CA1068225A - Derive du naphtacene, sa preparation et les compositions qui le contiennent - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet la préparation d'un nouveau dérivé au naphtacène de formule (I) (I) ses sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables et les compositions qui le contiennent. Ce nouveau dérivé désigné par le numéro 32 999 RP est un composé basique de couleur rouge foncé particulièrement utilisable pour le traitement de tumeurs.

Description

i~6~zzs Ia pr~en~e invention concerne un nouveau dérivé du napht~c~ne de formulQ :

O OH
ll I CHOH-CH3 ~1 ~ O . I
HO O OH O ~ CH - CH2 - ICH _ ICH _ CH _ CH3 ~H2 OH

~es sels, sa préparation et le~ compositions qui le contiennent.
~e produit de formule (I), qui sera désigné par le - numéro 32 999 RP~ pr~ente un int~r~t tout particulier par ~uite de ~on activité antitumorale.
~ e 32 999 RP e~t un composé ba~ique de couleur rouge foncé formant de~ sels d'addition avec le~ acides pharmaceutique~
ment acceptable~, - ~e chlorhydrate du 32 999 RP est soluble ~ raison d'environ 100 mg/cm~ dan~ le m~thanol, la pyridine, le diméthyl-formamide et l'esu~ en~iron 10 mg/cm3 dan~ le n.butanol ~aturé
d'eau ~ 20C~ en~iron 5 mg/cm3 dans l'~thanol, et pratiquement insoluble (moins de Ool mg/cm3) dsn~ i'ac~tone~ le chloro~ormet le chlorure de méthylène~ l'acétate d'~thyle~ le benzane~ la m~thyli~obutylcétone~ le dio~ne et l'hexane.
Ie chlorhydrate du 32 999 RP contient du c~rbone~ de l'hydrog~ne, de l'oxyg~ne, de l'azote et du chlore. Sa composi-tion elémentaire e~t voisine de :
C% = 56~6 H% ~ 5,7 0% = 29,41 N% = 2,39 Cl% - 6~0 Il est en outre c~rsotéri~é par les propriét~s phy3ico-chimi~ues ~ui~ntes :
- as~e~t : poudre microori~talline~ rouge orangé
~ point ae ~usion : ~ers 200C (avec décomposition) . ~

1068;~Z5 - ~ouvo`i~:rotatoire : (détermin~ en ~olution ~ 0,09~ dans l'~thanol ~ 0,1% de HCl 1 N) r~] - + 208 + 32 ~ 8~9~ d~termination ~ partir d'une ~olution ~ 10~6~ mg/l dan~ thanol ~ OJ1~ de HCl 1 N

_ .. __ I
Maximum d'absor~tlon ~ 1 cm 233 nm 620 :`
. 254 nm 495 ._ ._ 292 nm 140 Ce 9pectre e~t représent~ par la figure 1 annexee, - s~ctre ~is~b e : d~termination ~ partir d'une ~olution ~
10~65 mg/l dans l'éthanol à 0,1~ de HCl 1N.

.: -- ---:~ Maximum d'absorption à : 1 cm . I . I
:- 493 nm 272 ,. . I
512 nm 189 _. .__ 527 nm 190 .
Ce ~pectre e~t repr~ent~ par la figure 2 annex~e.
- ~ : (détermlnation ~ partir de comprimés en . 20 mélange avec KBr) ; Ce ~pectre e~t repré~enté par la ~igure 3 annexée ~ur laquelle on a port~ en absci~se~, d'une part les longueurs d'onde~
;- exprim~es en micron~ ~échelle ~upérieure) et d'autre part les : nombre d'ondes en cm 1 (échelle inférieure) et en ordonnées le~
den~ité~ optique~.
Dan~ le tableau I ci-apras on indique les principale 9 ~0 68 2 Z S

bandes d'absorption in~ra-rouge pour ce produit exprim~es en nombre d'ondee (cm 1):
3410 F 2680 ép. 1580 ép.1195 F 915 ép. 725 m 53Q f 3250 ~p. 2600 ép. 1510 ép.1165 ~ 885 m 708 m 485 m 3220 ép. 1980 tf 1460 F1115 ~ 875 m 695 ~p. 475 3050 ~p. 1930 ép, 1440 F1062 F 845 ép. 665 ép. 465 2970 ~ 1900 tf 1405 ~1050 ~p~ 840 ép, 640 ~p. 450 , 2930 F 1800 tf 1370 ép.1030 ép. 820 ~ 625 ~p. 438 m 2900 ~p. 1735 ~P. 1315 ~p.1010 F 810 ép, 600 m 415 tf - lO 2860 ép. 1690 ép~ 1285 F985 ~ 780 m 580 f 390 m 2820 ép. 1635 ép. 1255 m960 ~p~ 762 m 565 f 320 1600 tF 1235 ~930 m 750 m 540 f ,~ t~ - ~rès forte f ~ faible F = forte tf = trè3 ~aible m _ moyenne ~p.= épaulement ';
~e 32.999 RP peut être caractéri~ par chromatographie - ~ur couche mince de gel de ~ilice en utili~ant comme ~ol~ant de d~veloppement le mélange chlorure de méthyl~ne - acide formique -methanol (80-17-3 en volume) à une temp~rature de 24C. Dans ce, sy~tame l~ chlorhydrate du 32 999 RP a un R~ voiein de 0,2.
~'hyaroly~e acide du 32.999 RP ou d'un de se3 eel~
permet d'obtenir le produit de formule :

- OH (II) HO O OH OH
qui e~t l'a~lycone du 32.999 RPo L'aglycone ~u 32.999 RP e~t ~oluble ~ rai~on de 20 ~,, lQ68ZZ5 mg/cm3 dans la pyridine~ 5 mg/cm3 dans le méthsnol~ le dioxanne~
le chloroform~ et le chlorure de m~thylane et ~ moins de 0~1 mg/cm3 dans llac~tone, l~ac~tate d~thyle,- l~hexane et l~eau.
Ce produit présente en outre le~ propri~t~ phy~ico-chimique~ sui~a~te~ :
poudr~ ~icrocristalllne rouge orang~
- Point de fu''si`on : ~er~ 185C (avec d~compo~ition) - anal~e'é~émentaire : elle est ~oieine de :
C% = 61,5~ H% = ~,31 0~ - 30,16 - , ou'vo~r rotatoire : (d~terminé en solution ~ 0,1% dan~ le :; dioxanne) ~3 20 = ~ 249 ~ 32 ,s~ec~'~e' ult~a'-~olet : d~termination à partir de solutions à
- 50 et 5 ~g/1 dan~ l~éthanol ~ 0,1~ de ., HCl 1N
. .

. -,, Maximum d~absorption à : E1 ~o ., .
234 nm 770 . . . _ ~.~ .
.~ 254 nm 640 293 nm 1_0 __ _ Ce spectre e~t repré~ent~ par la flgure 4 annex~e ~ur laquelle le~ courbe~ I et II corre~pondent respectivement ~ de3 solutions ~ 50 et 5 mg/l~
- s~e'dt~ si~le : détermin~ à partir d~une ~olution a 10 mg/l dans l~éthanol à 0~1~o de HCl 1N

:

1~682Z5 M~imum d'ab~orption ~ 1 - --.:~ _ . _ _ _ ~` 493 nm _370 _ 5~5 ~ _ 255 ` 528 nm 270 _ Ce spectre est représenté par la figure 5 annexée, ;; - sPectre infra-rou~e : (dét~rmi~ation ~ partir de compiim~ en mélange avec K~r) ~Q spectre est repré~ente par la ~igure 6 ~ur laquelle - ~ on a porté en ab~ci~ses~ d'une part les longueur~ d'onde~
exprimées en micron~ (~cheile ~upérieure) et, d'autre part, le~
nombres d'ondes e~primés en cm~1 (échelle inférieure) et en ordonn~e~ le~ den~it~ optique~.
Dan~ le tableau II ci-apr~ on indique les prinoipale~
bandes d'ab~orption infra-rouge pour ce produit exprimée~ en nombrQs dlonde 9 (cm~1):

3500 ~p, 2680 ép, 1412 ~1095 f 910 m 740 m 530 tr 3420 F 1980 tf 1370 ~1070 ép. 885 m 710 m 505 ép.
3360 ep. 1705 f 1315 ép,~1062 P 875 m 700 ép, 485 m 3080 ép, 1640 ép, 1285 t~1050 ép, 865 f 680 tf 465 m 2975 m ?600 tf 1255 tF1030 m 840 m 665 tr 450 m 2925 m 1580 ép. 1240 ~p,1020 m 815 ~ 625 ép, 435 m 2910 ~p. 1540 ép, 1195 F1005 m 805 ép, 595 f 385 tf 2890 ép, 1458 P 1165 F975 m 785 ép, 585 f 360 tr 2860 ~p, t448 F 1130 m950 m 775 ép. 570 f 320 tf 925 m 765 m 545 tF = tre`s forte ~ = forte m = moyenne = faible tf - tra~ faible épO = ~paulement ~ aglycone du 32 9g9 RP peut être caract~risé par chromatographie sur couche minoe de gel de ~ilice en utilisant comm~ ~olvant de développement le mélange chlorure de méthylène -acide formique - méthanol (80-17-3 en ~olume) à une température de 24C. Dans ce sy~tème l~aglycone a un Rf voisin de 0,7.
Selon la présente invention, le 32 999 RP peut être obtenu selon l'u-n des procédé~ suivants :
1 par réduction microbiologique de l~antibiotique appelé carminomycine qui r~pond ~ la formule :

~aoo (III) HO O OH O_ CH - CH2 - CH _ CH _ CH _ CH3 ~ ' NH2 O~I
~ Ia carminomycine et 8a prépsrstion par culture - d'Actinomsdura carmina~a Sp. nov. ont été décrite~ dan~ la demande de brevet franQais 74.00349 qui a été publiée sous le num~ro 2~235,700. ~a structure de la carminomycine a été
publi~e par M G, ~razhnikova et coll , J. of Antibiotics, XXVII, n 4, 254-259 (1974).
~ a r~duction microbiologique de la osrminomycine s'effectue g~n~rslement en milieu aqueux au moyen ~oit de cultures de microorganismes arrivées à un stade convenable de d~veloppe-ment, 80it de cellules isolées de ces cultures, soit des extraits enzymatiques obtenu3 ~ partir de ces microorganisme~.
~ es microorganismes qui peuvent 8tre utilisés selon le proc~dé de la présente invention peu~ent appartenir à la catégorie des streptomycète~ ou des bactéries. Parmi les micro-organi~mes qui conviennent particulièrement bien peuvent 8trecités Streptomyces lavendulae (A~CC 8664), Streptomyce~ roseochro-. .

' ' -~ 1068ZZ5 mogenes (A~C~ 13.400), Coryn~bacterium simplex (A~CC 6946) ou Bacterium cyclooxydang (ATCC 12.673). ~es meilleur~ ré~ultat~
sont obtenu~ ~ partir de ~orynebacterium ~implex 1ATCC 6946), Io oulture du microorganisme produiaant le système enzymatique capable de réduire la carminomycine en 32 999 RP
peut ~tre effectuée par toute méthode de culture aérob~e en surface ou en profondeur mais cette dernière e~t ~ préférer pour des raisons de commodit~. On utilise à cette fin les techniques d~ensemencement et de fermentation et le~ différent~
type~ d'appareils qui ~ont d'un usage courant dan~ l'industrie dea fermentations.
le milieu de culture du microorgani~me doit contenir e~sentiellement des ~ources de carbone et d'azote assimilable~, des éléments minéraux et des facteurs de croi~sance~ tous oe~
éléments pouvant ~tre apportés sous forme de produits bien - dé~ini3 ou par de~ mé~anges complexe~ tel~ qulon en rencontre dans aes produit~ biologiques d'origines diverses, Comme source~ de carbone ~s~imilable on peut utiliser des hydrate~ de carbQne tels que glucose ou d'autre~ sub~tances - 20 csrbonées comme de~ sucre~ alcool~ ou comme certain~ acides organiques. Certaine~ huiles animale~ ou vég~tales comme l'huile de lard ou l~huile de soja peuvent avantageusement remplacer ces sources o~rbon~e~ ou leur ~tre ad~ointe~,l ~ es Mource~ d'azote a~similable ~ont extrêmement variées. Elle~ peuvent être de~ substances chimiques très simples ;; comme les sel~ min~raux ou or~ani~ues d~ammonium, l'urée, certain~
acides aminés. Elles peu~ent être aussi apportées par des sub-~tances complexe~ oontenant principslement l~azote sous ~orme protidique : caséine, lactalbumine, gluten et leur~ hydroly~ats, farine~ de ~o~, d'ar~chide, de poisson3, peptone, extraits de viande, de levure, di~tillersl soluble~, corn-steep.
Parmi le~ élements min~raux 8jout~9~ certains peuvent -avoir un ef~et tampon ou neutralisant comme le~ pho~phates alcalins ou alcalino-terreux. D'autres apportent l'~quilibre ionique nécessaire au d~veloppement du microorgani~me comme le3 chlorurec et le~ ~ulfates de m~taux alcalins ou alcalino-terreu~
~es facteur~ de croisssnce ~ont des produit~ de nature ~itaminique~ tel~ que la ribo~lavine~ l~aoide fol~ue, l'acide pantothénique.
;; ~e pH du milieu de fermentation au début de la culture doit etre cQmpris entre 6,0 et 7,8 et de préf~rence entre 6,5 et 7,5. IB température optimale pour la ¢ulture du mioroorgan-- isme est 29-31C mais un développement satisfaisant est obtenu à aes température~ compri~es entre 26 et 37C.
. ~t a~ration du milieu de culture peut ~arier entre des : valeurs assëz larges. Cn a cependant trouvé que des a~rations de 0~3 à 3 litres d~air par litre de bouillon et par minute : conviennent particulièrement bien~
De plu~, pour obtenir une culture po~s~dant une bonne activit~ réductrice, il est pr~f~rable d'agiter le milieu de oulture par exemple au moyen d~un agitateur dont la vite3se de rotation peut varier entre 100 et 250 tours/minute.
G~n~ralement la culture du microorganisme atteint un degré de développement satiafaisant après une pÇriode de 24 48 heures.
~activité r~ductrioe dépend essentiellement de la quantité de cellules formée~ 8U cours de la culture~ Ave¢ de~
cellule~ i~olées~ par exemple après centrifugation du milieu de culture~ la quantité de 32.999 RP formée ~ partir de la carmino-mycine est en relation directe avec 18 concentration en cellulec du milieu réactionnel; les milieux riohe~ en cellule~ possadent un pouvoir réducteur ~upérieur, ~ 8 réduction de la carminomycine en 32.999 RP s~ef~ectue en mettant en contact une colution aqueuse de carminomycine ou 1~682Z5 . .
d~un de 3es 3el~ a~ec la culture du microorgani~me ayant ~tteint un degré de dé~eloppement et un pou~oir réducteur suffisant~' ou avec les cellules i~olée9 de ce~ culture~ ou a~ec dege~traits enzymatique~ obtenus ~ partir de ce~ cellule 9 .
~ e~ extrait~ en~ymatique~ de~ cellule 9 peu~ent être obtenus aprè~ destruction des paroi~ oellulaire~ ~oit par de~
méthode~ chimiques ou biochimique~ ~oit par dea méthodes physiques. De pr~rence, la destruction des parois cellulaires est effectuée à partie de la culture du microorganisme ou des cellulee isolées de cette culture en su~pension en milieu aqueux soit en les t~aitant p~r un~ enzyme capable de lyser la paroi cellulaire, telle que le lysozyme, ~oit e~ le~ 90 nPttant action des ultra-sons.' ~es extraits enzymatiques sont en solution aans le liquide ~urnageant qui est obtenu apras centri-~ugation du milieu Généralement la solution des e~traits enzymatiques est utilisée ~a~s autre traitement ultérieur dans la phase de rédu¢tion.' Généralement la réduction steffectue en milieu agité
'~ ~ une température comprise entre 23 et 37C, de pr~férence entre 26 et 30C et elle est complate après 1 ~ 4 ~ours de contact.
Ia réduction peut avoir lieu ~ un p~ compris entre 5 et 10 maie il est préférabl~ d'opérer à un p~ ¢ompris entre 7 et ~e mllieu réactionnel peut ~tre agit~; par exemple par un agitateur dont la ~itesse de rotation peut ~arier entre 100 et 250 tour~/minute.
Ia réductlon peut être effectu~e ~oit ~ur la carmino-mycine ou l~un de 8e9 sels purs, ~oit sur un produit impur~
soit sur le ~iltrat acide d~une culture ayant produit de la carminomycine~ Pour obtenir de bons rendem~nt~ 9 la concentration de la carminomycine dsns le milieu réducteur est avsnt~geusement comprise entre 0~1 et ~ g/l 8U d~but de la réduction _g_ :` 10682ZS

2 par culture a~rob~e de microorgani~mes app~rte-n~nt au genre ~treptomycète et choi~i parmi Streptom~ces coerul-eorubidus DS 8899 (NRR~ 3046), Streptomyce~ coeruleorubidus DS 31.723 (NRR~ 3045), Streptomyce~ coeruleorubidu~ DS 7126 (NRR~ 8098)~ et Streptomyces bifurcu~ DS 2~.219 (NRRL 35~9) dan~ de~ milieux nutrit~f~ con~enant awc ~treptomyces, en pré~ence dlad~uvant~ choisi~ parmi l~am~thopt~rine, la sulfanil-amide, le ~ulfathiazole, la sulfapyridazine~'le barbital, le '; phénobarbital, le butobarbital et le penthiobarbital.
~a quantité d~antibiotique 32 999 RP formée 8U cour~
de la culture peut varier en ~onction de la compositio~ du ~- milieu de culture, de la quantit~ d'ad~u~ant ajouté et du moment de son addition, comme il ~era montré ci-apr~s.' ~es microorgani~mes Streptomyces coeruleorubidus DS 8899 (NRR~ 3046) et Streptomyce~ coeruleorubidus DS 31 723 (NRR~ 3045) ~ont dé~ décrlt~ dans le brevet françsi~ lj 380, 810 et ses divers corre9pondante~ Streptomyces bifurcue DS 23 219 (NRR~ 3539) est décrit dan~ le bre~et ~rançais 1,593,235 et ~es divers corre~pondants.
Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 est une souche nouvelle~ qui a ét~ isolée ~ partir d~une parcelle de terre.
Un é¢hantillon en a été déposé au Northern Regional Research '~ Iaboratory de l'U.S. Department of Agriculture ~ Peoris~ Ill, (Etats-Unis)~ où il a été enregistré ~ou~ la réf~rence NRR~
;~ 8098,` D~ échantillona de ce microorgani~me peu~ent être obtenus ; de ce laboratbire ~ur ré~érence au pr~sent document, ~'isolement de cette souche a été e~ectué en sui~ant la méthode g~nérale qui con~i~te à mettre une petite ~uantité
de terre en suspension dans de l~sau distillée stérile, ~ di~uer la suspension ~ différentes concentration~ et ~ ~tsler un petit volume de chaque dilution sur la ~urface de boite~ de P~tri contenant un milieu nutritif gélos~ Apr~s une incubation de ~068ZZ5 quelque~ ~ours ~ 26a~ qui permet ~ux microorganisme~ de ~e d~velopper, 1es colonie~ ~ue l~on veut lsQler pour en poursuivre l'~tude sont pr~levées et repiquées ~ur des g~loses nutritives inclin~es afin d'en obtenir des cultures plus abondante~.
Le streptomyce~ DS 7126 se rattache ~ l'espe`ce Stre~tom~ces coeruleorubidus, décrite par ~Fo GAUZE et col.
. (Problem~ in the cla~eification of Antagoni~t~c Actinomycete~ -The American In~titute o~ Biologicai Science~ Washington~ 1959, p~ 100)~ dont il po~sède le~ principaux caractères~ Il présente en effet un myc~lium aérien ~porulé bleu ~ bleu verd~tre clair sur le milieu minéral I de Gauze~ il d~veloppe un myc~lium ~égétatif qui prend une coloration rougeâtre et élabore un pig-ment ~oluble de même couleur qui diffuae dsns la g~lose~ toute~
ces propriétés étant carsctéristiques de l~e~pèce Stre~tom~ce~
coeruleorubidu~. C~est pourquoi on l~a déno~m~ Streptomyce~
coeruleorubi'dus~ ~ouche DS 7126.
Stre~tomyce~ coeruleorubidu~ DS 7l~ for~e de~ ~pores sphériques ~ ovales courtes, mesurant 0,7 ~ 0,9 ~/0,8 à 1~
Il développe de~ sporophore 9 simple 8 OU en grappe 8; ~e 9 chaines de ~pores~ qui sont asse~ longue~ et peuvent comprendre ~usqu'à
plusieurs dizaines de spores9 s'enroulent en formant des spirales plus ou moins ouvertes comptant le plus souvent de 2 ~ 5 ou 6 tours ~piralés Par ~on mode de ~porulation, Streptomyoea coeruleorubidus DS 71~6 se situe dans la Section S~ira de la classificatlon de Pridham Streptomyces coeruleorubidu~ DS 7126 se développe bien à 25C, un peu moins bien à ~7C, et pas ~ 50C, Dan~ ses cultures, effectuées à 26C, ll présente le~ caractère~ bio-chimiques suivants:
- production de mélanine : positive - production de ll2S : po~itiYe - tyroaina3e : po3itive ~0682Z5 .~
- l~qué~action de la g~latine : po~iti~e, lente - utilisation de la cellulo~e : positive - production de nitrite~ ~ : n~gative sur bouillon partir des nitrates nutritif nitrat~, ~ positive sur milieux ~ynth~tique 9 - hydrolyse de ~'amidon : positive, mod~rée - oulture ~ur lait ~crém~ : pas de coagulation ni de pepton~ation Dans lea tableaux III ~ VI oi-aprè~ sont ra~semblés les carsctère~ culturaux que pr~sente stre~tomA~ce~ coeruleorubi-,, dus DS 7126 ~ur un certain nombre de milieux habituellement utili~é9 pour d~terminer les caract~re~ morphologique~ des souches de streptomyces, les culture~ ~ur milieux g~losé~ ~tant ~ e~fectuée~ sur ae~ gélo~e~ inclinées, Ces caraotareg ~ont oeux de cultures arrivée~ a un bon stade de dé~eloppement, c~e~t-~-dire d'environ 3 eemaines ~ 26C sauf ~-ndications contraires.
Ie~ références des milieux de oulture utilisé~-~ont le9 : ~ui~antes:
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~scteria Society o~ America~ ~acteriologist~ -Gene~a~ N,Y, II50 ~ 18 Ré~. K _ "~ennettls Agar" - S.A. ~AKS~AN - ~he Actinomycete~, vol. 2, p. 331 - n 30 - ~he Williams snd Wilkin~ Compan~ ~altimore, 1961 Réf. ~ - "Melanin formation medium " - S.A, WAKSMAN -The Actinomycetes, vol. 2, p. 333 - n 42 - The William~ and Wilkin~ Company, ~altimore,' 1961 R~f. M _ ~he Actinomycete~ - S.A. WAKSMAN~ Chronica ~otanica Company~ Waltham, Ma~s.~ U.S A., 1950 -p. 197 - n 27 R~f, ~ - "Plain Gelatin"'- pr~paré ~uivsnt les indi-cations du "Msnual of Method~ for Pure Culture Study of ~cteria" - Society of American ~acteriologiats, Geneva, N.Y~ II50 -18 R~f. 0 - ~ait écr~mé en poudre commercial, reconstltué
~elon le 9 indications du fabricant R~f~ P _ Milieu indiqu~ pour la recherche de la pro-. ~ duction de H2S par: H~,D. ~ ER et F, DANGA -Joumal of Bacteriology, 76~ 239-244, 1958 ..

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-" iO68225 Ie Strç~tom~ces DS 7126 , par la coloration bleu ~
bleu verd~tre de son mycélium a~rien ~porulé, appartient ~ la ~rie ~Coerule~cen~ décrite par Gauze et col. Parmi le~ souche~
décrites dans cette 8érie~ il pré~ente un myc~lium végétatif se colorant de rouge comme S~ cioerulerorubidus et S bicolor.
Toutefoi~, il se diff~rencie de S bicolor par le ~ait ~ue, au - contr~ire de ce dernier~ il utilise la cellulose~ il ne coagule pas le lait~ et surtout est susceptible de former du pigment - soluble rouge diffusant dans la gélo~e sur milieu ~ynthétique, propriété qu'il ne partage qu'avec l'espèce S coerulerorubidus.
Cette derni~re propriété ~ointe à l'ensemble de ~e~ caractères - montre qu'il se rattache ~ l~e3pèce S _coeruleorubidus.
- La capacité de Stre~tom~ces coeruleorubidu~ DS 7126 utiliser diverse~ sources de carbone ou d'azote pour assurer son développement a été déterminée suivant le principe de la méthode de Prldham et Gottlieb (J of Bact, ~6~ 107-114~ 1948) le degré de d~eloppe-ment a été observé sur le milieu de base .
indiqu~ par le 9 suteurs en remplaçant ~oit le glucose par le~
; différentes souroes de ¢arbone respectivement essayées, soit S04(NH4)2 par le~ diverses sources d'a~ote respectivement e~sayées.
hes résultat~ sont indiqué~ dans le tableau VI
.. . .
suivant:

.
' :1068ZZ5 TA~LEAU VI
Sources de car- Utilisation Sources d~azote Utilisation bone essayées essayées D-Xylose positive NO~Na positive ~-Arabinose positive 2 positive ~-Rhamnose positive S04(NH4)2 positive D-Glucose positive P04H(NH4)2 positive D-Galactose positive Urée positive D-~ructose positive L-Asparagine po~itive 10 M-Mannose po~itive Glycocolle positive ~actose positive Sarcosine négative Maltose positive D~-Alanine positive Saccharose positive DL-Valine positive Tréhalose positive ~-~ysine positive Cellobiose positive D~-Méthionine positive,lente Dextrine positive ~aurine négative :~ Inuline négative ~-~yrosine positive Amidon positive Glycérol positive Erythritol négative Dulcitol négative D-Mannitol positive D-Sorbitol positive :. Inositol positive ; 5alicine positive .

` --19--~ ~ ~ 68 2 Z 5 Ie procédé de pr~paration du 32 999 RP consiste essentiellement ~ cultiver les souches de stre~tomycète~ cit~es ci-dessus sur un milieu et dan~ des conditions appropr~e~ en présence d'une ~uantité suffi~ante d'adjuvant et ~ ~éparer le produit form~ au cours de 1~ culture.
Ia culture des microorganisme3 peut ~tre e~fectuée par toute m~thode de culture aérobie en surface ou en profondeur~
mai~ cette dernière est ~ préférer pour de~ rai~ons de commodité.
On utilise ~ cette fin les différents type~ d'appareils qui sont d'un u3a~e courant dans l'industrie des fer~entatio~s.
On peut en particulier adopter la marche ~ui~ante pour ~- la oonduite de 9 opérations:
Souches productrice~ - Stock Culture sur gélose . l, .
Culture inoculum en fiole agitée .,.,..;

Culture inoculum en fermenteur ~. J, Culture de production en fermenteur ~ e milieu de fermentation doit contenir e~sentiellement une souroe de carbone et une souroe d'azote a~slmilable~ de~
él~mente min~raux~ en partioulier des chlorure~ ou de~ carbonate3, ~; et é~entuellement des facteur~ de croi~sance, tou~ ces éléments pouvant 8tre apportés ~OU9 forme de produit~ bien d~inis ou par des m~langes complexes, tels qu'on en rencontre dans le3 produita biologiques d'origine3 diver~es, Comme sources de carbone assimilable~ on peut utiliser des hydrate~ de carbone tels que le glucose, le lactose, le 9 dextrines, l'amidon ou d'autres substances carbon~e3 comm~ des ~ucres alcool~ (glyc~rol) ou comme certain~ acide3 organique~ :
acides lactique, citrique, Certaines huiles animales ou végé-lQ682ZS
t~les comn~ l'huile de lard ou l'huile de so~a peuvent remplacer avantageusem~nt ces différentes sources ~arbonée~ ou leur être ad jointe~.
Ie9 90urce9 convenable~ d'azote a~imilable ~ont extr~mem~nt variée~. Elle~ peuvent être des substances chimiques tras simples comme les ~el~ minéraux ou organi~ues d'ammonium~
- l~urée, certains acides amin~s. Elles peuvent être aussi apportées par dee substance~ complexes contenant principalement - l'azote sou~ forme protidique : caséine~ lactalbumine~ gluten et leurs hydrolysats~ farine de soja~ d~arachide, de poi~on~
extraits de ~iande, de levure, distillerst solubles, corn-steep.
Parmi les ~lément~ min~rauæ ajoutés, certain~ peuvent avoir un effet tampon ou neutraliaant comme les pho~phate~
slcalins ou aloalino-terreux ou les carbonate3 de calcium et de magnésium. D~autres apportent lléquilibre ionique nécessaire au développement des microorganismes et à l'~laboration du 32.999 ~P comme les chlorures et sulfates de métaux alcalins et alcalino-terreux Enfin certains agis3ent plus sp~cialement comme activa-teurs des r~actions m~tabolique~ de3 microorganismes, ce ~ont les ~els de zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganè~e, ~es ~acteur8 de croi~ance 30nt g~néralement d~s pro-duits de nature ~ltaminique tel~ que la thiamine, 18 ribo~la~ine, l~scide pantoth~nique, ~es ad~uvants peuvent ~tre a~out~s au cours de~
différents stades de la culture: culture inoculum en fiole agit~e) oulture de production en fermenteur.
Cependant les meilleurs résultats sont obtenus lor~que C8~ ad~uvants sont ajout~s soit au début de la phase de pro-duction ~oit au cour~ de celle-ei, Parmi les adjuvants ~ui conviennent parti¢uliarement bien peuvent etre cit~s la sulfanilamide, le ~ulfathia~ole et la sulfapyrid~zine :
- .

~68225 I,a concentration de l'adjuvant ~sn~ le milieu de fermentation peut varier dan~ de large~ limites selon 18 compo~ition du milieu de culture et ~elon la nature de l'adjuvant.' G~n~ralement des concentr~tions eomprises entre C,01 et 1 g par ~- litre de bouillon conviennent particulièrement bien.
Ie p~ du milieu de fermentation au départ de la culture doit e~tre compris entre 5,6 et 7,4 et de pré~érence entre 5~8 et 7,2, ~a température optimale pour la ~ermentation est comprise entre 25 et 30C, mais une production satisfaisante est obtenue pour des températures comprises entre 23 et 3~C ~'aération de la fermentation peut varier entre de~ va~eur~ a~sez larges. On a cependant trouvé que de~ aérations de ~,3 ~ 3 litre~ d'air par litre de bouillon et par minute conYiennent particulièrement bien. Ie rendement maximal en 32.999 RP est obtenu apr~s 2 à
10 jours de culture, ce temps dépendant essentiellement du milieu utili~é
D'après ce qui précède, on conçoit que les conditions genérale~ de Ia culture des :;microorgani~mes en pr~sence d'adju-vants peuvent varier dans une large mesure et etre adaptées chaque nécessit~ particulière

3 ~ partir des milieux de culture d'un nouveau microorganisme~ identifié plu~ oomplètement oi-après~ apparten~nt au genre Streptomyce~ et dé~igné par l'appellation Streptomyces atro~iolaceu~ DS 8938. Un ~chantillon de cette souche a été
dépo~é ~ l'United States Department of Agriculture ~ Peoria~
Illinois, ~ou~ le numéro NRR~ 8148 Dee échantillon~ de ce mioroorganisme peu~ent être obtenu~ de ce laboratoire ~ur référence au pré~ent document.
Cet organisme, qui a été isoI~ à partir d'un échantillon de terre~ présente des caractares ~ui n'ont pas permis de l'identifier a une espace déj~ décrite. Il doit donc être considéré comme une esp~ce nouvelle L'isolement en a été effectué en suivant la méthode générale qui consiste à mettre une petite quantité de terre en suspension dans de l'eau distillée stérile, à diluer la sus-pension à différentes concentrations, et à étaler un petit vo-lume de chaque dilution sur la surface de boltes de Petri con-tenant un milieu nutritif gélosé. Après une incubation de quelques ~ours à 26C, qui permet aux microorganismes de se développer, les colonies que l'on veut isoler pour en poursuivre l'étude sont prélevées et repiquées sur des géloses nutritives afin d'en obtenir des cultures plus abondantes.
streptomyces atroviolaceus DS 8938 forme des spores ovales, mesurant 0,4 à 0,6 ~/0,6 à 0,9 ~. Il développe des sporophores non ramifiés qui prennent naissance sur le mycélium aérien. Ses chaines'de spores sont longues, comptant en général plusieurs dizaines de spores, et s'enroulent en décrivant plusieurs tours spiralés généralement serrés. Par son mode de sporulation, cette souche se classe dans la Section Spira de la classification de Pridham.
Streptomyces atroviolaceus DS 8938 se développe bien à 25C et 30 C, moins bien à 37 C et pas à 50 C. Il forme le -.. .. .
plus souvent sur ses milieux de culture un mycélium végétatif d'abord brun jaune à brun rouge qui rapidement prend une teinte sombre allant de brun très foncé à brun violet ou brun noirâtre.
La sporulation ne se développe que sur un nombre de milieux limité, où elle apparalt diffici]ement et tardivement, en faisant prendre alors au mycélium aérien une coloration gris très clair;
il faut noter d'autre part que sur un certain nombre de milieux le mycélium aérien est susceptible de se teinter de rose pâle ou violacé pâle lorsque du pigment soluble violet sombre est pro-duit abondamment par la culture.
Streptomyces atroviolaceuS DS 8938 ne produit pas de 10~8ZZS

pigment ~oluble mélanique noir ~ur la gélo~e spéciale tyro~ine-extrait de levure de Waksman (Melanin formation medium); toute-fois il e~t susceptible dlelaborer sur de nombreux milieux, au99i bien ~ynthétiques gu'organique~, de~ pigment~ solubles a~eombri~ant la g~lose en la colorant en brun violacé, violet noir, brun noirâtre ou noir.
Dans ses oultures ef~ectuée~ ~ 26C~ il pré~ente les caractare~ biochimique~ ~uivant~:
- production de mélsnine : négative _ production de H2S : négative - tyro~inase : n~gative - liquéfaction de la gélatine : positive - utili~ation de la cellulose : négative - production de nitrites ~ partir : faiblement positi~e sur de~ nitrates milieux synthé-tiques au début des cultures - ~ydrolyse de l~amidon : positiYe - oulture ~ur lait : pas de coagulation ni peptoniaation pH aans changement appréciable en 1 moi~

~ es caractères culturaux de Stre Ptom~ce 9 atroviolaceu~ DS
8938 ~ont ra~aemblés dan~ les tableau~ YII à XI ci-après. Ce ~ont ceux de cultures arrivées à un bon ~tade de développement~
c'e~t-à-dire d~en~iron troi9 ~emainea ~ 26a~ ~auf indication~
contraire~. Ces caraotares ont été ob~erv~ sur dee g~lo~e~
nutriti~ea et de~ bouillona habituellement utili~é~ pour déterminer le~ caractares morpholog$ques des souche~ de strep-tomyces~ le~ cultures sur milieux g~lo~és étant effectuées aur dee géloses inclinéea. Un certain nombre des milieux de culture employés ont été préparés d'aprè~ les formules indiquée~ dans "The Actino~ycetes"~ S ~. WAKS~AN, p. 193-197~ Chronica Botsnica Company, Walthamt ~aa~., U S,A , 1950~ dans ce caq il~ aont indiqué~ par la lettre W auivie du numéro qui leur a été attribu~

1~68;~ZS

dans "The Actinomy¢ete3", I~e9 références ou con~titutions des autres m~lieux 90nt 1e9 gui~ante9:
R~f, A - "Yea~t Extract Agar" - ~.G. PRIDHAM et col. -Anti~iotic~ Annual~ 1956;-1957~ p. 950 R~r, ~ emlett's Agar" S,A, WAK~MAN - The Actinomy~
ce~es, vol.2, p. 331- n 30 - ~he Williams and WiIkin~
Company~ Baltimore~ t961 Réf. C - Formule W-2~ additionnée de 2% de g~lose R~f, D - "Hickey and Tre~ner'~ Agar" - ~,G. PRIDHAM et col~
10 - Antibiotics annual, 1956-1957, p. 950 R~f. ~ omato Paste Oatmeal Agar" - T,G, PRIDHAM et col.
_ Antibiotios Annual, 1956-1957~ p. 950 Réf, ~ _ "Melanin formation ~edium" - S.A. ~l~AKSDL9N - 'The Actinomycete~, vol. 2, p. 333, n42 - ~he ~Nilliam3 and Wilkins Company~ Baltimore, 1961 Réf. G. _W.~, GRU~D~ et col, - Antibiotics and Chem, 2, 401, 1952 ~é~; H _ "Inorganic Salt3 - Starch Agsr" - T.G, PRIDHAM
et col. - Antibiotios An~ual 1956-1957, p. 951 Réf. I _ Correspond ~ la formule W-1~ o~ 3% de saccharo~e ~ont remplscés par 1~5% de glucose Réf.l J _ Corre~pond ~ la formule W-1~ o~ 3% de saccharo~e sont remplacés par 1~5% de glyoérol Réf. K - Corre~pond à la formule W-18, où 3% de ~aocharo~e ~ont r~mplacés par 1J5% de glucose Réf. ~ _ Correspond ~ la ~ormule W-18, o~ le ~accharo~e e~t supprimé et remplacé par de petite~ bandes de pspier filtre immergées partiellement dans le liquide Réf. M - ~Manual of Methods for Pure Culture Study of Baoteris" - Society of American Bacteriologists - Gene~
N,Y. II50 -18 Réf~ N - "Plain gelatin" - prépar~ ~uivant les indications ~ ~ ` ,. , ., ~68225 du ~anual of Method~ fsr Pure Culture Study of .Bacteria"
_ Sooiety of A~nerican :Bacteriologi~ts - Geneva~ ~,Y. II5o Réf .' P - Iait ~cr~né en poudre commercial - reconstitu~
~elon le~ indications du fabricant Ré~,' Q - ~ilieu ~ndiqu~ pour 18 recherche de la pro-duction de H2S par: H,D. ~PES~ER e~ F~, DANGA - Journal of ~acteriology, ?6, 239-244, 1958.

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iO68ZZ5 Strept'o~ces a'tr~io~a'c'e~ DS-8938 pr~sente un en~emble de caractares qui ne co~ncide e~actement a~ec aucun de oeux des ~ouche~ dé~ décrite~, et c~est pourquoi on doit le con-~idérer comme une esp~ce n~uvelle.
En con~idérant les e~pace~ dont la de~cription est donnée dan~ "The Aotinomycetes" (vol, 2, S.A WAK~N, ~he William~ and Wilkins Company~ Baltimore~ 1961) ainsi ~ue dan~ le Bergey' 9 ~anusl o~ Determinative ~acteriology (7ème édition, The Williams and Wilkin~ Company, Baltimore~ 1957) l~espace ~ la~uelle on peut le plu~ volontier~ le comparer e~t S't~e~t~m~cé~ ~iola~'è~hi~er ~tant donn~ que comme oe dernier il ne produit pa~ de pigment ~oluble mélanique noir,'mai9 donne par contre ~r gélo3e synthétique de Czapek au saccharo~e (sucroee nitrate agar) un pigment soluble brun ~iolet de~enant noir très rapidement;
S. 'at~'o~i~lta'c'eu's DS 8g~8 ~orme d~ailleur~ ~ur de nombreux milieux des pigments ~oluble~ brun Yiolacé ~ violet noir, allant même jusqu'au noir dans un certsin nombre de cas`~ De plu9~
comme ~ v~blaceo'ni~er'~ atrov'i'olac'eu~iDS 8~ présente un myc~lium aérien sporulé de teinte grise et ~es chaines de spores s'enroulent en spirale~ out~ois, S, 3tro~iola'ceu~'DS 8~8 et S~ vi'ollaic~'o~i~e~ doi~ent être con~id~ré~ comme deux espace3 différente~. En e~fe~, malgré les analogies qui viennent d~tre oitée~ il faut noter que S.~iolaoeoni~er ne donne pa~ de pig-ment soluble sur pomme de terre, développe un mycélium végétatif . gri~ sur g~latine, et ~urtout montre par vieilliesement un noir-: ci~ement de son myc~lium ~érien qui le fait inclure dan~ le groupe de S.'h,~ ro~co~lcu~', alors que S~ a't'ro~i!olaceu~ DS 8~8 donne sur pomme de terre un pigment ~oluble brun ~ brun violacé
: fonc~, développe sur gélatine un myc~lium v~g~tatif brun~tre violac~, et m~me dsn~ ces cultures tra~ ~gée~ ne pré~ente jamai~
de noircissement de son mycélium aérien qui permette de la rapprocher du groupe de S. hydro~copicu~. Il faut aus~i noter que~ en p~rticulier ~ur g~lo~e synth~tique de ~zapek au 8~ccharose (sucrose nitrate agar), le pigm~nt ~oluble ~labore par S, violaceoni~er prend ~u début de la culture un ton bleut~
que ne présente pa~ le pigment ~o~uble ~laboré p~r ~I_e~
~9~a~ qui ~ pour sn part, montre a~nt de ~ ' obscurc~r une coloration violet pourpre et non violet bleuté.
- . Ia capacit~ de S, atroviolaceus DS 8938 ~ util~ser iverse~ ~ourcas de carbone ou d'~zote pour aesurer son d~veloppement a ~té détermin~e ~uivant le princ~pe de la méthode de Pridham et Gottlieb (~. of Bact, ~, 107-114, 1948)~ le : degré de développement a ét~ obser~ sur le milieu de baee indiqu~ par les auteur~ en remplaçant eoit le gluco~e par les diverse~ ~ource~ de carbone respect~vement essay~es~ eoit S04(NH4)2 par les diverse~ source~ dlazote respectivement ~; es~ay~ea. Ies résultats sont indiqués dan~ le tableau ~uivant:

-3~
"

` 1061~225 . . .
Sources de carbone Utilisation Sources d'azote Utilisation essayées essayées . , D-Ribose négative N03Na positive D-Xylose négative ~02Na positive L-Arabino~e négative S04(NH4)2 positive L-Rhamnose négative P04H(NH4)2 positive D-Glucose positive Adénine positive D-Galactose positive Adénosine positive D-Fructose positive,le~te Uracile négative D-Mannose positive Urée positive ~-Sorbose négative L-Asparagine positive ~actose positive Glycocolle positive Maltose positive Sarcosine positive,len~
. Saccharose positive DL-Alanine positive . Théhalose positive DL-Valine positive Cellobiose positive Acide D~-æ~ti~e positive :. Raffinose positive Acide L-gluta~ique positive ~- Dextrine positive L-Arginine positive : Inuline négative L-Lysine positive Amidon positive DL-Sérine positive Glycogène positive DL-~hréonine positive Glycérol positive D~-Méthionine positive Erythritol po~itive ~aurine négative Adonitol positive D~-~hénylalanine positive Dulcitolnégative L-~yrosine positive D-Mannitolpositive DL-Proline positive . D-Sorbitolnégative L-Histidine positive Inositolpositive L-~ryptophane positive,~nte Salicine négative 3eta~ne négative - ~e procéd~ de pr~psrstion du 32999 RP con3iste essentiellement ~ cultiver Streptomyces atroviolaceus DS
8938_Sto~k ou se:~ mutants producteurs sur un milieu et d~n~ des condition~ appro~ri~ea et ~ a~parer le produit ~orm~ au cour~
-~ de la culture, Ia culture de Streptomyce~ stro~iolaceu~ DS 8938~Stock : ~ peut ~tre effectu~e par toute m~thode de culture ~érobie en ~urface ou en profonaeur~ mais cette derniare est ~ pré~érer pour des rai~ons de commodité, On utilise ~ cette fin les différents types d~appareils qui sont d~un usage courant dans l~industrie des fermentations, On peut en particulier adopter la mar~he sui~ante pour la conduite des opération~:
Streptomyces at oviolaceus DS 8938-~tock Culture sur gélose '' l Culture en fiole agitee , ~
Culture inoculum en fermenteur Culture de produ¢tion en fermenteur he milieu de fermentation doit oontenir e~sentielle-ment une ~ouroe de ¢arbone et une ~ource d~azote assimilables~
des éléments minéraux, en particulier des chlorures ou des carbonates~ et é~entuellement des facteurs de croissance, tous ces él~ments pouvant être apporté~ sous ~orme de produits bien : d~finis ou par des mélanges complexes, tel3 qulon en rencontre dan~ des ~roduits biologiques d'origine 9 di~erses, Comme ~ources de carbone a~similable~ on peut utiliser des hydrates da carbone tels que le glucose, le lactose9 les dextr$nes, l'amidon ou d'autres substances carbon~es comme de~
sucres alcools (glycérol) ou comm~ certains acides organi~ues :

-35~

~0682Z5 acides lactique, citrique9 Certaineshuiles animales ou végé-tales comme llhuile de lard ou l'huile de ~oja peuvent rem-placer svantageu~ement ces différente~ ~ource~ carbonée~ ou leur ~tre aajointes Ies ~ources d'azote assimilable sont e~tr~mement vari~e~. Elle~ peuvent être des ~ub~tances ¢himiques tr~s ~implee comme le~ sels minéraux ou organique~ d'ammonium, l'urée~
-~ certains acides amin~. Elles peuvent être aussi apportée~ par des sub~tances complexes contenant principalement l'azote 90U9 forme protidique, caséine, lactalbumine, gluten et leur~
hydrolysat~, f~rine de soJa, d'arachide, de pois30n, extraits de viande, de levure, distillers' solubles, corn-steep.
Parmi le~ éléments minéraux ajoutés, certain~ peuvent avoir un effet tampon ou neutrali~ant, comme le~ phosphates slcalin~ ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium et de magnésium. D'autres apportent l'équilibre ionique néces3aire au developpement de Streptomyces atroviolaceus DS 8938 et ~ l'éla-boration du 32999 RPI comme les chlorures et sulfste~ de métaux alcalins ou alcalino-terreux. Certains agi~sent plu3 ~pécisle-ment comme aotivateurs des réactions métaboliques de Streptom~cesatrovio aceu~ DS 8938~ ce sont les sel~ de zinc, de cob~lt~ de fer, de cuivre, de mangana~e~
~ es ~acteur~ de croi~sance sont des produits de nature vitaminique tels que la riboflavine, l'acide foligue,yl'acide pantothénique ou la thiamine, Le pH de fermentation au départ de la culture doit etre compr~s entre 5,8 et 7,8. ~a température optimale pour la fermentation est comprise entre 25 et 30C, mais une production sati~faisante e~t obtenue pour de~ tempérsturee comprises entre 23 et 33C, ~'aération de la fermentation peut varier entre des valeurs as~ez large~. On a cependant trouvé que de 9 aérations de 0,3 ~ 3 litre~ d'air par litre de bouillon et psr r~ ~
~ 36-.f '; , :

` 106~3Z25 minute conviennent particuliarement bien. Ie rendement maximal en 32999 RP est obtenu apr~ 2 ~ 8 jours de culture~ ce temp~
d~pendant e~sentiellem~nt du milieu utili3~.
D~apras ce qui préoads, on oonçoit que les conditions g~nérales de la aulture de Streptom,yce~ atro~iolaceus DS 8938 pour la production du 32999 RP peuvent vsrier dans une large mesure et être aaaptées t chaque néces~it~ parti¢uli~re.
Ie 32999 RP peut ~tre sépar~ de ~on milieu dlobtention selon les méthode~ habituelle~ d'isolement de~ a~tibiotique~
appartenant ~ oette famille, Par exemple~ le ~2999 RP peut ~tre extrait du milieu ; de réd~ction ou de fermentation à un pH voi~in de 9 au moyen d~un ~olvant organique tel que le chloroforme, le chlorure de méthylène, le n butanol ou un mélange de ces ~olvants en pro-portions convenable~.
~e mo~t de fermentation peut ~us~i être filtré en présence d'un adjuvant de ~iltration ~ un pH compri~ entre 1,5 et 9. Il est avantsgeux d'effectuer cette opération en milieu acid~ et particulièrement en acidifiant ~ un pH compris entre 1,5 et 2 au moyen d~acide oxalique Il est également pos~ible d'effectuer la filtration à un pH compris entre 2 et 8 en pr~-~ence d'un alcool aliphatique ccntenant 1 à 3 atome~ d0 oarbone~
~e 32999 RP peut ~tre extrait du filtrat, après oonoentration, au moyen d~un solvant organique tel que le chlorofor~e, le ohlorure de méthylène~ le n.butanol ou un mélange de ces solvant~ en ~ proportions convenable 9 -~e 32999 RP peut eAtre isolé des extraits organiques, apra~ lavage~ et extractions succe~sifs, par pr~cipitation aprèe concentrution des extraits ~ un f~ible volume ou par addition dans un ~olvant ~i~cible dan~ lequel le 32999 RP est pratiquement ; in~oluble~ tel que l'hexane~ aprè3 tran~formation éventuelle de l'antibiotique en un sel d~addition avec un acide tel que le :
~37--~068Z25 " chlorhydrate.
Ie 32999 RP peut 8tre éventuellement purifié par le~
diverses opération~ cla~iqae~ de purification telles ~ue la cristalli~ation ou la chromstographie sur di~ers ad~orbants, ~e 32999 RP et ses ~el~ non toxi~ue~, c'e~t-~-dire acceptable~ phsrmaceuti~uement~ 9e 90nt montré~ particulièrement actifs sur les tumeur~ greffable~ de la souri~ ~ de3 dose3 comprises entre 0,125 et 0,250 mg/kg i~p. ~ur la leucémie L 1210, la leuc~mie P 388 et la leucossrcomato~e.
Ia toxicité du chlorhydrate de 32.999 RP a été ~tudi~e : prin¢ipalement che.z la ~ouri~. Sa do~e letale 50% (D~50) a été
déterminée (traitement pendant 4 ~ours consécuti~a) par voie intra-péritonéale et elle e~t voisine de 0,4 mg/kg.
~es exemple 8 sui~ants, donné~ à titre non limitatif, montrent ¢omment l'invention peut etre mi~e en pratlque. Dan~
ce qui suit ~ a) l'identi~ic~tion du ~2,999 RP e~t effectu~e par chromatographie -~ sur ~ouche~mince de gel de ~ilice en comparant le~ Rf des produits o~tenu~ ~ celui de 18 carminomycine ou du 32 999 RP
dans le m~me système de solvant, . b~ la production du 32,999 RP est déterminée à partir des chromatogrammes sur couohe mince, 30it d'aprèb le~ inten~it~
comparée~ de~ taches oorrespondantes de l'e~trait et de oelle du 32,999 RP pur pris comme réf~rence, ~oit par comparaison des surface~ des pics enrégi~tré~ au lecteur de plaque "Chromo~¢an" soit enfin en dosant oolorimétri~uement le 32.999 RP élué du support chromatographique au niveau de la tache du produit recherch~, ~: Exem~le 1 -On prépare un milieu de culture A dont la composition en ~/l est la 3uivante:
Autolysat de levure de bras~erie en poudre .. , 15 ~68Zz5 Pho~phate manopotassique ... 2,5 Phosphate dipota~sique .,. 2~5 Gluco~e anhydre Ø 15 Une ~olution des 3 premiers con3tituant~ dan~ 1000 cm3 d'eau distillee e~t ajust~e ~ pH 6~9 par addition de soude normale ~t est répar~ie en fiQles de ~00 cm~ ~ rai~on de 50 cm3 par ~iole. Ces ~ioles 30nt stérilisée~ ~ 122C pendant 20 minutes pUi9 refroidies. On complate le milieu en a~outant stérilement dans chaque fiole 1,5 cm3 d'une ~olution ~térile de glucose ~ 500 g/l. Ie pH du milieu est alors de 7,050 On en~emence 80 de ces fioles en a~outant dans chaque fiole 2,5 cm3 d'une culture inoculum de la souche Corynebacterium simplex (A~CC 6946)~ Ia oulture est développ~e ~ur table agitée 220 tr/mn dan~ une enceinte à 30C. Aprè~ 48 heures la culture e3t bien développée et son pH est de 7,70. On a~oute alors une ~ol~tion aqueuse à 10 mg/cm3 de chlorhydrate de carminomycine ; rai~on de 2,5 cm3 par ~iole. ~a pha~e de réductlon est pour-~uivie ~ur table agitée ~ 220 tr/mn dans une enceinte à 26C.
Après 48 heures la réduction est terminée et le pH de la culture est de 8,5, ~e contenu des 80 ~ioles est réuni. On prélève de façon homogène 50 cm3 de la culture qul e~t traité~
par 25 cm3 d~un tampon borate de façon à am~ner le pH à 9,0. On extrait alors par 2 foiu 50 cm3 d~un mélange chlorure de méthy-l~ne - butanol normal (70-30 en volu~e). ~es extrait~ organique~
sont eéché~ sur sulfate de ~odium anhydre.
~a produotion de 32.999 RP e~t d~rerminée par chroma-tographie de~ extraits organiques ~ur couche mince de silicagel.
~es volumes d~extraits déposé~ sont de 10 ~ 20 ~l. Ies plaques 50nt développées avec le mélange suivant:
chlorure de m~thylène - acide formique - m~thanol (80-17-3 en volume) afin d'obtenir une bonne séparation de la carminomycine et du 32 999 RP. ~es R~ des produit~ obtenu3 ~ont compar~s a ceux des produits de r~férence chromatographi~ dans les m~me~
conditions.
~valuation quantit~tive de la production de 32.999 RP
- montre que la oulture de Corynebacterium ~imple~ (ATCC 6946) : réduit la carminomycine en ~2 999 RP avec un rend~ment de 80%
~ur la csrm~nomycine mi~e en oeuvre.
Exemple ~ -Qn pr~pare et on r~partit en ~iole~ de 300 cm~ un milieu de culture A pr~par~ comme dan~ llexemple 1.
On pr~pare et on répartit ~galement en fiole 9 de 300 cm3 un m~lieu de culture ~ dont la compo~ition e~t la suivante:
Peptone .. 0 10 g Extr~it de ~iande ................................ ..... 5 g Gluco~e ... 10 g eau distill~e q.~.p. ................................. 1000 cm3 le pH est a~usté ~ 7,2 par addition de soude normale;
le mdlieu e~t st~rili~é ~ 122C pendant 20 minutes.
Qn en~emence une fiole contenant 50 cm3 de milieu A
dont le pH e~t de 7,05 et une fiole contenant 50 cm~ de milieu ~ dont le pH e~t de 6,5 avec, par fiole, 2,5 cm3 d~une oulture inoculum de la souche Corynebacterium simplex (ATCC 6946), ~e~ oultures sont d~veloppée~ ~ur une table agit~e 220 tr/mn dan~ une enceinte ~ 30C. Apras un temp~ de culture approprié (48 heuree pour le milieu A et 72 heures pour le milieu ~)~ une ~olution aqueuse à 10 mg/cm3 de chlorhydrate de carminomycine est alors ajoutée ~ raison de 2,5 cm3 par fiole pour obtenir une concentration de 0,5 g/l en carminomycine.
Après ces addition~ les culture~ A et B sont incubées pendant 2 et 4 ~our~, re~pectivement, ~ur lme table agitée 220 tr/mn dan~ une enceinte ~ 26C~ les fiole~ 80nt trait~e~
d~ns le 9 condition~ décrites ~ l'exemple 1 ~068ZZ5 ~ es rendements en 32.999 RP, par rapport ~ la carmino-mycine mise en jeu, sont le 8 suivant~ :

Milieu Re~dem~nt ~ Exe~le 3 -.. .
On pr~pare en ~iole de 300 cm3 dans les oondit~ons d~crite~ exemple 1 dee cultures sur le milieu A de la ~ouche Corynebacterium ~implex (A~CC 6946). ~es cultures 90nt développées sur une table agitée ~ 220 tr/mn dans une enceinte :. à 30C.
Apra~ 30 heurea d~incubation, 5 fioles sont r~unies (250 ~m3 de moût) et le~ cellule~ pr~ente~ ~ont récoltées par centrifugation. Ia récolte cellulaire da~s sa totalité est en-suite remise en suspension dans une ~iole de 300 c~3 conten~nt 50 cm3 d~un tampon phosphate M/15 ~ pH 8,0, On prépare égale-ment de la même maniere une sutre ~u~penaion cellulaire en utilisant pour la reprise de~ cellules, 50 cm3 d'un tampon phosphate M/15 ~ pH 5~0, On a~oute en~uite dan~ chaque fiole 295 cm3 d~une ~olution aqueuse ~ 4 mg~om3 de ohlorhydrat~ de carminomyoine pour obtenlr une concentr~tion de 0~2 g/l en carminomycine.
~e~ fioles sont mise~ à incuber pendant 48 heures dans les conditions décrite~ ~ l'exemple 1 et sont traitée~ comme dan3 l'e~emple 1.
~e~ rendements en antibiotique 32.999 RP par rapport la carminomycine mi3e en jeu, sont le~ suivants:
Rendement .
8,0 90% .

5,0 60%

...
.

~ ~ ~8 2 Z 5 Exem~le ~ -On pr~pare et on répartit en fiole~ de 300 cm3 un milieu de culture A dont le pH est 6,8 et qui est préparé comme décrit ~ l'exemple 1, ~ raison de 50 cm3 par fiole.
Gn ensemence plu~ieur~ fiole~ dont le pH est de 6,8 en ajoutant aans chacune d'elles ~,5 cm3 d'une culture inoculum de la souche ~acillu~ cyolooxydan~ (A~CC 12.673). Ia culture est d~elopp~e pendant 48 heure~ sur une table a~it~e a 220 tr/mn dan~ une enceinte ~ ~oC~ `
Ia r~duct~on de la carminomycine est e~fectuée en utili~ant:
- soit la culture entière dont le pE e~t de 7,65 - soit une ~uspension cellulaire dan~ un tampon de pH 8,0 pré-psr~e dans le~ conditions décrite 9 ~ l'exemple 3.
Gn ajoute dans chaque ~iole 1 cm3 d'une ~olution aqueuse ~ 10 mg/cm3 de carminomycine pour obtenir une concentra-tion de 0,2 g/l.
~ a phase de réduction est poursui~ie durant 4 jours : ~ur une table agitée ~ 220 tr/mn dsns une enceinte ~ 26C . ~es fioles sont traitée~ dans le~ conaitions décrite~ ~ l'e~emple 1.
~es rendements en 32.999 RP par rapport ~ la carminomycine mi30 en ~eu sont les ~ui~ants:

Milieu réducteur Rendement . I
: Culture entiare 94%
. . _ . _ Cellules isol~es 75% .

Exemp~e 5 -On prépare dan~ le~ conditions décrites ~ l'exemple 4 des cultures sur le milieu A de la souche ~acillus c~clooxydans (A~CC 12.673). Aux cultures entière~ -incubées pendant 48 heures et dont le pH e~t de 7,65, on ajoute la carminomycine sous ~orme:

` -42-:~ .

. , r "- 1068225 a) d~une ~olution aqueu~e ~ 10 mg/cm~ du produit pur, rai~on de 1 cm3 par ~iole (0, 2 g/1 de carminimycine) b) d'une solution aqueuae ~ 10 mg/cm3 d~un produit brut qui renferme 16% de carminomycine, ~ rai~on de 4 cm3 par fiole (0,13 g/l de carminomycine).
~ es fiole~ ~ont ensuite incubée~ pend~nt 4 jour~ dans les conditions d~crite~ ~ l'exemple 1 et traitées de la m~me m~niare. ~e~ rendement~ en 32,999 RP, par rapport ~ la carmino-mycine mi~e en jeu sont le 8 8uivants:

Produit Rendement :~
. _ ~ _ : _armin mycine pure_ _ 94~ _ carminomycine brute _ 92% _ :~ Exem~le 6 -On prépare un milieu de culture C dont la compoaition en g/l eat la ~uivante:
Farine de ~oja ... 30 Huile de soja (d=0,92) ~ 4,6 Ph08phate monopota~sique ...
Carbonate de calcium ,~, 2,5 Glucoae anhydr~ ... 50 Le~ con~tituants du milieu ~ l'exception du glucose sont di~sou~ ou mi3 en ~uspen~ion dsns 900 cm3 d'eau di~tillée ~a préparation, a~ust~e ~ un pH de 7,20 par addition de ~oude N, e8t répartie en fiole~ de 300 cm3 ~ rai~on de 45 cm3 par fiole.
Ce9 fioles ~ont stéri isée~ ~ 122C pendant 20 minute~ et re-froidie~ On complate le milieu en a~outant ~térilement dana chaqu~ fiole 5 cm3 d'une solution st~rile de gluco~e ~ 500 g/l.
Le pH du milieu pr~t pour l'ensemencement est de 7,0~
On ensemence une fiole de 300 cm3 contenant 50 cm3 du milieu pr~c~dent dont le plI est de 7,0 avec 2,5 cm3 d'une culture : ~)68225 inoculum de la ~ouche Streptomyces ~oseochromogene~ (A~CC 13.400).
ha culture est développée pendant 48 heure~ ~ur une table agitée ~ 220 tr/mn dan~ une enceinte ~ 30C, On récolte alors le~
- cellules produite 8 par cette culture. ~a réduction de la car-minomycine en ~ntibiotique 32.999 RP est effectu~e en utili~ant une ~u~pension des cellules dan~ 50 cm3 d'un tampon phosphate M/15 à pH 8,0 contenant 1 c~3 d'une solution aqueu~e ~ 10 mg/cm3 de chlorhydrate de carminomycine pour obtenir une concentration de 0,2 g/l. ~a pha~e de réduction e~t poursuivie pendant 48 heures sur une table agit~ ~ 22~ tr/mn dan~ une enceinte 26C. ~a suspen~ion cellulaire e~t braitée dans les condition~
décrite~ exemple 1. ~e rendement en 32.999 RP psr rapport la carminomyc~ne mise en jeu est de 57%.
Exem~le 7 -On prépare et on répartit en fioles de 300 cm3 un milieu de culture C prépar~ dans le~ conditions décrite 8 l'exemple 6.
On en~eme~ce de~ fioles oontenant 50 cm3 de ¢e milieu, dont le pH est de 6,90, avec 2,5 cm3 d'une culture inoculum de la ~ouche Streptomyces lavendulae (A~CC 8664). ~a culture est développée pendant 40 heures sur table agitée ~ 220 tr/mn dan~
une enceinte à 26C. On ajoute alore dan~ cha~ue fiole contenant la oulture enti~re, dont le pH e~t de 7,50, 1 cm3 d~une ~olution aqueuse à 10 mg/cm3 de chlorhydrate de carminomycine pour obtenir une concentration de 0,2 g/l. Ia phase de réduction est pour-suivie pendant 4 ~ours dan~ le~ mêmes conditions d'agitation et de temp~rature. ~es fiole~ sont trait~e~ dans les oonditions d~crites à l~exemple 1. ~e rendement en 32.999 RP, par rapport la carminomycine mise en jeu, e~t de 61%.
~o Exem~le 8 -A - ermentati~o~

~IL0682~5 On charge dan~ u~e fermenteur de 170 litre~
Peptone ... 600 g Extrait de viande .. ~ 600 g ~trait ds levure ... 600 g . Gluco3e monohydraté ,,, 600 g - Eau de ville q. g . p. ,, . t 10 litre 9 Apra~ svoir ~ust~ le pH ~ 6,8 avec 40 cm3 de ~oude 10 N on a~oute :
Csrbonate de calcium ., . 300 g - 10 le pH du milieu est alors voisin de 6,8 on ~térili~e le milieu par barbotage de vapeur ~ 122C pendant 40 minutes;
apras refroidissement~ du fait de la conden~ation de vapeur au cours de la ~t~rilisation, le volume de boulllon est de 120 litres et le pH de 8,3. Ic pH est a~ust~ à 7,0 par addition de 90 cm3 . d'acide chlorhydrique 12 ~.
- On ensemence avec 250 cm3 d'une culture inooulum en iole erlenmeyer agitée de la souohe Corynebac~erium ~implex (ATCC 6946), Ia oulture est développée ~ 30C pendant 32 heure 9 en agitant et en sérant avec de l'air ~térileS elle est alor~
convenable pour l'en~emencement de la culture productrice.
~ a culture produotrice est e~fectuée dans un fermenteur de 800 l~tre~ charg~ aveo le~ ~ubstanoe~ suivante3:
Autolysat de levure de brasserie en poudre ,,. 6 kg Phosph~te monopotas~ique ... 1 kg Phosphste dipotas~ique ... 1 kg Eau de vllle q.g.P. .~- 355 litres Après a~oir a~u~t~ le pH ~ 7,0 par addition de 460 cm3 de ~oude 10 N, on stérilise le milieu par barbotsge de vapeur - à 122C pendant 40 minutes, Après refroidl~sement, du fait de la condensation de vapeur au cour~ de la st~rilisation, le volume du bouillon est de 385 litres; il est eompl~té à 400 litre~ par addition de 15 litres d'une solution aqueu~e stérile .

~0 6 82 2 5 contenant :
Gluco3e monohydrat~ .. 6 kg ~ e pH du milieu e~t de 6~8, On en~em~nce avec 40 litre~ de la oulture inoculum en ~ermenteur de 170 litre~
décrite ¢i-dessus. Ia culture e~t développ~e ~ 30C en agitant avec une turblne tournant ~ S60 tr/mn et en aérant a~ec un volume d'sir ~t~rile de 20 m~/h. Apras 30 heures~ la culture est convenable pour effectuer la transformation biochimique de la carminomycine en 32.999 RP
On introduit dans la culture 4 litre~ d'une ~olution aqueu3e contenant:
Chlorhydr~te de carminomycine .~. 40 g ~incubation e~t poursuivie pGndant 17 heure~ à 26C~
en agitant et en aérant dans les oonditions décrites ci-des~us.
~a c~rminomycine e~t réduite en 32 999 RP aYec un rendement voi~in de 100~.
~ - xtractidn A 420 litre~ de moût obtenu comme déorit à l~exemple 8 A, on ajoute 42 litres de n.butanol et 2,9 litres de ~oude

6 N, ~e principe actif e3t extr~it à contre-courant par du n.butanol (60% en volume) ~ur deux centrifugeu~e~ ~extrait~
dont le volume e~t de 330 litres~ e~t oonc~ntré ~OU9 pre~ion r~duite (5 ~ 10 mm de mercure) à 40C ~u3qu~ un ~olume de 20 litre 9 .
A l~extrait concentr~ on a~oute 20 litres de chlorure de méthylène et on lsve ce m~lange par 10 litre~ d~eau smen~s à
pH 10 par addition de soude. ~eau de lavage, qui contient du 32~999 RP, est extraite 2 foie psr 10 litres du mélange ohlorure de m~thylène - n.butanol (80-20 en volume) ~e~ troi~ extraits organiques sont réuni~ pUi9 con-centrés sous pre~s~on r~duite (5 ~ 10 mm de mercure) ju~qu~à un volume de 15 litres. On ajoute ~lors en agitant 0,2 litre du :1~)6~225 mélange n,butanol - acide chlorhydrique 11 N (90-10 en volume) pui~ on concentre sous pres~ion réduite (5 ~ 10 mm de mercure) jusqut~ un volume de 5 litres~
~sntibiotique 32.999 RP ~u9 forme de chlorhydrate e~t precipit~ par sddition du concentrat dan~ 35 litre~ d'hexane.
Ie pr~cipit~ e~t e3soré, lavé et ~éch~. On obtient ainsi 52 g de chlorhydrate brut de 32,999 RP.
C - Purificatio~
~ ...
a) A une ~uspenqion de 50 g de chlorhydrate brut de 32.ggg RP, obtenu oomme indiqué ~ l~exe~ple 8 B, dsns 130 cm3 dleau, on a~oute 520 cm3 de dioxanne, Ia ~olution obte-nue est filtr~e, ~ e chlorhydrate de 32.999 RP e~t cristallisé par addition de 4 litres de dio~aNne~ ~ une température voisine de 20C,dans le filtrat. IeY cri~taux 90nt e~qsorés, l~é~ par du dioxanne et ~ch~s, On obtient ainsi 27 ~ de chlorhydrate de 32.999 RP semi purifié, b) 4,2 g de chlorhydrate brut obtenus comme ~ l'exemple 8 B sont mi~ en ~olution dans 0,2 litre d'eau, ~e pH est ajusté
à 4,5 par addition de ~oude N 10.
antibiotigue contenu dan~ cette eolution e~t ~ixé
~ur une colonne oontenant 14 litre d'Amberl~te IRC 50 (marque de commerce) 90U9 forme aoide, Ia colonne e~t lavée par 1 litre d'eau, 2 litres de méthanol a~ueux à 50~o, 2 litre~ de méthanol aqueux a 90~ et enfin par 3 litres de mé-thanol aqueux ~ 90~o con-tenant 1% de chlorure de ~odium, L~éluat est concentr~ ~ouY
pre~sion réduite (5 A 10 mm de mercure) ~ 40C ju~qu~ un volume de 0,5 litre. Ie concentrat, dont le pH e~t aju~té ~ 10 par addition de ~oude 11 N, est e~trait par 2 foi~ 0,5 litre de ohloroforme et 2 fois 0,5 litre du mélsnge chloroforme -n.butanol (80-20 en ~olume), le9 extraits organiques réunis ~ont concentr~s 90U~ pression réduite (5 ~ 10 mm de mercure) /~ ,' ~ ' -47-~ ` 106822S
` 40C. Pendant la ¢oncentration on ~joute 10 cm3 de n,butanol .
; contenant 1% (en volume) d~acide chlorhydrique 11 N et 5% ten ~olume) dleau. Ie concentrat, dont le volume est amen~ ~ ~0 cm3~ est 8 jouté lent~ment ~ 500 cm3 d'hexane. ~e précipit~
obtenu e~t e~sor~, la~é et séché. On obtient ainsi 1,26 g de chlorhydrate de 32.999 RP ~em~-puriri~.
-~Ie produit semi-puririé (27 g) obtenu ~elon a) est mis en solution dan~ 300 cm3 d'eau, ~a solution obtenue est filtrée, ~e chlorhydrate de 32.999 RP est crist~llisé par addition dans le filtrat de 2,7 litre~ d'ac~tone, ~ une tempérs-ture voi~ine de 20C~ ~es cristau~ sont e~sorés~ lavé~ et séché~ Cn obtient ainsi 17 g de chlorhydrate de 32.999 RP pur.
ExemP~e i9 -On centrifuge stérilement à une tempér~ture voisine de 0C~ 50 cm3 d'une culture de Corynebacterium simplex (A~CC 6946) d~eloppée pendant 30 heures dans les condition~
d~crites dans l'exemple 8 A. Après ~entrifugation les cellules sont remises en suspension dans 50 om3 de tampon phosphate M/15 a pH 7~5, ~es cellules ~ont alors ~oumises ~ l'action des ultra-~ons (25 kHz) pendant 15 minutes ~ une temp~rature voisine de oa. Aprè~ centrifugation on a~oute au li~uide ~urnageant 10 mg de chlorhydrate de carminomycine, ~a ~olu~ion ain~i obtenue e~t mi~e à incuber dan~ les cond~tions d~crites dans l'exemple 1. Après 40 heures, la carminomycine e~t r~duite en 32.999 RP avec un rendement voisin de 60%.
E~emPlè 10 -Cn cen~riruge stérilement ~ une température vo$3ine de 0C 50 cm3 d'une culture de Coryn~bacterium ~implex (A~CC
6946) développée pendant 30 heures dans les condit$ons qui sont décrites dans l'exemple 8 A. Apr~ centrifugation~ le~ cellules ~ont remises en ~uspen~ion dans 50 cm3 de tampon tri~(hydroxy-"` 1~16~3Z2S

méthyl) aminom~thane/HCl M/5 ~ p~ 8,1 et tran~férée~ dans une fiole erlenmeyer de 300 cm3 on a~oute alor~ 25 mg de ED~A
(acide ~thyl~ne diamine tétraac~ti~ue), 25 mg de C~A~ (bromure de c~tyltriméthylammonium) et 200 mg de ly~ozyme~ puis la fiole est placée à 37C pendsnt 1 heure, ~ur une table toUrnant ~
220 tr/mn. Apra~ centrifugation, on ajoute au li~uide ~ur-nageant 5 mg de chlorhydrate de carminomycine. ~a solution ainsi obtenue e~t mi~e ~ incuber dan~ le~ condition~ qui ~ont décrite~ dans l'e~emple 1. Après 40 heures, la carminomycine e~t réduite en 32.999 RP avec un rendement voisin de 30~0.
ExemPl'e 1~-0~5 g de ehlorhydrate de 32.999 RP pur ~ont hydroly~és par mise en solution dans 50 cm3 d'eau add~tionn~e de 10 cm3 d'acide chlorhydrigue 11 N et chauf~age ~ l'ébullition pendant 2 heures. Un pr~cipité cri~tallin d'aglycone se forme en cours d'hydroly~e. le précipité est essoré, la~ et ~ch~. Cn obtient ain~i 0,3 g d'aglycone pur~
Exem~e ~ --~ On pr~pare un milieu de oulture A ayant la composltion ~ui~ante:
- farine de so~s .,,8 g - levure de boulangerie en pa~n ,.,40 g - lactose pur .0l.58 g - chlorure de sodium ...2 g _ phosphate monopotassi~Ue ...1 g _ sulfate de magnésium heptahydrat~ ,..... 0,1 g - ~ulfate ferreux heptahydraté .~.0~1 g _ sulfate de zinc heptahydrat~ .,.0~1 g - eau distill~e ~ 75C ,,,800 cm3 - 30 ~e pH de la ~uspension s~t aju~té ~ 6,5 par addition de 1 cm3 de soude 10 N, pui~ on ajoutes - glyc~rine (d - 1~26) .~ ol 19 g : - carbonate de calcium ,,. 2 g ~ - eau distillée compl~m~nt ~ . .', 1000 cm3 ~- Ce mil~eu e~t r~parti ~n f~olea de 300 cm3 ~ rai~on de 50 cm3 par fiole. Ie~ fioles ~ont ~t~rilisée~ ~ 122C pendant 20 minutes, Apr~s refroidis~ement le pH du milieu est de 5,9, On prépare~ par ailleur~ une solution stér~le de sulfan~lEmide ~
10 mg/cm3 et ~ pH 9,0 par di~olution de sulfanilamide dans un m~lange de soude 5 N et d'eau distillée pUi9 filtration sur membrane nMillipore 0,45 ~".
~ e 3 fiole 9 contenant le milieu ~térile A sont ré-partie~ en 6 lot~ de 2 fiole~ ch~cun.
~ e~ fioles du lot Al ne reçoivent pas d~a~aition complémentaire.
~ e~ fiole~ des 5 autree lots reçoivent les addition~
complémentaire~ sui~ante~:
- lot A2 : 1 cm3 de la solution de ~ulfanilamide (0,2 g/l) - lot A3 : 2 cm3 de la 301ution de sulfsnilamide (0~4 g/l) - lot A4 s 3 ¢m3 de la ~olution de sulfanilamide (0~6 g/l) - lot A5 s 4 cm3 de la solution de sul~anllamide (0,8 g/l) - lot A6 s 1 cm3 de la ~olution de ~ulfanilamide (0~2 g/l) ~es ficle~ du lot A1 et le~ ~iole3 qul ont reçu une addition de ~ulfanilamide sont en~emenc~e~, à rai30n de 2,5 cm3 par fiole, a~ec une culture inoculum de Streptomyces coeruloeru-bidu3 DS 7.126 (NRR~ 8098) figée de 72 heures.
Ie9 cultures sont d~veloppéea 3ur une ~able agitée t 220 tour~/mn dan~ une enceinte ~ 26C, ~es fioles du lot A6 reçoivent apra~ 48 et 72 heures d'incubation 2 nou~elles addi-tion~ de la solution de sulfanilamide (concentration totale en sulfanilamide 0,6 g/l). Apra~ chacune de ces additions ll~ncu-bation d~ ~iole~ e~t reprise dans les m~mes condition~ d~agita-106~Z25 tion et de température.
Apras 7 ~ours d'incubation dans les conditions indiqu~e~ ci-de~su~, on tr~ite ~ chaque foi~ une fiole de chacun de~ lots pour do~er le 32,999 RP, ~e tra$tement s'effectu8 en a~outant dans chaque fiole 4 g d~acide oxaliq~e (~e qui amane le plI du moût ~ 1,5) et 50 om3 d~éthanol absolu.
- ~a fiole contenant ce mélange e~t bouchée hermét~quement e~~ plac~e pendant 1 heure sur une tab~e agit~e ~`220 tours/mn.
~e mélange e~t en~uite filtré ~ur papier et le filtrat di3-0 till~ 80U9 pres~ion r~duite ~ 50C ~usqu'~ la moiti~ de ~on ~olume init~al (50 cm3)~ Ie concentrat est aJu~t~ ~ pH 4,5 par addition de soude 5 N pUi9 on a~oute ~u¢cessivement 50 cm3 du mélange chlorure de méthylane n-butanol (80-20 en volume3~
et 25 cm3 de tampon borate 0,5 M ~ pH 9,0. Après agitation en ampoule~ on recueille par décantation la phase sol~ant colorée et on répete le traitement sur le~ eau~-m~ree aqueu~es qui sont - ~puisée~ par 50 cm3 du m~e m~lange ~olvant. Ies phase~ org2ni-ques sont réunie~ et séchées sur ~ulfatb de ~odium anhydre. ~e volume de la pha~e organique est finalement a~u~t~ ~ 100 em3 par addition du m~me mélange ~olvant.
Pour déterminer la production de 32.999 RP on chroma-tographie ces e~traits sur couche mince, a production e~t évaluée qualitativement en d~posant sur de~ pla~ues dè silicagel (Mbrcl~60 - 3upport verre - sans indicate~r de fluorescence) 100 ~1 de l'extrait et 2,510 ~g d'une r~férence de 32.999 RP pur. ~ee plaque~ ~ont développée~ avec le mélange chlorure de m~thylane - ~thanol -acide a~tique - eau (80/20/10/4 en volum~). Ia pr~ence éventuelle de 32.999 RP dan~ les extralt3 est mi~e en ~vidence, aprè~ d~veloppement~ en examinant le 3 chromatogramme~ ~oit la lumière du ~our soit en lumi~re ultra-~iolette ~ 254 nm, 2) - ~a production de 32.999 RP e~t me~ur~e quantita ~marque de commerce -51-.

tivement en d~posant ~ur des plaques de ~ilicagel [Merck 60 F
254 - support verre avec ~ndicateur de fluorescence] des volume3 d'extraits déte~minés dlaprè~ la chromatographie qualitative compris e~tre 10 et 100 ~l~ On dépo~e ~galement ~ur ce~ plaque~
une gsmme (0,5 ~ 1,5 ~g) de 32.999 RP pur.- ~es plaques ~ont développées avec le mélange ~olvant décrit ci-de~u~ Aprè~
développement ces pla~ues ~ont pas3ées au lecteur de plaque I'Chromo~c~n'l ~ui enregistre le~ pic~ oorrespondant au 32.999 RP
: contenu dans les extrait~. Cn calcule le~ surface~ de ces pic9 et celles correspondantes de la gamme ~t810n de 32,999 RP pur et on détermine ainsi la production de 32.999 RP des cultures.
A~ec le~ culture~ traitée~ ~Yec le ~ul~anilamide on a obtenu avec cette m~thode de do3age les r~sultats suivants :
.' .. _, , : .~ot~ Sulfanilamide (g/l)32,999 RP (mg/l) ; A1 O O
: A2 0,2 O
. 3 ~4 26 4 0,6 42 0,8 33 A6 0~6 (0,2 x 3) 5 _~

Exem'Plei '1'3' On r~partit en fiole~ de 300 cm3 a r~i~on de 50 cm3 par fiole un milieu A identique 3 celui decrit dans l'exemple 12.
On prépare également une ~olution de sulfanilamide 10 mg/cm3 dan3 le~ conditions d~crites dan3 l'e~emple 12.
~ e~ fiole3 con~nant le milieu stérile A sont réparties en 4 lots A1, Al1~A~ A~5 de 2 ~ioles chacun et on a~oute dan3 chaque fiole de~:
- - lots A5 et A'5 : 4 cm3 de la eolution de sulfanilamide (0~8 ~ ) lee fiole~ de~ lot~ A1 et A'1 ne ~ubis~ant aucune addition.
marque de commerce '1068225 On ensemence ensui~e toutes les fioles:
~ - des lots A1 et A5 avec 2,5 cm3 par fiole d'une culture - inoculum de Streptomyces coeruleorubidu~ DS 8899 (NRR~ 3046) ~gée de 72 heure~
- d~s lot~ A~l et A'5 avec 2,5 cm3 par fiole d~une culture ino-culum ae Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723 (NRR~ 3045) - agée de 72 heure~.
~ e~ cultures ~ont développées ~ur table agitée ~ 220 tours~mn dans une ence~nte ~ 26C. ~es flole~ incubées 7 jour~
d~n~ ces condition~ ~ont tra~tée~ pour doser le 32.999 RP comme décrit dans l'exemple 12.
~ es production~ suivante~ ont été obtenue 9 :

: ~ot~ Sulftng/l)mide Production de 32.999 RP (en mg/l) Streptomyce~ ~$8~99 Streptomyce~DS31.723 . .. _ _ _ A1 A' 1 0 0 A5 A ' 5_ 0 ,8 _ . _ 25 .. - ._ Exem~le~ ~4' -On répartit en fioles de 300 cm3 ~ raison de 50 cm3 ~ .
par fiole un milieu A identique ~ celui décrit dans l'e~emple 12.
On prépare ~galement une solution de ~ulfsnilamidQ a 10 mg/cm3 dans le9 oonditions d~crite9 dan0 l'exemple 120 ~e~ fioles contenant le milieu ~térile A ~ont repartie~
en 4 lots de 2 fioles chacun et on a~oute dane chaque fiole des:
- lot A2 : 1 cm3 de la ~olution de sulfanilamide (0,2 g/l) - lot A3 : 2 cm3 de la ~olution de ~ulfanilamide (0~4 g/l) - lot A4 : ~ cm3 de la solutlon de ~ulfanilamide (0,6 g/l) le~ ~ioles du lot Al ne subi~ant aucune addition Apre`s ce~ addition~ on en~emence toutes le~ fiole~ des lot~ A1~ A2~ A3 et A4 avec 2,5 cm3 par fiole d'une culture ino-culum de Streptomyoe3 bifurcus DS 23.219 (NRR~ 3539) ~gée de 72 1~682ZS
heures.
~ es cultures sont développées ~ur une table agitée à 220 tours/mn dans une enceinte à 26C. ~es fioles incubées

7 jours dans ces conditionq sont traitées pour doser le 32.999 RP comme décrit dans l'exemple 12. ~es productions suivantes ont été obtenues:

~ots Sulfanilamid e ( g/l) 32.999 RP (mg/l) , . . . ._._ . ,.. ______ _ . . .. _ A2 0,2 36 . A3 0,4 28 A4 0,6 13 .

Exemple 15 -On prépare un milieu de culture B ayant la composition suivante:
- farine de soja ... 30 g - distillers' solubles ... 5 g - amidon partiellement hydrolysé "Fox head"(marque de -- 5 g commerce ) - huile de soja (d = 0,92) .., 27,5 g - chlorure de sodium ... 10 g - eau distillée .. 1000 cm3 Ce milieu, dont le pH est ajusté à 7,20 par addition de soude N, est réparti en fioles de 300 cm3 à raison de 50 cm3 par fiole et est stérilisé à 122C pendant 20 minutes. Après refroidissement le pE~ est de 6,60.
On prépare une solution aqueuse de sulfanilamide identique à celle décrite dans l'exemple 12.
~es fioles contenant le milieu sterile B sont répar-ties en 2 lots B1 et B2 de 2 fioles chacun. ~es fioles du lot B1 ne reçoivent aucune autre addition complémentaireO On ajoute 106~3225 dans chaque fiole du:
- lot B2 : 2 cm3 de la solution de sulfanilalDide (0,4 g/l).
`` Après ces additions on ensemence toutes les fioles des lots B1 et B2 avec 2,5 cm3 d'une culture inoculum de Streptomyces coeruleorubidus DS 31,723 (NRR~ 3045) âgée de 72 heures. ~es cultures sont développées sur une table agitée à 220 tours/mn dans une enceinte à 26C. ~es fioles incubées 7 jours dans ces conditions sont traitées pour doser le 32.999 RP comme - décrit dans l'exemple 12, ~es productions suivante3 ont été
obtenues:

~ fan~ amide (g/l~ 32.999 :-, ~
Exemple 16 -On répartit en fioles de 300 cm3 à raison de 50 cm3 par fiole un milieu A identique à celui decrit dans l'exemple 12.
On prépare également une solution de sulfathiazole à 10 mg/cm3 dans les conditions décrites dans l'exemple 12 pour la préparation de la solution de sulfanilamide.
~ es fioles contenant le ~Dilieu stérile A sont répar-ties en 4 lots de 2 fioles chacun et on e~fectue dans chaque fiole les additions suivantes:
- lo~ A7 : 0,25 cm3 de la solution de sulfathiazole (0,05 g/l) - lot A8 : 1 cm3 de la solution de sulfathiazole (0,2 g/l) - lot Ag : 0,5 cm 3 de la solution de sulfathiazole (0,1 g/l) les fioles du lot A1 ne subissant aucune addition.
On ensemence ensuite chaque fiole des lots A1, A7, A8 et Ag avec 2,5 cm3 d'une culture inoculum de Streptomyces coeruleorubidus DS 7.126 (NRR~ 8098) âgée de 72 heures. ~es cultures sont développées sur une table agitée a 220 tours/mn dans une enceinte à 26C. ~es fioles du lot Ag reçoivent aprè~
48 et 72 heures d'incubation 2 nouvelles additions de 0,5 cm3 de la solution de sulfathiazole (concentration totale en sulfa-' thiazole 0,3 g/l). Après chacune de ces additions l'incubation des fioles est repri~e danæ les même co~ditions d'agitation et - de température.
Les fioles sont incubées 7 jours et traitées pour doser le 32.999 RP comme décrit dans l'exemple 12. ~es produc-tions suivantes ont été obtenues:
. . .

A~Sulfathiazole (g/l) 32.999 RP (mg/l) A70,05 O
A80,2 51 Ag_ _ ~ 64 Exem~le 17 -On répartit en fioles de 300 cm~ à raison de 50 cm3 par fiole un milieu A identique à celui décrit dans l'exemple 12.
On prépare éga'lement une solution de sulfathiazole à
10 mg/cm3 dans les conditions décrites dans l'exernple 16.
Les fioles contenant le milieu stérile A sont répar-ties en 4 lots de 2 fioles chacun. Les fioles du lot A1 ne reçoivent aucune autre addition complémentaire. On effectue dans chacune des autres fioles les additions suivantes:
- lot A10 : 0,5 cm3 de la solution de sulfathiazole (0,1 g/l) - lot A11 : 2 cm3 de la solution de sulfathiazole (0,4 g/l) - lot A12 : 2,5 cm3 de la solution de sulfathiaæole (0,5 g/l) Après ces additions, on ensemence toutes les fioles .
des lots Al, Alo, Al,l et A12 avec 2,5 cm3 d'une culture inocu-- lum de Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723 (NRRL 3045) âgée de 72 heures. Les cultures sont développées sur table agitée à
220 tours/mn dans une enceinte à 26C.
Les fioles incubées 7 jours dans ces conditions sont traitées pour doser le 32.999 RP comme décrit dans l'exemple 12.
Les productions suivantes ont été obtenues:

_ . . _ ~.~ Lots Sulfathiazole (g/l) 32.99~ RP (mg/l) - 10 . . ._ . ': Al O O
Al o O 1 1 ~ O
All 0,4 9 .. Al 2 ~ ~ I
Exemple 1~ -On répartit en fioles de 300 cm3 à raison de 50 cm3 par fiole un milieu A identique à celui décrit dans l'exemple 12.
On prépare également une solution de sulfathiazole à
10 mg/cm3 dans les conditions décrites dans l'exemple 16.
Les fioles contenant le milieu stérile A sont réparties en 4 lots de 2 fioles chacun et on effectue dans ehaque Eiole les additions suivantes:
- lot Alo : 0,5 em3 de la solution de sulfathiazole (0,1 g/l) - lct A8 : 1 cm3 de la solutionde sulfathiazol~e (0,2 g/l) - lot All : 2 cm3 de la solution de sulfathiazole (0,4 g/l) les fioles du lot Al ne subissant aucune addition.
Après ces additions, on ensemence chaque fiole des lots Al, Alo, A8 et All avec 2,5 cm3 d'une culture inoculum de Streptomyces bifurcus DS 23.219 (NRRL 3539) agée de 72 heures.
30 Les eultures sont développées sur table agitée à 220 tours/mn dans une enceinte à 26C.

.

. ..
-10682~5 ~ es fioles incubées 7 jours dans ces conditions sont traitées pour doser le 32.999 RP comme décrit dans l'exemple 12.
~es productions suivantes ont été obtenues:

Dots Sulfathiazole (g/l)32.999 '' ~mg/l) A? O O
0,1 18 A8 0,2 22 _ _ 0,4 5 Exemple 19 -On prépare un milieu de culture C contenant :
- haricots en grain ... 40 g - distillers' solubles ... 10 g - glucose ... 15-g - huile de soja (d = 0,92) ... 18,5 g - chlorure de cobalt hexahydraté ... 0,02 g qui est obtenu de la manière suivante:
~es haricots ~près cuisson à l'autoclave avec 500 cm3 d'eau distillée pendant 45 minutes à 122C sont réduits en puree.
On ajoute ensuite les di~tiller~' soluble~, l'huile de soja, le chlorure de cobalt et l'eau distillee pour obtenir un volume de 900 cm3.
Le pH du mélange est a;justé à 7,2 par addition de soude 5 N. ~e mélange est réparti en fioles de 300 cm3 à raison de 45 cm3 par fiole. ~es fioles sont stérilisées à 122C pen-dant 20 minutes. Après refroidissement, on ajoute stérilementd~ns chaque fiole 5 cm3 d'une solution stérile de glucose à 15 %
~e pH de ce milieu stérile prêt pour l'ensemencement est de 6,70 F' 1~1682Z5 On prépare également une solution aqueuse de sul~a-thiazole identique à celle qui est décrite dans l'exemple 16, Les fioles contenant le milieu stérile C sont répar-ties en 2 lots C1 et C2 de 2 fioles chacun. ~es fioles du lot C1 ne reçoivent aucune addition complémentaire. On ajoute dans cha~ue fiole du lot C~ 0,5 cm3 de la solution de sul~athiazole (0,1 g/l).
Après cette addition on ensemence chaque fiole des lots C1 et C2 avec 2,5 cm3 d'une culture inoculum de Strepto-myces bifurcus DS 23.219 (NRR1 3539) âgée de 72 heures. ~es cultures sont développées sur une table agitée à 220 tours/mn dans une enceinte à 26C. ~es fioles incubées 10 jours dans ces conditions sont traitées pour doser le 32,999 RP co~me décrit dans l'exemple 12.
~es productions suivantes ont été obtenues:

~ots Sulfathiazole (g/l) ~^,999 RP (~
C1 . __ .. .
C2 ---~ - -- - 16 - Exemple 20 -On répartit en fioles de 300 cm3 à raison de 50 om~
par fiole un milieu A identique ~ celui decrit dans l'exemple 12.
On prépare par ailleurs une solution de ~ulfapyrida-zine à 10 mg/cm3 en dissolvant le produit dans un mélange d'eau distillée et d'acide chlorhydrique 5 N~ La solution dont le pH est 2,0 est stérilisée par filtration sur membrane "Millipore 0,45 ~"(marque de commerce), ~es fioles contenant le milieu stérile A sont réparties - en 3 lots de 2 fioles chacun et on effectue stérile~ent dans - chacune des fioles les additions suivantes:

,..... . .

106~3Z25 - lot A13: 0,5 cm3 de la solution de sulfapyridaæine (0,1 g/l) - lot A14 : 1 cm3 de la solution de sulfapyridazine (o,~ g/l) les fioles du lot A1 ne subiss~nt aucune addition.
On en~emence ensuite chaque fiole des lots A1, A1~ et A14 avec 2,5 c~3 d'une culture inoculum de Streptomyce~ coerule-orubidus DS 7.126 (NRR~ 8098) ~gée de 72 heures.
J.es cultures sont incubées pendant 7 jours avec agita-tion dans les conditions décrites à l'exemple 12. ~es résultats des dosages effectués dans les conditions décrites dans l'exemple 12 sont les suivants:

. ~ots Sulfapyridazine (g/l) 32.999 RP (mg/l~
'' ___ .

A13 0,1 38 _ _ 0,2 _ Exemple 21 -On répartit en fioles de 300 cm3 à raison de 50 cm3 par fiole un milieu A identique à celui décrlt dans l'exernple 12.
On prépare par ailleurs une solution d'a~éthoptérine à 20 mg/cm3 en dissolvant le produit dans un mélange d~eau dis-tillée et de soude 5 N. La solution dontle pH est de 10,0 est stérilisée par filtration sur membrane "Millipore 0,~5 ~u".
~ es fioles contenallt le milieu stérile A sont répar-en 4 lots A1~ A1s~ A16 et A17 de 2 fioleG chacun I.esfioles du lot A1 ne reçoivent aucune addition complémentaire.
Dans chacune des fioles des 3 autres lots, on effectue les additions suivantes:
- lot A1~ : 0,25 cm3 de la solution d'améthoptérine (0,1 g/l) - lot A16 : 0,6 cm3 de la solution d'a~éthoptérine (0,24 g/l) " - 60 -~)68~25 - lot A17: 1 cm3 de la solution d'améthoptérine (0~4 g/l) Après ces additions on ensemence chaque fiole des lots A1, A15, A16 et A17 avec 2,5 cm3 d~une culture inoculum de Strepto~yces coeruleorubidus DS 7.126 (NRR~ 8098) âgée de 72 - heures. ~es cultures sont incubées pendant 7 jours avec agita-tion dan~ les conditions décrite8 dans l'exemple 12.
~ es résultats du dosage du 32.999 RP effectué dans les conditions habituelles sont les suivants:

~ots Améthoptérine(g/l)¦ 32.999 RP(mg/l) :, . ~ .

A15 0,1 7, A16 0,24 11 A17 0,4~ ~ 1 -~ Exemple 2? -On répartit en fioles de 300 cm3 à raison de 50 cm3 ~ par fiole un milieu A identique à celui décrit dans l'exemple 12.
On prépare par ailleurs une solution de barbital à
50 mg/cm3 en dissolvant le produit dans un mélange d'eau distil-lée et de soude 5 N. La solution dont le pH est de 11,0 est stérilisée par filtration sur membrane "Millipore 0,45/u".
Les fioles contenant le milieu stérile A sont réparties en 4 lots Al, A18, A~g et A20 de 2 fioles chacun e-t on effectue -; dans chaque fiole des lots A18 et A19 les additions suivantes:
- lot A18 : 0,5 cm3 de la solution de barbital (0,5 g/l) - lot A19 : 2 cm3 de la solution de barbital (2 g/l) les fioles du lot A1 ne subissant aucune addition et les fioles du lot A20 recevant, dans les conditions indiquées ci-dessous, une addition en cours de la culture.
On ensemence ensuite chaque fiole des lots A1, A18, '' .

~ 61 -~ 6~322$
A19 et A20 avec 2,5 cm3 d'une culture inoculum de Streptomyces coeruleorubidus DS 7.126 (NRR~ 8098) âgée de 72 heures.
Les fioles sont incubées dans une enceinte à 26C sur table agitée à 220 tours/mn. Après 24 heures d'incubation on ajoute dans chaque fiole du lot A20, 1.5 cm3 de la solution de barbital (1,5 g/l) et l'incubation de ces fioles est poursuivie dans les mêmes conditions d'agitation et de température.
Aprè~ 7 ,jour~ d'incubation les fioles sont traitées dans les conditions décrites dans l'exemple 12. ~es résultats suivants ont été obtenus:

~ote barbital (g/l) 3'.999 RP ~ ) Alg 2~5 23 A20 1,5 _ _ En opérant comme ci-dessus, en utilisant un milieu de culture A réparti en lots A1, A21, A22, A23 e 24 chacun, les lots A2l9 A22, A23 et A24 recevant des additions respectives de 0,5 g/l de phénobarbital sodique, 0,5 g/1 de butobarbital sodique (sel de sodium de l'acide butyl-5 ~thyl-5 barbiturique), 0,5 g/l et 2 g/l de penthiobarbital (acide éthyl-5 (méthyl-1 butyl)-5 thiobarbiturique), et en poursuivant l'incu-bation pendant 9 jours, on obtient les résultats suivants:

6~ 2 2 5 ~ots Adjuvants (g/l) 32999 RP (mg/l) ' _ . .

A21 phénobarbital 0~5 9 A22 butobarbital 0,5 12 A2~ penthiobarbital 0,5 12 penthiobarbital 2 22 Exemple 23 -a) ~ermentation -.
On charge dans un fermenteur de 75 litres:
- farine de soaa .,, 1500 g - distillers' solubles ... 250 g - amidon partiellement hydrolysé .,, 1750 g - huile de soja ... 750 cm3 . . .
- chlorure de sodium .,. 500 g - eau de ville q.s.p. ... 45 litres - ~e pH est ajusté à 7,50 par addition de 40 cm3 de soude 10 N. On stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 122C
- pendant 40 minutes. Après refroidissement, du fait de la conden-sation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 50 litres; le pH est de 6,70. On ensemence alors avec 200 cm3 d'une culture en erlenmeyer agité du Streptomyces coeruleorubidus DS 7.126 (NRR~ 8098). ~a culture ~
est developpée à 30C pendant 25 heures en agitant et en aérant avec de l'air 3tériie; elle est alors convenable pour l'ensemen-cement de la culture productrice.
~a culture productrice est effectuée dans un fermenteur de 800 litres chargé avec les substances suivantes:
` - farine de soja ........................................ 3,2 kg - crème de levure de boulangerie ........................ 24 kg , 1C)682ZS
- lactose ... 23,2 kg - chlorure de sodium ... 098 kg - phosphate monopotassique ... 0,4 kg - sulfate de magnésium heptahydraté ... 0,04 kg - sulfate ferreux heptahydraté ,... 0,04 kg - sulfate de zinc heptahydraté ... 0,04 kg - antimousse -- 30 cm3 - eau de ville complément à 200 litres Après avoir ajusté le pH à 6,50 par addition de 210 cm3 de soude 10 N, on ajoute:
- glycérine ... 7,6 kg - carbonate de calcium ... 0,800 kg - eau de ville complément à ... 360 litres ~ e pH du milieu est alors égal à 6,45. On stérilise - le bouillon par barbotage de vapeur à 122C pendant 40 minutes;
après refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 400 litres; le pH du milieu est de 6,25.
On ajoute alors 10 litres d'une solution aqueuse sté-rile contenant:
- sulfanilamide ... 308 g ~e plI du bouillon devient égal à 6,80. On en~emence ,,~., avec 40 litres de la culture inoculurn en fermenteur de 75 litres décrite précédernment. ~a culture est maintenue à 27C en agitant avec une turbine tournant à 205 tours/mn et en aérant ave~ un volume d'air stérile de 20 m3/h. Au bout de 24 heures de culture on ajoute S litres de solution aqueuse stérile contenant:
- sul~anilamide .,, 44 g et on poursuit la :~ermentation. Après 140 heures de culture, le pH du bouillon est de 6,75 et son volume de 350 litres; la teneur du moût en 32.999 RP est de 35 mg/l.
-.,. ~ .

lV68Z25 b) Extraction A 350 litres de moût obtenu précédel~ment on ajoute 350 litres de méthanol et de la soude 6 N pour amener le pH
à 7,5 On agite pendant l heure. Après addition de 25 kg d'adjuvant de flltration la suspension est filtrée sur filtre presse. On recueille le filtrat. ~e gâteau est lavé par 100 litres de méthanol aqueux à 50 %. ~e ~iltrat et le la~age - sont réunis et concentrés sous pression réduite jusqu'à un volu~e de 250 litres. Après alcalinisation par addition de 220 cm3 de soude 6 N l'antibiotique contenu dans ce concentrat est extrait par 2 fois 150 litres du mélange chlorure de ~éthylè-ne - butanol (80-20 en volume~ es 238 litres d'extraits ' organiques réunis sont concentrés sous pression réduite jusqu'à
un volume de 30 litres. On ajoute alors au concentrat, 100 cm~
de n-butanol saturé en acide chlorhydrique 11 N. Après concen-tration jusqu'à un volume de 3 litres, on aioute lentement la solution dans 21 litres d'hexane. ~e précipité obtenu est -~ essoré, la~é et séché. On obtient ainsi ~37 g de chlorhydrate de ~2.999 RP brut.
c) Purification -1) 112 g de chlorhydrate brut de 32.999 RP obtenus co~me indiqué
précédemment sont mis en solution dans 1 litre d'eau à 50C. ~a solution, dont le pH est de 2,9, est filtree sur verre fritté.
~es impuretés colorées contenues dans ce filtrat sont extraites par 2 fois 500 cm3 puis 1 fois 1 litre de chloroforme. Après addition de 75 g de chlorure de sodium à la phase aqueuse on extrait l'antibiotique par 3 fois 0,5 litre de n-butanol. 1e pH de la phase aqueuse est ajusté à 9,5 par addition de soude concentrée et l'antibiotlque restant est extrait par 0,5 litre de n-butanol.
~es extraits butanoliques contenant l'antibiotique sont réunis et concentrés sous pression réduite jusqu'à un ",.

Yolume de 1 litre. On a~oute alors 1 litre de chloroforme ~
ce concentrat. ~a ~olution est lav~e par 2 fois 500 cm3 d'eau alcalinisée ~ pH 9,5. Les eaux de lavage 80nt extraites par 2 fois 500 cm3 du m~lange chloro~orme - n-butanol (80~20 en volume) ~ pH 9~5. Les extraitæ organiqueæ sont réunis, puis concentr~ ~ous pre~sion r~duite. Pendant la concentration on ajoute ~00 cm3 du mélange n-butanol - eau - acide chlorhydrique 11 N (94-5-1 en volume). ~a concentration est poursuivie ~usqu'à l'obtention d'un volume de 150 cm3 puis la solution e~t a~out~e lentement ~ 2 litres d'hexane. ~e précipité obtenu est sssoré, lavé et séch~. On obtient ainsi 30 g d'un produit con-tenant du chlorhydrate de 32.999 RP.
2) ~3 g de produit ainsi obtenu sont mis en solution danæ 26 cm3 du mélange eau - dioxanne (20-~0 en volume) ~ 35C. ~'antibio-tique cristallise par addition lente de 624 cm3 de dioxanneO
Apras 3 heures d'agitation, le cr~staux sont essorés9 lavés et æ~ché~. On obtient ainsi 2 g d'un produit cristallis~ contenant -~ du chlorhydrate de 320999 RP.
3) 4,47 g d~'un produit criætallisé obtenu comme indiqué pré-cédem~ent sont mis en solution dans 40 cm3 dleau. ~a solution e~t filtrée. ~e chlorhydrate de l'antibiotique 32.~99 RP con-tenu dans le filtrat cristallise par addition de 405 cm3 d'acé-tone en agitant. ~es cri~taux obtenus sont e~sor~s, la~és et séchés. On obtient ainsi 2~47 g d'un produit contenant du chlorhydrate de 32.999 RP cristalliséO
4) 2,84 g de produit obtenu comme indiqué ci-de~su~ sont mis en solution dans 2894 cm3 du mélange méthanol - acétone (50-50 en volume). On ajoute ~ la solution 16~9 cm3 du mélange acétone-eau (84-16 en volume). Par chauf~age ~ 30C puis refroidissement 3o le chlorhydrate du 32.999 RP cristallise. ~es cristaux obtenu~
sont essor~s, lavés et séchés. On obtient ainsi 2,33 g de chlorhydrate semi-puri~i~ de 32.999 RP cristallisé~

.

:.

5) 1,85 g de chlorhydrate se~i-purifié obtenus com~e indiqué
précédemment sont mis en solution dans 400 cm~ d'eau à pH 5,5.
Des impuretés colorées sont extraites de cette solution par 10 fois 400 cm~ du mélange n-butanol - chloroforme (20-80 en volume). Par concentration de la phase aqueuse au cours de laquelle on ajoute du n-butanol on obtient une phase butanolique de 75 cm3 qui est ajoutée lentement dans 1,5 litre d'hexane. ~e précipité obtenu est essoré, lavé et séché. On obtient ainsi ` 1,4 g de chlorhydrate de 32.999 RP pur qui est identique au produit décrit dans l'exemple 8.

., A - ~ERMEN~A~ION
On charge dans un fermenteur de 170 litres: -- corn-steep (à 50 % d'extrait sec) .............................. 2400 g - saccharose ..................................................... 3600 g - sul~ate d'ammonium ............................................. 2~0 g - carbonate de calciurn ........,............ 900 g - - eau de ville q.s.p. ..........~.......... 110 litres ~e milieu, dont le pH est égal à 6,0, est stérilisé
par barbotage de vapeur à 122C pendant 40 minutes. Après réfroidissement, du ~ait de la condensation de vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 120 litres;
le pH est égal à 6,65. On ensemence avec 250 cm3 d'une culture en erlenmeyer agite de Streptomyces atroviolaceus DS 89~8. ~a culture est développée à 26C pendant 33 heures en agitant et en aérant avec de l'air stérile; elle est alors convenable pour l'ensemencement de la culture productrice.
~a culture productrice es-t effectuée dans un fermenteur de 800 litres chargé avec les substances suivantes:
- farine ae 90 ja .......................................... 22 kg - distillers' solubles .................................... 2,750 kg - amidon (partiellement hydrolysé) ....................... 16,500 kg ,.

- 10~i8225 - huile de so ja ....... ~ ............ 2,750 litres - chlorure de sodium ................. 5,500 kg - eau de ville q.s.p. ................ 510 litres ~e pH du milieu est ajusté à 7~5 par addition de . ~ .
500 cm3 de ~oude 10N, puis on stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 122C pendant 40 minutes. Après refroidissement, du fait de la condensation de vapeur au cours de la stérilisa-tion, le volu~e du bouillon est de 550 litres. I.e pH du milieu est de 6,60. On ensemence avec 55 litres de la culture inoculum en fermenteur de 170 litres décrite ci-dessus. IJa culture est développée pendant 117 heures à 26C en agitant avec une turbine tournant a 205 tours/minute et en aérant avec un volume d'air - stérile de 15 m3/heure. ~e pH, en fin de culture, est égal à
- 7,60.
B - EXTRACTION
A 560 litres de moût obtenu comme décrit on ajoute 28 kg d'acide oxalique. Après agitation pendant 1 heure à
40C et addition de 25 kg d'adjuvant de filtration, le moût - acidifié est filtré sur filtre-presse. ~e gâteau mycélien est lavé par 120 litres dleau à 50C, contenant 3 kg d'acide oxali-que. ~e filtrat et le lavage réunis, dont le pH est égal à 1, sont refroidis à 10C. ~e pH est ajusté à 4,5 par addition de 50 litres de soude 6N. ~'antibiotique présent dans cette solu-tion est fixé par passage 9ur une colonne contenant 25 litres d'AM~ERLI~E IRC 50 (marque de commerce) sous forme H~. ~a rési-ne est lavée successive~ent par de l'eau, jusqu'à ce que l'e~fluent sorte incolore, puis par 100 litres d'un mélange méthanol-eau (50-50 en volume) et par 100 litres d'un mélange méthanol-eau (90-10 en volume). Enfin l'antibiotique est élué par 250 litres d'un mélange méthanol-eau (90-10 en volume) contenant 1 %
(poids/volume) de chlorure de sodium. ~'éluat est concentré
-;-1 SOU9 pression réduite (5 à 10 mm de mercure) à 40C jusqu'à un . ~ .

volume de 20 litres. Le concentré, dont le pH est ajusté à 9 ~^- par addition de soude 11N~ est extrait par une fois 20 litres, puis 2 fois 10 litres de chloroforme. On obtient en tout 35 litres d'extraits qui sont concentrés sous`pression réduite (5 à 10 mm de mercure) à 40C jusqu'à un volume de 2 litre~.
~a solution restante e~t acidifiée par addition de 50 cm3 de n.butanol saturé en acide chlorhydrique 11N et concentrée à
nouveau jusqu'à un volume de 1 litre. ~a solution est versée lentement dans 7 litre~ d'hexane, ~e précip~té qui se forme est essoré, lavé et séché. On obtient ainsi 13 g de chlorhydra-te brut de l'antibiotique 32999 RP.
C - PURI~ICA~ION
a) ~'antibiotique est purifié par distribution à contre courant en 3 ampoules de 2 litres A, B, C.
On prépare un mélange chlorure de méthylne-n.butanol-tarnpon phosphate M/15 à pH 7,38 (8-2-10 en volume). Quand le mélange est en équilibre on sépare les deux phases.
Dans l'ampoule A, on verse 500 cm3 d'un mélange acide phosphorique (à 85 % en poids ) - eau (1-125 en volume) et 500 cm3 de phase organique lourde. On dissout dans ce mélange de phases 13 g de chlorhydrate d'antibiotique brut obtenu comme ; indiqué paragraphe B. ~près 15 minutes d'agitation et élimina-tion d'un insoluble par filtration, on ajuste le pH 7,5 par addition de soude N.
Dans les ampoules B et C on charge 500 cm3 de phase aqueuse légère, le pH étant respectivement ajusté à 7 dans l'ampoule B et à 6,5 dans l'ampoule C, par de l'acide phospho-rique à 85 %.
~ n partant de l'ampoule A pour passer dans les ampoules B puis C, on effectue une distribution à contre courant de 5 transferts, en utilisant la phase lourde (solvant) comme phase mobile et les phases légères (aqueuses) à pH 7,5 - 7 et 6,5 .
comme phases stationnaires, en mettant en oeuvre chaque fois 500 cm3 de phase mobile et en maintenant constant le pH des phases st~tionnaires.
L'antibiotique contenu dans la phase aqueuse de l'ampoule C est extrait à pH 9,5 par deux fois 500 cm3 du mélan-ge chloroforme-n butanol (8-2 en volume). ~es extraits organi-ques réunis sont concentrés sous pression reduite (5 à 10 mm de mercure) ~ 40C. Pendant la concentration on ajoute 30 cm3 de n.butanol contenant 6 ~ (en volume) d'acide chlorhydrique 2N. ~e concentrat est amené jusqu'à un v~lume de 5 cm3, puis versé lentement dans 500 cm3 d'hexane. ~e précipité qui se forme est essoré, lavé et séché. On obtient ainsi 275 mg de ; chlorhydrate de 32999 RP semi-purifié.
b) 80 Mg du chlorhydrate obtenu comme indiqué précédemment sont mis en solution dans un mélange de 1 cm3 d'eau et 1 cm3 de méthanol. Cette solution est répartie également sous forme d'un dépôt linéaire sur 4 plaques de chromatographie analytique en couche mince de gel de silice MERCK. ~es plaques sont déve-~ loppées pendant 1 heure dans une cuve, dont les parois sont 20 recouvertes de papier filtre, contenant du mélange chlorure de méthylène-acide formique-méthanol (80-17-3 en volume). Après séchage, la zone contenant le 32999 RP est récupérée par grat-tage de la ~ilice. ~a poudre obtenue est mise en suspension dans 40 cm3 d'eau, l'antibiotique est extrait à pH 9,5 par deux fois 20 cm3 de chloroforme. ~es extraits organiques reunis sont concentrés 90US pression réduite (5 à 10 mm de mercure) à 40C.
Pendant la concentration on ajoute 1 cm3 de n.butanol contena~nt 6 % (en volume) d'acide chlorhydrique 2N. ~e concentrat est amene jusqu'à un volume de 2 cm3, puis versé lentement dans 50 cm3 d'hexane ~e précipité qui se forme est essoré, lavé et séché.
On obtient ainsi 4 mg de chlorhydrate de 32999 RP pur sous forme d'une poudre microcristalline rouge-orangé fondant vers 200C

~,~.

` ~06~3Z25 a~ec décompo~ition qui est identique au produit obtenu à
1 ' exemple 8.

. ~

Claims (4)

Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé de préparation d'une nouvelle substance antitumorale basique, désignée par le numéro 32 999 RP, dont le chlorhydrate présente les caractéristiques ci-après:
- c'est une poudre microcristalline rouge orangé
soluble à raison d'environ 100 mg/cm3 dans le méthanol, la pyridine, le diméthylformamide et l'eau, 10mg/cm3 dans le butanol saturé d'eau à 20°C, 5 mg/cm3 dans l'éthanol et moins de 0,1 mg/cm3 dans l'acétone, le chloroforme, le chlorure de méthylène, l'acétate d'éthyle, le benzène, la méthylisobutyl-cétone, le dioxanne et l'hexane - sa composition élémentaire est voisine de:
C % = 56.6 H % = 5,7 0 % = 29,41 N %=2,39 Cl % = 6,0 - son pouvoir rotatoire déterminé en solution à 0,09 %
dans l'éthanol à 0,1 % de HCl 1 N est:
[.alpha.]?0 = + 208° ? 32°
- son spectre ultra-violet et son spectre visible déterminés à partir d'une solution à 10,65 mg/l dans l'éthanol à 0,1 % de HCl 1 N présentent des maxima d'absorption à 233 nm, 254nm, 292 nm, 493nm, 512nm et 527nm - son spectre infra-rouge présente des bandes d'absorp-tion à
3410, 3250, 3220, 3050, 2970, 2930, 2900, 2860, 2820, 2680, 2600, 1980, 1930, 1900, 1800, 1735, 1690, 1635, 1600, 1580, 1510, 1460, 1440, 1405, 1370, 1315, 1285, 1255, 1235, 1195, 1165, 1115, 1062, 1050, 1030, 1010, 985, 960, 930, 915, 885, 875, 845, 840, 820, 810, 780, 762, 750, 725, 708, 695, 665, 640, 625, 600, 580, 565, 540, 530, 485, 475, 465, 450, 438, 415, 390 et 320 cm-1 - en chromatrographie ascendante sur couche mince de gel de silice avec comme solvant de développement le mélange chlorure de méthylène-acide formique-méthanol (80-17-3 en volume), il a un Rf de 0,2 - il est actif sur la leucémie L 1210, la leucémie P 388 et la leucosarcomatose à des doses comprise entre 0,125 et 0,250 mg/kg i.p. chez la souris, et dont la formule est ladite substance étant prise sous forme de base libre ou de sel d'addition avec un acide pharmaceutiquement acceptable, ce pro-cédé étant caractérisé en ce que l'on réduit par voie microbiolo-gique la carminomycine de formule ou l'un de ses sels, ou cultive un microorganisme choisi parmi:
Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098) Streptomyces coeruleorubidus DS 31 723 (NRRL 3045) Streptomyces coeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046) et Streptomyces bifurcus DS 23 219 (NRRL 3539) dans un milieu nutritif aéré convenant aux Streptomyces, en présence d'adjuvants choisi parmi l'améthoptérine, le barbital, le phénobarbital, le butobarbital, le penthiobarbital, la sulfanilamide, la sulfapyridazine et la sulfathiazole puis extrait l'antibiotique du milieu de culture, ou cultive Streptomyces atroviolaceus DS 8938 (NRRL 8148) ou ses mutants producteurs dans un milieu nutritif aéré contenant des sources de carbone et d'azote assimilables et des sels minéraux à un pH initial de 5,8 à 7,8 et à une température de 23° à 33°C puis extrait l'antibiotique du milieu de culture.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réduction est effectuée au moyen d'une culture d'un microorganisme choisi parmi Streptomyces lavendulae (ATCC 8664), Streptomyces roseochromogenes (ATCC 13.400) Corynebacterium simplex (ATCC 6946) ou Bacteriurm cyclooxydans (ATCC 12.673), ou des cellules isolées de cette culture ou des extraits enzymatiques obtenus à partir de cellules de ces microorganismes.

3. La substance antitumorale basique 32 999 RP dont le chlorhydrate présente les caractéristiques ci-aprè:
- c'est une poudre microcristalline rouge orangé
soluble à raison d'environ 100 mg/cm3 dans le méthanol, la pyri-dine, le diméthylformamide et l'eau, 10 mg/cm3 dans le butanol saturé d'eau à 20°C, 5 mg/cm3 dans l'éthanol et moins de 0,1 mg/cm3 dans l'acétone, le chloroforme, le chlorure de méthylène, l'acétate d'éthyle, le benzène, la méthylisobutylcétone, le dioxanne et l'hexane - sa composition élémentaire est voisine de :
C % = 56,6 H % = 5,7 0 % = 29,41 N %=2,39 Cl % = 6,0 - son pouvoir rotatoire déterminé en solution à 0,09 %
dans l'éthanol à 0,1 % de HCl 1 N est :
[.alpha.]?2= + 208° ? 32°
- son spectre ultra-violet et son spectre visible déterminés à partir d'une solution à 10,65 mg/l dans l'éthanol à 0,1 % de HCl 1N présentent des maxima d'absorption à 233 nm, 254 nm, 292 nm, 493 nm, 512 nm et 527 nm - son spectre infra-rouge présente des bandes d'absorp-tion à
3410, 3250, 3220, 3050, 2970, 2930, 2900, 2860, 2820, 2680, 2600, 1980, 1930, 1900, 1800, 1735, 1690, 1635, 1600, 1580, 1510, 1460, 1440, 1405, 1370, 1315, 1285, 1255, 1195, 1165, 1115, 1062, 1050, 1030, 1010, 985, 960, 930, 915, 885, 875, 845, 840, 820, 810, 780, 762, 750, 725, 708, 695, 665, 640, 625, 600, 580, 565, 540, 530, 485, 475, 465, 450, 438, 415, 390, et 320 cm-1 - en chromatographie ascendante sur couche mince de gel de silice avec comme solvant de développement le mélange chlorure de méthylène - acide formique méthanol (80-17-3 en volume), il a un Rf de 0,2 - il est actif sur la leucémie L 1210, la leucémie P 388 et la leucosarcomatose à des doses comprises entre 0,125 et 0,250 mg/kg i.p. chez la souris et dont la formule est ladite substance étant prise sous forme de base libre ou de sel d'addition avec un acide pharmaceutiquement acceptable, lorsque préparée par un procédé selon la revendication 1 ou ses équiva-lents chimiques manifestes.

4. La substance 32 999 RP, lorsque préparée par le procédé de la revendication 2 ou ses équivalents chimiques manifestes.