergedompelde cultuur met geroerde fermentatievaten kweken.

Een vloeibaar kweekmedium bevat een bron van assimileerbare koolstof, een stikstofbron en minerale zouten. Voorbeelden van bruik-35 bare koolstofleveranciers zijn aminozuren, glucose, oliezuur, linolzuur, cholesterolesters en natriumacetaat. Stikstofbronnen zijn onder andere organische en anorganische stikstofverbindingen bijvoorbeeld vleesextract, gistextract, pepton, triptan, aminozuren, gehydrolyseerde caseine, soja-bonenmeel, nitraten en NH^-zouten.

kO Een geschikt kweekmedium bezit bijvoorbeeld de volgende 8103522 -> samenstelling:

Gistextract 1-5 g/l

Sojabonenmeel 1-5 g/l K^HPO^ i \ sporen 5 NaNO^, MgSoJ tot 1 g/l

De pH-waarde van het kweekmedium ligt tussen 6 en 8, bij voorkeur tussen 6,8 en 7*2. Het temperatuurbereik is 20°C tot 37°C, bij voorkeur 28°C tot 32°C*

Men bereidt het enzym door vóór de enting, cholesteryl-10 oleaat of natuurlijke plantaardige oliën aan het kweekmedium toe te voegen. De hydrolyse van de genoemde esters in het kweekmedium door de choleste-rase die door de Achromobacter delitftulus SM-1307 stam is gevormd vormt één van de onderwerpen deyknderhavige uitvinding.

De inductietijd kan variëren van Zk tot 72 uren, bij 15 voorkeur ko tot k8 uren.

Men kan het tijdens of aan het einde van de fermentatie verzamelde kweekextract als zodanig gebruiken.

Men kan ook de bovendrijvende vloeistof van het gefiltreerde of gecentrifugeerde kweekextract gebruiken.

20 Tenslotte kan nog een technische en economische verbe tering bereikt worden door het enzym te immobiliseren door vermenging met een macromoleculaire verbinding onder vorming van chemische bindingen met de matrix, of ionogene bindingen.

De uitvinding wordt nu aan de hand van de volgende voor-25 beelden nader toegelicht.

VOORBEELD I

Men bereidt een kweekmedium met de volgende samenstelling. NaNO^ 2 g/l K2HP04 2 g/l 30 KC1 0,5 g/l

MgSO^.THgO 0,5 g/l

Gistextract 10 g/l

Cholesteryloleaat 5 g/l door bovengenoemde verbindingen aan gedeioniseerd water toe te voegen, de 35 pH van het medium met verdunde HC1 op 7 in te stellen en het aldus bereide medium in hoeveelheden van 50 ml aan kolven met een inhoud van 250 ml, die 30 minuten bij 116°C zijn gesteriliseerd, toe te voegen.

Men ent met 1 ml van een suspensie van Achromobacter delicatulus SM-1307 die men bereidt door het patina van een kweek van 20 *f0 ml voedingsagar in 200x20 mm buisjes, die *f8 uren bij 30°C gegroeid zijn, 8103522 mf 5 s -Λ- met 10 ml fysiologische oplossing te wassen.

Men incubeert de fermentatiekolven onder rondschudden (180-200 r.p.m.) bij 30°C.

Men verzamelt de kweekmengsels k8 uren na de enting en 5 onderzoekt de enzymatische werkzaamheid. 1 ml van het cultuurmedium bevat 0,2 enzymeenheden.

Men bepaalt de enzymatische werkzaamheid op de volgende wijze.

- Men voegt 1 ml van een met een 0,1 M fosfaatbuffer met een pH van 6,7 10 verdund kweekmedium toe aan 5 ml van een oplossing, die 0,3 yamol choles-teryloleaat per ml van een 0,1 M fosfaatbuffer met pH 6,7 met 0,5$ triton X-100 bevat. Men laat 10 minuten bij 37°C in een geroerd waterbad reageren en onderbreekt de reactie door monsters uit het reactiemengsel 3 minuten te koken. Men bepaalt de concentratie van de door hydrolyseren van choles-15 teryloleaat bereide cholesterol colorimetrisch, waarbij de vrije cholesterol door cholesteroloxidase tot cholest-^-een-3-on geoxydeerd wordt onder gelijktijdige vorming van waterstofperoxyde, dat ^-aminoantipyrine en fenol in aanwezigheid van peroxidase oxydeert onder vorming van een chrorao-geen met een maximale absorptie bij 500 mp.

20 De optische dichtheid van de gekleurde monsters meet men in een DBrGT Bëckmann-grid-spectrofotometer, waarin het cuvet een optische weg van 0,1 dm, bij een golflengte van 500 mp bezit.

Als men aanneemt dat een eenheid de hoeveelheid enzym is die onder de bovengenoemde proef omstandigheden per minuut 1 ^tmol 25 cholesterol levert, kan men het aantal enzymeenheden per ml kweekmedium met de volgende formule berekenen.

U _ k x 6 x (e10-e0)

ml kweekmedium 5,^5 x 0,1 x D

waarin: 30 E^0 = de optische dichtheid van een na 10 minuten getrokken monster

Eq = de optische dichtheid van een na 0 minuten getrokken monster 5, lf5= de optische dichtheid van een cholesteroloplossing van 1 ^imol per ml D = enzymverdunning.

VOORBEELD II

35 Men bereidt een kweekmedium met de volgende samenstel ling:

NaNO- 2 g/1 3

KgHPO^ 2 g/1 KC1 0,5 g/1 4q MgSO^.TBgO 0,5 g/1 é 1 0 3 5 2 2 ψ -5-

Gistextract 10 g/1

Olijfolie 5 g/l door de bovengenoemde verbindingen aan gedeioniseerd water toe te voegen en de pH met zoutzuur op 6,7 in te stellen.

5 Men incubeert volgens Voorbeeld I bereide kweken van

Achromobacter delicatulus SM-1307 in. het medium onder rondschudden (180 r.p.m.) bij 30°C.

Men verzamelt 72 uren na de enting de kweekmedia en onderzoekt deze op cholesterasewerkzaamheid. 1 ral cultuurmedium bevat 10 0,4 enzym-eenheden*

VOORBEELD III

Mentereidt een kweekmedium met de samenstelling zoals aangegeven in Voorbeeld II.

Men incubeert volgens Voorbeeld X bereide kweken van 15 Achromobacter delicatulus SM-1307 in dit medium onder rondschudden (180 r.p.m.) bij 30°C.

Men verzamelt de kweekmedia 72 uren na het enten, centrifugeert en gebruikt de cholesterase van de bovendrijvende vloeistof voor het vaststellen van het totale cholesterolgehalte in een monster van 20 menselijk bloedserum.

Voor dit doel bereidt men de volgende reagens. Natriumcholaat 6 fflM

Triton X-100 15 g

Fenol 7>5 mM

25 4-Aminoantipyrine 0,5 mM

Peroxydase 16.400 U (Boehringer No.

127361 in de catalogus) 0,1 M natriumfosfaatbuffer pH 7,0 1000 ml

Men bepaalt het cholesterolgehalte als volgt.

50 Men voegt 50^il menselijk serum en 0,25 ml kweekmedium toe aan 2,5 ml reagens.

De reaktie vindt direkt in het glazen cuvet plaats, dat een optische weg van 1 cm bezit, waarbij men de vorming van het chromogeen direkt daarna in een DB-GT Beckmann-grid-spectrofotometer bij een golf-35 lengte van 500 ntμ volgt totdat alle cholesterol in het serum volledig is omgezet. Onder deze omstandigheden bedraagt de uiteindelijke optische dichtheid 0,500, overeenkomende met 164 mg totale hoeveelheid cholesterol per 100 ml van het onderzochte menselijke serum.

40 8103522

Claims

1, Werkwijze voor de vorming van het enzym cholesterase met het kenmerk, dat men het enzym vormt door kweken van een 5 micro-organisme van het geslacht Achromobacter delicatulus ingeschreven onder nummer NKRL B-12115·

2. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat men het micro-organisme kweekt bij een pH tussen 6 en 8, bij voorkeur tussen 6,8 en 7» 2. 10

3. Werkwijze volgens conclusie 1. of 2, met het kenmerk, dat men het micro-organisme kweekt bij een temperatuur tussen 20°C en 37°C, bij voorkeur tussen 28°C en 32°C, k. Werkwijze voor het hydrolyseren van cholesterolesters van vetzuren, met het kenmerk, dat men de esters in aanraking 15 brengt met een kweekmengsel van het geslacht Achromobacter delicatulus NRRL B-12115. 20 8103522