DE3127979C2 - Verwendung einer bestimmten Cholesterase zur Hydrolyse von Cholesterin-Fettsäure-Estern - Google Patents
Verwendung einer bestimmten Cholesterase zur Hydrolyse von Cholesterin-Fettsäure-EsternInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die im Patentanspruch angegebene Verwendung.
Cholesterin, ein wesentlicher Bestandteil des menschlichen Organismus, ist eine wichtige Verbindung für den
Aufbau von Zellmembranen in allen Geweben sowie zur Bildung von zahlreichen Hormonen. Es ist bekannt, daß
die Bestimmung des Gesamt-Cholesterins im Blut von großer Bedeutung für die klinische Diagnose ist und da
Cholesterin im Serum im wesentlichen in Form seiner Fettsäureester vorliegt, ist das Enzym Cholesterase
erforderlich, um Cholesterin aus den Estern freizusetzen, damit es anschließend bestimmt werden kann.
In einigen Veröffentlichungen sind Verfahren zur Hydrolyse von Cholesterinestern mit Hilfe von Enzymen
aus Mikroorganismen der Gattungen Fusarium, 3t)
Nocardia, Pseudomonas, Saccharomyces und Streptomyces
angegeben. Im allgemeinen wird das Enzym jedoch aus tierischen Geweben erhalten.
Es wurde nun gefunden, daß ein neuer Mikroorganismus, der zur Gattung Achromobacter gehört, Choleste- n
rase bildet, und daß das von diesem Mikroorganismus unter den unten angegebenen Kulturbedingungen
gebildete Enzym cxozellulär ist und es daher nicht erforderlich ist, es zu extrahieren, sondern daß es
lediglich konzentriert zu werden braucht. m
Außerdem besitzt dieser Mikroorganismus, da er ein Baklerium ist, eine Verdoppelungszeit, die geringer ist
als diejenige von Schimmelpilzen und Actinomycetcs, was ebenfalls einen erheblichen Vorteil bedeutet.
Dieser Mikroorganismus, der aus pflanzlichen Pro- <s
dukten (Zclltrümmern) vom Tiberufer isoliert worden ist, wurde als Achromobacter delicatulus SM-1307
identifiziert und beim Northern Regional Center, U.S. Department of Agriculture, Pcoria (JII) unter der
Nummer NRRL, B.-I2115 hinterlegt. v>
Im folgenden sind die Charakteristika seiner Kultur,
Morphologie und Physiologie angegeben.
a) AufNähr-Ager:
Kolonien von 2 mm 0 nach 24 h langer Inkubation bei 30° C mit glatten Rändern, die
nach 7tägigcm Altern dazu neigen, sich zu wellen. Konvexe weißliche Kolonien von w
feuchter cremeartiger Konsistenz, leicht leuchtend. Kein Ausschwärmen aus agarisierten
Medien.
b) Auf AgarGclntinc:
2. Flüssiges Medium:
a) Auf Salzlösung-1 lefeextrakt:
b) Auf peptonisiertem Wasser:
Starke Trübung nach 24 h bei 30" C Kein Sediment oder Oberflächenfilm erkennbar.
von 2 μπι.
Tropfens).
wurde nicht beobachtet
1. Optimale Wachstumstemperatur zwischen 25 und 30° C; wächst auch bei 20° C; wächst nicht bei 42° C.
2. Greift Agar nicht an.
3. Bildet keine Säure oder Gas aus Glucos ;.
4. Verwertet Harnstoff nicht.
5. Besitzt (bildet) keine Cytochrom-C-Oxidase.
6. Reduziert Nitrate zu Nilriten.
7. ist inert im OX/F-Test
8. Bildet kein Indol aus Tryptophan.
9. Negative Methylrot-Reaktion.
10. Positive Katalyse.
11. Bildet keine Säure oder Gas aus Lactose.
12. Verflüssigt Gelatine.
13. Lackmusmilch: Leichte Ansäuerung nach 7 Tagen.
Zu Identifikationszwecken wurde das in »Methods of detection and identification of bacteria« von B. M.
Mitruka und M. J. Bonner, CRC Press Ine 1976 und in »Bergey Manual of Determinative Bacteriology« 7.
Auflage angegebene Verfahren angewandt.
Der die erfindungsgemäß angewandte Cholesterase bildende Stamm kann unter aeroben Bedingungen als
Submerskultur in bewegten Fcrmentatoren gezüchtet
werden.
Ein flüssiges Kulturmedium enthält eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine Quelle für Stickstoff
und Mineralsalze. Kohlenstoffquellen, die angewandt werden können, sind unter anderem Aminosäuren,
Glucose, ölsäure, Linolsäure, Cholesterinester und Natriumacetat. Stickstoffquellen, die angewandt werden
können, sind unter anderem organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Fleischextrakt,
Hefeextrakt, Pcpton, Triptan, Aminosäuren, hydrolysiertes Casein, Sojamehl, Nitrate und Ammoniumsalze.
Ein geeignetes Kulturmedium besitzt die folgende Zusammensetzung:
Hefeextrakt
Sojamehl
K2HPO4
NaNOi, MgSO4
Sojamehl
K2HPO4
NaNOi, MgSO4
I-5 g/l
1-5 g/l
I Spuren bis
I zu I g/l
1-5 g/l
I Spuren bis
I zu I g/l
Der pH-Bereich für die Kultur liegt zwischen 6 und 8,
vorzugsweise zwischen 6,8 und 7,2. Der Temperaturbereich liegt zwischen 20 und 37° C. vorzugsweise
zwischen 28 und 32" C.
Das Enzym wird gebildet durch Zugabe von Cholesteryloleat oder natürlichen pflanzlichen Ölen zu
dem Kulturmedium vor dem Beimpfen.
Die Induktionszeit kann von 24 bis zu 72 h, vorzugsweise 40 bis 48 h, betragen.
Die während oder am finde der Kultur gewonnene Fcrmentationsbrühc kann als solche angewandt werden.
Wahlweise kann die überstehende Flüssigkeit oder die abfiltrierte oder abzcntrifugierte Kulturbrühe
angewandt werden.
Eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung
kann selbstverständlich erreicht werden durch Immobilisieren des Enzyms oder eine Kombination mit
makromolekularen Verbindungen unter Bildung chemischer Bindungen mit der Matrix oder ionischer
Bindungen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert
10
Es wurde eine Kulturbrühe der folgenden Zusammensetzung
hergestellt
NaNOj
K2HPO4
KCl
MgSO4 ■ 7 HD
2 g/l
2 g/l
0,5 g/l
0,5 g/l
10 g/l
5 g/l
2 g/l
0,5 g/l
0,5 g/l
10 g/l
5 g/l
durch Zugabe dieser Verbindungen zu entionisiertem Wasser.
Der pH-Wert der Brühe wurde mit verdünnter HCI auf 7,0 eingestellt. Das so hergestellte Medium wurde
durch Einbringen von 50 ml in jeden Kolben in 250-ml-Kolben verteilt Diese wurden 30 min bei 116° C
sterilisiert
Sie wurden mit J ml einer Suspension des Achromobacter delicatulus SM-1307 beimpft, der erhalten
worden war durcfc Waschen der »Ridna« einer Kultur
von 20 ml Nähr-Agar in 200 · 23 mm Röhrchen, die 48 h
bei 300C gewachsen war, mit 10 mi physiologischer
Kochsalzlösung.
Die Fermentations-Kolben wurden unter Orbitalschülteln
(180 bis 200 UpM) bei 300C inkubiert
Die Kulturbrühe wurde 48 h nach dem Beimpfen gewonnen und auf die Enzymaktivität untersucht 1 ml
Kulturbrühe enthielt 0,2 Enzymeinheiten.
Die Enzymaktivität wurde folgendermaßen bestimmt:
1 ml Kulturbrühe, die mit 0,1 m Phosphatpuffer-Lösung,
pH 6,7, entsprechend verdünnt war, wurde zu 5 ml einer Lösung von Cholesteryloleat, enthaltend
0,3 μΐτιοΙ/ml in 0,1 m Phosphatpuffer, pH 6,7, enthaltend
03% Triton X-IOO, gegeben. Die Reaktion wurde
10 min bei 37°C in einem bewegten Wasserbad durchgeführt und durch 3 min langes Erhitzen der von
dem Reaktionsgemisch abgezogenen Probe zum Sieden abgebrochen.
Die Konzentration des durch Hydrolyse von Cholesteryloleat entstandenen Cholesterins wurde colorimetrisch
bestimmt, wobei das freie Cholesterin mit Cholesierinoxidase zu Cholest-4-en*3-on oxidiert wurde
unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid. Dieses reagiert oxidativ mit 4-Aminoantipyrin und
Phenol in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines Chromogens mit Absorptionsmaximum bei
500 nm.
Die optische Dichte der gefärbten Proben wurde in
einem DB-GT Beckmann-Gilterspektrophotometer gemessen, bei dem die Küvette einen optischen Weg von
1 cm (0,1 dm) bei einer Wellenlänge von 500 nm besaß.
Wenn eine Einheit als die Menge an Enzym definieit
wird, die 1 μπιοΙ Cholesterin pro Minute unter der, oben
angegebenen Testbedingungen bildet, berechnen sich die Enzymeinheiten pro ml Kulturbrühe nach der
folgenden Formel:
U _ 4· 6 -(E10-E0)
ml Kulturbrühe 5,45 · 0,1 · D '
in der
Probe
E0 = optische Dichte der nach 0 min entnommenen
E0 = optische Dichte der nach 0 min entnommenen
Probe
5,45 = optische Dichte einer Lösung, enthaltend 1 μπιοί
5,45 = optische Dichte einer Lösung, enthaltend 1 μπιοί
Cholesterin pro ml und
D = die Enzymverdünnung bedeutet
D = die Enzymverdünnung bedeutet
Es wurde eine Kulturbrühe der folgenden Zusammensetzung
hergestellt
25 NaNO3
K2HPO3
MgSO4 · 7 H.<O
Olivenöl
2 g/l
2 g/l
03 g/I 03 g/I
lOg/1 5 g/l
durch Zugabe dieser Bestandteile zu entionisiertem Wasser und Einstellung des pH-Wertes mit Salzsäure
jo auf 6,7.
Kulturen von Achromobacter delicatulus SM-1307 in diesem Medium und entsprechend Beispiel 1 hergestellt,
wurden unter Orbitalschütteln (180UpM) bei 300C inkubiert
η Die Kulturbrühe wurde 72 h nach dem Beimpfen gesammelt und auf die Cholesterase-Aklivität untersucht
I ml der Kuiturbrühe enthielt 0,4 Enzymeinheilen.
Es wurde eine Kulturbrühe mit der in Beispiel 2 angegebenen Zusammensetzung hergestellt.
Kulturen von Achromobacter delicatulus SM-1307, in diesem Medium und entsprechend Beispiel 1 hergestellt
wurden unter Orbitalschütteln (180UpM) bei 30°C inkubiert
gewonnen, zentrifugiert und die Cholcsterase in der überstehenden Flüssigkeit angewandt zur Bestimmung
des Gesamt-Cholesterins in einer Probe von menschliehern
Blutserum.
Zu diesem Zweck wurde das folgende Reagens hergestellt:
Natriumcholat
Triton X-IOO
Phenol
Triton X-IOO
Phenol
4-Aminoantipyrin
Peroxidase
Peroxidase
60 6mM 15g
73 mM
03 mM 16 400 E (BoehringerNr. 127 361 im Katalog)
Das Cholesterin wurde auf folgende Weise bestimmt: 50 μπι menschliches Serum und 0,25 ml des Kulturmediums
wurden zu 2,5 ml Reagens gegeben. Die Reaktion fand direkt in der Glasküvette statt, die
einen optischen Weg von 1 cm aufwies, und die Entwicklung des Chromogens wurde direkt in einem
DB-GT Beckmann-Gitterspektrophotometer bei einer
I 5
ι:: Wellenlänge von 500 nm beobachtet bis zur vollständi-
\i gen Umwandlung des in dem Serum vorhandenen
ί Cholesterin^
■".. Unter diesen Bedingungen erhielt man am Ende eine
Γ optische Dichte von 0,500, entsprechend 164 mg
; Gesamt Cholesterin pro 100 ml der untersuchten
Serumprobe.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verwendung einer durch Züchten von Achromobacter delicatulus NRRL B.-12115 in einem Nährmedium, dem vor dem Beimpfen Cholesteryloleat oder natürliche pflanzliche öle zugegeben worden sind, erhaltenen Fermentationsbrühe, der überstehenden Flüssigkeit davon oder der abfiltrierten oder abzentrifugierten Kulturbrühe direkt zur Hydrolyse m> von Cholesterin-Fettsäure-Estem.
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8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |