DE2939269A1

DE2939269A1 - Verfahren zur optischen trennung von d,l-2-amino-4-methylphosphinobuttersaeure

Info

Publication number: DE2939269A1
Application number: DE19792939269
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Goi; Shinji Miyado; Takashi Shomura
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1978-10-02
Filing date: 1979-09-28
Publication date: 1980-04-30
Also published as: JPS6247520B2; FR2438054B1; JPS5547630A; FR2438054A1; GB2031896B; GB2031896A; DE2939269C2

Description

MEISSN E «.-£.£ O*L.TE.

BREMEN

-V-

Anmelderin: MEIJI SEIKA KAISHA, LTD. 4-16, Kyobashi 2-chome, Chuo-ku, Tokyo, Japan

Erfinder: Hitoshi GOI,

1-5-2-422, Saiwai-cho, Chiba-shi, ^J Chlba-ken, Japan

ShinJi MIYADO,

178-6, Sasanodai, Asahi-ku,

Yokohama-shi, Kanagawa-ken,

Japan

Takashi SHOMURA,

203, Komaoka-cho, Tsurumi-ku,

Yokohama-shi, Kanagawa-ken,

Japan

Akira SUZUKI,

17-17, Daikanyama-cho, Shibuya-ku,

Tokyo, Japan

Tomizo NIWA,

920, Hiyoshi-Hon dio, Kohoku-ku,

Yokohama-shi, Kanagawa-ken,

Japan

Yujiro YAMADA,

385-13, Shimoda-cho, Kohoku-ku,

Yokohama-shi, Kanagawa-ken,

Japan

PATENTANWÄLTE DIPL.-INC. HANS MEISSNER DIPL.-ING. ERICH BOLTE

D 28OO BREMEN I, Sievogtstraße 21 Bundesrepublik Deutidtland Telefon 0421 -34 2019 Telegramme: PATMEIS BREMEN Telex: 246157 (melbo d)

Datum 20.9.1979

Unter Zeichen 1511 Ihr Zeichen

Verfahren zur optischen Trennung von D,L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Abtrennung von L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure aus D,L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure.

Eingesandt· Modell· warden nach 2 Monaten, falls nicht zurückgefordert, vernichtet. Mündliche Abreden, Insbesondere durch Fernsprecher, bedürfen schriftlicher •eitltigung — Die In Rechnung gestellten Kosten Und mit Rechnungsdatum ohne Abzug fäll Ig. — Bei verspäteter Zahlung werden Bankzlnien berechnet.

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D,L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure (im Folgenden als DjL-MPGA bezeichnet) sowie die Salze derselben mit anorganischen oder organischen Basen sind nicht nur als Bakterizide für landwirtschaftliche Zwecke und Gartenbauzwecke (vgl. japanische Patent-Vorveröffentlichungen Nr. 14644/74, 14641/74 und 26430/74) geeignet, sondern auch als Herbizide, insbesondere für mehrjährige Unkräuter und verschiedene Straucharten (vgl. japanische Patent-Vorveröffentlichung Nr. 139727/77).

Kürzliche Untersuchungen über die herbizide Wirkung der genannten Verbindungen haben gezeigt, daß die Wirkung von L-MPGA etwa zweimal so hoch ist wie die des Racemates, d.h. von D,L-MPGA; d.h. also, daß die herbizide Wirkung der Verbindungen im wesentlichen dem L-MPGA und nicht dem D - MPGA zuzuordnen ist.

Es ist bereits vorgeschlagen worden, L-MPGA aus einem bekannten anti-mikrobiellen Mittel, nämlich der Substanz SF-1293 herzustellen. Bei der Substanz SF-1293 handelt es sich um L-MPGA-alanyl-alanin. Diese Substanz wird einem sauren Abbau (vgl. japanische Patent-Vorveröffentlichung Nr. 85538/73) oder einem enzymatischen Abbau (vgl. japanische Patent-Vorveröffentlichung Nr. 31890/74) unterworfen. Bezüglich der Substanz SF-1293 und der Herstellung derselben wird auf die japanische Patent-Vorveröffentlichung Nr.22688/73 und die Literaturstelle Helvetic Chimica Acta, 55» Fase 1, 224-239 (1972) verwiesen. Es ist weiterhin bekannt, mit Hilfe chemischer synthetischer Verfahren MPGA in Form des Racemates, d.h. der D,L-Mischung herzustellen (vgl. japanische Patent-Vorveröffentlichungen Nr. 91019/73 und Nr. 139727/77).

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Die jetzt durchgeführten Untersuchungen betreffen die optische Trennung von D,L-MPGA, welches mit Hilfe eines chemischen SyntheseVerfahrens hergestellt worden ist. Dabei hat sich gezeigt, daß N-Acyl-D,L-MPGA durch eine spezifische Deacylierung von N-Acyl-L-MPGA mit bestimmten Acylasen mikrobiellen Ursprungs getrennt werden kann, so daß das L-MPGA von dem N-Acyl-D-MPGA isoliert werden kann.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, daß bestimmte mikrobielle Acylasen als optisch spezifische hydrolytische Enzyme wirken, die die Fähigkeit besitzen, selektiv die Acylgruppe aus N-acyliertem L-MPGA zu eliminieren, ohne dabei das N-Acyl-D-MPGA anzugreifen. Derartige mikrobielle Acylasen werden bei der Züchtung von Bakterienstämmen der Gattung Pseudomonas oder von Actinomyceten der Gattung Streptomyces oder von Pilzen der Gattung Aspergillus erzeugt.

Die Erfindung betrifft infolgedessen ein Verfahren zur optischen Trennung von D.L^-Amino-^methylphosphinobuttersäure, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man D,L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure in das N-Acylderivat überführt, letzteres in wässrigem Medium mit einer mikrobiellen Acylase, welche eine spezifische optische hydrolytische Aktivität aufweist und durch Züchtung eines Mikrobenstammes der Gattung Pseudomonas, Streptomyces oder Aspergillus gewonnen wird, umsetzt, so daß selektiv die Acylgruppe aus der N-Acyl-L-2-amino-4-methylphosphinobuttersäure eliminiert wird und ein Gemisch aus L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure und N-Acyl-D-2-amino-4-methylphosphinobuttersäure anfällt, aus dem die L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure abgetrennt wird.

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Die als Ausgangsverbindung benutzte N-Acyl-D,L-2-amino-4-methylphosphinobuttersäure läßt sich durch die allgemeine Formel

O 0

tt η

CH,-P-CH₉-CH₉-CH-C-OH

OH HNR

darstellen, in welcher R eine nicht-substituierte oder halogen-substituierte Acylgruppe darstellt.

Die Acylgruppe des N-Acyl-D,L-MPGA, welches als Substrat für die mikrobiellen Acylasen wirkt, kann, wie sich gezeigt hat, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aus jeder beliebigen Acylgruppe bestehen, vorausgesetzt, daß sie sich durch die Einwirkung der Acylasen hydrolysieren läßt, so daß L-MPGA entsteht. Üblicherweise kann daher die Acylgruppe sowohl eine Alkanoyl- als auch eine Aroylgruppe sein. Von diesen sind insbesondere geeignet Alkanoylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen wie die Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Butyryl- und Pentanoylgruppe sowie die Benzoylgruppe. Die Acylgruppe kann halogen-substituiert sein, vorausgesetzt, daß der Halogensubstituent bzw. die Halogensubstituenten die gewünschte enzymatische Umsetzung nicht beeinflussen bzw. nicht behindern.

Typische Beispiele für Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, mikrobielle Acylasen zu erzeugen, die ihrerseits für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbar sind, sind:

Bakterien: Pseudomonas maltophilia BN-233, isoliert aus einer Bodenprobe, die auf der Halbinsel Chita, Aichi Prefecture, Japan, genommen worden ist;

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Actinomycetes: Streptomyces violascens SF-2072 und Streptomyces diastatochromogenes SF-2073, isoliert aus einer Bodenprobe, die in Shiga Prefecture, Japan, genommen worden ist;

Fungi: Aspergillus sp. KS-101 und Aspergillus sp. KS-102, beide isoliert aus einer Bodenprobe, die in Yokohama, Japan, entnommen worden ist.

Die vorstehend erwähnten Stämme weisen folgende mikrobiologische Kenndaten auf:

Pseudomonas maltophilia BN-253
(a) morphologische Eigenschaften

Die auf Bouillon-Agar gezüchteten Zellen sind stäbchenförmig und haben eine Größe von 0,5 bis 0,7 Mikron χ 1,0 bis 2,0 Mikron; sie sind mit Hilfe einer polaren Geißel beweglich. Bildung von Sporen sowie von Polymorphismus wurden nicht beobachtet. Gram-negativ.

(b) Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien

1) Bouillon-Agar:

Die Zellen wachsen mit gelblich-brauner Farbe. Die Bildung eines diffusionsfähigen Pigmentes, schrumpliges Wachstum, gummiartiges Wachstum sowie Kriechen wurden nicht beobachtet.

2) Bouillon-Brühe:

Das gesamte Kulturmedium wurde trübe. Keine Hautbildung.

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S-

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3) Bouillon-Gelatine-Ansatz:
Das Medium wird verflüssigt.

4) Milch:

Das Medium wird verflüssigt, wobei der pH-Wert in den alkalischen Bereich übergeht.

(c) Physiologische Eigenschaften:

1) Reduktion von Nitrat : negativ

2) Denitrifizierung : negativ

3) Methyl-rot-Test : negativ 4) Voges-Proskauer-Test : negativ

5) Erzeugung von Indol : negativ

6) Erzeugung von Schwefelwasserstoff: Bleiacetat-Papier wird schwarz gefärbt; Schwärzung von TSI-Medium tritt dagegen nicht auf.

7) Hydrolyse von Stärke : negativ

8) Verwendung von Zitronensäure : positiv

9) Verwendung von Stickstoffquellen : der Stamm kann Ammoniumsalz verwenden, jedoch nicht Nitrat als einzige Stickstoffquelle.

10) Erzeugung eines wasserlösliches Pigmentes auf King-Α und King-B-Medien: nicht feststellbar.

11) Wachstumsfaktoren : Methionin ist erforderlich.

12) Ansammlung von Poly-ß-hydroxybutyrat in den Zellen : negativ

13) Oxjdase-Test: negativ

14) Wachstumstemperatur : der Stamm wächst bei 15 bis 37⁰C, jedoch nicht bei 5°C und nicht bei 42°C.

15) Anaerobe Bedingungen : der Stamm kann dann nicht

wachsen. 16) 0.F.-Test : 0 -Typ

17) Verwendung von Kohlenstoffquellen : der Stamm kann Glukose, Maltose, Cellobiose und Lactose als alleinige Kohlenstoffquelle für das Wachs-

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turn verwenden, jedoch nicht Glyzerin und Glutarsäure.

Die Identifizierung des Stammes BN-233 mit den vorstehend angegebenen mikrobiologischen Eigenschaften wurde mit Hilfe von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8.Ausgabe (1974) durchgeführt, wobei sich folgendes ergab:

(1) Der Stamm BN-233 gehört offensichtlich zur Gattung Pseudomonas, und zwar im Hinblick auf die Tatsache, daß es sich um gram-negative Stäbchen handelt, die mittels einer polaren Geißel beweglich sind, keine Sporen produzieren und strikt aerob sind.

(2) Die Zuordnung des Stammes BN-233 zur Gattung

Pseudomonas maltophilia erfolgt im Hinblick auf die Tatsache, daß er Methionin benötigt, dem Oxydase-Test gegenüber negativ ist und bei der Verflüssigung von Gelatine ein positives Ergebnis liefert sowie insbesondere im Hinblick auf die Palette der benutzten Kohlenstoffquellen.

Der Stamm BN-233 wurde daher als Pseudomonas maltophilia BN-233 bezeichnet und bei der amtlichen japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology", Inage, Chiba-city, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 4487 sowie bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C, USA unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31559 hinterlegt.

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Streptomyces violascens SF-2072

(a) Morphologische Eigenschaften

Die Bildung von Luft-Mycel ist im allgemeinen auf verschiedenen Züchtungsmedien schlecht, Jedoch gut auf Böden aus anorganischen Salzen-Stärke-Agar, wobei es zu einer reichlichen Bildung von Sporen kommt. Die Luft-Mycelien bilden monopodiale Verzweigungen, wobei quirlständige Verzweigungen nicht beobachtet wurden. Die Spitzen des Luftmycels sind spiralig (hauptsächlich kompakt-spiralig). Sklerotium wurde nicht beobachtet.

Bei der elektronen^mikroskopischen Beobachtung zeigte sich, daß die Oberflächenstruktur der Sporen dornig ist. Die Sporen selbst haben hauptsächlich eine zylindrische Form bei einer Größe von 0,6 bis 0,7 Mikron χ 1,1 bis 1,3 Mikron. Im allgemeinen bilden sie eine Kette aus 10 oder mehr Sporen.

(b) Kultureigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien Die Kultureigenschaften des Stammes SF-2072 sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Die Angabe von Farbzahlen in ( ) basiert auf dem Standardwerk "Color Harmony Manual", erstellt von der Container Corporation of America. Die Bebrütungstemperatur betrug 28⁰C und die Begutachtung erfolgte nach einer Bebrütung von 14 bis 21 Tagen.

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Tabelle

Kulturmedium

Saccharose-Nitratagar

Wachstum; Farbe
der Rückseite

Luftmycel

schwaches Wachs- sehr turn, farblos schwach,

baumwollartig, blaßlila,

lösliches Pigment

keins

Glucose- Asparaginagar	gewöhnliches Wachstum, hell- gelbli ch-braun	keins	keins
Glycerin- Asparaginagar	gewöhnliches Wachstum, grau- gelb bis hell gelblich-braun	keins	keins
Anorganische Salze-Stärkeagar	gutes Wachstum, hellgrau-gelb	reichlich, baumwoll artig, blaßlila,	keins
Hafermehlagar	gewöhnliches Wachstum, creme	sehr schwach, baumwoll artig, weiß	keins
Hefe-Malzagar	gewöhnliches oder gutes Wachstum, schwach-braun	keins oder sehr schwach weiß	keins »
Tyrosinagar	gewöhnliches oder gutes Wachstum, braun oder dunkelbraun	sehr schwach, baumwoll- artig, weiß bis blaßlila	schwach braun
Nähragar	gewöhnliches Wachstum, dunkelbraun	keins	braun

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(c) Physiologische Eigenschaften

1) Wachstumstemperaturbereich:

Der Stamm SF-2072 wächst in einem Temperaturbereich von 15 bis 38° C auf anorganischen Salzen-Stärkeagar. Die optimale Wachstumstemperatur liegt zwischen 25 und 30°C.

2) Verflüssigung von Gelatine: positiv (bei 20⁰C, 21 Tage Bebrütung)

3) Hydrolyse von Stärke:
positiv (bei 28⁰C)

4) Gerinnung von Magermilch:
negativ (bei 28⁰C)

5) Peptonisierung von Magermilch: negativ (bei 28°C)

6) Bildung eines melanin-ähnlichen Pigmentes: positiv

(d) Verwendung von Kohlenstoffquellen (bei Bebrütung auf Pridham-Gottlieb's-Agar bei 28⁰C):

1) verwendet werden: D-Glucose, D-Fructose, D-Xylose, L-Inosit, L-Arabinose, Saccharose, Raffinose.

2) nicht verwendet werden: D-Mannit, Rhamnose.

Im Hinblick auf die vorstehend aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften kann der Stamm SF-2072 der Gattung Streptomyces zugerechnet werden. Er bildet ein Luftmycel, dessen Spitzen eine spiralige Form

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aufweisen. Die Sporenoberfläche hat eine dornige Struktur. Das Luftmycel nimmt eine blaßlila Farbe an und gehört zu den "Violett-Reinen" nach der Definition von H.D. Tresner und F.J. Bacus in Appl.Microbiol. IM.» 335 bis 338 (1963). Die Rückseite des Wachstums färbt sich schwach gelblich-braun ohne andere ausgeprägte Farben. Ein melanin-ähnliches Pigment wird gebildet; die Produktion anderer löslicher Pigmente konnte nicht beobachtet werden.

Vergleicht man die angegebenen mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes SF-2072 mit denen von Streptomyces violascens gemäß ISP (International Streptomyces Project), beschrieben in International Journal of Systematic Bacteriology, 1j3, 380 - 382 (1968), so zeigt sich, daß die ersteren mit den letzteren selbst in den geringstens Einzelheiten übereinstimmen, so daß der Stamm SF-2072 als Streptomyces violascens SF-2072 bezeichnet wurde.

Dieser Stamm, Streptomyces violascens SF-2072, wurde beim japanischen Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P-4617 sowie außerdem bei der American Type Culture Collection in den USA unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 31560 hinterlegt.

Streptomyces diastatochromogenes SF-2073

(a) Morphologische Eigenschaften

Die Bildung von Luftmycel durch den Stamm auf anorganischen Salzen-Stärkeagar, Hafermehragar oder Tyrosinagar ist gut bei reichlicher Erzeugung von Sporen. Die Luftmycelien bilden monopodiale Verzweigungen ohne quirlständige ^ferzreigungen. Die Spitzen des Luftmycels sind spiralig (hauptsäch-

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lieh kompakt-spiralig). Sklerotium wurde nicht beobachtet.

Die elektronen-mikroskopische Untersuchung der Sporen zeigte, daß sie eine glatte Oberfläche aufweisen und eine elliptische oder kurze zylindrische Form bei einer Größe von 0,8 - 1,1 Mikron χ 1,0 1,3 Mikron besitzen. Gewöhnlich bilden sie eine Kette aus 10 oder mehr Sporen.

(b) Kultureigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien

Die Kultureigenschaften des Stammes SF-2073 sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt. Die Bebrütungstemperatur betrug 28°C und die Beobachtungen wurden nach 14 - 21-tägiger Bebrütung gemacht .

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-. 16 -

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Tabelle

Kulturmedium Wachstum; Farbe der Rückseite

Saccharose-Nitrat agar

gewöhnliches oder gutes Wachstum, gelblich-braun mit Graustich Luftmycel

schwach grau

(2dc-2fe)

lösliches Pigment

schwach graugelb

Glucose- gewöhnliches Asparaginagar Wachstum, schwach braun

Glyzerin- gewöhnliches Asparaginagar Wachstum,

schwachgrau

Anorganische gutes Wachstum, Salze-Stärke- grau-braun, agar

Hafermehlagar

Hefe-Malzagar

Tyrosinagar

Nähragar

gutes Wachstum, grau-braun

gewöhnliches Wachstum,
schwach braun

gutes Wachstum, dunkelbraun bis schwarz

gewöhnliches Wachstum,
schwach braun keins oder keins sehr schwach,

schwach, keins grauweiß

(2dc)

reichlich, keins bräunlichgrau (3ge-4ig)

reichlich, keins bräunlich-

frau 3ge)

schwach, keins weiß bis grau-weiß

reichlich, dunkelbraun bräunlich-

?rau 3ge)

keins schwach braun

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(c) Physiologische Eigenschaften

1) Wachstumstemperaturbereich:

Der Stamm SF-2073 wächst in einem Temperaturbereich von 15 bis 38°C auf anorganischen Salzen-Stärkeagar. Die optimale Wachstumstemperatur liegt zwischen 25 und 30⁰C.

2) Verflüssigung von Gelatine: positiv (bei 20°C, 21 Tage Bebrütung)

3) Hydrolyse von Stärke:
positiv (bei 28°C)

4) Gerinnung von Magermilch:
negativ (bei 28⁰C)

5) Peptonisierung von Magermilch: positiv (bei 28⁰C)

6) Bildung eines melanin-ähnlichen Pigmentes: positiv

(d) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen (bebrütet auf Pridham-Gottliebs-Agar bei 28°C):

Der Stamm nutzt gut D-Glucose, D-Fructose, D-Xylose, D-Mannit, L-Arabinose, L-Inosit, Saccharose, Raffinose und Rhamnose für sein Wachstum.

Im Hinblick auf die vorstehend aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften kann der Stamm SF-2073 der Gattung Streptomyces zugeordnet werden. Die Luftmycelien sind spiralig an der Spitze und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt. Die Farbe des Luftmycels ist bräunlich-grau und die Rückseite des Wachstums nimmt eine schwach-braune bis grau-braune Farbe ohne

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weitere bestimmte Farben an. Es kommt zur Bildung eines melanin-ähnlichen Pigmentes, während andere lösliche Pigmente nur geringfügig oder gar nicht erzeugt werden.

Ein Vergleich der mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes SF-2073 mit denen von Streptomyces diastatochromogenes nach ISP, erläutert in International Journal of Systematic Bacteriology, 22, 290-294 (1972), zeigte eine enge Übereinstimmung zwischen beiden. Der Stamm SF-2073 stimmt in seinen mikrobiologischen Eigenschaften mit Streptomyces diastatochromogenes weiter überein als mit allen anderen bekannten Stämmen, die unter die Gattung Streptomyces fallen; geringe Unterschiede bestehen bei dem Stamm SF-2073 hinsichtlich der Färbung der Rückseite des Wachstums auf anorganischen Salzen-Stärkeagar oder Hafermehlagar, welche grau-braun ist, und hinsichtlich der Spitzen der Luftmycelien, die im wesentlichen spiralig geformt sind; bei dem entsprechenden ISP-Stamm ist die Farbe der Rückseite des Wachstums schwach gelb bis grau-gelb und die Spitzen des Luftmycels sind nicht nur spiralig, sondern auch wellig und gerade geformt.

Im Hinblick auf die weitgehende Übereinstimmung in den fundamentalen Eigenschaften des Stammes SF-2073 mit dem entsprechenden ISP-Stamm wurde der Stamm SF-2073 trotz der bestehenden geringfügigen Unterschiede der Art Streptomyces diastatochromogenes zugeordnet und als Streptomyces diastatochromogenes SF-2073 bezeichnet.

Dieser Stamm wurde bei dem japanischen Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P-4618 und außerdem bei der American Type Culture Collection in den USA unter der ATCC-Nr. 31561 hinterlegt.

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Aspergillus sp. KS-101

Bei der Bebrütung des Stammes auf Kartoffelstärke-Glucoseagar bei 28⁰C in 10 Tagen bilden sich Kolonien mit einem Durchmesser von 65 mm. Das gebildete weiße Mycel war baumwollartig und wies zahlreiche schwarzbraune Sporen auf. Eine entsprechende Bebrütung des Stammes auf Czapek·s-Agar ergab Kolonien mit einem Durchmesser von 70 mm, die ein samt-ähnliches Wachstum mit einer großen Zahl schwarz-brauner Sporen zeigten. Auf Malζextraktagar hatten die gebildeten Kolonien einen Durchmesser von 90 mm; die Mycelien derselben waren in kurz-flockiger Form mit einer großen Anzahl schwarzbrauner Sporen.

Bei der mikroskopischen Betrachtung zeigte sich, daß die reifen Konidienköpfe eine kugelförmige Gestalt mit einem Durchmesser von 40 bis 60/u aufwiesen und dicht mit schwarz-braunen Sporen bzw. Konidien besetzt waren. Die Konidienträger sind glatt und besitzen an der Spitze kugelförmige Bläschen mit einem Durchmesser von 10 bis 15/u. Die Sterigmata verlaufen in zwei Reihen und die Konidien haben die Form von Kügelchen mit einem Durchmesser von 3 bis 4/u, die mit zahlreichen kleinen warzenförmigen Erhebungen besetzt sind.

Der Stamm wächst gut in einem Temperaturbereich von 15 bis 37°C; er wächst nicht bei 42⁰C

Aufgrund der vorstehend aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften wurde geschlossen, daß dieser Stamm zu der Gattung Aspergillus, u.a. zu der Gattung Aspergillus niger gehört; er wurde als Aspergillus sp. KS-101 bezeichnet.

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Dieser Stamm wurde bei dem japanischen Fermentation Research Institute unter der Nummer FERM-P-4614 sowie bei der American Type Culture Collection in den USA unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 20567 hinterlegt.

Aspergillus sp. KS-102

Bei der Bebrütung des Stammes auf Kartoffelstärke-Glucoseagar in einer Petri-Schale bei 28⁰C während 10 Tagen bildeten sich Kolonien mit einem Durchmesser von 13 mm, die ein samt-ähnliches Aussehen zeigten. Der Rand der Kolonien war weiß und die Mitte derselben war leicht hochgewölbt und zeigte eine gelblich-grüne Farbe. Eine entsprechende Bebrütung des Stammes auf Czapek·s-Agar ergab Kolonien mit einem Durchmesser von 50 mm, die einen tief grün gefärbten Wuchs mit samt-ähnlichem Aussehen, in welchem sich sporadisch kleine schwarze Klümpchen von etwa 1 mm Durchmesser befanden, zeigten. Auf Malzextraktagar hatten die gebildeten Kolonien einen Durchmesser von 90 mm und zeigten ein samt-ähnliches Aussehen des Wuchses mit einer großen Anzahl tief grün gefärbter Sporen.

Bei der mikroskopischen Betrachtung zeigte sich, daß die Konidienkörpe? keulenförmig oder säulenförmig ausgebildet sind; die Bläschen haben in einem frühen Wachstumsstadium eine elliptische Gestalt. Im Reifezustand sind die Konidienköpfe kugelförmig und haben einen Durchmesser von 40 - 60/u; die Bläschen sind ebenfalls kugelförmig oder subglobular bei einem Durchmesser von 15-20/u. Die Konidienträger sind glatt, die Sterigmata sind in einzelnen Reihen angeordnet und die Konidien sind kugelförmig oder subglobular bei einem Durchmesser von 4 - 6 /u, die Oberfläche der Sporen ist glatt.

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Der Stamm wächst gut bei einer Temperatur im Bereich von 15 - 40°C.

Im Hinblick auf die vorstehend aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften wurde geschlossen, daß der Stamm zur Gattung Aspergillus sowie u.a. zur Art Aspergillus flavus-Oryzae gehört. Er wurde als Aspergillus sp. KS-102 bezeichnet.

Dieser Stamm wurde bei dem japanischen Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P 4615 und außerdem bei der American Type Culture Collection in USA unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 20568 hinterlegt.

Alle vorstehend erwähnten Stämme besitzen Eigenschaften, die sich ändern können, wie dies auch von anderen Stämmen bei einer großen Vielzahl von Mikroorganismen bekannt ist. Die Stämme können infolgedessen Varianten oder Mutanten bilden, wenn sie mit verschiedenen Mutagenen wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequenz-elektromagnetischen Wellen, radioaktiven Strahlen oder Chemikalien behandelt werden. Alle vorstehend aufgeführten Stämme einschließlich aller natürlichen oder künstlichen Varianten oder Mutanten derselben können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie die Fähigkeit besitzen, die gewünschte Acylase zu bilden.

Die Züchtung eines Acylase erzeugenden Stammes, dessen Acylase als optisch spezifisches, hydrolytisches Enzym für das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden soll, kann in üblicher bekannter Weise durchgeführt werden. So läßt sich der Acylase produzierende Stamm in einem Kulturmedium züchten, welches die üb-

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licherweiee für Fermentierungsprozesse, die der Züchtung von Mikroorganismen dienen, benutzten Nährstoffquellen enthält. Beispielsweise können folgende Nährstoffquellen bei der Züchtung verwendet werden: Glucose, Saccharose, Stärke, Glyzerin, Malzsirup, Melasse, pflanzliche öle u.a. als Kohlenstoffquellen; Sojabohnenmehl, Weizenkeine, Fleischextrakt, Pepton, Maisweichwasser, getrocknete Hefe, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat u.a. als Stickstoffquellen. Erforderlichenfalls können auch anorganische Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Phosphate u.ä sowie andere Zusätze, die das Wachstum des Stammes fördern, eingesetzt werden. Insbesondere durch Verwendung der letzteren läßt sich die Erzeugung der gewünschen Acylase beschleunigen.

Die Züchtung kann in üblicher Weise sowohl in flüssigen als auch in festen Kulturen durchgeführt werden, wobei eine Kultur unter submersen Bedingungen bei der Züchtung in größerem Maßstab bevorzugt wird. Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 25 und 37⁰C, vorzugsweise bei einer Temperatur um etwa 28⁰C durchgeführt. Die Züchtungsdauer hängt von den Züchtungsbedingungen ab, insbesondere von der zur Züchtung verwendeten Apparatur, der Zusammensetzung des Kulturmediums, der Temperatur usw. Vorzugsweise wird die Züchtung solange fortgesetzt, bis die Aktivität der erzeugten Acylase ein Maximum erreicht. In den meisten Fällen macht sich die Acylase-Aktivität einen Tag nach Beginn der Züchtung bemerkbar, erreicht nach zwei bis drei Tagen ihr Maximum und verringert sich dann allmählich bis zum Verschwinden. Infolgedessen erscheint eine Dauer von 2 bis 4 Tagen für die Züchtung besonders günstig.

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Die so erhaltene Kultur oder das "Enzymmaterial¹¹, das aus einer solchen Kultur durch gewisse Nachbehandlungsschritte erhalten worden ist, enthält eine Acylase, die als optisch spezifisches, hydrolytisches Enzym wirkt und für das optische Trennungsverfahren gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden kann. Mit dem Ausdruck "Enzymmaterial", welcher im vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, wird jedes beliebige Material verstanden, welches durch Nachbehandlung der Kulturen der vorstehend erwähnten Stämme gewonnen worden ist, die die Kultur in eine für die Zwecke der Erfindung vorteilhaftere Form umwandeln. Durch die Umwandlung wird insbesondere der Wirkungsgrad des Enzyms bei der Acyl-Eliminierung bei der Herstellung von L-MPGA und N-Acyl-D-MPGA erhöht. Beispiele für "Enzymmaterialien" der genannten Art sind Zellen, die aus der Kultur gewonnen worden sind, und zwar sowohl in gewaschener als auch in ungewaschener, in getrockneter oder nicht getrockneter Form, zerkleinerte Zellen, deren Extrakte, die reich an der gewünschten Acylase sind und durch Extraktion der mittels Ultraschall oder mechanisch aufgebrochenen Zellen sowie anschließende Reinigung gewonnen wurden, immobilisierte Acylasepräparate, die aus den Zellen gewonnen wurden, zerkleinerte Zellen oder deren Extrakte.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die optisch aufzutrennende, als Ausgangsmaterial eingesetzte D,L-MPGA in Form ihres N-Acylderivates eingesetzt. Die enzymatische Deacylierungsreaktion durch optisch spezifische Hydrolyse von N-Acyl-L-MPGA unter der Wirkung einer mikrobiellen Acylase wird in einem wässrigen Medium durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen werden so ausgewählt, daß die Eigenschaften der Acylase optimal ausgenutzt werden. Wird die Acylase in Form von intakten, aus der Kultur abgetrennten Zellen verwendet,

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so ist die enzymatische Aktivität derselben bei einem pH-Wert von 6 bis 8,5 zufriedenstellend hoch. Bei einem pH-Wert unter 5 oder über 9 verringert sie sich oder verschwindet ganz, wobei keine nennenswerten Unterschiede in den enzymatisehen Eigenschaften unter den Acylasen, die von verschiedenen Arten von Mikroorganismen erzeugt wurden, festgestellt werden konnten. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von 20 bis 45°C für alle in Frage kommenden Acylasen liegen, der bevorzugte Bereich liegt zwischen 28 und 35°C Über 50⁰C verlieren die Acylasen, wie festgestellt werden konnte, ihre Wirkung.

Die Reaktionsbedingungen sollten daher vorzugsweise so ausgewählt werden, daß der pH-Wert zwischen 6,5 und 8,5 liegt und daß eine Temperatur zwischen 25 und 40⁰C eingehalten wird. Es wurde gefunden, daß die für das erfindungsgemäße Verfahren zu verwendende mikrobielle Acylase kaum eine oder nur eine sehr geringe Wirkung gegenüber anderen Substraten als N-Acyl-L-MPGA besitzt, beispielsweise gegenüber N-Acylderivaten von bekannten üblichen L-Aminosäuren.

In Fällen, in denen die mikrobielle Acylase in Form von gewaschenen Zellen verwendet wird, dispergiert man die Zellen vorzugsweise in einer Lösung des Substrates, so daß die Reaktion in der Dispersion ablaufen kann. Besonders günstig ist es, wenn die Umsetzung unter Schütteln oder Rühren durchgeführt wird. Andererseits ist es auch möglich, die Reaktion so durchzuführen, daß man eine Kolonne mit der Kultur oder einem Enzymmaterial, welches aus der Kultur gewonnen worden ist, füllt und kontinuierlich die Substratlösung durch die Kolonne leitet, so daß die Deacylierung sukzessive erfolgen kann. Die Reaktionsdauer hängt von der Konzentration

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des Substrates, dem Ausmaß der Deacylierungsaktivität, der Reaktionstemperatur und anderen Faktoren ab; sie liegt im allgemeinen im Bereich von 2-40 Stunden. Die Beendigung der Reaktion kann bestimmt werden, indem man die Zeit feststellt, in welcher die Bildung der gewünschten L-MPGA ein Maximum erreicht. Die Substratkonzentration wird hauptsächlich in bezug auf das Ausmaß der Deacylierungsaktivität bestimmt und liegt gewöhnlich im Bereich von 0,1 bis 10 %. Gegebenenfalls kann ein beliebiges Antiseptikum zugesetzt werden, um eine mögliche Verunreinigung der Reaktionsmischung mit anderen Mikroorganismen während der Umsetzung zu verhindern.

Die Abtrennung von L-MPGA und N-Acyl-D-MPGA aus dem Reaktionsgemisch und die Isolierung und Abtrennung Jeder der beiden Verbindungen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. So kann man die Zellen oder die Derivate derselben, die eingesetzt worden sind, aus dem gewonnenen Reaktionsgemisch abfiltrieren oder mittels Zentrifugalkraft oder mit anderen Trennoperationen entfernen. Das Filtrat bzw. die flüssige Fraktion, die auf diese Weise gewonnen wird, kann durch eine Kolonne geleitet werden, die mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz beladen ist. Ein geeignetes Ionenaustauscherharz dieser Art ist beispielsweise das Handelsprodukt Dowex 50^-1 Die L-MPGA wird an der Kolonne adsorbiert, während die nicht umgesetze N-Acyl-D-MPGA die Kolonne passiert, ohne an derselben adsorbiert zu werden. Anschließend kann die Kolonne mit Wasser entwickelt werden, um die L-MPGA zu eluieren. L-MPGA reagiert positiv auf Ninhydrin. Das Eluat kann gegebenenfalls gereinigt werden, indem man es mit Aktivkohle oder einem Ionenaustauscherharz behandelt. Als letzteres ist beispielsweise das Handelsprodukt Dowex 1^ geeignet. Das gereinigte Eluat kann eingeengt oder zur Kristallisation gebracht oder der Gefriertrock-

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nung unterworfen werden, so daß man reine L-MPGA in Form von Kristallen oder in Form eines weißen Pulvers erhält.

Die abgetrennte, N-Acyl-D-MPGA enthaltende Fraktion kann leicht in an sich bekannter Weise racemisiert werden, so daß man eine weitere Menge der als Ausgangsmaterial zu verwendenden N-Acyl-D,L-MPGA erhält. So kann man beispielsweise die N-rAcyl-D-MPGA enthaltende Fraktion in wässrigem Natriumhydroxid lösen und die Racemisierung der entstandenen Lösung durch Zugabe eines großen Überschusses an Essigsäureanhydrid oder unter Durchleiten von Ketengas durch die Lösung vornehmen. Die Racemisierung von N-Acyl-D-MPGA kann auch erreicht werden, indem man N-Acyl-D-MPGA in Eisessig gibt und eine äquimolekulare oder etwas geringere als äquimolekulare Menge an Essigsäureanhydrid unter Erwärmen zusetzt. Die mehrfache Wiederholung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur optischen Auftrennung in Kombination mit der anschließenden Racemisierung in der beschriebenen Weise führt zu einer vollständigen !Anwandlung von D-MPGA in L-MPGA.

Der Endpunkt der enzymatischen Deacylierungsreaktion kann bestimmt werden, indem man die Menge an gebildeter L-MPGA nach folgender Methode mißt: Die Menge an gebildeter L-MPGA kann quantitativ mit Hilfe der Spektrophotometrie unter Verwendung von Ninhydrin als Reagenz bestimmt werden. Zunächst wird eine Standard-Kalibrierungskurve hergestellt, mit welcher das Absorptionsvermögen der zu prüfenden Proben verglichen wird. (Vgl. E.W. Yemm und E.C. Cocking, Analyst, 80, 209 (1955).

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Reagentien:

Lösung A:
Lösung B:

Lösung C:
Lösung D;
Lösung Ej

4m Essigsäurepufferlösung (pH 5,0); Mischung aus 5 ml 0,01m Kaliumcyanidlösung und 245 ml Methylcellosolve; Lösung aus 2,5 g Ninhydrin in 50 ml Methylcellosolve;

Mischung aus 250 ml der Lösung B und 50 ml der Lösung C; 60#ige Äthanollösung.

Meßvorgang:

1,0 ml der zu prüfenden Probelösung wird in ein Reagenzglas gegeben, in welches dann noch 0,5 ml der Lösung A und 1,2 ml der Lösung D gefüllt werden. Die entstandene Mischung wird 15 Minuten auf einem siedenden Wasserbad gehalten und dann 5 Minuten in kaltem Wasser abgekühlt. Anschließend werden 3,0 ml der Lösung E zu der Mischung gegeben. Man rührt gut durch und mißt das Absorptionsvermögen bei 570 nm in einem Spektrophotometer.

Die Standardkurve des Absorptionsvermögens von L-MPGA zeigt eine lineare Beziehung in den Konzentrationen von 1 - 50/ug/ml, so daß der Vergleich der gemessenen Werte mit der Standardkurve den Gehalt an L-MPGA in der Probelösung angibt.

Die im Folgenden aufgeführten Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Eine Schlinge voll einer Schrägbodenkultur von Pseudomonas maltophilia BN-233 (FERM-P 4487) wurde in 200 ml eines sterilisierten Kulturmediums eingeimpft, welches

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0,5 % Glucose, 0,3 % Fleischextrakt, 0,5 % Pepton, 0,2 % Natriumglutamat, 0,001 % Kobaltchlorid und 0,001 % Ferrosulfat enthielt. Das geimpfte Medium wurde unter Schütteln bei 28°C 42 Stunden bebrütet. Die KuI-turbrühe wurde anschließend in 20 Minuten bei 8000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen, die anschließend mit 50 ml physiologischer Salzlösung gewaschen wurden. Man erhielt auf diese Weise 5 g (Naßgewicht) gewaschene Zellen.

1,6 g dieser gewaschenen Zellen wurden in 50 ml einer 0,05m Phosphat-Pufferlösung (pH 5) suspendiert. Zu der Suspension wurden anschließend 240 mg N-Acetyl-D,L-MPGA gegeben. Die Mischung wurde unter Schütteln 18 Stunden bei 28°C in einem 200 ml-Erlenmeyer-Kolben gehalten, damit die Umsetzung ablaufen konnte. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert. Man erhielt die Zellen als feste Masse und eine darüberstehende Flüssigkeit. Die feste Masse wurde zweimal mit je 5 ml Wasser gewaschen. Die Waschwässer wurden mit der überstehenden Flüssigkeit vereinigt. Die vereinigten Flüssigkeiten wurden durch eine Kolonne (1,6 cm im Durchmesser und 12 cm hoch) geleitet, die ein Icnenaustauscherharz, und zwar Dowex 1 χ 2 ^ (CH^COO"") enthielt. Durch die Kolonne wurde eine große Menge Wasser zum Waschen und dann 0,3n Essigsäure zum Entwickeln geleitet. Die Eluatfraktionen (Gesamtvolumen 90 ml), die gegenüber Ninhydrin positiv reagierten, wurden zusammen aufgefangen, unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Auf diese Weise erhielt man 84 mg L-MPGA als weißes Pulver. Reinheit 85 %i (tt)p² 21,7° (c=1, 1n HCl); Ausbeute 68 %.

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Beispiel 2

Eine Schlinge voll einer Schrägbodenkultur von Streptomyces violascens SF-2072 (FERM-P 4617) wurde in 200 öl eines sterilisierten Kulturmediums eingeimpft, welches 1 % lösliche Stärke, 0,2 % Hefeextrakt und 0,2 % Pepton enthielt. Der pH-Wert vor dem Sterilisieren lag bei 7,0. Das geimpfte Medium wurde unter Schütteln bei 28°C 72 Stunden bebrütet. Die entstandene Kultur wurde über einem Papierfilter (Toyo Nr. 2 ^) abgesaugt und die auf dem Papier zurückbleibenden Zellen wurden mit 50 ml physiologischer Salzlösung gewaschen. Man erhielt auf diese Weise 6,5 g (Naßgewicht) der gewaschenen Zellen.

3 g der gewaschenen Zellen wurden sorgfältig in 200 ml einer 0,05m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert. Die Suspension wurde anschließend mit 400 mg N-Acetyl-DjL-MPGA versetzt; die entstandene Mischung wurde bei 30⁰C 16 Stunden geschüttelt, damit die Umsetzung ablaufen konnte. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch wieder über ein Papierfilter der genannten Art filtifert und die auf dem Papierfilter zurückbleibende feste Masse wurde mit 20 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschwässer wurden vereinigt und durch eine Kolonne (1,2 cm im Durchmesser und 15 cm hoch) geleitet, in der sich ale Ionenaustauscherharz das Handelsprodukt ~ ^—. _ (H ) befand. Zum Entwickeln wurde Wasser durch die Kolonne geleitet. Die Eluatfraktionen (Gesamtvolumen 160 ml), die gegenüber Ninhydrin positiv reagierten, wurden zusammen aufgefangen und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und anschließend der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese

Weise 158 ml L-MPGA als weißes Pulver. Reinheit 92 %; (a)£² 23° (c-1, 1η HCl); Ausbeute 88,6 %.

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Beispiel 3

Die Eluatfraktionen, die durch die in Beispiel 2 benutzte Kolonne mit Dowex 50 χ 2^(H⁺) hindurchgegangen und zusammen aufgefangen worden waren und deren Gesamtvolumen 250 ml betrug, wurden mit 1n Natriumhydroxidlösung neutralisiert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Zu dem getrockneten Konzentrat wurden 2 ml Essigsäure und 0,11 ml Essigsäureanhydrid gegeben, worauf die Mischung bei 100⁰C 18 Stunden zum Rückfluß erhitzt wurde. Das entstandene Gemisch wurde wiederum unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der feste Rückstand wurde der enzymatischen Deacylierung in derselben Weise wie in Beispiel 2 beschrieben unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 55 mg L-MPGA als weißes

^;D

Pulver, (α)²² 22° (c=1, InHCl).

Beispiel 4

Die folgenden Stämme wurden zur Züchtung benutzt, um die gewünschten mikrobiellen Acylasen in derselben Weise zu erzeugen, wie das in den vorausgegangenen Beispielen erläutert worden ist.

A: Pseudomonas maltophilia BN-233 (FERM-P 4487) B: Streptomyces violascens SF-2072 (FERM-P 4617) C: Streptomyces diastatochromogenes SF-2073

(FERM-P 4618)
D: Aspergillus sp. KS-101 (FERM-P 4614) E: Aspergillus sp. KS-102 (FERM-P 4615)

100 mg (Naßgewicht) der jeweils bei der Züchtung der vorstehend genannten Stämme gewonnenen gewaschenen Zellen wurden in 1 ml einer 0,05m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert. Die Suspension wurde jeweils mit

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5mg eines der in der folgenden Tabelle aufgeführten Substrates versetzt und die Mischung wurde in einer Schüttelvorrichtung bei 28° C 6 Stunden behandelt, da- \ mit die Umsetzung zuende ablaufen konnte. Das Reaktiionsgemisch wurde nachbehandelt wie in den voraufgegangenen Beispielen beschrieben. Die prozentuale Erzeugung von L-MPGA wurde spektrophotometrisch in den Filtraten gemessen, wobei Ninhydrin als Reagenz benutzt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

Prozentuale Erzeugung von L-MPGA

Substrat A B

N-Acetyl-L-MPGA 55,0 73,2 65,4 52,0 45,8

N-Propionyl-L-MPGA 52,2 70,5 55,0 38,0 46,2

N-Butyryl-L-MPGA 38,8 46,4 46,4 37,5 35,0

N-Benzoyl-L-MPGA 24,3 36,1 26,1 24,0 22,4

N-p-Chlorbenzoyl-

L-MPGA 21,6 33,8 24,5 - 18,6

Einzelheiten der Herstellung der gewaschenen Zellen: Stamm A: entsprechend der Methode von Beispiel 1

Stämme B und C: entsprechend der Methode von

Beispiel 2

Stämme D und E: Schüttelkultur auf einem sterilisierten Kulturmedium, welches 1 %

Pepton, 0,2 96 Hefeextrakt, 2 %

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Glucose und 0,001 % Kobaltchlorid (pH 7,0 vor dem Sterilisieren) enthält, bei 28⁰C über 68 Stunden. Die entstandene Kultur wurde filtriert; die abfiltrierten Zellen wurden gewaschen.

Beispiel 5

3 g der gewaschenen Zellen von Streptomyces violascens SF-2072 (FERM-P 4617), die gemäß Beispiel 2 erhalten worden sind, wurden in 100 ml einer 0,05m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert. Die entstandene Suspension wurde zur Zerkleinerung der Zellen in einer französischen Druckzelle bei einem Druck von 105 kg/cm*" behandelt und dann bei 1500 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die nach dem Zentrifugieren überstehende Flüssigkeit wurde als Acylase für den folgenden Versuch benutzt.

20 ml der Acylase wurden mit 120 mg N-Acetyl-D, L-MPGA vermischt. Die Mischung wurde 16 Stunden bei 30⁰C gehalten, damit die Umsetzung ablaufen konnte. Danach wurde das Reaktionsgemisch durch eine Kolonne (1,2 cm im Durchmesser und 10 cm hoch) geleitet, die als Ionenaustauscherharz das Handelsprodukt Dowex 50 χ 2^V^^/(H ) enthielt. Anschließend wurde eine ausreichende Menge Wasser als Entwicklungsmittel durch die Kolonne geleitet. Die gegenüber Ninhydrin positiv reagierenden Fraktionen, deren Gesamtvolumen 2A ml betrug, wurden aufgefangen und mit 100 mg Aktivkohle unter Rühren bei Raumtemperatur 30 Minuten behandelt und dann filtriert. Die abfiltrierte Kohle wurde zweimal mit Je 5 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat wurde mit den Waschwässern vereinigt und unter

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vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der verbleibende Rückstand wurde der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 48 mg L-MPGA als weißes Pulver. Reinheit 91 %; (a)|² 21,5° (c=1, 1n HCl); Ausbeute 88,7 %.

Beispiel 6

50 ml der gemäß Beispiel 5 gewonnenen Acylase wurden durch Zugabe von 1n HCl auf einen pH-Wert von 5»5 eingestellt. Anschließend wurde die Acylase mit 20 ml DEAE-Sephacel^ (OH-Typ), welches mit Wasser aufgequollen worden war, versetzt. Die Mischung wurde bei 5°C drei Stunden gerührt, so daß die Acylase vollständig an dem DEAE-Sephacel ^ adsorbiert wurde. Danach wurde die Mischung 20 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, wodurch das DEAE-Sephacel ®in gelförmigem Zustand abgeschieden wurde. Das Gel wurde zweimal mit je 50 ml 0,05m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gewaschen. Eine Lösung von 50 mg N-Acetyl-D,L-MPGA in 50 ml einer 0,05m Phosphat-Pufferlösung (ph 7,0) wurde zu 10 ml des wie beschrieben gewonnenen Gels gegeben und die Mischung wurde auf einem magnetischen Rührer 16 Stunden bei 30⁰C gerührt, damit die Reaktion zuende ablaufen konnte. Danach wurde das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um das Gel abzuscheiden, welches mit 5 ml derselben Pufferlösung gewaschen wurde. Die nach dem Zentrifugieren in der Zentrifuge überstehende Flüssigkeit wurde mit den Waschwässern vereinigt.

Dieselbe Umsetzung wie vorstehend beschrieben, wurde wiederholt, indem man 50 ml einer 0,1 % N-Acetyl-D,L-MPGA-Phosphat-Pufferlösung zu dem gewaschenen DEAE-Sephacel^V®-Gel gab. Die prozentuale Erzeugung von

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L-HPGA wurde mittels eines Spektrophotometers in der überstehenden Flüssigkeit unter Verwendung von Ninhydrin als Reagenz gemessen.

Die Umsetzung wurde dreimal, jeweils mit demselben DEAE-Sephacel^-Acylase-Gel durchgeführt; die prozentuale Bildung von L-MPGA bei diesen Versuchen war wie folgt:

1. Versuch = 86,1 %

2. Versuch = 85,0 % 3. Versuch - 81,2 %

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Claims

Patentansprüche

\Λ .) yverfahren zur optischen Trennung von D,L-2-Aminoipmethylphosphinobuttersäure, dadurch gekennzeichnet, daß man D,L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure in das N-Acylderivat überführt, letzteres im wässrigen Medium mit einer mikrobiellen Acylase, welche eine spezifische optische hydrolytische Aktivität aufweist und durch Züchtung eines Mikrobenstammes der Gattung Pseudomonas, Streptomyces oder Aspergillus gewonnen worden ist, umsetzt, so daß selektiv die Acylgruppe aus der N-Acyl-L-2-amino-4-methylphosphinobuttersäure eliminiert wird und ein Gemisch aus L-^-Amino-^methylphosphinobuttersäure und N-Acyl-D-2-amino-4-methylphosphinobuttersäure anfällt, aus dem die L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure abgetrennt wird.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikrobenstamm um einen Stamm der Art Pseudomonas maltophilia handelt.
3.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikrobenstamm die Bezeichnung Pseudomonas maltophilia BN-233 trägt und unter den Hinterlegungs-Nummern FERM-P 4487 und ATCC 31559 hinterlegt ist.
4.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikrobenstamm um einen Stamm der Art Streptomyces violascens handelt.
5.) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm die Bezeichnung Streptomyces violascens SF-2072 trägt und unter den Hinterlegungs-Nummern FERM-P 4617 und ATCC 31560 hinterlegt ist.

ORfGINAL INSPSCTED .

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20.9.79 . 2-
6.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikrobenstamm um einen Stamm der Art Streptomyces diastatochromogenes handelt.
7.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm die Bezeichnung Streptomyces diastatochromogenes SF-2073 trägt und unter den Hinterlegungs-Nummern FERM-P 4618 und ATCC 31561 hinterlegt ist.
8.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikrobenstamm um einen Stamm der Art Aspergillus niger handelt.
9.) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm die Bezeichnung Aspergillus sp. KS-101 trägt und unter den Hinterlegungs-Nummern FERM-P 4614 und ATCC 20567 hinterlegt ist.
10.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikrobenstamm um einen Stamm der Art Aspergillus flavus-oryzae handelt.
11.) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm die Bezeichnung Aspergillus sp. KS-102 trägt und unter den Hinterlegungs-Nummern FERM-P 4615 und ATCC 20568 hinterlegt ist.
12.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobielle Acylase in Form einer Kultur, die durch Züchtung eines der angegebenen Mikrobenstämme erhalten worden ist, oder in Form eines durch Nachbehandlung einer solchen Kultur gewonnenen Enzymmateriales verwendet wird.

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13.) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzymmaterial um aus der Kultur abgetrennte Zellen in gewaschener oder nicht gewaschener, getrockneter oder nicht getrockneter Form, zerkleinerte Zellen, deren an mikrobieller Acylase reichen Extrakten, die durch Extraktion der zerkleinerten Zellen und nachfolgende Reinigung gewonnen worden sind, oder um aus Zellen, zerkleinerten Zellen oder deren Extrakten hergestellte immobilisierte Acylasepräparate handelt.
14.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobielle Acylase durch Züchtung eines der angegebenen Mikrobenstämme unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium bei einer Temperatur von 25 bis 37°C gewonnen wird, wobei die Züchtung bis zur Erreichung des Maximums der Acylasewirkung fortgesetzt wird.
15.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nicht umgesetzte N-Acyl-D^-amino-A-methylphosphinobuttersäure aus dem Reaktionsgemisch zurückgewonnen und in an sich bekannter Weise racemisiert wird, so daß man eine weitere Menge an N-Acyl-D,L-2-amino-4-methyl-phosphinobuttersäure gewinnt, die erneut der Umsetzung mit der mikrobiellen Acylase unterworfen wird.

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