DE2610557A1 - Neues naphthacenderivat, seine herstellung und dieses enthaltende zusammensetzungen - Google Patents

Description

Neues Naphthacenderivat, seine Herstellung und dieses enthaltende Zusammensetzungen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Derivat des Naphthacene der Formel

O OH

CHOH-CH₃

_0H

HO .0' OH 6 - CH - CH₂ - CH - CH - CH - CH₃

NH₂ OH

seine Salze, seine. Herstellung und die dieses enthaltenden Zusammensetzungen .

Das Produkt der Formel I, welches als j52 999 RP bezeichnet wird, besitzt ein besonderes Interesse infolge seiner antitumoralen Aktivität.

Das Produkt 32 999 RP ist eine basische Verbindung von dunkelroter Farbe, welche mit Säuren Salze bildet.

Das Hydrochlorid des j52 999 RP ist im Verhältnis von etwa 100 mg/ cm^ in Methanol, Pyridin, Dimethylformamid und Wasser, im Verhältnis von etwa 10 mg/cnr in mit Wasser gesättigtem Butanol

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von 20 C und im Verhältnis von etwa 5 mg/enr in Äthanol löslich sowie in Aceton, Chloroform, Methylenchlorid, Äthylacetat, Benzol, Methylisobutylketon, Dioxan und Hexan praktisch unlöslich (weniger als 0,1 mg/cnr ).

Das Hydrochlorid des 32 999 RP enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Chlor. Seine Elementarzusammensetzung beträgt etwa:

C £ = 56,6 H % = 5,7 0 # = 29,41 N # = 2,39 Cl % = 6,0

Es ist im übrigen durch folgende physiko-chemische Eigenschaften gekennzeichnet:

Aussehen: mikrokristallines Pulver, rot-orange.

Schmelzpunkt: etwa 200⁰C (unter Zersetzung).

Drehvermögen: (bestimmt in 0,09 #-iger Lösung in Äthanol mit

0,1 % In Salzsäure)

[06] 2° = + 208° t 32°.

Ultraviolettspektrum: Bestimmung aus einer Lösung von 10,65 mg/1

in Äthanol mit 0,1 % In Salzsäure.

Absorptionsmaximum bei:	E ** E 1 cm
233 nm	620
254 nm	495
292 nm	l40

Dieses Spektrum ist in der beigefügten Figur 1 angegeben.

Sichtbares Spektrum: Bestimmung ausgehend von einer Lösung von

10,65 mg/1 in Äthanol mit 0,1 # In-SaIzsäure.

Absprptionsmaximum bei:	F 1 £ E 1 cm
493 nm	272
5I2 nm	I89
527 nm	I90

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Dieses Spektrum ist in der beigefügten Figur 2 wiedergegeben. Infrarotspektrum; (Bestimmung an einem KBr-Preßling).

Zeichnung) und andererseits die Wellenzahlen in cm" (am unteren Rand der Zeichnung) und als Ordinaten die optischen Dichten angegeben sind.

In der folgenden Tabelle I sind die hauptsächlichsten Infrarot-Absorptionsbanden für dieses Proc⁵ tt, ausgedrückt in Wellenzahlen (cm" ), angegeben:

Tabelle I

5410 F 2680 Sch I580 Sch 1195 F 9I5 Sch 725 m 53Of

3250 Sch 2600 Sch I5IO Sch II65 F 885 m 708 m 485 m

5220 Sch I98O tf 1460 F III5 F 875 m 695 Sch 475 Sch

5050 Sch 1930 Sch 1440 F IO62 F 845 Sch 665 Sch 465 f

2970 F I900 tf 1405 F 1050 Sch 840 Sch 640 Sch 450 Sch

2930 F I800 tf I37O Sch IO3O Sch 820 F 625 Sch 438 m

29OO Sch 1735 Sch I3I5 Sch lOlO F 810 Sch 600 m 415 tf

286O Sch I690 Sch I285 F 985 F 780 m 58Ο f 390 m

282O Sch I635 Sch 1255 m 96Ο Sch 762 m 565 f 320 f

I600 tF 1235 F 930 m 750 m 540 f

tF = sehr stark f = schwach F = stark tf = sehr schwach

m = mittel Sch *= Schulter

Das 32 999 RP kann durch Dünnschicht-Chromatographie an Siliciumdioxidgel unter Verwendung eines Gemisches aus Methylenchlorid/ Ameisensäure/Methanol (80-17-3 in Volumina) bei einer Temperatur von 24°C dtfaxäkterisiert werden. In diesem System hat das 32 999 RP-Hydrochlorid einen Rf-Wert in der Nähe von 0,2.

Durch saure Hydrolyse von 32.999 RP oder eines seiner Salze erhält man ein Produkt der Formel

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(ID

¹ H HO O OH OH

das das Aglycon von 32.999 RP ist.

Das Aglycon von 32.999 RP ist im Verhältnis von 20 mg/cnr in Pyridin, von 5 mg/cnr in Methanol, Dioxan, Chloroform und Methylenchlorid und von wenigstens 0,1 mg/cnr in Aceton, Äthylacetat, Hexan und Wasser löslich.

Dieses Produkt besitzt im übrigen die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:

Aussehen: mikrokristallines rot-orange-farbenes Pulver. Schmelzpunkt: etwa 185⁰C (unter Zers.). Elementaranalyse: Sie beträgt etwa:

C £ = 61,57 H £ = 5,31 0 % = 30,16 Drehvermögen: (bestimmt in 0,1 #-iger Lösung in Dioxan)

[o6]2° = + 249° + 32°.

Ultraviolettspektrum: Bestimmung ausgehend von Lösungen mit 50 und 5 mg/1 in Äthanol mit 0,1 % In Salzsäure

Absorptionsmaximum bei:	El cm
234 nm	770
254 nm	640
293 nm	190

Dieses Spektrum wird durch Figur k dargestellt, worin die Kurven I und II den Lösungen mit""50 bzw. 5 mg/1 entsprechen.

Sichtbares Spektrum: bestimmt ausgehend von einer Lösung mit

10 mg/1 in Äthanol mit 0,1 % In Salzsäure

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Absorptionsmaximum bei:	E \* 1 cm
493 nm	370
515 nm	255
528 nm	270

Dieses Spektrum ist in Figur 5 wiedergegeben. Infrarotspektrum: (Bestimmung an KBr-Preßlingen).

Dieses Spektrum wird in Figur 6 wiedergegeben, worin auf den Abszissen einerseits die Wellenlängen in Mikron (oberer Rand) und
andererseits die Wellenzahlen in cm" (unterer Rand) und als Ordinaten die optischen Dichten aufgetragen sind.

In der folgenden Tabelle II sind die hauptsächlichsten Infrarot-Abs orpt ions band en für dieses Produkt, ausgedrückt in Wellenzahlen

(cm "

) wiedergegeben.

268O

Tabelle II

1412

F

1095

f

9IO

m

740

= Sc

m

53D

tf

I98O

Sch

1370

F

1070

Sch

885

m

710

m

505

Sch

3500

Sch

I705

tf

I3I5

Sch

IO62

F

875

m

700

Sch

485

m

3420

F

1640

f

I285

tF

I050

Sch

865

f

680

tf

465

m

3360

Sch

I600

Sch

1255

tF

IO3O

m

840

m ·

665

tf

450

m

3080

Sch

I58O

tF

1240

Sch

1020

m

815

F

625

Sch

435

m

2975

m

I540

Sch

II95

F

1005

m

805

Sch

595

f

385

tf

2925

m

1458

Sch

1165

F

.975

m

785

Sch

585

f

360

tf

29IO

Sch

1448

F

II30

m

950

m

775

Sch

570

f

320

tf

2890

Sch

F

= sehr stark

F =

stark

m =

ϊ mittel

2860

Sch

= schwach

tf =

sehr

schwach

Sch

•hu It

er.

tF

f

Das Aglycon des 32.999 RP kann durch Dünnschicht-Chromatographie an Siliciumdixodgel unter Verwendung eines Gemisches aus Methylenchlorid/Ameisensäure/Methanol (80-I7-3 in Volumina) als Entwicklungslösungsmittel bei einer Temperatur von 24°C charakterisiert werden. In diesem System hat das Aglycon einen Rf-Wert von 0,7.

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Erfindungsgemäß kann die "\ferbindung 32.999 RP nach einem der folgenden Verfahren erhalten werden:

1.) Durch mikrobiologische Reduktion des als Carminomycin bezeichneten Antibiotikums, das der Formel

(III)

if¹ -Ι

ο OH 0 - CH - CH₀- CH - CH - CH - CH_

2 ι , 3

NH OH

entspricht.

Das Carminomycin und seine Herstellung durch Züchtung von Actino-

madura carminata..Sp. nov. ist in der unter der Nummer 2 235 700 ι iranzoaisonen_t

veröffentlichtenV Patentanmeldung 74.00349 beschrieben. Die Struktur des Carminomycins wurde von M. G. Brazhnikova u.Mitarb. J. of Antibiotics, XXVII, No. 4, 254-259 (1974) beschrieben.

Die mikrobiologische Reduktion des Carminomycins erfolgt im allgemeinen in wässrigem Medium, entweder mittels Mikroorganismenkulturen, welche ein geeignetes Entwicklungsstadium erreicht haben, oder mittels isolierter Zellen aus diesen Kulturen oder aus enzymatischen Extrakten, welche aus diesen Mikroorganismen erhalten wurden.

Die Mikroorganismen, welche gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, können zur Kategorie der Streptomyceten oder der Bakterien gehören. Unter den Mikroorganismen, welche sich besonders gut eignen, können die folgenden genannt werden: Streptomjüces lavendulae (ATCC 8664), Streptomyces roseochromogenes (ATCC 13.400), Corynebacterium simplex (ATCC 6946) oder Baf-i-erium cyclooxydans (ATCC 12.673). Die besten Ergebnisse werden aus Corynebacterium simplex (ATCC 6946) erhalten.

Die Mikroorganismenkultur, welche das enzymatische System erzeugt, das das Carminomycin zu der Verbindung 32.999 KP zu reduzieren vermag, kann durch jede geeignete aerobe Oberflächen-

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oder Submerskultur bewirkt werden, jedoch ist die letztere aus BequemlichkeitsgrUnden vorzuziehen. Man verwendet zu diesem Zweck die Impfungs- und Fermentationstechniken sowie die verschiedenen Apparatetypen, welche in der Industrie der Fermentationen üblich sind.

Das Züchtungsmedium des Mikroorganismus soll im wesentlichen assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, mineralische Elemente und Wachstumsfaktoren enthalten, welche alle in Form von wohldefinierten Produkten oder durch komplexe Mischungen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, eingebracht werden.

Als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff kann man Kohlehydrate, wie Glucose oder andere kohlenstoffhaltige Substanzen wie Zuckeralkohole oder gewisse organische Säuren verwenden. Bestimmte tierische oder pflanzliche öle wie Specköl oder Sojaöl können vorteilhaft diese Kohlenstoffquellen ersetzen oder ihnen beigefügt werden. Die Quellen für assimilierbaren Stickstoff sind außerordentlich verschieden. Es können sehr einfache chemische . Substanzen sein wie mineralische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff oder bestimmte Aminosäuren. Sie können auch als komplexe Substanzen, die hauptsächlich Stickstoff in Proteinform enthalten, eingebracht werden: Kasein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Sojamehl, Arachismehl oder Fischmehl, Pepton, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Distiller's solubles, Maisquellwasser.

Unter den zugesetzten mineralischen Elementen können gewisse einen Puffer- oder neutralisierenden Effekt haben, wie die Alkali- oder Erdalkaliphosphate. Andere tragen zum ionischen Gleichgewicht bei, welches^zur Entwicklung des Mikroorganismus notwendig ist,wie"die Chloride und Sulfate der Alkali- oder Erdalkalimetalle .

Die Wachstumsfaktoren sind Produkte mit Vitamin-Natur, wie Riboflavin, Folsäure oder Pantothensäure.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums zu Beginn der Züchtung soll" zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5, liegen.

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Die optimale Temperatur für die Züchtung des Mikroorganismus ist 29 - 51°C, jedoch kann eine zufriedenstellende Entwicklung auch bei Temperaturen zwischen 26 und 37°C erhalten werden.

Die Belüftung des Kulturmediums kann zwischen weiten Grenzen variieren. Es wurde jedoch festgestellt, daß Belüftungen von 0,3 - 3 1 Luft je Liter Brühe und je Minute besonders gut geeignet sind.

Darüber hinaus ist es, um eine Kultur mit einer guten reduzierenden Aktivität zu erhalten, vorzuziehen, das Züchtungsmedium zu bewegen, beispielsweise mittels eines Rührers, dessen Rotationsgeschwindigkeit zwischen 100 und 250 Umdr./Min. variieren kann.

Im allgemeinen erreicht die Züchtung des Mikroorganismus nach einer Periode von 24 bis 48 Stunden einen befriedigenden Entwicklungsgrad.

Die reduzierende Aktivität hängt im wesentlichen von der Menge der im Verlaufe der Züchtung gebildeten Zellen ab. Bei isolierten Zellen, beispielsweise nach Zentrifugieren des Kulturmediums, steht die aus dem Carminomycin gebildete Menge an 32.999 RP in direkter Beziehung zur Konzentration des Reaktionsmediums an Zellen; die an Zellen reichen Medien besitzen ein höheres Reduktionsvermögen .

Die Reduktion des Carminomycins zu 32.999 RP wird bewirkt, indem eine wässrige Carminomycin-Lösung oder eines seiner Salze mit der Kultur des Mikroorganismus, der einen befriedigenden Entwicklungsgrad und ein ausreichendes Reduktionsvermögen erreicht hat, oder mit aus diesen Kulturen isolierten Zellen oder mit enzymatischen Extrakten, welche aus diesen Zellen erhalten wurden, in Kontakt gebracht wird.

Die enzymatischen Extrakte der Zellen können nach Zerstörung der Zellwände entweder durch chemische oder biochemische oder durch physikalische Methoden erhalten werden. Vorzugsweise wird die Zerstörung der Zellwände, ausgehend von der Kultur des Mikroorganismus oder von den aus dieser Kultur isolierten Zellen, in Suspension in wässrigem Milieu bewirkt, indem sie entweder mit einem

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Enzym, das die Zellwand zu lysieren vermag, wie Lysocym, behandelt werden, oder indem sie der Einwirkung von Ultraschall unterworfen werden. Die enzymatischen Extrakte sind in Lösung in der überstehenden Flüssigkeit, die nach dem Zentrifugieren des Milieus erhalten wird. Im allgemeinen wird die Lösung der enzymatischen Extrakte ohne weitere Nachbehandlung in der Reduktionsphase verwendet .

Die Reduktion wird im allgemeinen unter Rühren bei eine r Temperatur zwischen 23 und 37°C, vorzugsweise zwischen 26 und 30⁰C, bewirkt, und sie ist nach 1 bis 4 Tagen Kontakt vollständig.

Die Reduktion kann bei einem pH-Wert zwischen 5 und 10 stattfinden, jedoch ist es vorzuziehen, bei einem pH-Wert zwischen 7 und zu arbeiten.

Das Reaktionsmedium kann gerührt werden, beispielsweise durch einen Rührer, dessen Rotationsgeschwindigkeit zwischen 100 und 250 Umdr./Min. variieren kann.

Die Reduktion kann entweder an dem Carminomycin oder einem seiner reinen Salze, oder an einem unreinen Produkt oder auch an dem sauren Filtrat einer Kultur, welche das Carminomycin produziert hat, durchgeführt werden. Um gute Ausbeuten zu erhalten, soll die Konzentration des Carminomycins in dem Reduktionsmedium vorteilhaft zwischen 0,1 und 1 g/l zu Beginn der Reduktion betragen.

2.) Durch aerobe Kultur von Mikroorganismen, die zum Genus Streptomycetes gehören und unter Streptomyces ooeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046), Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723 (NRRL 3045), Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098) und Streptomyces bifurcus DS 23 219 (NRRL 3593) ausgewählt sind, in für die Streptomyces geeigneten Nährmedien in Gegenwart von Hilfsmitteln, ausgewählt aus Amethopterin, SuIfanilamid, SuIfathiazol, Sulfapyridazin, Barbital, Phenobarbital, Butobarbital und Penthiobarbital.

Die Menge an im Verlauf der Züchtung gebildeten Antibiotikum 32.999 RP kann variieren, je nach der Zusammensetzung des Züchtungsmediums, der Menge des zugefügten Hilfsmittels und dem

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Zeitpunkt seiner Zugabe, wie dies weiter unten gezeigt wird.

Die Mikroorganismen Streptomyces ooeruleorubidus DS _8899 (NRRL 5046) und Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723 (NRRL 3045) sind bereits in der französischen Patentschrift 1 380 810 beschrieben, der Streptomyces bifurcus DS 23.219 (NRRL 3539) ist in dem französischen Patent 1 593 235 beschrieben.

Der Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 ist ein neuer Stamm, der aus einer Erdprobe isoliert wurde. Eine Probe wurde im Northern Regional Research Laboratory des U.S. Department of Agriculture in Peoria, 111. (U.S.A.) hinterlegt, wo er unter der Nummer NRRL 8098 registriert ist. Proben dieses Mikroorganismus können unter Bezugnahme auf vorliegende Erfindung von dort erhalten werden.

Die Isolierung dieses Stammes erfolgte nach der allgemeinen Methode, die darin besteht, daß eine kleine Erdprobe in Suspension in sterilem destilliertem Wasser gebracht wird, die Suspension bei-verschiedenen Konzentrationen verdünnt wird und ein kleines Volumen jeder Verdünnung auf die Oberfläche von Petri-Schalen ausgebreitet wird, die ein Gelose-Nährmedium enthalten. Nach einigen Tagen Inkubieren bei 26⁰C, was die Entwicklung der Mikroorganismen erlaubt, werden die Kolonien, welche man zur Weiterverfolgung des Studiums isolieren will, entnommen und auf Schräg-Nährgelose-PJatten pikiert, um daraus reichliche Kulturen zu erhalten.

Der Streptomyces DS 7126 ähnelt der Art Streptomyces coeruleorubidus, das von G. F. Gauze und Mitart). (Problems in the classification of Antagonistic Actinomycetes - The American Institute of Biological Sciences, Washington, 1959, S. 100) beschrieben ist, von dem er die hauptsächlichen. Merkmale besitzt. Tatsächlich weist er ein blaues bis blaugrünes Sporen-Luftmycel auf; auf mineralischem Medium I nach Gauze entwickelt er ein vegetatives Mycel, das eine rötliche Färbung annimmt, und bildet ein lösliches Pigment von .gleicher Farbe, das in die Gelose diffundiert; alle diese Eigenschaften sind für die Spezies Streptomyces coeruleorubidus charakteristisch. Infolgedessen hat man diesen Mikroorganismus Streptomyces coeruleorubidus Stamm DS 7126 genannt.

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Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 bildet kurze sphärische bis bis ovale Sporen, mit Abmessungen 0,7 bis O,9ju/O,8 bis 1,1 μ. Er entwickelt einfache Sporophoren oder in Trauben; seine Sporenketten,die ziemlich lang sind und bis zu mehreren Zehnern Sporen umfassen können, rollen sich auf unter Bildung von mehr oder weniger offenen Spiralen, die meistens 2 bis 5 oder 6 Spiralenwindungen aufweisen. Durch seine Sporulationsart fällt Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 in die Section Spira der Klassifikation nach Pridham.

Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 entwickelt sich gut bei 25°C, etwas weniger gut bei J57°C und gar nicht bei 50⁰C. In seinen bei 26⁰C durchgeführten Züchtungen zeigt es die folgenden biochemischen Eigenschaften:

Melanin-Produktion: . positiv Produktion von HpS: positiv

Tyrosinase: positiv

Verflüssigung von Gelatine: positiv, langsam Verwertung von Cellulose: positiv

Produktion von Nitriten aus Nitraten: negativ auf Nitrat-Nährbouillon, positiv auf synthetischen Medien

Hydrolyse von-. Stärke:- positiv^ mäßig

Züchtung auf entrahmter Milch weder Koagulation noch

Peptonisation.

In der folgenden Tabelle sind die Züchtungseigenschaften zusammengestellt, welche Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 auf einer bestimmten Zahl von Medien, die üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Streptomyces-Stämmen verwendet werden^ ;die Kulturen auf Gelose-Medien wurden auf Schräg-Gelosen durchgeführt. Die Eigenschaften sind solche von auf einem guten Entwicklungsstadium angekommenen Kulturen, d.h. etwa 3 Wochen bei 26⁰C, wenn nichts anderes angegeben ist. Die Literaturreferate für die verwendeten Züchtungsmedien sind die folgenden:

Ref. A - "Medium 1 with a mineral source of nitrogen" G.P. Gauze und Mitarb. - Problems in the classification of Antagonistic Actinomycetes - S. Γ5 - The American Institute

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of Biological Sciences, Washington 6, D.C, 1959*

Ref. B - The Actinomycetes - S.A. Waksman, Chronica Botanica

Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950, S.""194 - Nr. 10,

Ref. C - "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. Pridham und Mitarb. - Antibotics Annual, 1956-1957 - S. 951,

Ref. D - The Actinomycetes - S.A. Waksman, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass. U.S.A., 1950 - S. 193 - Nr. 3,

Ref. E - The Actinomycetes - S.A. Waksman, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950 - S. 193 - Nr. 1,

Ref. F - entspricht Ref. E - wo } ^ der Saccharose ersetzt wird durch 1,5 % Glucose,

Ref. G - The Actinomycetes - S.A. Wafcsraan, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950 - S. 195 - Nr. 18,

Ref. H - entspricht Ref. G - wo 3 % der Saccharose ersetzt wird durch 1,5 % Glucose,

Ref. I - entspricht Ref. G - wo die Saccharose weggelassen und durch kleine Streifen von Filterpapier ersetzt ist, welche teilweise in die Flüssigkeit tauchen,

Ref. J - Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria ■ Society of.·,American-Bacteriologists - Geneva, ΪΓ.Υ. IIcq - 18, Ref. K - "Bennett's Agar" - S.A. Waksman - The Actinomycetes, Bd. 2, S. 331 - Nr. 30 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, I96I,

Ref. L - "Melanin formation medium" - S.A. Waksman - The Actinomycetes, Bd. 2, S. 333 - Nr. 42 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, Ι96Ί,

Ref. M - The Actinomycetes-« S.A. Waksman, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., I950 - S. 197 - Nr. 27,

Ref. N - "Plain Gelatin" - hergestellt nach den Angaben des "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" Society of American Bacteriologists, Geneva, N.T. H^q - 18,

Ref. 0 - entrahmte Milch als handelsübliches Pulver, zubereitet nach den Angaben des Herstellers,

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Ref. P - Medium für die Herstellung von HgS gemäß : H.D. Tresner und F. Danga - Journal of Bacteriology, 76, 239 - 2^4, 1958.

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Züchtungs-	Grad der	•	vegetatives Mycel (v.M.)	Luftorgane	lösliches	Beobachtungen u.
medium	Entwick		der	(umfassend das	Pigment	biochemische
	lung		Unterseite der Kultur	gesamte Luftmycel		Eigenschaften
				u.d.Sporenbildung!
Gelose mit	ziemlich		v.M. rötlich	hellblau-grünlich	karmin
einer anor	gut				rot-
ganischen					bräunlich
Stickstoff
quelle nach
Gauze
(Ref. A)		ziemlich
Gelose-	ziemlich	gut	v.M. rötlich	weißlich mit	karmin	Hydrolyse der
Stärke-Ni-	gut			Blaus ti e.h., sehr	rot	Stärke: positiv,
trat (Ref. B)				mäßig entwickelt		mäßig
Gelose-	ziemlich	Ziemlich	Kehrseite rot-orange-	helles blau-	orange-	Hydrolyse der
Stärke -	gut	gut	schwach bräunlich	grünlich	schwach	Stärke: positiv,
Mineral				bräunlich	mäßig
salze nach					kurze sphärische
Pridham,					bis ovale Sporen,
(Ref. C)				Abmessungen 0,7-
				0,9 /λ/0,8-1,1 }*<-
				Sporenketten in
				mehr oder weniger
				geöffneten Spi
				ralen mit j 2 Ms" 5
				oder 6 Drehungen
Gelose-	Unterseite rot-orange	weißlich mit	rosa
Glycerin-		Blaustich, sehr	orange
Asparagin		mäßig entwickelt
(Ref. D)
synthet.	v.M. rosa-gelbich bis	weißlich, sehi? schwach	karmin rot
GeIose nach	rot-bräunlich.
Czapek mit	Rückseite rötlich	"Il 1>W J-L< JtVC? JL Ο
Saccharose
(Ref. E}

CD -J 4Π

	Grad der Entwick lung	vegetatives Mycel (v.M.) oder Unterseite der Kultur	Luftorgane(um fassend das ge.--1 samte Luftmycel u.d.Sporenbildung)	lösliches Pigment	Beobachtungen u. biochemische Eigenschaften
.Züchtungs medium	ziemlich gut	v.M. rosa-gelblich bis rot-bräunlich. Kehrseite rosa-rötlich	weißlich. Spuren	karmin rot- bräunlich
synthet. Gelose nach Czapek mit Glucose (Ref. P) ■	sehr mäßig	schwacher rosa-bräun- licher Schleier	keine	keines	Erzeugung von Nitriten: positiv zu Beginn der Züchtungen
Bouillon nach Czapek mit Saccharose (Ref. G)	sehr mäßig	schwacher grau-rosa bräunlicher Schleier	keine	keines	Erzeugung von Nitriten: positiv zu Beginn der Züchtungen
Bouillon nach Czapek mit Glucose (Ref. H)	sehr mäßig	weißlicher Schleier	keine	keines	Verwertung der Cellulose: positiv, mäßig
Bouillon nach Czapek m.Cellulose ^ Ref. I)	mäßig	heller braun-rötlicher Ring	keine	braun	Erzeugung von Nitriten: negativ
Nährbouillcn mit Nitrat (Ref. J)	gut	braun-rötlich	hellblau-grünlich bis blau-gräulich	braun rötlich
Gelose nach Bennett (Ref. K)

Zuchtungs-	Grad der	vegetatives Mycel (v.M.)	Luftorgane	lösliches	Beobachtungen u.
medium	Entwick	oder	(umfassend das	Pigment	biochemische
	lung	Unterseite der Kultur	gesamte Luftmycel		Eigenschaften
			u.d.Sporenbildung)
Gelose-Tyro ·	mäßig	braun-schwärzlich	gräulich - wenig	braun-	WeIa nin-Produk
sin-Hefeex-			entwickelt	schwärzlich	tion: positiv
trakt zur					(Ablesungen nach
Bildung von					den Angaben des
Melanin					Autors durchge
(Ref. L)					führt) j
Kultur auf	gut	dunkelbraun bis	weiß-gräulich bis	dunkelbraun
Kartoffeln		orange-braun-rötlich	weiß-rosa und	orange-röt
(Ref. M)			hellblau-gräulich,	lich bis
			ziemlich wenig	braun
			entwickelt	schwärzlich
reine Gela	« ziemlich	braun-schwärzlich	keine	braun-	Verflüssigung
tine von 12 % (Ref. N)	gut			schwärzlich	positiv, langsam
entrahmte
Milch	gut	orange-bräunlicher	keine	keines oder	keine Koagula
(Ref. 0)		bis braun-rötlicher		schwach-	tion und keine
		Ring		gräulich	Peptonisation,
					sehr leichte
					Säuerung des pH,
					die von 6,2 -
					6,3 bis 6,0-6,1
Gelose nach					in 1 Monat geht
Tresner und Dänga	mäßig	grau-schwärzlich	keine	schwarz	Produktion von
(Ref. P)					HoS: positiv (Ablesungen
					durchgeführt
					nach den Anga
				ben d.Autors)

Der Streptomyces DS 7126 gehört infolge der Färbung von blau bis blaugrünlich seines Sporen-Luftmycels zu der Serie "Coerulescens", die von Gauze und Mitarb, beschrieben ist. Unter den in dieser Serie beschriebenen Stämmen zeigt es ein vegetatives Myeel, das sich rot färbt, wie S. coeruleorubidus und S. bicolor. Jedoch unterscheidet e** sich von S. bicolor durch die Tatsache, daß er im Gegensatz zu diesem Zellulose verwertet, er koaguliert nicht die Milch und ganz besonders vermag er ein rotes lösliches Pigment zu bilden, das in die Gelose auf synthetischem Medium diffundiert, eine Eigenschaft, welche er nur mit der Spezies S. coeruleorubidus teilt. Diese letztgenannte Eigenschaft, verbunden mit der Gesamtheit der übrigen Eigenschaften, zeigt, daß er der Spezies S. coeruleorubidus nahekommt oder eventuell zugeordnet ist.

Die Fähigkeit von Streptomyces coeruleorubidus DS 7126, verschiedene Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen für seine Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 56, 107 - 114, 1948) bestimmt; der Grad der Entwicklung wurde auf dem Basismedium, das von den Autoren angegeben ist, beobachtet, wobei entweder die Glucose durch verschiedene untersuchte Kohlenstoffquellen oder (NHh)₂SO^ durch verschiedene untersuchte Stickstoffquellen ersetzt wurde.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

6 0 9 8 3 9 / 1 Π 7 5

untersuchte Kohlenstoff- -quellen	Verwertung	untersuchte Stickstoff quellen	Verwertung
D-Xylose	positiv	NaNO3	positiv
L-Arabinose	positiv	' NaNO2	positiv
L-Rhamnose	positiv	(NH4)SO4	positiv
D-Glucose	positiv	(NH4^HPO4	positiv
D-Galactose	positiv	Harnstoff	positiv
D-Fructose	positiv	L-Asparagin	positiv
D-Mannose	positiv	Glycokoll	positiv
Lactose	positiv	Sarcosin	negativ
Maltose	positiv	DL-Alanin	positiv
Saccharose	positiv	DL-Valin	positiv
Trehalose	positiv	L-Lysin	positiv
Cellobiose	positiv	DL-Me thionin	positiv, langsam
Dextrin	positiv	Taurin	negativ
Inulin	negativ	L-Tyrosin	positiv
Stärke	positiv
Glycerin	positiv
Erythrit	negativ
Dulcit	negativ
D-Mannit	positiv
D-Sorbit	positiv
Inosit	positiv
Salicin	positiv

Das Verfahren zur Herstellung von 32.999 RP besteht im wesentli chen darin, die oben erwähnten Streptomyces-Stämme auf einem Milieu und unter geeigneten Bedingungen in Gegenwart einer ausreichenden Menge Hilfsmittel zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Produkt abzutrennen.

Die Züchtung der Mikroorganismen kann nach Jeder aeroben Oberflächen- oder Submersen-Züchtungsmethode erfolgen, jedoch ist letztere aus Gründen der Bequemlichkeit vorzuziehen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Typen von Apparaturen,

welche in der Industrie der Fermentationen laufend verwendet werden,

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Man kann insbesondere folgende Reihenfolge für die Durchführung der Arbeitsgänge anwenden:

Erzeugerstämme - Vorrat (Stock) Züchtung auf Gelose

Impfkultur in bewegten Kolben Impfkultur im Fermentationsgefäß Erzeugungskultur im Fermentationsgefäß

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff, mineralische Elemente, insbesondere Chloride oder Carbonate,und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von wohldefinierten Produkten oder komplexen Mischungen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedener Herkunft antrifft, eingebracht werden.

Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff kann man Kohlehydrate, wie Glucose, Lactose, Dextrine, Stärke oder andere kohlenstoffhaltige Substanzen, ,wie Zuckeralkohole (Glycerin) oder gewisse organische Säuren: Milchsäure, Zitronensäure verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie Specköl oder Sojaöl, können mit Vorteil diese verschiedenen Kohlenstoffquellen ersetzen oder ihnen zugefügt werden.

Die geeigneten Quellen für assimilierbaren Stickstoff sind außerordentlich verschieden. Es können sehr einfache chemische Substanzen sein, wie anorganische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff oder gewisse Aminosäuren. Es können auch komplexe Sub-HLanzen eingebracht werden, welche hauptsächlich den Stickstoff in protidischer Form enthalten, z.B. Kasein, Lactalbumin, Gluten oder deren Hydrolysate, Sojamehl, Arachis-Mehl, Fischmehl, Fleischextrakte, Hefeextrakte, distiller's solubles und Maisquellwasser.

Unter den zugefügten mineralischen Elementen können einige einen

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Puffer- oder Neutralisationseffekt haben, wie die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder die Calcium- und Magnesiumcarbonate. Andere tragen zur Einstellung des ionischen Gleichgewichts bei, welches zur Entwicklung der Mikroorganismen und zur Ausbildung von 32.999 RP notwendig ist, wie·die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse Stoffe speziell als Aktivatoren der metabolischen Reaktionen der Mikroorganismen, das sind Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer-, Mangansalze .

Die Wachstumsfaktoren sind im allgemeinen Produkte mit Vitamin-Natur, wie Thiamin, Riboflavin, Pantothensäure.

Die Hilfsmittel können im Verlaufe der verschiedenen Stadien der Züchtung zugegeben werden: Entweder bei der Impfkultur in bewegten Flaschen, bei der Produktionskultur im Fermentationsgefäß.

Die besten Resultate werden jedoch erhalten, wenn diese Hilfsmittel entweder zu Beginn der Produktionsphase oder im Verlauf derselben zugegeben werden.

Unter den Hilfsmitteln, welche besonders geeignet sind, kann man Sulfanilamid, Sulfathiazol und Sulfapyridazin nennen.

Die Konzentration des Hilfsmittels im Fermentatlcnsmedium kann in weiten Grenzen je nach der Zusammensetzung des Kulturmediums und der Natur des Hilfsmittels variieren. Im allgemeinen sind Konzentrationen zwischen 0,01 und 1 g/l Fermentationsbrühe besonders zweckmäßig.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums zu Beginn der Züchtung soll zwischen 5*6 und 7,4 und vorzugsweise zwischen 5*8 und 7,2 liegen. Die optimale Temperatur, zur Fermentation liegt zwischen 25 und 50°C, jedoch kann auch eine zufriedenstellende Produktion für Temperaturen zwischen 23 und 33°C erhalten werden. Die Belüftung der Fermentation kann zwischen weiten Grenzen variieren, es wurde jedoch festgestellt,daß Belüftungen von 0,3 bis 3 1 Luft je Liter Brühe und je Minute besonders gut entsprechen. Die maximale Ausbeute an 32.999 RP wird nach 2 bis 10 Tagen Züchtung erhalten, diese Zeit hängt jedoch auch im wesentlichen von dem verwendeten Nährmedium ab.

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Aus den obigen Ausführungen wird ersichtlich, daß die allgemeinen Bedingungen der Züchtung des Mikroorganismus in Gegenwart der Hilfsmittel in weitem Maße variieren können und für jeden speziellen Zweck angepaßt werden können.

3.) Aus dem Züchtungsmedium eines neuen Mikroorganismus,der weiter unten vollständiger identifiziert wird und der zum Genus Streptomyces gehört und als Streptomyces atroviolaceus DS 8938 bezeichnet wird. Eine Probe dieses Stammes wurde beim United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, unter der Nummer NRRL 8148 hinterlegt. Proben dieses Mikroorganismus können dort unter Bezugnahme auf vorliegende Patentschrift bezogen werden.

Dieser Organismus, der aus einer Erdprobe isoliert wurde, weist Eigenschaften auf, wodurch er einer bereits bekannten Art nicht zugeordnet werden konnte. Er wird daher als neue Art angesehen.

Seine Isolierung wurde bewirkt, indem die allgemeine Methode befolgt wurde, welche darin besteht, eine kleine Erdprobe in Suspension in destilliertem sterilem Wasser zu bringen, die Suspension auf verschiedene Konzentrationen zu verdünnen und ein kleines Volumen jeder Verdünnung auf die Oberfläche von Petri-Schalen, welche ein Gelose-Nährmedium enthalten, auszubreiten. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 26⁰C, welche die Entwicklung der Mikroorganismen erlaubt, werden die Kolonien, welche man isolieren» möchte, um das Studium weiter zu verfolgen, entnommen und auf Nährgelosen weiter gezüchtet, damit man dann reichlichere Kulturen erhält.

Streptomyces .atroviolaceus DS 8938 bildet ovale Sporen mit Abmessungen von 0,4 bis 0,6 ü/0,6 bis 0,9 u. Er entwickelt nichtverzweigte Sporophoren, welche auf dem Luftmycel entstehen. Seine Sporenketten sind lang,mit im allgemeinen mehreren Zehnern von Sporen und rollen* sich zusammen, wobei mehrere spiralische, im allgemeinen geschlossene Windungen entstehen. Nach der Art der Sporenbildung wird dieser Stamm in die Sektion Spira der Klassifikation nach Pridham eingeordnet.

Streptomyces atroviolaceus DS 8938 entwickelt sich gut bei 25°C

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und 3O°C, weniger gut bei 37°C und gar nicht bei 5O°C. Er bildet auf seinen Kulturmedien fast immer ein vegetatives Myeel, das zuerst braun bis braun-rot ist und dann rasch einen dunklen Ton annimmt, der von sehr dunkelbraun bis braunviolett oder braunschwärzlich reicht. Die Sporenbildung entwickelt sich nur auf einer begrenzten Zahl von Medien, wo sie nur schwierig und zögernd erscheint, wobei dann das Luftmycel eine sehr helle graue Färbung annimmt.

Es sei erwähnt, daß auf einer gewissen Anzahl von Medien das Luftmycel sich schwach rosa oder schwach violett färbt, während durch die Kultur reichlich dunkelviolettes lösliches Pigment gebildet wird.

Streptomyces atroviolaceus DS 8938 bildet kein schwarzes lösliches Melaninpigment auf Spezial-Gelose-Tyrosin-Hefeextrakt nach Waksman (Melanin formation medium); Jedoch kann es auf zahlreichen Medien, sowohl synthetischen als auch organischen, lösljche Pigmente bilden, welche die Gelose dunkel färben, sie wird violett-braun oder violett-schwarz, braun-schwärzlich oder schwarz gefärbt. Auf seinen bei 26⁰C bewirkten Kulturen weist es folgende biochemische Eigenschaften auf:

Melanin-Produktion: negativ

Produktion von HpS: negativ

Tyrosinase: negativ

Verflüssigung von Gelatine: positiv

Verwertung von Cellulose: negativ

Erzeugung von Nitriten aus Nitraten: schwach positiv auf

synthetischen Medien zu Beginn der Züchtungen

Hydrolyse von Stärke: positiv

Züchtung auf Milch: keine Koagulation und keine

Peptonisation, der pH-Wert ο ist ohne merkliche Veränderung innerhalb eines Monats.

Die Züchtungs-Charakteristika von Streptomyces atroviolaceus DS 8938 sind in der folgenden Tabelle zusammengesetellt. Es sind solche aus Kulturen, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, d.h. etwa 3 Wochen bei 26⁰C, wenn nichts anderes angegeben

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ist. Diese Eigenschaften wurden auf Nähr-Gelosen und Bouillons festgestellt, welche üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Streptomyces-Stämmen verwendet werden, wobei die Kulturen auf Gelose-Medien auf Schräg-Gelosen durchgeführt, wurden. Eine gewisse Anzahl der angewandten Kulturmedien wurden nach den in "The Actinomycetes", S.A. Waksman, S. 193-197* Chronica Botanica Company, Waltham, Mass.,U.S.Α., 1950, hergestellt; in diesen Fällen sind sie durch den Buchstaben W und anschließend die Nummer, welche in dem Werk "The Actinomycetes" angegeben ist, gekennzeichnet. Die Literaturangaben oder Zusammensetzungen der anderen Medien sind die folgenden:

Ref. A - "Yeast Extract Agar" - T. G. Pridham und Mitarb. Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 950,

Ref. B - "Bennett's Agar" - S.A. Waksman - The Actinomycetes, Bd. 2, S. 331 - Nr. 30 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, I96I,

Ref. C - Formel W-23, versetzt mit 2 # Gelose,

Ref. D - "Hickey and Tresner's Agar" - T.G. Pridham und Mitarb. - Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 950,

Ref. E - "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G. Pridham und Mitarb. - Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 950,

Ref. F - "Melanin formation medium" - S.A. Waksman - The Actinomycetes, Bd. 2, S. 333, Nr. 42 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, I96I,

Ref. G - W.E. Grundy und Mitarb. - Antibiotics and Chem. 2, 401, I952,

Ref. H - "inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. Pridham und Mitarb. - Antibiotics-Annual 1956-1957, S. 95I,

Ref. I - entspricht der Formel W-I, wo 3 % Saccharose durch 1,5 % Glucose ersetzt sind,

Ref. J - entspricht der Formel W-I, wo 3# Saccharose durch 1,5 # Glycerin ersetzt sind,

Ref. K - entspricht der Formel W-I8, wo 3 # Saccharose durch 1*5 % Glucose ersetzt sind,

¹ 609839/1075

Ref. L - entspricht der Formel W-18, wo Saccharose weggelassen und durch kleine Streifen Filterpapier, die teilweise in die Flüssigkeit eingetaucht sind, ersetzt ist, —

Ref. M - "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" - Society of American Bacteriologists - Geneva,Hf.Y. II^q-18, Ref. N - "Plain gelatin" - hergestellt nach den Angaben aus "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" _t-Society of American Bacteriologists - Geneva, N.T. H₅₀-I8, Ref. P - entrahmte Milch als handelsübliches Pulver - zubereitet nach den Angaben des Herstellers,

Ref. Q - Milieu angegeben zur Feststellung auf HpS-Produktion von: H.D. Tresner und F. Danga - Journal of Bacteriology, 76, 259-244, I958.

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CD CO CO te

vn

Zuchtungs- mediutn	Grad der Entwick lung	vegetatives Myeel (v.M.) oder Unterseite der Kultur	Luftorgane (umfassend das gesamte Luftmycel u .d.Sporenbildung)	lösliches Pigment	Beobachtungen u. biochemische Eigenschaften	dunkelorange
Gelose mit	gut	Rückseite braun	weiß-gräulich,	schwarz	ovale Sporen,	bis zu braun-
\^ ^^ e^· ^^ ^h# *<^ AItV* ^^ Hefeextrakt nach Pridham (Ref. A)		schwärzlich '	mäßig entwickelt		mit den Abmes sungen 0,4-0 ,Sp/ 0,6-0,9 μ. Nicht verzweigte	schwärzlich
					Sporophoren;	braun
					Sporenketten, die	schwärzlich·
					die sich unter	violett
					Bildung mehrerer
					Windungen von
					geschlossenen	braun
					Spiralen auf	schwarz
					rollen
Gelose nach	gut	Unterseite dunkel	weißlich bis rosa	braun
Bennett		braun	gräulich sehr hell	schwarz
(Ref. B)			violett,
			mäßig entwickelt
Emerson-	ziemlich	v.M. braun-dunkel	weißlich bis rosa	braun, sehr
Gelose	gut	orange bis braun	gräulich, sehr hell
(Ref. C)		violett	violett,
			spärlich entwickelt
Gelose nach	ziemlich	v.M. braun-dunkel-	weiß-gräulich bis
Hickey u.	gut	violett	sehr hell violett-
Tresner			rosa,
(Ref. D)			ziemlich spärlich
			entwickelt
Gelose mit	ziemlich	v.M. sehr dunkles	weiß-gräulich,
Hafermehl u.	gut	Braun	mäßig entwickelt
Tomatenex
trakt nach
Pridham
(Ref. E)

Ul

S3 X>

cn cn

Zuchtungs- medJLum	Grad der Entwick lung	vegetatives My eel (v.M.) oder Unterseite der Kultur	Luft organe (umfassend das gesamte Luftmycel u.d.Sporenbildung )	lösliches Pigment	Beobachtungen u. biochemische Eigenschaften
Gelose Glucose- Pepton (W-6)	mittel	v.M. braun-orange bis braun-dunkelviolett	weiß-gräulich, nur Spuren	braun orange
Nährgelose (W-5)
Gelose Tyrosin- Hefeextrakt z.Bildung v. Melanin (Ref. P)	mäßig	v.M. violett-rosa bräunlich	keine	braun orange
Gelose mit Calcium- malat nach Krainsky (Ref. G)	mäßig	v.M. dunkelviolett	keine	violett bräunlich	Erzeugung von Melanin: negativ (Ablesungen durchgeführt nach den Angaben des Autors)
Gelose mit Ovalbumin (W-12)	mäßig	Unterseite braun-gelb gräulich	weiß-gräulich, sehr mäßig entwickelt	graubraun	Lösiichmachung des Malats: positiv, jedoch nicht vollständig
Gelose Glucose- Asparagin (W-2)	sehr spärlich	v.M. farblos bis gelblich, sehr spärlich entwickelt	keine	keines - oder sehr schwach bräunlich
mäßig	v.M. braun-dunkelgelb	weiß-gräulich, nur Spuren	braun schwarz

Zuchtungs-	Grad der	Stärke-Nitrat	gut	vegetatives My eel (v.M.)	Luftorgane	lösliches	Beobachtungen u.
medium	Entwick	(W-IO)		oder	(umfassend .das	Pigment	biochemische
	lung			Unterseite der Kultur	gesamte Luftmycel		Eigenschaften
		synthet.	ziemlich		u.d.Sporenbildung )
Gelose,	ziemlich	Gelose nach	gut	v.M. braun-schwärzIich	weißlich.	braun	I
Glycerin-	gut	Czapek mit Saccharose (W-I)			Sehr mäßig	schwarz
Asparagin (W -3)		synthet.			entwickelt
Gelose,	ziemlich	Gelose nach		v.M. sehr dunkles Braun	weiß-gelblich bis	braun
Stärke-	-gut	Czapek mit		weiß-gräulich.	schwärzlich	Hydrolyse der
Mineral-		Glucose		Sehr mäßig ent		Stärke: positiv .
salze nach		(Ref. I)		wickelt		ovale Sporen,
Pridham'						Abmessungen 0,4-
(Ref. H)"						0,6 /i/o,6-0,9 μ-
					Nicht-verzweigte
					Sporophoren. Die
					Sporenketten rol
					len sich auf unter
					Bildung von mehre
					ren Windungen ge
					schlossener
					Spiralen
Gelose,	mäßig	v.M. dunkelviolett	blau-gräulich bis	violett-	Hydrolyse der
	schwach-violett-	rosa	Stärke: positiv
	rosa. Sehr mäßig	bräunlich
	entwickelt
v.M. braun-schwärzlich	weiß-gräulich bis	schwarz
	grau-hellrosa.
	Ziemlich spärlich entwickelt
v.M. braun-dunkel	weiß-gräulich.	braun-
violett	Bur Spuren	orange-
		violett

CD
CD
CD
CO
CO

Zuchtungs· medium

synthet. Gelose nach Czapek mit Glycerin (Ref. J)

Bouillon Stärke-Nitrat (W-19)

synthet» Bouillon nach Czapek m. Sac char cse (W-18)

sy ηthet. Bouillon naoh Czapek m.Glueöse (Ref. K)

synthet« Bouillon nach Czapek m. Cellulose (Ref. L)

Nährbouillon mit Nitrat (Ref. M)

Grad der Entwicklung

ziemlich gut

sehr spärlich

sehr mäßig

sehr Spärlich

keines

sehr spärlich

vegetatives Mycel (v.M.)

oder 'Unterseite der Kultur

v.M. dunkelbraun bis violett-bräunlich

weißliche flockenartige

Kultur

weißliche bis bräunliche flockenartige Kultur

weißliche flockenartige Kultur

weißliche bis gelbliche flockenartige Kultur

Luftorgane (umfassend das gesamte Luftmycel u .d. Sporenbildung]

keine

keine

keine

keine

keine

lösliches Pigment

braundunkel orange bis etwa braunschwärzlich

keines

keines

keines

keines

Beobachtungen und

biochemische

Eigenschaften

Produktion von Nitriten: positiv zu Beginn der Kulturen

Erzeugung von Nitriten: schwach positiv zu Beginn der Kulturen

Produktion von Nitriten:positiv zu Beginn der Züchtungen

Verwertung der Cellulose: negativ

Erzeugung von Nitriten: negativ

	Zuchtungs- medium	Grad der Entvric ίο- lung	vegetatives My eel (v.M.) oder Unterseite der Kultur	Luftorgan (umfassend das gesamte Luftmycel u.d.Sporenbildung	lösliches Pigment	Beobachtungen u. biochemische Eigenschaften	ro
	reine	mäßig	v.M. bräunlich bis	keine	keines	Verflüssigung	VU
	Gelatine zu		violett.			der Gelatine:
	12 %		Spärlich entwickelt			positiv,
	(Ref. N)					ziemlich langsam
	Züchtung	ziemlich	v.M. braun-rötlich bis	weißlich bis rosa-	braun bis
	auf	gut	violett-bräunlich	hellgräulich.	braun-dun
CD	Kartoffeln			Nur Spuren	kelviolett
CD	(W-27)
OO CaJ	entrahmte	mäßig	braun-gelblicher bis	keine		keine Koagula
* ί"'	Milch		braun-violettlicher			tion und keine
	(Ref. P)		Ring			Peptonisation.
—S.						Keine merkliche
O						Änderung des pH
Απ						innerhalb eines
						Monats
	Gelose nach	mäßig	v.M. grau-hellgelblich	keine	braun-gelb	Erzeugung von
	Tresner u.					H2S: negativ
	Danga (Ref. Q)					(Ablesungen nach den An
						weisungen des
						Autors)

Streptomyces atroviolaceus DS 8938 zeigt eine Anzahl von Eigenschaften, welche mit keinen derjenigen der bereits beschriebenen Stämme genau übereinstimmt, und infolgedessen muß man ihn als neue Spezies ansehen.

Unter Berücksichtigung der Arten, deren Beschreibung in "The Actinomycetes" (Bd. 2, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, I96I) sowie in "Bergey's Manual of Determination Bacteriology (7. Aufl., The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957) erfolgt ist, so ist die Art, mit der man ihn am ehesten vergleichen könnte, Streptomyces violaceoniger, da der letztgenannte kein schwarzes lösliches Melaninpigment bildet, jedoch andererseits auf synthetischer Gelose nach Czapek mit Saccharose (Zucker-Nitrat-Agar) ein braunviolettes lösliches Pigment bildet, das sehr rasch schwarz wird; im übrigen bildet S. atroviolaceus DS 8938 auf zahlreichen Medien braun-violettliche bis violett-schwarze lösliche Pigmente, welche sogar in einer gewissen Anzahl von Fällen bis zu schwarz gehen können. Darüber hinaus weist S. atroviolaeeus DS 8938 wie S. violaceoniger ein Sporen-Luftmycel von grauer Farbe auf und seine Sporenketten rollen sich zu Spiralen auf. Jedoch muß man S. atroviolaceus DS 8938 und S. violaceoniger als zwei verschiedene Arten ansehen. Tatsächlich muß man trotz der eben beschriebenen Analogien feststellen, daß S. violaceoniger kein lösliches Pigment auf Kartoffel ergibt, auf Gelatine ein graues vegetatives Myeel entwickelt und vor allem zeigt er bei der Alterung seines Luftmycels ein Schwarzwerden, wodurch er in die Gruppe von S. hygroscopicus einzuordnen ist, während S. atroviolaceus DS 89^8 auf Kartoffeln ein braunes bis dunkelviolett-braunes lösliches Pigment ergibt, auf Gelatine ein bräunliches bis violettliches vegetatives Mycel entwickelt und sogar in seinen sehr alten Kulturen niemals ein Schwarzwerden seines Luftmycels zeigt, was eine Annäherung an die Gruppe von S. hygroscopicus gestattet hätte. Es ist ferner festzustellen, daß insbesondere auf synthetischer Gelose nach Czapek mit Saccharose (Zucker-Nitrat-Agar) das von S. violaceoniger entwickelte lösliche Pigment zu Beginn der Züchtung einen Blauton annimmt, welchen das von S. atroviolaceus DS 8938 entwickelte lösliche Pigment nicht aufweist, sondern seinerseits vor dem Dunkelwerden eine violett-purpurne Färbung und nicht violett-bläuliche Färbung

609839/1 0.7 S

Die Fähigkeit von S. atroviolaceus DS 8938 zur Verwertung verschiedener Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen für seine Entwicklung wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bacfc. 56, 107-114, 1948) bestimmt; der Entwicklungsgrad wurde auf dem von den Autoren angegebenen Basismedium beobachtet, wobei entweder die Glucose durch verschiedene untersuchte Kohlenstoffquellen oder das (NH₁^)₂S0^ durch verschiedene untersuchte Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

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untersuchte Kohlenstoff- quelieft~	Verwertung	positiv	untersuchte Stickstoff quellen	Verwertung	positiv	i
D-Ribose	negativ-	negativ	NaNO3	positiv	positiv	j
D-Xylose	negativ	NaNO2	positiv	positiv
L-Arabinose	negativ	(NH^)2SO4	positiv	positiv
L-Rhamnose	negativ	(NH4)2P04	positiv	positiv,langsam
D-Glucose	positiv	Adenin	positiv	negativ
D-Galactose	positiv	Adenosin	positiv
D-Fructose	positiv,langsam	Uracil	negativ
D-Mannose	positiv	Harnstoff	positiv
L-Sorbose	negativ	L-Asparagin	positiv
Lactose	positiv	Glycocoll	positiv
Maltose	positiv	Sarcosin	positiv,langsam
Saccharose	positiv	DL-Alanin	positiv
Trehalose	positiv	DL-Valin	positiv
Cellobiose	positiv	DL-Asparagin- säure	positiv
Raffinose	positiv	L-Glutaminsäure	positiv
Dextrin	positiv	L-Argihin	positiv
Inulin	negativ	L-Lysin	positiv
Stärke	positiv	DL-Serin	positiv
s Glycogen	positiv	DL-Threonin	positiv
{ Glycerin	positiv	DL-Methionin	positiv
Erythrit	positiv	Taurin	negativ
Adonit	positiv	DL-Phenylalanin
DuIcit	negativ	L-Tyrosin
J D-Mannit	positiv	DL-Prolin
D-Sorbit	negativ	L-Histidin
Inosit	L-Tryptophan
Salicin	Betain

Das Herstellungsverfahren für 32 999 RP besteht im wesentlichen darin, Streptomyces atrovlolaceus DS 8938-Stammvorrat (Stock) oder seine Produktionsmutanten auf einem geeigneten Medium und unter ge eigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Produkt abzutrennen.

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Die Züchtung des aus dem Vorrat entnommenen Streptomyces atroviolaceus DS 8938-Ausgangsprodukts kann nach jeder geeigneten aeroben Oberflächen- oder Submers-Züchtungsmethode erfolgen, jedoch ist die letztere aus Gründen der Bequemlichkeit vorzuziehen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturen, welche in der Industrie der Fermentationen geläufig sind.

Zur Durchführung der einzelnen Arbeitsgänge kann man folgenden Verlauf anwenden:

Streptomyces atroviolaceus DS 8938-Ausgangs bzw. Vorrats-Stamm (Stock)

Züchtung, auf Gelose Züchtung im bewegten Kolben

Impfkultur im Fermentationsgefäß Produktsionskultur im Fermentationsgefäß

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthalten, mineralische Elemente, insbesondere Chloride oder Carbonate, und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, wobei alle diese Bestandteile in Form wohldefinierter Produkte oder als komplexe Mischungen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs findet, eingebracht werden können.

Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff kann man Kohlehydrate wie Glucose, Lactose, Dextrine, Stärke oder andere kohlenstoffhaltige Produkte wie Zuckeralkohole (Glycerin) oder gewisse organische Säuren: Milchsäure, Zitronensäure verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche öle wie Specköl oder Sojaöl können mit Vorteil diese verschiedenen Kohlenstoffquellen ersetzen oder ihnen zugefügt werden.

Die Quellen für assimilierbaren Stickstoff sind außerordentlich vielfältig. Es können sehr einfache chemische Substanzen sein,

609839/1 075

wie beispielsweise anorganische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff, gewisse Aminosäuren. Es können auch komplexe Substanzen sein, welche hauptsächlich Stickstoff in protidischer Form enthalten, Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Fleischextrakt, Hefeextrakt, distiller's solubles, Maisquellwasser.

Unter den zugefügten mineralischen Elementen können gewisse einen Puffer- oder Neutralisationseffekt haben, wie die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder die Calcium- und Magnesiumcarbonate. Andere tragen zum ionischen Gleichgewicht bei, das zur Entwicklung von Streptomyces atroviolaceus DS 8938 und zur Herstellung von 32.999 RP notwendig ist, wie die Alkali- oder Erdalkalimetallchloride und -sulfate. Gewisse Substanzen wirken insbesondere als Aktivatoren der metabolischen Reaktionen von Streptomyces atroviolaceus DS 8938, diese sind die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- oder Mangansalze.

Die Wachstumsfaktoren sind Produkte mit Vitamin-Natur, wie Riboflavin, Folsäure, Pantothensäure oder Thiamin.

Der pH-Wert der Fermentation zu Beginn der Züchtung soll zwischen 5,8 und 7*8 liegen. Die optimale Temperatur für die Fermentation liegt zwischen 25 und 3O⁰C, jedoch wird für Temperaturen zwischen 23 und 33°C ebenfalls eine befriedigende Produktion erhalten. Die Belüftung bei der Fermentation kann zwischen ziemlich weiten Grenzen variieren, es wurde jedoch festgestellt, daß Belüftungen von 0,3 bis 3 1 Luft je Liter Brühe und je Minute besonders geeignet sind. Die maximale Ausbeute an 32.999 RP wird nach 2 bis 8 Tagen Züchtung erhalten, wobei diese Zeit im wesentlichen vom angewendeten Züchtungsmedium abhängt.

Aus den obigen Ausführungen wird ersichtlich, daß die allgemeinen Züchtungsbedingungen von Streptomyces atroviolaceus DS 8938 zur Erzeugung von 32.999 RP in weitem Umfang variieren können und jeder speziellen Notwendigkeit angepaßt werden können.

Die Verbindung 32.999 RP kann aus dem Erzeugermedium nach den üblichen Isolierungsmethoden für Antibiotika dieser Familie abgetrennt werden.

609839/1075

Beispielsweise kann die Verbindung 52.999 RP aus dem Reduktionsoder Fermentationsmedium bei einem pH-Wert von etwa 9 mittels eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, Methylenchlorid, n-Butanol, oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel in geeigneten Mengenverhältnissen extrahiert werden.

Die Fermentationsbrühe kann auch in Gegenwart eines Filterhilfsmittels bei einem pH-Wert zwischen 1,5 und 9 filtriert werden. Es ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang in saurem Milieu durchzuführen und insbesondere auf einen pH-Wert zwischen 1,5 und 2 mittels Oxalsäure anzusäuern. Es ist auch möglich^, die Filtration bei einem pH-Wert zwischen 2 und 8 in Gegenwart eines aliphatischen Alkohols mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen vorzunehmen. Die Verbindung 32.999 RP kann aus dem Filtrat nach dem Einengen mittels eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, Methylenchlorid, n-Butanol, oder Gemischen dieser Lösungsmittel in geeigneten Mengenverhältnissen extrahiert werden.

Die Verbindung 32.999 RP kann aus den organischen Extrakten nach aufeinanderfolgenden Wasch- und Extraktionsmaßnahmen durch Ausfällung nach dem Einengen der Extrakte auf ein kleines Volumen isoliert werden oder aber durch Zugabe in ein mischbares Lösungsmittel, worin die Verbindung 32.999 RP praktisch unlöslich ist, wie Hexan, gegebenenfalls nach Umwandlung des Antibiotikums in ein Additionssalz mit einer Säure, wie beispielsweise das Hydrochlorid.

Das 32.999 RP kann gegebenenfalls durch die verschiedenen klassischen Reinigungsmaßnahmen gereinigt werden, wie Kristallisation oder Chromatographie an verschiedene Adsorbentien.

Die Verbindung 32.999 RP und ihre nicht-toxischen Salze, d.h. die pharmazeutisch annehmbaren Salze, haben sich besonders wirksam bei einpflanzbaren Tumoren der Maus in Dosen zwischen 0,125 und 0,250 mg/kg i.p., bei der Leukämie L 1210, der Leukämie P 388 und der Leukosarcomatose erwiesen.

Die Toxizität des Hydrochlorids von 32.999 RP wurde hauptsächlich an der Maus untersucht. Die 50 #-ige letale Dosis (DLj-q) wurde intraperitoneal bestimmt (Behandlung während vier aufeinander-

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folgenden Tagen) und liegt bei etwa O,4 mg/kg.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken. Im folgenden wird

a) die Identifizierung von 32.999 RP durch Dünnschicht-Chromatographie an Siliciumdioxidgel durchgeführt, wo.bei die Rf-Werte der erhaltenen Produkte mit denjenigen von Carminomycin oder von 32.999 RP in demselben Lösungsmittelsystem verglichen wurden,

b) die Produktion von 32.999 RP ausgehend von den Dünnschichtchromatogrammen bestimmt, entweder durch Vergleich der Intensitäten der entsprechenden Flecken des Extrakts und desjenigen von reinem, als Kontrollprobe genommenen 32.999 RP, oder aber durch Vergleich der Oberflächen der Piks, welche auf der "Chromoscan"-Platte registriert wurden, oder aber durch kolorimetrische Bestimmung von 32.999 RPj das aus dem chromatographischen Träger auf der Höhe des Fleckens des gesuchten Produktes eluiert wurde.

Beispiel 1

Man stellt ein Kulturmedium A mit folgender Zusammensetzung in g/l her:

Brauereihefe-Autolysat in Pulverform .... 15

Monokaliumphosphat .... 2,5

Dikaliumphosphat .... 2,5

wasserfreie Glucose .... I5

Eine Lösung der drei ersten Bestandteile in 1000 cnr destilliertem Wasser wird auf pH 6,9 durch Zugabe von η-Natronlauge eingestellt und auf 300 cnr-Kolben verteilt, wobei pro Kolben 50 cm eingefüllt werden. Diese Kolben werden 20 Minuten lang bei 122°C sterilisiert und dann abgekühlt. Man vervollständigt das Medium, indem in jeden Kolben unter sterilen Bedingungen 1,5 Snr einer sterilen Glueöse-Lösung mit 500 g/l zugegeben werden. Der pH-Wert des Mediums beträgt dann 7*05·

Man beimpft 80 dieser Kolben, indem man in jeden Kolben 2,5 cnr einer Impfkultur des Stammes Corynebacterium simplex (ATCC 6946)

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zugibt. Die Kultur wird auf einemY220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 3O°C entwickelt. Nach 48 Stunden ist die Kultur gut entwickelt und der pH-Wert beträgt 7,70. Man gibt dann eine wässrige Lösung von 10 mg/cnr Carminomycin in einer Menge von 2,5 cnr Je Kolben zu. Die Reduktionsphase wird auf dem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 26°C fortgesetzt.

Nach 48 Stunden ist die Reduktion beendet und der pH-Wert der Kultur beträgt 8,5· Der Inhalt der 80 Kolben wird vereinigt. Man entnimmt in homogener Weise 50 cnr der Kultur, welche mit 25 cnr eines Boratpuffers derart behandelt wird, daß der pH-Wert 9,0 erreicht wird. Man extrahiert dann zweimal mit 50 cnr eines Gemisches aus Methylenchlorid und n-Butanol (70/30 in Volumina). Die organischen Extrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.

Die Produktion von 32.999 RP wird durch Dünnschicht-Chromatographie der organischen Extrakte an Silcagel bestimmt. Die Volumina der abgesetzten Extrakte betragen 10 bis 20 ^zI. Die Platten werden mit dem folgenden Gemisch entwickelt:

Methylenchlorid-Ameisensäure-Methanol (80/17/3 in Volumina), um eine gute Trennung von Carminomycin und 32.999 RP zu erhalten. Die Rf-Werte der erhaltenen Produkte werden mit denjenigen von Standardprodukten, welche unter denselben Bedingungen chromatographiert wurden, verglichen. Die quantitative Auswertung der Erzeugung von 32.999 RP zeigt, daß die Kultur von Corynebacterium simplex (ATCC 6946) das Carminomycin zu der Verbindung 32.999 RP in einer Ausbeute von 80 #, bezogen auf das eingesetzte Carminomycin, reduziert.

Beispiel 2

Man stellt ein Kulturmedium A wie in Beispiel 1 her und verteilt es auf 300 cnr-Kolben.

Man stellt ferner ein Kulturmedium B folgender Zusammensetzung her und verteilt es ebenfalls auf 300 cnr-Kolben:

Pepton .... 10 g

Fleischextrakt .... 5g

Glucose .... 10 g ,

destilliertes Wasser auffüllen auf lOOO cm.

Der pH-Wert wird auf 7,2 durch Zugabe von η-Natronlauge eingestellt; das Medium wird 20 Minuten lang bei 122°C sterilisiert.

Man beimpft einen Kolben, der 50 cnr Medium A enthält und dessen pH-Wert 7,05 beträgt, und einen Kolben, der 50 cnr Medium B enthält, mit einem pH-Wert von 6,5, mit 2,5 .chk einer Impfkultur von Corynebaeterium simplex (ATCC 6946) je Kolben.

Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 30⁰C entwickelt. Nach angemessener Züchtungszeit (48 Stunden für das Medium A und 72 Stunden für das Medium B) wird eine wässrige Lösung mit 10 mg/cnr Carminomyein-Hydrochlorid in einer Menge von 2,5 cnr je Kolben zugegeben, so daß eine Konzentration an Carminomycin von 0,5 g/l erhalten wird.

Nach diesen Zugaben werden die Kulturen A und B während 2 bzw. 4 Tagen auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 26°C inkubiert. Die Kolben werden dann unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen weiterbehandelt.

Die Ausbeuten an 32.999 RP sind, bezogen auf das eingesetzte Carminomycin, die folgenden:

Medium	Ausbeute
A	80 %
B	6o %

Beispiel 3

Man stellt in 300 cnr-Kolben unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen Kulturen des Stammes Corynebaeterium simplex (ATCC 6946) auf dem Medium A her. Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 30°C entwickelt.

Nach 30-stündiger Bebrütung werden fünf Kolben vereinigt (250 cnr Fermentationsbrühe), und die vorhandenen Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet. Die gesamte Zellernte wird dann in einem 3OO cnr-Kolben wieder suspendiert, der 50 cnr eines m/15

60 983 97 1075

Phosphatpuffers bei pH 8,0 enthält. Man stellt ebenfalls in der gleichen Weise eine andere Zellsuspension her unter Verwendung von 50 cnr* eines m/15 Phosphatpuffers bei pH 5,0 zur Wiederaufnahme der Zellen. Man gibt dann in jeden Kolben 2,5 cnr einer wässrigen Lösung von 4 mg/cnr Carminomycin-Hydrochlorid, so daß eine Konzentration von 0,2 g/l an Carminomycin erzielt wird.

Die Kolben werden 48 Stunden lang unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bebrütet und werden dann wie in Beispiel 1 weiterbehandelt.

Die Ausbeuten an Antibiotikum 32.999 RP, bezogen auf das eingesetzte Carminomycin sind die folgenden:

pH	Ausbeute
8,0	90 %
5,0	60 %

Beispiel 4

Man stellt ein Züchtungsmedium A mit einem pH-Wert von 6,8 wie in Beispiel 1 beschrieben her und verteilt es in 300 cnP-Kolben in einer Menge von 50 cnr je Kolben.

Man beimpft mehrere Kolben, deren pH-Wert 6,8 beträgt, indem man in jeden von ihnen 2,5 cnr einer Impfkultur des Stammes Bacillus cyclooxydans (ATCC 12.673) zugibt. Die Kultur wird während 48 Stunden auf einem mit 220 Umdr./fain. bewegten Tisch in einem Raum von 30⁰C entwickelt.

Die Reduktion des Carminomycins wird bewirkt, indem man verwendet:

entweder die gesamte Kultur, deren pH-Wert 7,65 beträgt, oder eine Zellsuspension in einem Puffer vom pH 8,0, hergestellt unter den in Beispiel 3 beschriebenen Bedingungen.

Man gibt in jeden Kolben 1 cnr einer wässrigen Lösung von 10 mg/cnr Carminomycin, um eine Konzentration von 0,2 g/l zu er-

^halten· · 609839/1075

Die Reduktionsphase wird während 4 Tagen auf einem mit 200 Umdr./ Min. bewegten Tisch in einem Raum von 26°C fortgesetzt. Die Kolben werden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen behandelt. Die Ausbeuten an 32.999 RP* bezogen auf das eingesetzte Carminomycin, sind die folgenden:

Reduktionsmedium	Ausbeute
Gesamte Kultur	94 %
isolierte Zellen	75 %

Beispiel 5

Man stellt unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen Kulturen des Stammes Bacillus cyclooxydans (ATCC 12.673) auf dem Medium A her. Zu den gesamten Kulturen, welche während 48 Stunden inkubiert wurden und deren pH-Wert 7,65 beträgt, gibt man das Carminomycin in folgender Form zu:

a) in Form einer wässrigen Lösung a 10 rng/cnr reines Produkt in einer Menge von 1 cnr je Kolben (0,2 g/l Carminomycin),

b) in Form einer wässrigen Lösung ä 10 mg/crrr Rohprodukt, das 16 % Carminomycin enthält, in einer Menge von 4 cnr je Kolben (0,13 g/l Carminomycin).

Die Kolben werden dann während 4 Tagen unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bebrütet und in der gleichen Weise behandelt. Die Ausbeuten an 32.999 RPj bezogen auf das eingesetzte Carminomycin, sind die folgenden:

Produkt	Ausbeute
reines Carminomycin	94 %
rohes Carminomycin	92 %

Beispiel 6

Man stellt ein Kulturmedium C her mit folgender Zusammensetzung in g/l:

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Sojamehl .... 30

Sojaöl (d = 0,92) 4,6

Monokaliumphosphat .... 1

Calciumcarbonat .... 2,5

wasserfreie Glucose .... 50

Die Bestandteile des Mediums mit Ausnahme der Glucose werden in 900 cnr destilliertem Wasser gelöst oder suspendiert. Diese Zubereitung, welche durch Zugabe von η-Natronlauge auf pH 7,20 eingestellt ist, wird auf 300 cm^-Kolben in einer Menge von 45 cnr je Kolben verteilt. Diese Kolben werden 20 Minuten lang bei 122°C sterilisiert und dann abgekühlt. Man vervollständigt das Medium, indem unter sterilen Bedingungen in jeden Kolben 5 cnr einer sterilen Glueöse-Lösung von 500 mg/1 gegeben wird. Der pH-Wert des Mediums, das für die Beimpfung bereit ist, beträgt 7,0.

Man beimpft einen Kolben von 300 cnr, welcher 50 cm-⁷ des obigen Mediums enthält und dessen pH-Wert 7*0 beträgt, mit 2,5cnr einer Impfkultur des Stammes Streptomyces roseochromogenes (ATCC 13.400). Die Kultur wird während 48 Stunden auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 30°C entwickelt. Man erntet dann die von dieser Kultur erzeugten Zellen. Die Reduktion des Carminomycins zum Antibiotikum 32.999 RP wird bewirkt unter Verwendung einer Suspension der Zellen in 50 cnr eines m/15 Phosphatpuffers vom pH 8,0, die 1 enr einer wässrigen Lösung von 10 mg/anr Carminomycin-Hydrochlorid, zur Erzielung einer Konzentration von 0,2 g/l enthält. Die Reduktionsphase wird während 48 Stunden auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 26⁰C durchgeführt. Die Zellsuspension wird unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen behandelt. Die Ausbeute an 32.999 RP_/ bezogen auf eingesetztes Carminomycin beträgt 57 $>·

Beispiel 7

Man stellt ein Kulturmedium C unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen her und verteilt es in 300 cm-Kolben.

Man beimpft die Kolben, welche 50 cnr dieses Milieus enthalten, dessen pH-Wert 6,90 beträgt, mit 2,5 cm³ eines Züchtungsinoculums

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des Stammes Streptomyces lavendulae (ATCC 8664). Die Kultur wird während 40 Stunden auf einem mit 220 Umdrehungen je Minute bewegten Tisch in einem Raum von 26⁰C entwickelt. Man gibt dann in jeden Kolben, der die gesamte Kultur enthält, deren pH-Wert 7,50 beträgt, 1 cnr einer wäßrigen Lösung von 10 rng/cm^ Carminomycin-Hydrochlorid, sodaß eine Konzentration von 0,2 g/l erhalten wird. Die Reduktionsphase wird dann während 4 Tagen unter denselben Rühr- und Temperaturbedingungen fortgesetzt. Die Kolben werden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen behandelt. Die Ausbeute an 32.999 RP beträgt bezogen auf das eingesetzte Carminomycin 6156.

Beispiel 8
^-^Fermentation

Man gibt in ein Fermentationsgefäß von 170 Liter

Pepton . 600 g

Fleischextrakt 600 g

Hefeextrakt 600 g

Glucosemonohydrat 600 g

Leitungswasser auffüllen auf 110 Liter.

flach dem Einstellen des pH-Wertes auf 6,8 mit 40 cm⁵ 10 n-Hatron-

lauge gibt man zu:

Calciumcarbonat 300 g.

Der pH-Wert des Mediums beträgt dann etwa 6,8; man sterilisiert das Medium durch Durchlaufen von Dampf bei 122⁰C während 40 Minuten; nach dem Abkühlen beträgt das Volumen der Brühe aufgrund der Kondensation des Dampfes während der Sterilisation 120 Liter und der pH-Wert ist 8,3. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 90 cnr 12 η-Salzsäure auf 7,0 eingestellt.

Man beimpft mit 250 cm⁵ einer Impfkultur im gerührten Erlenmeyerkolben von Corynebacterium simplex (ATCC 6946). Die Kultur wird während 32 Stunden bei 30⁰C unter Rühren und unter Belüften mit steriler Luft entwickelt; sie ist dann zum Beimpfen der Produktionskultur geeignet.

Die ProduktionsZüchtung wird in einem 800 Liter-Fermentations-

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gefäß "bewirkt, das mit folgenden Substanzen besohickt ist: Brauereinefeautolysat in Pulverform 6 kg

Monokaliumphosphat 1 kg

Dikaliumphosphat 1 kg

Leitungswasser . auffüllen auf 355 Liter.

Hachdem der pH-Wert durch Zugabe von 460 cnr 10 n-Natronlauge auf 7,0 eingestellt ist, wird das Medium durch Durchleiten von Dampf von 122⁰C während 40 Minuten sterilisert. Fach dem Abkühlen beträgt das Tolumen der Brühe aufgrund der Kondensation des Dampfes im Verlauf der Sterilisation 385 Liter; es wird durch Zugabe von 15 Liter einer sterilen wäßrigen Lösung, welche

Glucosemonohydrat 6 kg

enthält, vervollständigt.

Der pH-Wert des Mediums beträgt 6,8. Man beimpft mit 40 Litern der oben beschriebenen Impfkultur aus dem 1 TO-Liter-Permentationsgefäß. Die Kultur wird bei 30⁰C entwickelt, unter Rühren mit einer Turbine mit 160 Umdrehungen je Minute und unter Belüften mit einem Volumen steriler Luft von 20 cnr je Stunde. Nach 30 Stunden ist die Kultur geeinget, um die biochemische Umwandlung des Carminomycins zu 32.999 RP zu bewirken.

Man führt in die Kultur 4 1 einer wäßrigen Lösung ein, die

enthält:

Carminomycin-Hydrochlorid 40 g.

Die Inkubation wird während 17 Stunden bei 26⁰C fortgesetzt, wobei unter den oben beschriebenen Bedingungen gerührt und belüftet wird. Das Carminomycin wird zu 32.999 RP in einer Ausbeute von etwa 100$ reduziert.

B^ -Extraktion

Zu 420 Liter Fermeritationsmaische, die wie in Beispiel 8 A beschrieben erhalten wurde, gibt man 42 Liter S-Butanol und 2,9 Liter 6 n-Hatronlauge· Die aktive Substanz wird im Gegen strom mit n-Butanol (60 YoI.-#) über zwei Zentrifugen ex-

. 609839/1075

-.44-

trahiert. Der Extrakt, dessen Volumen 330 Liter beträgt, wird unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bei 4O⁰C bis auf ein Volumen von 20"Litern eingeengt.

Zu dem eingeengten Extrakt gibt man 20 Liter Methylenchlorid und man wäscht dieses Gemisch, mit 10 Litern Wasser, das durch Zugabe von Natronlauge auf pH 10 gebracht wurde. Das Waschwasser, das 32.999 RP enthält, wird 2 χ mit 10 Litern eines Gemisches aus Methylenchlorid-n-Butanol (80-20 in Vol.) extrahiert.

Die drei organischen Extrakte werden vereinigt und dann unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bis auf ein Volumen von 15 Litern eingeengt. Man gibt dann unter Rühren 0,2 Liter eines Gemisches aus n-Butanol/11-n-Salzsäure (90-10 in Vol.) zu und engt dann unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bis auf ein Volumen von 5 Litern ein.

Das Antibiotikum 32.999 RP wird in Eorm seines Hydrochlorids durch Zugabe des Konzentrats in 35 Liter Hexan ausgefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 52 g rohes 32.999 RP-Hydrochlorid.

O_i_-__Reinigung

a) Zu einer Suspension von 50 g rohem 32.999 RP-Hydrochlorid, das wie in Beispiel 8 B angegeben erhalten wurde, in 130 cm Wasser gibt man 520 cnr Dioxan. Die erhaltene Lösung wird filtriert.

Bas 32.999 RP-Hydrochlorid wird durch Zugabe von 4 Liter Dioxan bei einer Eemperatux von etwa 20⁰C in dem Piltrat kristallisiert. Die Kristalle werden abgesaugt, mit Dioxan gewaschen und getrocknet. Man erhält so 27 g halbgereinigtes 32.999 RP-Eydrochlorid.

b) 4,2 g rohes Hydrochlorid, das wie in Beispiel 8 B beschrieben erhalten wurde, wird durch Zugabe von 10 n-Natron— lauge auf 4,5 eingestellt.

§0983 9/1075

Das in dieser Lösung enthaltene Antibiotikum wird an einer Säule enthaltend 0,4 1 Amberlit IRC 50_;Säureform,fixiert. Die Säule wird mit 1 Liter ¥asser, 2 Litern wäßrigem 50^-igen Methanol, 2 Litern wäßrigem 90$-igen Methanol und schließlich mit 3 Litern wäßrigem 90^-igen Methanol, das 1# Natriumchlorid enthält, gewaschen. Das Eluat wird unter vermindertem Druck (5 "bis 10 mm Hg) "bei 40⁰O "bis auf ein Volumen von o,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat, dessen pH-Wert durch Zugabe von 11 n-Natrorilauge auf 10 eingestellt wird, wird mit 2 χ 0,5 Liter Chloroform und 2 χ 0,5 Liter eines Gemisches Chloroform/n-Butanol (80-20 in ToI.) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden unter vermindertem Druck (5 "bis 10 mm Hg) "bei 40⁰C eingeengt.. Während des Einengens gibt man 10 cnr n-Butanol, das 1$ (in YoI.) 11-n-Salzsäure und 5$ (in Vol.) Wasser enthält, zu. Das Konzentrat, dessen Volumen auf 30 cnr gebracht wird, wird langsam zu 500 cnr Hexan gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man .erhält so 1,26 g halbgereinigtes 32.999 RP-Hydrοchlorid.

Das halbgereinigte Produkt (27 g), erhalten gemäß a), wird in 300 cnr Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird filtriert.

Das 32.999 RP-Hydrochlorid wird durch Zugabe von 2,7 Litern Aceton bei einer Temperatur von etwa 20⁰C in das Piltrat kristallisiert. Die Kristalle werden abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 17 g reines 32.999 RP-Hydrochlorid.

Beispiel 9

Man zentrifugiert unter sterilen Bedingungen bei einer Temperatur von etwa O⁰C 50 cm einer Kultur von Corynebacterium simplex (ATCC 6946), die während 30 Stunden unter den in Beispiel 8 A beschriebenen Bedingungen entwickelt wurde. Nach dem Zentrifugieren werden die Zellen in 50 cnr m/15-Phosphatpuffer von pH 7,5 wieder suspendiert. Die Zellen werden dann der Einwirkung von Ultraschall (25 kHz) während 15 Minuten bei einer Temperatur von etwa O⁰C unterworfen. Nach dem Zentrifugieren gibt man zu der tiberstehenden Flüssigkeit 10 mg Carminomycinhydrochlorid. Die so erhaltene Lösung wird unter

h0 9839/1075

den in Beispiel 1 "beschriebenen Bedingungen "bebrütet. Nach 40 Stunden ist das Carminomycin zum 32.999 KP in einer Ausbeute von etwa 60$ reduziert.

Beispiel 10

Man zentrifugiert unter sterilen Bedingungen bei einer Temperatur von etwa O⁰C 50 cnr einer Kultur von Corynebacterium simplex (ATCC 6946), das während 30 Stunden unter den in Beispiel 8 A beschriebenen Bedingungen entwickelt wurde. Fach dem Zentrifugieren werden die Zellen in 50 cnr m/5-tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan/HCl von pH 8,1 wieder suspendiert und in einen 300 cm -Erlenmeyerkolben überführt; man gibt dann 25 mg EDTA ethylendiamintetraessigsäure), 25 mg CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) und 200 mg Lysozym zu, dann wird der Kolben 1 Stunde lang bei 37⁰C auf einen mit 220 Umdrehungen je Minute drehenden Tisch gestellt. Nach dem Zentrifugieren gibt man zu der überstehenden Flüssigkeit 5 mg Carminomycinhydrochlorid. Die so erhaltene lösung wird der Inkubation unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen unterworfen. Mach 40 Stunden ist das Carminomycin zum 32.999 RP in einer Ausbeute von etwa 30$ reduziert.

Beispiel 11

0,5 g reines 32.999 EP-Hydrochlorid wird hydrolysiert durch Lösen in 50 cm' Wasser, das mit 10 cm^ 11 η-Salzsäure versetzt ist und Erhitzen während 2 Stunden zum Sieden. Während der Hydrolyse bildet sich ein kristalliner Niederschlag von AgIycon. Der Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 0,3 g reines Aglycon.

Beispiel 12

M«n stellt ein Kulturmedium A mit folgender Zusammensetzung

Sojamehl ^y 8 g

Bäckerhefe im Stück 40 g

reine Lactose 58 g

Natriumchlorid 2 g

Monokaliumphosphat 1 g

Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,1 g

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Eisen-II-sulfat-heptahydrat 0,1 g

Zinksulf a-t-h.eptah.ydrat 0,1 g

destilliertes Wasser von 75⁰C 800 cm⁵.

Der pH-Wert der Suspension wird durch Zugabe von 1 cnr 1On-ÜTatronlauge auf 6,5 eingestellt, dann gibt man zu: Glycerin (d = 1,26) 19 g

Calciumcarbonat 2 g

destilliertes Wasser auffüllen auf 1000 cm⁵.

Dieses Medium wird auf 300 cm-Kolben in einer Menge von 50 cnr je Kolben verteilt. Die Kolben werden während 20 Minuten bei 122⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen betragt der pH-Wert des Mediums 5,9. Man stellt außerdem eine sterile Lösung von Sulfanilamid mit 10 mg/cm⁵ und einem pH 9,0 durch Auflösen von Sulfanilamid in einem Gemisch aus 5 N-Natronlauge und destilliertem Wasser und anschließendes Filtrieren durch eine "Millipore 0,45 ^"-Membrane her.

Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in 6 Gruppen mit je 2 Kolben eingeteilt.

Die Kolben der Gruppe A.. erhalten keinen weiteren Zusatz.

Die Kolben der 5 anderen Gruppen erhalten die folgenden weiteren Zusätze:

Gruppe A₂: 1 cm⁵ der Sulfanilamidlösung (0,2 g/l) Gruppe A,: 2 cm⁵ der Sulfanilamidlösung (0,4 g/l) Gruppe A,: 3 cnr der Sulfanilamidlösung (0,6 g/l) Gruppe A,-: 4 cm⁵ der Sulfanilamidlösung (0,8 g/l) Gruppe A_g: 1 cm⁵ der Sulfanilamidlösung (0,2 g/l).

Die Kolben der Gruppe A₁ und die Kolben, welche einen Sulfanilamidzusatz aufweisen, werden in einer Menge von 2,5 cnr je Kolben mit einer 72 Stunden alten Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 7.126 (NRRL 8098) beimpft.

Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdrehungen je Minute bewegtem Tisch in einem Raum von 26⁰C entwickelt. Die Kolben der

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Gruppe Ag erhalten nach 48 und 72 Stunden Inkubation zwei neue Zusätze der Sulfanilamidlösung (Gesamtkonzentration an Sulfanilamid 0,6 g/l). Nach jeder der Zugaben wird die Bebriitung der Kolben unter denselben Rühr- und Temperaturbedingungen wieder aufgenommen.

Nach 7-tägiger Inkubation unter den oben angegebenen Bedingungen behandelt man jedesmal einen Kolben aus jeder der Gruppen, um das 32.999 EP festzustellen. Diese Behandlung wird bewirkt, indem in jeden Kolben 4 g Oxalsäure (was den pH-Wert der Brühe auf 1,5 bringt) und 50 cnr absolutes Äthanol zugesetzt wird. Der dieses Gemisch enthaltende Kolben wird hermetisch verschlossen und 1 Stunde lang auf einen mit 220 Umdrehungen je Minute bewegten Tisch gegeben. Die Mischung wird dann über Papier filtriert und das Piltrat unter vermindertem Druck bei 5O°C bis auf die Halfte seines Anfangsvolumens (50 cnr) destilliert. Das Konzentrat wird durch Zugabe von 5 ri-Natronlauge

auf pH 4,5 eingestellt und dann gibt man nacheinander 50 cnr eines Gemisches aus Methylenchlorid/n-Butanql (80-20 in ToI.) und 25 cnr⁵ 0,5 M Boratpuffer von pH 9,0 zu. Mach Rühren im geschlossenen Gefäß gewinnt man durch Dekantieren die gefärbte Lösungsmittelphase und wiederholt die Behandlung bei den

•7.

wäßrigen Mutterlaugen, welche mit 50 cnr desselben Lösungsmittelgemisches ausgeschüttelt werden. Die organischen Phasen werden vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Yolumen der organischen Phase wird schließlich durch Zugabe

•z

desselben Lösungsmittelgemisches auf 100 cnr eingestellt.

Um die Erzeugung von 32.999 RP zu bestimmen, unterwirft man diese Extrakte der Dünnschichtchromatographie.

1. Die Erzeugung wird qualitativ ausgewertet, indem auf Silicagelplatten (Merck 60 - Glasunterlage ohne Fluoreszenz-« indikator) 100 nl des Extraktes und 2,5 bis 10 pg einer Standardprobe von reinem 32.999 RP gegeben werden. Die Platten werden mit einem Gemisch: Methylenehlorid - Äthanol - Essigsäure · Wasser (80/20/10/4 in YoI.) entwickelt. Die eventuell vorhandene Anwesenheit von 32.999 RP in den Extrakten wird nach dem

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Entwickeln ersichtlich, indem die Chromatogramme entweder am Tageslicht oder an ultraviolettem Licht bei 254 nm geprüft werden.

2. Die Erzeugung von 32.999 RP wird quantitativ bestimmt, indem auf Silicagelplatten (Merck 60 JP 254 - Glasträger mit Fluoreszenzindikator) Volumina von Extrakten, die nach der qualitativen Chromatographie bestimmt wurden, zwischen 10 und 100 ul gegeben werden. Man gibt auch auf diese Platten eine Reihe (0,5 bis 1,5 ug) von reinem 32.999 RP-Proben. Die Platten werden mit dem oben beschriebenen Lösungsmittelgemisch entwickelt. Nach dem Entwickeln werden diese Platten auf den Plattenleser "Chromoscan" gegeben, der die Pics entsprechend dem in den Extrakten enthaltenen 32.999 RP registriert. Man rechnet die Flächen dieser Pics aus und diejenigen der entsprechenden aus den Proben von reinem 32.999 RP und man bestimmt so die Erzeugung von 32.999 RP dieser Kulturen.

Bei den mit dem Sulfanilamid behandelten Kulturen erhielt man durch diese Bestimmungsmethode die folgenden Ergebnisse:

Gruppen	Sulfanilamid (g/l)	32.999 RP (mg/1)
A1	0	0
A2	0,2	0
A3	0,4	26
V	0,6	42
A5	0,8	33
A6	0,6 (0,2 χ 3)	50

Beispiel 13

Man verteilt in 300 cm -Kolben in einer Menge von 50 cnr je Kolben ein Medium A, das mit dem in Beispiel 12 beschriebenen identisch ist.

Man stellt auch eine Sulfanilamidlösung mit 10 mg/cnr unter den in Beispiel 12 beschriebenen Bedingungen her.

609839/1075

Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen A₁, A¹ ^, A^ und A¹ c von je zwei Kolben aufgeteilt und man gibt in jeden Kolben der: —

Gruppen A^ und A'c: 4 cm' der Sulfanilamidlösung (0,8 g/l), die Kolben der Gruppen A₁ und A¹.. erhalten keinen Zusatz.

Man beimpft dann alle Kolben:

die Gruppen A₁ und A^ mit 2,5 cnr je Kolben einer Impfkultur

von Streptomyces coeruleorubidus DS 8899 (HBRL 3046), die

72 Stunden alt ist,

die Gruppen A^ und A¹^ mit 2,5 cm⁵ je Kolben einer Impfkultur

■von Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723 (ITElRL 3045), die

72 Stunden alt ist.

Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdrehungen je Minute bewegten lisch in einem Raum von 26⁰C entwickelt. Die 7 Tage unter diesen Bedingungen bebrüteten Kolben werden dann wie in Beispiel 12 beschrieben behandelt, um das 32.999 RP festzustellen.

Es wurden folgende Produktionen erhalten:

Proben	Sulfanilamid (g/l)	Produktion von 32.999 RP (in mg/1)	Streptomyces DS 31.723
A1 A^ A5 V5	O 0,8	Streptomycins DS 8.899	0 25
0 17

Beispiel 14

Man verteilt in 300 cm⁵-Kolben in einer Menge von 50 cnr⁵ je Kolben ein Medium A, das mit dem in Beispiel 12 beschriebenen identisch ist.

Man bereitet ebenfalls eine Sulfanilamidlösung mit 10 mg/cm^ unter den in Beispiel 12 beschriebenen Bedingungen.

Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen zu je 2 Kolben aufgeteilt und man gibt in jeden Kolben:

60 9 8397 10 75

Gruppe A₀: 1 cnr der Sulfanilamidlösung (0,2 g/l) Gruppe A,: 2 cnr der Sulfanilamidlösung (0,4 g/l) Gruppe A,: 3 cm⁵ der Sulfanilaaidlösung (0,6 g/l).

Die Kolben der Gruppe A^ erhalten keinen Zusatz.

Nach diesen Zugaben "beimpft man alle Kolben der Gruppen A₁, A«, A, und A. mit 2,5 cnr je Kolben einer Impfkultur von Streptomyces bifurcus DS 23.219 (NRRl 3539), die 72 Stunden alt ist.

Die Kulturen werden auf einem mit 22o Umdrehungen je Minute bewegten Tisch in einem Raum von 26⁰C entwickelt. Die unter diesen Bedingungen während 7 Tagen inkubierten Kolben werden zur Bestimmung des 32.999 RP wie in Beispiel 12 beschrieben behandelt. Es wurden die folgenden Erzeugnisse erhalten:

Gruppe	Sulfanilamid (g/l)	32.999 RP (mg/1)
A1	0	0
A2	0,2	36
H	0,4	28
H	0,6	13

Beispiel 15

Man stellt ein Züchtungsmedium B mit folgender Zusammensetzung her:

Sojamehl 30 g

Distillers¹ Solubles 5 g

teilweise hydrolysierte Stärke (lox head") 5 g

Sojaöl (d = 0,92) * 27,5 g

Natriumchlorid 10 g

Destilliertes Wasser 1000 cnr*.

Dieses Medium, dessen pH-Wert durch Zugabe von n-Natronlauge auf 7,20 eingestellt ist, wird in 300 cnr^Kolben in einer Menge

• 609839/1075

von 50 cm^ je Kolben aufgeteilt und während 20 Minuten "bei 122⁰C sterilisiert. Each dem Abkühlen beträgt der pH-Wert 6.60.

Man stellt eine wässrige Sulfanilamidlösung her, die mit der in Beispiel 12 beschriebenen identisch ist.

Die das sterile Medium B enthaltenden Kolben werden in zwei Gruppen B₁ und B₂ mit je zwei Kolben eingeteilt. Die Kolben der Gruppe B^ erhalten keinen weiteren Zusatz. Zu jedem Kolben der Gruppe B₂ gibt man 2 cm^ der Sulfanilamidlösung (0,4 g/l). Nach diesen Zugaben beimpft man alle Kolben der Gruppen B^ und B₂ mit 2,5 cnr einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 3* 723 (NRRL 3045), die 72 Stunden alt ist. Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 26⁰C entwickelt. Die unter diesen Bedingungen 7 Tage lang inkubierten Kolben werden wie in Beispiel 12 beschrieben behandelt, um den Gehalt an 32.999 RP festzustellen. Es wurden die folgenden Produktionen erhalten:

Gruppen	Sulfanilamid (g/l)	32.999 RP (mg/1)
Bl B2	0 0,4	0 7

Beispiel 16

Man verteilt ein Medium A, das mit dem in Beispiel 12 beschriebenen identisch ist, auf 300 cm -Kolben in einer Menge von 50 cnr je Kolben.

Man stellt weiterhin eine Sulfathiazollösung mit 10 mg/cnr unter den in Beispiel 12 für die Herstellung der Sulfanilamidlösung beschriebenen Bedingungen her.

Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen mit je zwei Kolben eingeteilt, und man macht bei jedem Kolben folgenden Zusatz:

609839/10 7-5

Gruppe A₇ : 0,25 cnr der Sulfathiazollösung Gruppe Ao : 1 cnr der Sulfathiazollösung Gruppe Ag : 0,5 cnr der Sulfathiazollösung

(0,05 g/i)

(0,2 g/l)

Die Kolben der Gruppe

erhalten keinen Zusatz,

Man beimpft dann jeden Kolben der Gruppen A₁, A

Ao und A_n mit ο 9

-Z ·*■ I ^ S

2,5 cnr einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 7·126 (NRRL 8098), die 72 Stunden alt ist. Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 26⁰C entwickelt. Die Kolben der Gruppe A_Q erhalten nach 48 und 72

7 3

Stunden Inkubation zwei neue Zugaben von 0,5 cm der Sulfathiazollösung (Gesamtkonzentration an Sulfathiazol 0,3 g/l)· Nach jeder dieser Zugaben wird die BebrUtung der Kolben unter denselben Rühr- und Temperaturbedingungen wiederaufgenommen.

Die während 7 Tagen bebrüteten Kolben werden dann zur Bestimmung des 32.999 RP wie in Beispiel 12 beschrieben behandelt. Es wurden die folgenden Produktionen erhalten:

Gruppen	Sulfathiazol	(g/l)	32.999 RP	(mg/1)
A1	0		0
A7	0,05		0
A8	0,2		51
A9	0,3 (0	,1 x 3)	64

Beispiel 17

Man verteilt ein Medium A, das mit dem in Beispiel 12 beschriebenen identisch ist, auf 300 cnP-Kolben in einer Menge von 50 cm-⁵ je Kolben.

Man stellt ferner unter den in Beispiel 16 beschriebenen Bedingungen eine Sulfathiazollösung mit 10 mg/crrr her. c

Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen zu je zwei Kolben eingeteilt. Die Kolben der Gruppe A^ erhalten keinen weiteren Zusatz. In jeden der anderen Kolben werden folgende Zusätze gegeben:

60 983 9/ 1-0 7 5

Gruppa A Gruppe A

₁₁:

Gruppe A_l2 ^:

0,5 crn^ der Sulfathiazollösung 2 cnr der Sulfathiazollösung

der Sulfathiazollösung

cnr

(0,1 g/l) (0,4 g/l) (0,5 g/l)

_1Q

Nach diesen Zugaben beimpft man alle Kolben der Gruppen A₁ A^₁ und A₁₂ mit 2p cm einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 31 723 (NRRL 3045), die 72 Stunden alt ist. Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 26°C entwickelt.

Die unter diesen Bedingungen während 7 Tagen inkubierten Kolben werden wie in Beispiel 12 beschrieben zur Feststellung des 32.999 RP behandelt. Es wurden die folgenden Produktionen erhalten:

Gruppen	Sulfathiazol	(g/l)	32.999 RP	(mg/1)
Al	0		0
A1O	0,1		0
A11	0,4		9
A12	0,5		13

Beispiel 18

Man verteilt ein Medium A, das mit dem in Beispiel 12 beschriebenen identisch ist, auf 300 cnr-Kolben in einer Menge von 50 cnr je Kolben.

Man stellt ferner unter den in Beispiel 16 beschriebenen Bedingungen eine Sulfathiazollösung mit 10 mg/cnr her.

Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Grup-? pen zu je zwei Kolben eingeteilt, und man bewirkt bei jedem Kolben die folgenden Zusätze:

Gruppe A₁₀ : 0,5 cnr der Sulfathiazollösung (0,1 g/l) Gruppe Ag : 1 cnr der Sulfathiazollösung (0,2 g/l) Gruppe A₁₁ : 2 cnr der Sulfathiazollösung (0,4 g/l).

Die Kolben der Gruppe A₁ erhalten keinen Zusatz.

6 0 9 83 S/ 1 075

Nach den Zugaben beimpft man jeden Kolben der Gruppen A₁, ^Aio' Ag und A₁₁ mit 2,5 cnr einer Impfkultur von Streptomyces bifurcus DS 23~"219 (NRRL 5559), die 72 Stunden alt ist. Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 26°C entwickelt.

Die unter diesen Bedingungen während 7 Tagen inkubierten Kolben werden zur Bestimmung von 52.999 RP wie in Beispiel 12 beschrieben behandelt. Es wurden folgende Produktionen erhalten:

Gruppen	Sulfathlazol	(g/l)	32.999 RP	(mg/1)
A1	0		0
Al0	0,1		18
A8	0,2		22
All	0,4		5

Beispiel 19 .

Man stellt ein Kulturmedium C her, enthaltend:

Bohnenkörner .... 40 g

distiller's solubles .... 10 g

Glucose .... 15 g

Sojaöl (d = 0,92) 18,5 g

Kobaltchlorid-hexahydrat .... 0,02 g,

was folgendermaßen erhalten wird:

Die Bohnen werden nach 45 Minuten langem Kochen im Autoklaven mit 500 cnr destilliertem Wasser bei 122°C zu Püree verarbeitet.

Man gibt dann die distiller's solubles, das Sojaöl, das Kobalt-Chlorid und das «destillierte Wasser zu, so daß ein Volumen von 900 cnr erhalten wird.

Der pH-Wert der Mischung wird durch Zugabe von 5n-Natronlauge auf 7,2 eingestellt. Das Gemisch wird auf 300 cm3-Kolben in einer Menge von 45 cnr je Kolben verteilt. Die Kolben werden 20 Minuten lang bei 122°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen gibt man unter

" 60 9839/1075

sterilen Bedingungen in jeden Kolben 5 cnr einer sterilen Lösung von 15 #-iger Glucose. Der pH-Wert dieses sterilen, zur Beimpfung fertigen Mediums beträgt 6,70.

Man stellt ferner eine wässrige Sulfathiazollosung her, die mit der in Beispiel 16 beschriebenen identisch ist.

Die das sterile Medium C enthaltenden Kolben werden in zwei Gruppen C^ und C₂ zu je zwei Kolben aufgeteilt. Die Kolben der Gruppe C₁ erhalten keinen weiteren Zusatz. In jeden Kolben der Gruppe C₂ gibt man 0,5 cnr der Sulfathiazollosung (0,1 g/l).

Nach dieser Zugabe beimpft man jeden Kolben der Gruppen C₁ und

•5 ^x

C₂ mit 2,5 cnr einer Impfkultur von Streptomyces bifurcus

DS 23 2I9 (NRRL 3539)> die 72 Stunden alt ist. Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 26⁰C entwickelt. Die unter diesen Bedingungen während 10 Tagen inkubierten Kolben werden zur Bestimmung von 32.999 RP wie in Beispiel 12 beschrieben behandelt. Es wurden die folgenden Produktionen erhalten:

Gruppen	Sulfathiazol (g/l)	32.999 RP (mg/1)
Cl C2	■ 0 0,1	0 16

Beispiel 20

Man verteilt ein Medium A, das mit dem in Beispiel 12 beschriebenen identisch ist, auf 3OO cnr-Kolben in einer Menge von 50 cnr je Kolben.
Man stellt ferner eine Sulfapyridazinlosung mit 10 mg/cnr her,

indem das Produkt in einem Gemisch aus destilliertem Wasser und ο

5n-Salzsäure gelöst wird. Die Lösung, deren pH-Wert 2,0 beträgt, wird durch Filtrieren über eine Membran "Millipore 0,45 μ" sterilisiert.

Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in drei Gruppen zu je zwei Kolben eingeteilt, und man bewirkt unter sterilen

60983 9/1075

(0,1 g/l) (0,2 g/l).

- 57 Bedingungen in jeden Kolben den folgenden Zusatz:

Gruppe A-,, : 0,5 cnr der Sulfapyridazinlösung Gruppe A-* : 1 cnr der Sulfapyridazinlösung

Die Kolben der Gruppe A₁ erhalten keinen Zusatz.

Dann beimpft man jeden Kolben der Gruppen A-, A--, und A₁^ mit 2,5 cnr einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098), die 72 Stunden alt ist.

Die Kulturen werden unter Rühren unter den in Beispiel 12 beschriebenen Bedingungen während 7 Tagen bebrütet. Die unter den in Beispiel 12 beschriebenen Bedingungen ausgeführten Bestimmungen ergeben die folgenden Resultate:

Gruppen	Sulfapyridazin (g/l)	32.999 RP (mg/1)
Al A13 A14	0 0,1 0,2	0 38 32

Beispiel 21

Man verteilt ein Medium A, das mit dem in Beispiel 12 beschriebenen identisch ist, auf 300 cnP-Kolben in einer Menge von 50 cnr je Kolben.

Man stellt ferner eine Amethopterinlosung mit 20 mg/enr her, indem das .Produkt in einer Mischung aus destilliertem Wasser und 5n-Natronlauge gelöst wird. Die Lösung, deren pH-Wert 10,0 beträgt, wird durch Filtrieren über eine Membran "Millipore 0,45 μ" sterilisiert.

Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen A^, A.f-, A-^ und A₁₇ zu je zwei Kolben eingeteilt. Die Kolben der Gruppe A^ erhalten keinen weiteren Zusatz.

In jeden der Kolben der drei weiteren Gruppen macht man folgenden Zusatz:

6 0 9 8 3 9 / H) 7 5

Gruppe A₁₅ Gruppe A^g: Gruppe A₁₇

0,25 cnr der Amethopterinlösung 0,6 cnr der Amethopterinlösung 1 cnr der Amethopterinlösung

(0,24 g/l) (0,4 g/l).

Nach diesen Zusätzen beimpft man jeden Kolben der Gruppen A^, A^,-» A^g und kyj mit 2,5 cnr einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 7126(NRRL 8098), die 72 Stunden alt ist. Die Kulturen werden während 7 Tagen unter Rühren unter den in Beispiel beschriebenen Bedingungen inkubiert.

Die Ergebnisse der Bestimmung von 32.999 RPj ausgeführt unter den üblichen Bedingungen, sind die folgenden:

Gruppen	Amethopterin	(g/l)	32.999 RP	(mg/1)	■
Al	0		0
A15	0,1		7,0
A16	0,24		11
A17	0,4		1

Beispiel 22

Man verteilt ein Medium A, das mit dem in Beispiel 12 beschriebenen identisch ist, auf 300 cnr-Kolben in einer Menge von 50 cnr je Kolben.

Man stellt ferner eine Barbitallösung mit 50 mg/cm her, indem das Produkt in einem Gemisch aus destilliertem Wasser und 5n-Natronlauge gelöst wird. Die Lösung, deren pH-Wert 11,0 beträgt, wird durch Filtrieren über eine Membran "Millipore 0,45 u" sterilisiert.

Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen A^, Ajo, AjQ und A₂₀ zu je zwei Kolben eingeteilt, und man bewirkt bei federn Kolben der Gruppen A^g und A-g die folgenden Zusätze:

Gruppe A^g : 0,5 cnr der Barbitallösung (0,5 g/l) Gruppe A^q : 2 cnr der Barbitallösung (2' g/l) .

Die Kolben der Gruppe A. erhalten keinen Zusatz und die Kolben der

609839/1 Π 75

.- 59 -

Gruppe Ap₀ erhalten unter den weiter unten angegebenen Bedingungen einen Zusatz Im Verlaufe der Züchtung.

Man beimpft dann jeden Kolben der Gruppen A₁, ^Ai8* ^A1Q ^{und A}20 mit 2,5 cnr einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098), die 72 Stunden alt ist. Die Kolben werden auf einem mit 220 Umdr./Min. bewegten Tisch in einem Raum von 26⁰C inkubiert. Nach 24-stündiger Inkubation gibt man in jeden Kolben der Gruppe A₂₀ 1,5 enr der Barbitallösung (1,5 g/l) und die Inkubation dieser Kolben wird unter denselben Rühr- und Temperaturbedingungen fortgesetzt.

Nach 7-tägiger Inkubation werden die Kolben unter den in Beispiel 12 beschriebenen Bedingungen behandelt. Es werden folgende Ergebnisse erhalten:

Gruppen	Barbital (g/l)	32.999 RP (mg/1)
A1 Al8 A19 A20	0 0,5 2 1,5	0 11 23 50

Wenn man wie oben beschrieben arbeitet unter Verwendung eines Kulturmediums A, das in Gruppen A₃, A₂₁, Ap₂, A₂-, und Apj, von je zwei Kolben verteilt ist, wobei die Gruppen A₂₁, A₃₃, A₂-, und A₂₂, Zusätze von 0,5 g/l Natriumphenobarbital, bzw. 0,5 g/l Natriumbutobarbital (Natriumsalz der 5-Butyl-5-äthyl-barbitursäure), bzw. 0,5 g/l und 2' g/l Pentiobarbital (5-Äthyl-5-(l-methyl-butyl)-thiobarbitursäure) erhalten und eine Inkubation von 9 Tagen durchgeführt wird, so erhält man die folgenden Resultate:

609839/1075

- 6ο -

Gruppen	Adjuvantien (g/l)	32.999 RP (mg/1)
Al A21 Α22 Α23 A24	O Phenobarbital 0,5 Butobarbital 0,5 Penthiobarbital 0,5 Penthiobarbital 2	0 9 12 12 22

Beispiel 23

a) Fermentation

Man gibt in ein Fermentationsgefäß von 75 Liter;

Sojamehl

distiller's solubles

teilweise hydrolysierte Stärke Sojaöl

Natriumchlorid

Leitungswasser auffüllen auf

1500 g 250 g

1750 g _ 750 om" 500 g

45 1.

Der pH-Wert wird durch Zugabe von 40 cnr 10n-Natronlauge auf 7,50 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch Durchlaufen von Dampf von 122°C während 4o Minuten. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon aufgrund der Kondensation des Dampfes im Verlaufe der Sterilisation 50 1; der pH-Wert beträgt 6,70. Man beimpft dann mit 200 cnr einer Kultur im bewegten Erlenmeyer-Kolben von Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098). Die Kultur wird während 25 Stunden bei 30°C entwickelt, wobei gerührt und mit steriler Luft belüftet wird; sie ist dann zum Animpfen der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem Fermentationsgefäß von 8OO 1, das mi?t den folgenden Substanzen beschickt ist, durchgeführt: Sojamehl .... 3,2 kg

Bäckerhefe-Paste .... 24 kg

Lactose .... 23,2 kg

Natriumchlorid .... 0,8 kg

Monokaliumphosphat .... 0,4 kg

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Magnesiumsulfat-heptahydrat .... O,O4 kg

Eisen 11-sulfath.eptahydrat .... 0,04 kg

Zinksulfat-heptahydrat .... 0,04 kg

Antischaummittel .... JO cnr

Leitungswasser auffüllen auf 200 1.

Nach dem Einstellen des pH-Werts durch Zugabe von 210 cnr 1On-Natronlauge gibt man zu;

Glycerin .... 7,6 kg

Calciumcarbonat .... 0,800 kg

Leitungswasser auffüllen auf 36O 1.

Der pH-Wert des Mediums beträgt dann 6,45· Man sterilisiert die Bouillon durch Durchperlen von Dampf bei 122°C während 40 Minuten; nach dem Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon aufgrund der Kondensation des Dampfes im Verlaufe der Sterilisation 400 Ij der pH-Wert des Mediums beträgt 6,25.

Man gibt dann 10 1 einer wäßrigen sterilen Lösung zu, welche 308 g Sulfanilamid enthält.

Der pH-Wert der Bouillon wird 6,80. Man beimpft mit 40 1 der oben beschriebenen Impfkultur aus dem 75 1-Fermentationsgefäß. Die Kultur wird unter Rühren mit einer Turbine mit 205 Umdr./Min. und unter Belüften mit steriler Luft von 20 nr je Stunde bei 27°C gehalten. Nach 24 Stunden Züchtung gibt man 3 1 wässrige sterile Lösung mit:

Sulfanilamid .... 44 g

zu und setzt die Fermentation fort. Nach 140 Stunden Züchtung beträgt der pH-Wert der Brühe 6,75 und ihr Volumen 350 1; der Gehalt der Brühe an 32.999 RP beträgt 35 mg/1.

b) Extraktion c

Zu 350 1 Brühe, die wie vorstehend erhalten wurde, gibt man 350 Methanol und 6n-Natronlauge, um den pH-Wert auf 7,5 zu bringen. Man rührt während einer Stunde. Nach Zugabe von 25 kg Filterhilfe wird die Suspension auf einer Filterpresse filtriert. Man sammelt das Filtrat. Der Filterkuchen wird mit 100 1 wässrigem

8 ü 9 8 3 9 / 1 Γ) 7 5

50 #-igem Methanol gewaschen. Das Piltrat und die Waschwässer werden vereinigt und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 250 1 eingeengt. Nach dem Alkalischmachen durch Zugabe von 220 cnr 6n-Natronlauge wird das in diesem Konzentrat enthaltene Antibiotikum zweimal mit I50 1 eines Gemisches aus Methylenchlorid/Butanol (80 - 20 in Volumina) extrahiert. Die 238 1 der vereinigten organischen Extrakte werden unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 30 1 eingeengt. Man gibt dann zu dem Konzentrat 100 cnr n-Butanol, das mit lln-Salzsäure gesättigt ist, zu. Nach dem Einengen bis auf ein Volumen von 3 1 gibt man die Lösung langsam in 21 1 Hexan. Der erhaltene Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 137 g rohes 32.999 RP-Hydrochlorid.

c) Reinigung

1) 112 g rohes 32.999 RP-Hydrochlorid, das wie vorstehend angegeben erhalten wurde, werden in 1 1 Wasser von 50°C in Lösung gebracht. Die Lösung, deren pH-Wert 2,9 beträgt, wird auf einer Glasfritte filtriert. Die in dem Filtrat enthaltenen gefärbten Verunreinigungen werden mit zweimal 500 cnr und dann einmal 1 1 Chloroform extrahiert. Nach Zugabe von 75 g Natriumchlorid zu der wässrigen Phase extrahiert man das Antibiotikum mit dreimal 0,5 1 n-Butanol. Der pH-Wert der wässrigen Phase wird durch Zugabe von konz. Natronlauge auf 9*5 eingestellt, und das verbleibende Antibiotikum wird mit 0,5 1 n-Butanol extrahiert.

Die das Antibiotikum enthaltenden Butano!extrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 1 1 eingeengt. Man gibt dann 1 1 Chloroform zu diesem Konzentrat. Die Lösung wird mit zweimal 500 cnr Wasser, das auf pH 9*5 alkalisch gemacht wurde, gewaschen. Die Waschwässer werden mit zweimal 500 cnr eines Gemisches aus Chloroform/n-Butanol (80-20 in Volumina) bei pH 9_f5 extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Während des Einengens gibt man 300 cnr eines Gemisches n-Butanol/Wasser/ lln-Salzsäure (94-5-1) in Volumina) zu. Das Einengen wird bis zur Erzielung eines Volumens von 150 cnr⁵ fortgesetzt, und dann wird die Lösung langsam zu 2 1 Hexan gegeben. Der erhaltene

609839V1075

Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 30 g eines Produktes, das 32.999 RP-Hydrochlorid enthält.

2) 13 g des so erhaltenen Produktes werden in 26 cnr eines Gemisches Wasser/Dioxan (20-80 in Volumina) bei 35°C in Lösung gebracht. Das Antibiotikum kristallisiert durch langsame Zugabe von 624 cm^ Dioxan. Nach 3-stündigem Rühren werden die Kristalle abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 2 g eines kristallisierten Produktes, das 32.999 RP-Hydrochlorid enthält.

3) 4,47 g eines wie oben beschrieben erhaltenen kristallisierten Produktes werden in 4o cnr Wasser in Lösung gebracht. Die Lösung wird filtriert. Das in dem Filtrat enthaltene Hydrochlorid des Antibiotikums 32.999 RP kristallisiert durch Zugabe von 405 cn? Aceton unter Rühren. Die erhaltenen Kristalle werden abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 2,47 g eines Produktes, das kristallisiertes 32.999 RP-Hydrochlorid enthält.

4) 2,84 g des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes werden in 28,4 cm eines Gemisches Methanol/Aceton (50-50 in Volumina) in Lösung gebracht. Man gibt zu der Lösung 16,9 cnr eines Gemisches aus Aceton/Wasser (84-16 in Volumina). Durch Erwärmen auf 30°C und dann Abkühlen kristallisiert das 32.999 RP-Hydrochlorid. Die erhaltenen Kristalle werden abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 2,33 g halbgereinigtes Hydrochlorid von kristallisiertem 32.999 RP·

5) 1*85 g des wie oben beschrieben erhaltenen halbgereinigten Hydrochloride werden in 400 cnr Wasser bei pH 5*5 in Lösung gebracht. Gefärbte Verunreinigungen werden aus dieser Lösung mit zehnmal 400 cnr eines Gemisches n-Butanol/Chloroform (20-80 in Volumina) extrahiert. Durch Einengen der wässrigen Phase, wobei im Verlaufe des Einengens n-Butanol zugefügt wird, erhält man eine Butanol-Phase von 75 cnr, welche langsam in 1,5 1 Hexan gegeben wird. Der erhaltene Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 1,4 g reines 32.999 RP-Hydrochlorid, das mit dem in Beispiel 8 beschriebenen Produkt identisch ist.

9839/1075

Beispiel 24

A. Fermentation —

Man gibt in ein Fermentationsgefäß von 170 1:

Maisquellwasser (mit 50 % Trockenextrakt) 2400 g

Saccharose J56"OO g

Ammoniumsulfat 240 g

Calciumcarbonat 900 g

Leitungswasser auffüllen auf 110 1.

Das Medium,dessen pH-Wert 6,0 beträgt, wird durch Durchleiten von Dampf bei 122°C während 40 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon aufgrund der Kondensation des Dampfes im Verlaufe der Sterilisation 120 1; der pH-Wert beträgt 6,65. Man beimpft mit 250 cnr einer im gerührten Erlenmeyer erzeugten Kultur von Streptomyces atroviolaceus DS 8938. Die Kultur wird während 33 Stunden unter Rühren und Belüften mit steriler Luft bei 26⁰C entwickelt; sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem Fermentationsgefäß von 800 bewirkt, das mit folgenden Substanzen beschickt ist:

Sojamehl ..... 22 kg

distiller's solubles 2,750 kg

Stärke (teilweise hydrolysiert) . 16,500 kg

Sojaöl 2,750

Natriumchlorid 5,500 kg

Leitungswasser aufgefüllt auf 510 1.

Der pH-Wert des Mediums wird durch Zugabe von 500 crrr* 10n-Natronlauge auf 7*5 eingestellt, dann sterilisiert man das Medium durch Durchleiten von Dampf bei 122⁰C während 4o° Minuten. Nach dem Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon aufgrund der Kondensation des Dampfes im Verlaufe der Sterilisation 550 1. Der pH-Wert des Mediums ist 6,60. Man beimpft mit 55 1 der oben beschriebenen Impfkultur aus dem 170 1-Fermentationsgefäß. Die Kultur wird während II7 Stunden bei 26⁰C unter Rühren mit einer Turbine

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mit 205 Umdr./Min. und unter Belüften mit steriler Luft von 15 tir/Std. entwickelt. Der pH-Wert nach Beendigung der Züchtung

ist 7,60.

B. Extraktion

Zu 56O 1 der wie beschrieben erhaltenen Brühe gibt man 28 kg Oxalsäure. Nach einstündigem Rühren bei 4o°C und Zugabe von 25 kg Filterhilfe wird die angesäuerte Brühe auf der Filterpresse filtriert. Der Mycelkuchen wird mit 120 1 Wasser von 5O°C, das 5 kg Oxalsäure enthält, gewaschen. Das Filtrat und die vereinigten Waschwässer, deren pH 1 ist, werden auf 1O°C abgekühlt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 50 1 6n-Natronlauge auf 4,5 eingestellt, Das in dieser Lösung enthaltene Antibiotikum wird durch Passieren an einer Säule mit 25 1 Amberlite IRC 50, H⁺-Form, fixiert. Das Harz wird fortlaufend mit Wasser gewaschen, bis der Abfluß farblos herauskommt, dann mit lOO 1 eines Gemisches aus Methanol/Wasser (50-50 in Volumina) und mit 100 1 eines Gemisches Methanol/ Wasser (90-I0 in Volumina). Schließlich wird das Antibiotikum mit 250 1 eines Gemisches Methanol/Wasser (90-I0 in Volumina), das 1 % (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid enthält, eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck (5 - 10 mm Hg) bei 4o°C bis auf ein Volumen von 20 1 eingeengt. Das Konzentrat, dessen pH-Wert durch Zugabe von 1ln-Natronlauge auf 9 eingestellt wird, wird einmal mit 20 1 und dann zweimal mit 10 1 Chloroform extrahiert. Man erhält insgesamt 55 1 Extrakte, welche unter vermindertem Druck (5 - 10 mm Hg) bei 4o°C bis auf ein Volumen von 2 1 eingeengt werden. Die verbleibende Lösung wird durch Zugabe von 50 cnr n-Butanol, das mit lln-Salzsäure gesättigt ist, angesäuert und von neuem bis auf ein Volumen von 1 1 eingeengt. Die Lösung wird langsam in 7 1 Hexan gegossen. Der sich bildende Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 13 g rohes Hydrochlorid des Antibiotikums 52.999 RP.

C. Reinigung

a) Das Antibiotikum wird durch Gegenstromverteilung in drei 2 Liter-Korben A, B, C gereinigt.

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Man stellt ein Gemisch aus Methylenchlorid/n-Butanol/M/15-Phosphatpuffer vom pH 7*58 (8-2-10 in Volumina) her. Wenn das Gemisch im Gleichgewicht ist, trennt man die beiden Phasen.

In den Kolben A gießt man 500 cnr eines Gemisches aus Phosphorsäure (85 Gew.-^) und Wasser (1-125 in Volumina) und 500 cnr der schweren organischen Phase. Man löst in diesem Phasengemisch 13 g des wie oben unter B beschrieben erhaltenen rohen Antibiotikum-Hydrochlorids. Nach 15 Minuten Rühren und Entfernen von Unlöslichem durch Filtrieren stellt man den pH-Wert durch Zugabe von η-Natronlauge auf 7,5 ein.

In die Kolben B und C gibt man 500 cm-⁵ der leichten wässrigen Phase, wobei der pH-Wert mittels 85 /6-iger Phosphorsäure in dem Kolben B auf 7 und in dem Kolben C auf 6,5 eingestellt wird.

Wenn man von dem Kolben A ausgeht, um auf die Kolben B und C überzugehen, so bewirkt man eine Gegenstromverteilung in fünf Abschnitten, wobei die schwere Phase (Lösungsmittel) als mobile Phase und die leichten Phasen (wässrige) vom pH 7*5 bis 7 und 6,5 als stationäre Phasen dienen, wobei jedesmal 500 cnP mobile Phase eingesetzt werden und der pH-Wert der stationären Phasen konstant gehalten wird.

Das in der wässrigen Phase des Kolbens C erhaltene Antibiotikum wird bei. pH 9,5 mit zweimal 500 cnr eines gemisches aus Chloroform/n-Butanol (8-2 in Volumina) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bei 4o°C eingeengt. Während des Einengens gibt man 30 cnr n-Butanol, das 6 % (in Volumina) 2n-Salzsäure enthält, zu. Das Konzentrat wird auf ein Volumen von 5 cm-⁵ gebracht, dann wird es langsam in 500 cnr Hexan gegossen. Der sich bildende Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 275 mg

halbgereinigtes 32.999 RP-Hydrochlorid.

b) 80 mg des wie oben beschrieben erhaltenen Hydrochlorids werden in einem Gemisch aus 1 cm-⁵ Wasser und 1 cm-⁵ Methanol in Lösung gebracht. Diese Lösung wird gleichmäßig in Form eines linearen Niederschlags auf vier Platten für analytische Dünnschicht-

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Chromatographie mit Siliciumdioxidgel-Merck verteilt. Die Platten werden während 1 Stunde in einem Trog, dessen Wände mit Filterpapier bedeckt sind, der ein Gemisch aus Methylenchlorid/Ameisensäure/Methanol (80-17-5 in Volumina) enthält, entwickelt. Nach dem Trocknen wird die Zone, welche das 52.999 RP enthält, durch Abkratzen des Siliciumdioxids gewonnen. Das erhaltene Pulver wird in 40 cnr Wasser suspendiert, das Antibiotikum wird bei pH 9,5 zweimal mit 20 cm Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden unter vermindertem Druck (5 - 10 mm Hg) bei 4o°C eingeengt. Während -"-»s Einengens gibt man 1 cm5 n-Butanol, das 6 % (in Volumina) 2n-Salzsäure enthält, zu. Das Konzentrat wird bis auf ein Volumen von 2 enr gebracht, dann langsam in 50 cm Hexan gegossen. Der gebildete Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 4 mg reines 32.999 RP-Hydrochlorid in Form eines rot-orangenfarbenen mikrokristallinen Pulvers, das bei etwa 200⁰C unter Zersetzung schmilzt und das mit dem gemäß Beispiel 8 erhaltenen Produkt identisch, ist.

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Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche wenigstens das 32.999 RP in Form.der freien Base oder eines Säureadditionssalzes zusammen mit jedem anderen Produkt enthalten.

Diese Zusammensetzungen können in jeder für die vorgesehen«Verabreichungsart geeigneten Form vorliegen. Die parenterale Verabreichung ist die bevorzugte Verabreichungsform, insbesondere auf intravenösem Wege.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung können wässrige oder nicht-wässrige sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein. Als Lösungsmittel oder Träger kann man Propylenglykol, Polyäthylenglykol, pflanzliche öle, wie insbesondere Olivenöl, und injizierbare organische Ester, beispielsweise Äthyloleat, verwenden. Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsmittel, insbesondere Netzmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel enthalten. Die Sterilisation kann auf verschiedene Weise erfolgen, beispielsweise mit Hilfe eines bakteriologischen Filters, indem der Zusammensetzung sterilisierende Mittel einverleibt werden, durch Bestrahlung oder durch Erhitzen. Sie können auch in Form von festen sterilen Zusammensetzungen hergestellt werden, welche im Augenblick der Verwendung in sterilem Wasser oder in jedem anderen injizierbaren sterilen Medium ge löst oder dispergiert werden können.

Das Antibiotikum 32.999 RP und seine Salze sind gegen feste und Ascites-Tumoren wirksam und werden insbesondere bei der Behandlung von Carcinom in der Humanmedizin verwendet, wobei die Tagesdosen für einen Erwachsenen im allgemeinen zwischen 0,1 und 2 mg/kg

intravenös liegen.

Das folgende Beispiel erläutert eine erfindungsgemäße Zufflnmensetomg:

Beispiel 25

Man stellt eine Lösung mit 10 mg/cm⁵ Wirkstoff her, indem 1,07 g 32.999 RP-Hydrochlorid in 100 cnr apyrogener physiologischer Salzlösung gelöst werden. Die erhaltene Lösung wird aseptisch in 2 cm^-Ampullen in einer Menge von 1 cnr je Ampulle verteilt. Die Ampullen werden verschlossen und enthalten je 10 mg aktive Substanz.

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Claims (1)

1. Neue antitumorale 'basische Substanz, welche mit der Nummer 32.999 EP "bezeichnet wird, dadurch gekennzeichnet, daß

-ihr Hydrochlorid ein mikrokristallines rot-organgefarbenes Pulver ist, das in einer Menge von etwa 100 mg/cnr in Methanol, Pyridin, Dimethylformamid und Wasser, von 10 mg/cnr in mit Wasser gesättigtem Butanol von 20⁰C, 5 mg/cnr in Äthanol und zu weniger als 0,1 mg/cnr in Aceton, Chloroform, Methylenchlorid, Äthylacetat, Benzol, Methylisobutylketon, Dioxan und Hexan löslich ist,

—dessen Elementarzusammensetzung etwa folgendermaßen ist: C % = 56,6 H $> = 5,7 0 % = 29,41 N % = 2,39 Cl ^= 6,0,

-dessen Drehvermögen,bestimmt in 0,09%-iger Lösung in Äthanol mit 0,1% 1-n-Salzsäure beträgt:
[oc]20 _{= +} 208° ± 32°,

-dessen UltraviolettSpektrum und sichtbares Spektrum, bestimmt aus einer Lösung von 10,65 mg/1 in Äthanol mit 0,1% 1-n-Salzsäure Absorptionsmaxima bei 233 nm, 254- nm, 292 nm, 493 nm, 512 nm und 527 nm aufweisen,

-dessen Infrarotspektrum Absorptionsbanden bei

3410, 3250, 3220, 3050, 2970, 2930, 2900, 2860, 2820, 2680, 2600, 1980,

1930, 1900, 1800, 1735, 1690, 1635, 1600, 1580, 1510, 1460, 1440, 1405,

1370, 1315, 1285, 1255, 1235, 1195, 1165, 1115, 1062, 1050, 1030, 1010,

985, 960, 930, 915, 885, 875, 845, 840, 820, 810, 780,* 762,

750, 725, 708, 695, 665, 640, 625, 600, 580, 565, 540, 530,

485, 475, 465, 450, 438, 415, 390und320 ca"¹ aufweist,

das bei der aufsteigenden Dünnschicht Chromatographie an Siliciumdioxidgel mit einem Gemisch aus Methylenchlorid/Ameisensäure/ Methanol (80-17-3 in Vol.) als Entwickelungslösungsmittel einen Rf-Wert von 0,2 besitzt,

sie g^gen Leukämie L 1210, Leukämie P 388 und Leukosarcomatose in Dooen zwischen 0,125 und 0,250 mg/kg, i.p. an der Maus wirksam ist,

wobei diese Substanz in Eorm der freien Base oder als Additionssalz mit einer Säure vorliegt.

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- 70 -

j/ Verbindung gemäß Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel

jj ?^H CHOH-CH₃

—oh'

—ο

HO O OHHO- CH - CH, - CH - CH - CH - CH_

ι ι ³

NH₂ OH

in Form der freien Base oder des Additionssalzes mit einer Säure entspricht.

3. Das Hydrochlorid des Produkts gemäß den Ansprüchen 1 oder

4. Verfahren zur Herstellung eines Produktes gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Carminomyoin der Formel

-_T j -c— 1

HO 0 OH H O - CH - CH₂ - CH - CH - CH -

NH₂ OH

oder eines seiner Salze auf mikrobiologischem Wege reduziert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion mittels einer Kultur eines Mikroorganismus ausgewählt aus Streptomyces lavendulae (ATCC 8664), Streptomyces roseochromogenes (AiECC 13.400), Corynebacterium simplex (ATCC 6946) oder Bacterium cyclooxydans (ATCC 12.673) bewirkt wird oder mittels Zellen, die aus dieser Kultur isoliert wurden oder mittels enzymatisohen Extrakten, die aus den Zellen dieser

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- 71 Mikroorganismen erhalten wurden.

6. Verfahren zur Herstellung eines Produktes gemäß den Ansprüchen 1 "bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, ausgewählt aus Streptomyoes coeruleorubidus DS 31723 (NRRL 3045), Streptomyces coeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046) und Streptomyces bifurcus DS 23219 (NRRL 3539) in einem "belüfteten, für Streptomyces geeigneten Nährmedium in Gegenwart von Hilfsmitteln, ausgewählt aus Amethopterin, Barbital, Phenobarbital, Butobarbital, Penthiobarbital, Sulfanilamid, Sulfapyridazin und Sulfathiazol züchtet und das Antibiotikum dann aus dem Züchtungsmedium extrahiert.

7. Verfahren zur Herstellung eines Produktes gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces atroviolaceus DS 8938 (NRRL 8148) oder seine Mutantenerzeuger in einem Medium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff sowie Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur zwischen 23 und 33⁰C und bei einem pH-Wert zwischen 5,8 und 7,8 aerob züchtet und das Antibiotikum dann aus dem Züchtungsmedium extrahiert.

8. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteil das Produkt gemäß den Ansprüchen 1,2 oder 3 zusammen mit einem inerten oder pharmazeutisch wirksamen Produkt enthalten.

9. Der neue Mikroorganismus Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098).

10. Der neue Mikroorganismus Streptomyces atroviolaceus DS 8938 (NRRL 8148).

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