FR2515207A1 - Agents antibacteriens ll-c23024 b et iota, leur procede de preparation et microorganisme actinomadura yumaense nrrl 12515 - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DES AGENTS ANTIBACTERIENS ET ANTICOCCIDIENS APPELES LL-C23024A, LL-C23024B ET LL-C23024 IOTA, UN NOUVEAU MICROORGANISME ACTINOMADURA YUMAENSE SP. NOV. ET SES MUTANTS, ET UN NOUVEAU PROCEDE POUR LA PREPARATION DE CES AGENTS.

Description

L'invention concerne des agents antibactériens et anticoccidiens appelés

LL-C 23024 a, $ et iota, un nouveau

microorganisme Actinomadura yumaense sp nov ou ses mu-

tants. L'invention concerne en outre un nouveau procédé pour la production des antibiotiques LL-C 23024 (, 3 et iota, par fermentation dans des conditions déterminées du nouveau

microorganisme Actinomadura yumaense sp nov.

L'antibiotique LL-C 23024 a répond à la structure suivante: o Me Me ">/>; i Me OH Me \ Oe O Me 4 %O M e Me O H v KH 'oOI 4 e H H H OR COOH Mle

L'antibiotique LL-C 23024 $ de l'invention se dis-

tingue des composés de la technique antérieure par ses ca-

ractéristiques physiques et chimiques, comprenant, mais de

manière non exhaustive, sa microanalyse, son pouvoir rota-

toire, son spectre infrarouge, son spectre de résonance magnétique nucléaire de 13 C et son spectre de résonance magnétique nucléaire de H.

L'antibiotique LL-C 23024 f a la structure présu-

mée suivante: 0 o H 3 OH H 3 C %",,,s XCH 3 H 3 c 3 O? O Rc H CH HOH H 3 C OH, or HC H

0 H 3

CCQH CH 3

dans laquelle R 1 et R 2 sont différents et sont choisis par-

mi l'hydrogène et CH 3.

La structure présumée ci-dessus est basée sur

l'analyse élémentaire, le pouvoir rotatoire, la masse molé-

culaire calculée par spectroscopie de masse, par désorption du champ, le point de fusion, le spectre infrarouge (IR), le spectre de résonance magnétique nucléaire de 13 C (RMN de 13 C) et la résonance magnétique du proton (RMN de 1 H), tel que détaillé dans les exemples et représenté sur les figures des dessins annexés représentant respectivement:

Figure 1: le spectre IR du LL-C 23024 B dans K Br.

Figure 2: le spectre RMN de 13 C du LL-C 23024 S 20 M Hz

dans CDC 13, étalon de référence interne tétra-

méthylsilane (TMS).

Figure 3: le spectre RMN de 1 H du LL-C 23024 S 80 M Hz

dans CD Cl 3, étalon de référence interne TMS.

TABLEAU I

Spectre RIN de 13 C de LL-C 23024 B (opm oar rapport à TMS) Déplacement chimique (ppm) Nombre d'atomes de carbone

,5 1

11,O 1

12,2 1

17,0 1

17,7 1

17,9 1

22, 3 26, i 26, 8 27, 6 , 2 32, O 33, 3 33, 7 33, 8 36, 5 36, 8 39,0 39, 9 , 5 57, 1 59, 1 , 7 66, 9 67, 6 , 2 71, 3 72, 9 74, 9 , 1 79, 9 , 8 82, 1 84, 5 84, 7 , 6 86, 9 , 8 96, 9 97, 7

107, 5

179, 2

Carbones tiotauxl i i i i Le LL-C 23024 iota est un nouvel antibiotique à

base de polyéther ayant une très puissante activité anticoc-

cidienne Il est au moins dix fois plus puissant que la plu-

part des autres polyéthers connus Les données du spectre de masse par désorption du champ indiquent qu'il a une masse

moléculaire de 930, qui avec son spectre de résonance magné-

tique nucléaire de 13 C permet de proposer une formule molé-

culaire possible de C 48 H 82017 Le LL-C 23024 iota semble pos-

séder quatre groupes méthoxy, le même sucre que celui obser-

vé dans l'antibiotique de polyéther X-14868 A (brevet US

4 278 663) et un groupe carboxyle Le seul autre antibioti-

que de polyéther dont la masse moléculaire est de 930 est l'antibiotique A 28595 B (hydroxyseptamycine) T Antibiotics 33 ( 2): 252 ( 1980)l dont la structure et les propriétés

biologiques sont très différentes Les observations ci-des-

sus sont basées sur l'analyse élémentaire, le pouvoir rota-

toire, la masse moléculaire calculée par spectroscopie de masse par désorption du champ, le spectre IR, le spectre de RMN de 13 C et le spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (RMN de 1 H), tel que détaillé-dans les exemples et dans les figures des dessins annexés qui représentent respectivement:

Figure 4: le spectre IR du LL-C 23024 iota dans K Br.

Figure 5: le spectre RMN de 1 H du LL-C 23024 iota 80 M Hz

dans CD C 13, étalon de référence interne TMS.

Figure 6: le spectre RMN de 13 C du LL-C 23024 iota.

Figure 7: le spectre RMN de 13 C du LL-C 23024 iota (échelle agrandie: 50110-ppm) 20 M Hz dans CDC 13,

étalon de référence interne TMS.

Figure 8: le spectre RMN de 13 C du LL-C 23024 iota (échelle agrandie: 50110 pnm) 20 M Hz dans CD C 13,

étalon de référence interne TMS.

On a obtenu les spectres de RMN de 13 C du LL-

C 23024 iota dans le chloroforme deutérié (CDC 13) à une in-

tensité de champ de 20 M Hz Les pics avec leurs déplace-

ments chimiques respectifs en parties par million par rap-

port au tétraméthyl silane (TMS) et le nombre évalué de carbones oar chloroforme, Dic sont rapportés dans le tableau II Pour le

on a observé des pics à 75,4, 77,0 et 78,6.

TABLEAU II

Déplacement Nombre de Déplacement Nombre de chimique carbones chimique carbones ,6 ,9 11,7 16,4 17,6 18,0 21,7 22,9 24,1 28,2 31,2 32,2 33,4 33, 8 34,2 36,7 37,2 39,4 , 3 44,5 ,5 47,6 56, 8 59, 9 , 8 68,5 68,8 71,3 72, 2 76,1 76,9 78,5 81,0 81,3 81,8 84,8 ,3 ,6 86,8 88,5 ,9 97, 9 99,6

107, 2

173,0 Total Les antibiotiques LL-C 23024 a, e et iota sont des acides carboxyliques organiques et sont donc capables de

former des sels avec des cations non-toxiques, pharmaceuti-

quement acceptables C'est ainsi que des sels obtenus en mélangeant l'acide antibiotique libre avec des quantités

stoechiométriques de cations, avantageusement dans un sol-

vant neutre, peuvent être formés avec des cations tels que

les cations sodium, potassium, calcium, magnésium et ammo-

nium, ainsi qu'avec des cations amine organique tels qu'une tri-(alkyl inférieur)amine (par exemple la triéthylamine, la triéthanolamine), la procaine et similaires Les sels catio- niques de l'antibiotique LL-C 23024 e sont généralement des solides cristallins, relativement insolubles dans l'eau et solubles dans la plupart des solvants organiques usuels tels

que le méthanol, l'acétate d'éthyle, l'acétone, le chloro-

forme, l'heptane, l'éther et le benzène Pour les buts de l'invention, l'acide antibiotique libre est équivalent à

ses sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables.

Les antibiotiques LL-C 23024 l et iota sont actifs in vitro contre les bactéries gram-positives selon le test de dilution sur gélose, standard Les résultats sont donnés en concentrations inhibitrices minimales (CIM) en pg/ml dans les tableaux III et IV Les antibiotiques LL-C 23024 $ et iota ne sont pas actifs contre les organismes gram-négatifs

à des concentrations de 256 pg/ml ou moins.

TABLEAU III

Activité antibactérienne in vitro du LL-C 23024 e

Organisme Concentration inhibi-

trice minimale(pg/ml) Staphylococcu il Streptococcus il Enterococcus ll is aureus Smith

SSC 80-11

" SSC 80-32

" SSC 80-38

" LL-14

" LL-45

LL-27

" ATCC 25923

pyogenes C 203 B-hémolytique Keller T 623 pneumoniae 78-1

SSC-80-62

SSC-80-63

TABLEAU IV

Activité antibactérienne in vitro du LL-C 23024 iota

Organisme Concentration inhibi-

trice minimale(pg/ml) LL-C 23024 iota Enterococcus OSU 75-1 1 Enterococcus SM 77-15 1 Staphylococcus aureus SSC 79-18 1 Staphylococcus aureus FU 79-19-2 2 Micrococcus lutea PCI 1001 1 Staphylococcus aureus Smith 0,5 Staphylococcus aureus ATCC 25923 0,5 Comme démontré par les données ci-dessus, les

antibiotiques LL-C 23024 a, B et iota inhibent la multipli-

cation de certaines bactéries gram-positives et sont donc utilisables comme antiseptiques topiques et de surface dans des solutions de lavage pour la peau, les appareils, les murs, les sols, etc.

On a également trouvé que les agents antibacté-

riens LL-C 23024 a, 1 et iota sont actifs in vivo comme a-

gents anticoccidiens chez les volailles, comme démontré

par les tests suivants.

Deux jours avant l'inoculation, on a donné à dif-

férents groupes de poussins âgés d'un jour un aliment conte-

nant différents taux de médicament L'aliment pour volailles utilisé dans le test est préparé comme suit: Prémélange de vitamines et d'acides aminés 0,5 % Minéraux à l'état de traces 0,1 % Chlorure de sodium 0,3 % Phosphate dicalcique 1,2 % Calcaire broyé 0,5 % Graisse stabilisée 4,0 % Luzerne déshydratée, à 17 % de protéines 2,0 % Farine de gluten de mais à 41 % de protéines 5,0 % Farine de poisson de menhaden à 60 % de protéines 5,0 % Farine de soja à 44 X de protéines 30,0 % Mais jaune broyé, fin complément à 100 % Le pré-mélange de vitamines et d'acides aminés

dans la composition d'aliment ci-dessus est préparé à par-

tir de la formulation suivante Les quantités sont expri-

mées en unités par kg de la composition d'aliment complète.

Hydroxy-toluène butylé 125,0 mg dl-méthionine 500,0 mg Vitamine A 3300,0 U I. Vitamine D 3 1100,0 UCI Riboflavine 4,4 mg Vitamine E 2,2 U I. Niacine 27,5 mg Acide panthothénique 8,8 mg

15207

Chlorure de choline 500,0 mg Acide folique 1,43 mg Bisulfate sodique de médianone 1,1 mg Vitamine B 12,O; ig Mais jaune broyé, fin complément à SO g

On a inoculé les poussins expérimentaux par inocu-

lation directe dans le jabot de chaque poussin avec un ino-

culum mixte de 5000 oocystes sporulés de Eimeria acervulina et d'un nombre suffisant d'oocystes de Eimeria tenella de

manière à produire de 85 à 100 % de mortalité chez les té-

moins non traités Les poussins pouvaient se nourrir et

boire de l'eau à volonté pendant toute la période d'essai.

Sept jours après l'inoculation, on a arrêté les essais et pesé les poussins, nuis on les a autopsies et examiné leur

tractus intestinal quant à des lésions possibles Les ré-

sultats sont reportés dans les tableaux V et VI ci-dessous et montrent qu'une survie améliorée des poussins infectés est obtenue lorsqu'on administre dans le régime 10 ppm ou

moins d'antibiotique LL-C 23024 B ou iota Les résultats mon-

trent également une suppression significative des lésions

intestinales dues à Eimeria tenella et Eimeria acervulina.

TABLEAU V

Evaluation de l'antibiotique LL-C 23024 8 comme agent anticoccidien chez les poussins Composé Concentration Nombre de % de % de Doussins avec des lésions réduites dans le régime poussins survie E E. ppm au départ tenella acervulina

LL-C 23024 B 15 3 100 100 100

LL-C 23024 B 10 5 100 60 100

LL-C 23024 B 5 5 80 O 100

NNC* O 15 46,6 O o

LL-C 23024 B 120 15 100 100 100

15 100 100 100

15 100 100 100

O 15 20 O o

NNC 15 100

LL-C 23024 B 20 15 100 87 100

15 100 60 100

15 60 O o

15 47 7 O

vi

O 15 27 O O

NNC 15 100

NNC = témoin non traité, non infecté.

TABLEAU VI

Evaluation de l'antibioticque LL-C 23024 iota comme aqent anticoccidien chez les poussins Concentration Nombre de % de % de Doussins avec des lésions réduites dans le régime poussins survie E E. ppm tenella acervulina

5 100 100 100

5 100 100 100

5 60 20 60

O 15 20 O O

10 100 100 100

7,5 10 100 70 100

PO Ln 1

Les tests suivants démontrent l'activité némato-

cide. Exemn Dle A.

Evaluation des compositions d'essai quant à l'activité néma-

tocide en utilisant le nématode microbivore hermaphrodite

indépendant Caenorhabditis eleqans II.

Dans les tests suivants, on utilise C elegans

pour déterminer l'activité nématocide du bouillon de fer-

mentation et de la bouillie récoltée préparée par le procé-

dé de l'invention Cet organisme est également utilisé pour évaluer les LLC 23024 a et LL-C 23024 e pour déterminer leur

activité nématocide.

Dans ces tests, le bouillon de fermentation est constitué du mélange de liquide et de matières solides de fermentation avant que les matières solides, c'est-à-dire la bouillie récoltée, ne soient séparées du liquide La bouillie récoltée est constituée des matières solides après

la séparation.

Pour évaluer la bouillie récoltée, on disperse les matières solides de la bouillie récoltée dans de l'eau distillée, 1:1 Le bouillon de fermentation est utilisé tel

quel et contient un liquide et des matières solides.

Dans les évaluations présentes, C elegans est

maintenu dans un milieu d'entretien de C briggsae Le mi-

lieu d'entretien est commercialisé par la firme Grant Island Biological Company, Grant Island, New-York, et a la composition suivante: Milieu d'entretien de C briciaqsae( 1) Constituant mq C/l

SELS MINERAUX

Ca Cl 2 2 H 20 220,50 Cu C 12 2 H 20 6,50 Fe(NH 4)2 ( 504)2 6 H 20 58,80

KH 2 PO 4 1225,50

KOH (a) Mn C 12 4 H 20 22,20 Zn C 12 _ 10,20

AUTRES CONSTITUANTS

N-acétylglucosamine 15,00 Acide adénosine-3 '-( 2 ')-phosnhorique H 20 365,00 Acide cytidine-3 '-( 2 ')-phosphorique 323,00 D-glucose 1315,00 Glutathione, réduit 204,00 Guanosine-3 '-( 2 ')-PO 4 Na 2H 20 363,00 Citrate de magnésium 5 H 20 (dibasique) 915,00 Citrate de potassium H 20 486,00 Acide dl-thioctique 3,75 Thymine 126,00 Acide uridine-3 '-( 2 ')phosohorique 324,00

ACIDES AMINES

L-alanine 1395,00 L-arginine 975,00 Acide L-aspartique 1620,00 L-cystéine H Cl H 20 28,00 L-glutamate (Na) H 20 550,00 L-glutamine 1463,00 Glycine 722,00 L-histidine 283,00 L-isoleucine 861,00 L-leucine 1439,00 L-lysine HC 1 1283,00 L-méthionine 389,00 L-phénylalanine 803,00 L-proline 653,00 L-sérine 788,00 L-thréonine 717,00 L-tryptophane 184,00 L-tyrosine 272,00 L-valine 1020,00

VITAMINES

Acide p-aminobenzoique 7,50 Biotine 3,75 Citrate d'acide de choline 88,50 cyanocobalamine (B 12) 3,75 Folinate (Ca) 3,75 Myo-inositol 64,50 Niacine 7,50 Niacinamide 7,50 Pantéthine 3,75

Pantothénate (Ca) 7,50-

Acide ptérolyglutamique 7,50 Phosphate de pyridoxal 3,75 Pyridoxamine 2 H Cl 3,75 Pyridoxine H Cl 7,50 Riboflavine-5 '-P 04 (Na)2 H 20 7,50 Thiamine H Cl 7,50 Références: ( 1) Hansen E L, Proc Soc Exn Bio & Med 121: 30-393

( 1966).

Remarques:

(a) Quantité nécessaire pour régler le p H à 5,9 + 0,1.

Pour les évaluations, on utilise une plaque à puits comportant une série de petits puits Dans chacun des puits, on dépose aseptiquement 25 ml de bouillon de

fermentation, d'une suspension 1:1 dans l'eau de la bouil-

lie récoltée, ou d'une solution aqueuse acétonique de LL-C 23024 a ou de LL-C 23024 f contenant de 31,25 à 500 ppm du composé d'essai On dépose alors dans chaque puits 25 ml du milieu d'entretien C elegans contenant de 10 à 20 vers

adultes, plus des larves de différents âges, plus des oeufs.

On Dlace les plaques sous une hotte et on les examine 48 heures après l'inoculation pour évaluer la vitesse et le degré d'activité nématocide des compositions d'essai Les

données obtenues sont reportées ci-dessous Lorsqu'on ob-

serve l'activité du bouillon de fermentation, on dilue le bouillon de manière à avoir un rapport bouillon/C elegans

de 1:4.

TABLEAU VII

Composition Concentration Activité ppm ou nématocide dilution après 48 heures Bouillon de fermentation D= 1:1 8 (pas de motilité)

D= 1:4

Bouillie récoltée LL-C 23024 a 500 ppm 7 250 ppm 7 pnm 7 62,5 ppm 6 31,25 ppm O LL-C 23024 B 500 ppm 7 250 ppm O Les chiffres utilisés nour évaluer l'activité dans ce tableau ont les significations suivantes: Valeur d'activité: 8 = pas de motilité (mort apparente) 7 = motilité nettement réduite 6 = motilité réduite O = motilité normale pour l'espèce Exem Dle B. Evaluation du LL-C 23024 a comme agent nématocide contre des

larves infectieuses++ de nématodes de ruminants.

L'évaluation de LL-C 23024 a comme agent nématoci-

de contre les larves infectieuses de nématodes de ruminants:

Haemonhmus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostron-

gylus axei, T Colubriformis; et contre l'anguillule du

vinaigre, Turbatrix aceti, est faite en remplaçant C ele-

gans par les espèces de nématodes mentionnées ci-dessus.

Les données obtenues sont reportées dans le ta-

bleau ci-dessous.

+ Larves enrobées au troisième stade.

Concentration in vitroa de LL-C 23024 a, Dom

TABLEAU VIII

Activité contre (après 48 heures)

H Contort.

0 Circum.

T Axei T Colub T Aceti 500 8 8 b 8 b 8 6 250 7 8 b 8 b 7 6

7 7 7 6 6

625 7 6 7 6 6

31,25 6 6 O 6 6

0 (témoin) 0 O O O O

a Sur des plaques de culture de tissu à 96 puits, X 14868 A, préparées dans de l'eau bidistil-

lée: 25 pl de solution de LL-C 23024 a et 25 pl de culture de nématode ajoutés par puits.

Valeur d'activité: 8 = aucune motilité (mort apparente) 7 = motilité nettement réduite 6 = motilité réduite 0 = motilité normale pour l'espèce

bdans les 24 heures.

a'1 ru Ln VI -:x r%> o ,-à

15207

Exemole C. Evaluation de l'activité nématocide de l'antibiotique LL-C 23024 a contre Nematosniroides dubius et Aspicularis

tetra Dtera chez les souris.

Dans les tests suivants, on a infecté des souris blanches femelles, SwissWebstern avec Nematospiroides

dubius et Aspicularis tetraptera et on a attendu trois se-

maines pour permettre la maturation des infections.

Après la période d'attente, on répartit les sou-

ris au hasard en groupes de 4 animaux et on place les grou-

pes dans des cages séparées On donne alors à volonté aux

souris pendant une semaine des aliments médicamentés conte-

nant environ de 31,25 ppm à 4000 ppm du composé d'essai.

Pendant la période d'essai, de l'eau est également fournie à volonté Pendant la période de traitement, on examine les excréments des souris pour vérifier si des vers ont été rejetés Dans tous les groupes traités, on a observé le rejet de vers, indiquant ainsi l'activité nématocide à

toutes les concentrations du composé contre les deux néma-

todes A la fin du traitement d'une semaine avec un aliment

médicamenté, on autopsie les souris et on examine les te-

neurs en vers dans les voies intestinales Les données ob-

tenues sont reportées ci-dessous en % de réduction des vers

par rapport à des témoins non médicamentés, infectés.

Dans ces tests, on a évalué les bouillons de fer-

mentation bruts obtenus avec la récolte de la bouillie et

contenant de 1000 à 4000 ppm de l'antibiotique nématocide.

On a évalué également une souris nourrie avec un aliment contenant de 31, 25 à 500 ppm de LL-C 23024 a dissous dans

un mélange acétone/eau 1:1.

Composition Concentration Activité d'essai diététique (% de réduction) (opm) contre N dubius A tetra Dtera Bouillon de

*fermentation+ 4 000 73 -

avec LL-C 23024 a 2 000 44 53 LL-C 23024 a 1 000 65 33

500 70 SA

250 63 SA

61 SA

62,5 29 SA

31,25 32 SA

+ = quantité de LL-C 23024 a non déterminée, ++ = légère activité:nombre accru de vers pinworms récupérés dans l'examen fécal,

= comparée avec des témoins non médicamentés, infectés.

Les nouveaux agents antibactériens et anticocci-

diens de l'invention sont formés pendant la culture

d'Actinomadura yumaense so nov dans des conditions déter-

minées. Une souche représentative de ce microorganisme a été isolée à partir d'un échantillon de sol recueilli dans Yuma County, Arizona et est conservée dans la collection de cultures de la Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New-York, sous le numéro de

culture LL-C 23024 Une culture viable de cette souche re-

présentative a été déposée au Culture Collection Laborato-

ry, Northern Regional Center, U S Department of Agricul-

ture, Peoria, Illinois 61604 et a été ajoutée à sa collec-

tion permanente sous le numéro d'admission NRRL 12515.

Caractérisation taxonomique de NRRL 12515.

La souche NRRL 12515 a été taxonomiquement ca-

ractérisée et identifiée comme la souche type d'une nou-

velle espèce du genre Actinomadura, sous l'appellation

"Actinomadura Yumaense sp nov ".

Les caractéristiques de culture, physiologiques et morphologiques de la souche représentative 12515 ont été observées en utilisant les procédés décrits en détail

par E B Shirling et D Gottlieb dans "Methods for charac-

terization of Streptomyces species", Internat J 5 y Sto Bacteriol 16: 313340 ( 1966) et R E Gordon et al, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica and the nocardin

strain", Internat J Syst Bacteriol 24: 54-63 ( 1974).

Les milieux utilisés dans cette étude ont été choisis parmi ceux recommandés Par T G Pridham et al, "A selection of

media for maintenance and taxonomic study of Streptomyce-

tes", Antibiotics Ann, pp 947-953 ( 1956/1957); G F Gauze

et al, "Problems in the classification of antagonistic ac-

tinomycetes", State Publishing House for Medical Litterature, Medgiz, Moscou ( 1957); et R E Gordon et al voir ci-dessus, pour l'étude taxonomique des actinomycetes et des bactéries du sol La composition chimique des parois cellulaires du microorganisme a été déterminée en utilisant la méthode de H.A Lechevalier et al,"Chemical composition as a criterion

in the classification of actinomycetes", Adv Ap Dpl Micro-

biol 14: 47-72 ( 1971) Les modèles de phospholipides ont été déterminés par la méthode de M P Lechevalier et al. "Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition", Biochem Syst Ecol 5: 249-260 ( 1977) Les détails sont reportés dans les tableaux IX à XIV, et une

description générale de la culture est donnée ci-dessous.

Les couleurs descriptives soulignées sont prélevées dans K.L Kelly et D B Judd, "Color, Universal Language and Dictionary of Names", U S Nat Bur Stand Spec Publ. 440, Washington D C ( 1976) et l'Inter-Society Color

Council, Natl Bur Stand Centroid Color Charts associé.

Les données observées pour cette nouvelle espèce représentée par la souche NRRL 12515 ont été comparées avec

les données oubliées pour l'espèce connue du genre Actino-

madura ti Goodfellow et al, "Numerical Taxonomy of Acti-

nomadura and related actinomycetes", J Gen Microbiol.

122: 95-111 ( 1979); L H Huang, "Actinomadura macra sp.

nov, the producer of antibiotic CP-47,433 and CP-47,434 ", Internat J Syst Bacteriol 30: 565-568 _( 1980); J Meyer,

"New snecies of the genus Actinomadura", Z Allgem Mikro-

biol 19: 37-44 ( 1979); H Nomura et Y Ohara, "Distribu-

tion of actinomycetes in soil XI "Some new species of the qenus Actinomadura'' Lechevalieret al, "J Ferment Technol. 49: 904-912 ( 1971); et T P Preobrazhenskaya et al "Key for identification of the snecies-of the genus Actinomadura", The Biology of Actinomycetes and Related Organisms 12:

-38 ( 1977)1 La culture NRRL 12515 offre une légère res-

semblance avec Actinomadura pelletieri, mais ne ressemble à aucune autre espèce décrite et diffère de A pelletieri car Plusieurs caractéristiques La souche NRRL 12515 a donc été désignée comme la souche type d'une nouvelle espèce sous l'appellation Actinomadura yumaense sp nov en raison

du site de collection de l'échantillon de sol dont on a iso-

lé la souche type.

Micromormhologie. Les spores ont la forme de courtes chaînes en spirale (longueur maximale environ 20 spores par chaîne) fixées sur des sporophores ramifiés, aériens, presque tous verticillés Les spores sont ovoïdes, et ont de 0,6 à 0,8

micron sur 1,0 à 1,4 micron, avec une surface unie.

Comnosition des parois cellulaires.

Les hydrolysats de la cellule entière de cette culture contiennent du madurose ( 3-0-méthyl-D-galactose) et le méso-isomère de l'acide diaminopimélique (DAP) La culture a également un modèle de mhospholipides de type P-I et pas d'autres phospholipides diagnostiques qu'un peu de phosphatidyl glycérol Ces caractéristiques sont toutes

très typiques des membres du genre Actinomadura.

Ouantité de croissance.

Une croissance satisfaisante est observée sur de

la gélose de Bennett, de la-gaze no 2 gélose; de la NZ-

amine-amidon-glucose gélose (ATCC milieu 172), de la pâte

de tomate-farine d'avoine gélose, et de l'extrait de levu-

re-extrait de malt gélose; une croissance modérée est ob-

servée sur de la gélose de Benedict, du saccharose de Czapek gélose, du glycérol-aspargine gélose, de la gélose de Hickey-Tresner et de la farine d'avoine gélose; une croissance médiocre est observée sur du malate de calcium gélose, de la gaze n 1 gélose, et des sels minéraux-amidon gélose.

Mvcelium végétatif.

Sur des milieux favorisant une croissance satis-

faisante, on a observé que le mycelium végétatif s'élevait

et s'enroulait et avait généralement des teintes gris-jau-

nâtre.

Mycelium aérien et couleur des spores.

Les mycelia aériens et/ou les masses de spores avaient une couleur allant du blanc au gris clair 264 La production de mycelia aériens était légère sur la plupart

des milieux.

Pigments solubles.

On a fait les observations suivantes: absence sur de nombreux milieux; pigment jaune sur les géloses de Benedict et glycérol-asparagine; pigment jaune-vert sur le malate de calcium gélose; pigment brun-verdâtre sur le NZ-amine-amidon-glucose gélose; pigment orange sur les géloses de Bennett et extrait de levure-extrait

de malt.

Réactions Dhysiologiques.

Aucun pigment de mélanine sur peptone-fer gélose et tyrosine gélose (ISO7); forte peptonisation du lait de tournesol; forte protéolyse de la gélatine nutritive;

réduction modérée des nitrates; pas d'hydrolyse de l'adé-

nine ou de la guanine; forte hydrolyse de l'hypoxanthine, de la tyrosine et de la xanthine; faible hydrolyse de l'amidon; hydrolyse de l'esculine; hydrolyse variable

de l'urée Aucune croissance à 4 C, 10 C, ou 55 C; crois-

sance modérée à 25 C et 45 C; croissance satisfaisante à 320 C et 37 C Utilisation des hydrates de carbone selon la méthode de T G Pridahm et D Gottlieb "The utilization of

carbon compounds by some actinomycetes as an aid for spe-

cies determination", J Bacteriol, 56: 107-114 ( 1948): bonne utilisation du glucose, du glycérol et du tréhalose; utilisation modérée du maltose et du saccharose; mauvaise utilisation du fructose, du galactose, de l'inositol, du mannose, et du mélézitose; pas d'utilisation de l'adonitol, de l'arabinose, du dulcitol, du lactose, du mannitol, du mé-

libiose, du raffinose, du rhamnose, de la salicine, du sor-

bitol et du xylose Production d'acide à partir d'hydrates de carbone par la méthode de Gordon et al, voir ci-dessus: bonne production d'acide à partir du glucose, du glycérol,

du maltose, du saccharose et du tréhalose; faible produc-

tion d'acide à partir du galactose, de l'inositol et du mannose Utilisation des acides organiques par la méthode

de Gordon et ai, voir ci-dessus: utilisation de l'acéta-

te, du malate, du propionate, du pyruvate, du succinate et du tartrate; pas d'utilisation du benzoate, du citrate,

du lactate, du mucate et de l'oxalate.

TABLEAU IX

Caractéristiques de culture de Actinomadura yumaense NRRL 12515 Incubation: 14 jours Température 28 a C Milieu Quantité de Mycelium aérien et/ou spores Pigment Couleur inverse dévelopnement soluble Gélose de Modérée à Colonies plates, pulvérulentes; jaunâtre jaune pale 89 Benedict faible mycelia aériens blanc à gris clair Gélose de Bonne Pas de mycelia aériens; mycelium orange brun grisâtre Bennett végétatif enroulé grisjaunâtre 93 jaunâtre foncé 81 à brun jaunâtre grisâtre 80 Malate de Faible Développement plat; mycelia aériens vert jaune verdâtre 90 calcium blancs épars jaune gélose Saccharose Faible à Développement plat; mycelia aériens nul jaune pâle 89 de Czapek modérée modérés, développement végétatif gélose jaune grisâtre o TABLEAU IX (suite) Milieu Quantité de Mycelium aérien et/ou spores Pigment Couleur inverse dévelo Dnnement soluble Gaze n 1 Faible Développement plat incolore; my nul incolore gélose celia aériens blancs épars Gaze n 2 Bonne Colonies élevées enroulées; myce nul jaune orange gélose lia végétatifs gris jaunâtre 93; foncé 72 mycelia aériens modérés blanc jaunâtre 92 Glycérol Faible à Colonies nlates, pulvérulentes; jaune jaune pâle 89 aspargine modérée mycelia aériens blancs gélose Gélose de Modérée Colonies plates cireuses, Mycelia nul jaune grisâtre 90 Hickey aériens épars, jaune grisâtre 90, Tresner blanc à gris Dâpale 264 Sels minéraux Faible Colonies plates, incolores, pulvé nul incolore amidon rulentes; mycelia aériens blancs gélose TABLEAU IX (suite) Milieu Quantité de Mycelium aérien et/ou spores Pigment Couleur inverse développement soluble NZ-amine Bonne Dévelopnement épais, enroulé, brun brun brun jaunâtre amidon jaunâtre grisâtre 61 à noir brunâ verdâtre foncé 78 glucose tre; mycelia aériens modérés, gélose blanc à gris pâle 264 Farine Modérée Développement plat cireux, jaune nul jaune grisâtre 90 d'avoine grisâtre 90; mycelia aériens gélose modérés, blancs Pâte de to Bonne Développement plat cireux, jaune nul mate farine grisâtre foncé 91; trace de d'avoine mycelia aériens blancs gélose Extrait de Bonne Colonies élevées, cireuses, enrou orange brun jaunâtre levure lées, gris jaunâtre 93 à brun foncé 78 r L-n Extrait de grisâtre jaunâtre 80; pas de % malt gélose mycelia aériens o "

TABLEAU X

Micromor Dhologie de Actinomadura vumaense NRRL 12515 Milieu Mycelium aérien et/ou structures Forme des Dimension des Surface des s Dorifères spores spores spores Saccharose S Dorophores aériens; ramifiés, ovoïde 0, 6-0,8 im unie M Gélose de presque verticillés; portant des par Czapek chaînes en spirale relativement 1,0-1,4 pm courtes de spores matures O-

TABLEAU XI

Réaction Dhvsiologique de Actinomadura Yumaense NRRL 12515.

Milieu Période Quantité Réaction physiologique

d'incubation de déve-

lonpement Peotone 7 jours bonne léger brunissement fer 14 jours bonne léger brunissement gélose Tyrosine 7 jours modérée pas de pigment gélose 14 jours bonne pigment jaunâtre Lait de 14 jours bonne bonne peptonisation Litmus 28 jours bonne forte peptonisation Gélatine 14 jours bonne légère protéolyse nutritive 28 jours bonne protéolyse totale Nitrate 14 jours bonne très faible réduction Bouillon 28 jours bonne réduction modérée Adénine 14 jours bonne pas d'hydrolyse gélose 21 jours bonne pas d'hydrolyse Guanine 14 jours bonne pas d'hydrolyse gélose 21 jours bonne pas d'hydrolyse Hypoxan 14 jours bonne hydrolyse totale thine 21 jours bonne hydrolyse gélose Tyrosine 14 jours bonne forte hydrolyse gélose 21 jours bonne forte hydrolyse

15207

TABLEAU XI (suite) Milieu Période Ouantité Réaction physiologique

d'incubation de déve-

loppement Xanthine 14 jours bonne hydrolyse modérée gélose 21 jours bonne forte hydrolyse NZ-amine 5 jours Développement faible ou nul à 40 C, avec ami 10 C et 55 C; modéré à 25 C, 28 O C

don solu et 45 C; bon à 320 C et 37 C.

ble et glucose gélose (ATCC Med. n 172) Bouillon 28 jours bonne décomposition variable Urée Esculine 14 jours bonne hydrolyse Bouillon 28 jours bonne hydrolyse Amidon 5 jours bonne pas d'hydrolyse Gélose 10 jours bonne pas d'hydrolyse

TABLEAU XII

Utilisation de sources de carbone par Actinomadura vumaense MODT 1)t i Ul, i 1, ui, il-Fii m 'ii 7 r 1 r-+è 1 l(-rhonn

ISP-9.

Incubation: 28 jours Température: 28 C Source de carbone Utilisation Adonitol 1-arabinose Dulcitol Fructose d-galactose d-glucose Glycérol iinositol Lactose Maltose d-mannitol d-mannose d-mélézitose d-mélibiose draffinose 1-rhamnose Salicine Sorbitol Sucrose d-tréhalose d-xylose Témoin négatif mauvaise mauvaise bonne bonne mauvaise passable mauvaise mauvaise passable bonne -

TABLEAU XIII

Production d'acide à partir de divers hydrates de carbone par Actinomadura vumaense NRRL 12515 sur un milieu d'azote

minéral basal de Gordon.

Incubation: 28 jours Température: 28 C Source de carbone Production d'acide * 7 jours 28 jours Adonitol 1-arabinose Dulcitol Fructose dgalactose + d-glucose +++ +++ Glycérol ++ +++ i-inositol + Lactose Maltose +++ d-mannitol d-mannose + d-mélézitose d-mélibiose d-raffinose 1rhamnose Salicine Sorbitol Sucrose +++ d-tréhalose +++ d-xylose Témoin négatif *+++ = forte réponse positive ++ = réponse positive modérée + = légère réponse positive = réponse négative

TABLEAU XIV

Utilisation d'acides oraaniques oar Actinomadura Vumaense NRRL 12515 sur une modification de Gordon du milieu basal de caélose de Koser (gélose citrate I - Incubation: 28 jours

de Koser).

Température: 28 C + = réponse oositive = réponse négative Il est évident que le terme Actinomadura yumaense n'est oas limité à la souche Actinomadura yumaense NRRL

12515 ou à des souches répondant totalement aux caractéris-

tiques de développement et microscopiques ci-dessus, qui

sont données uniquement à titre d'illustration Actinomadu-

ra yumaense décrit ici comprend toutes les souches de Acti-

nomadura yumaense qui oroduisent les antibiotiques LL-C 23024 a, 8 et iota et qui ne peuvent oas être différenciées de façon définie de Actinomadura yumaense NRRL 12515 et de

ses sous-cultures, comprenant des mutants et leurs varian-

tes Le terme "mutants" englobe les mutants naturels (spon-

tanés) de cet organisme aussi bien que les mutants induits,-

produits à partir de cet organisme Dar différents moyens mutagènes bien connus des spécialistes de la technique,

tels qu'une exposition aux rayons X, aux rayons ultravio-

lets, de la moutarde d'azote, des actinonhages, des nitro-

Source de carbone Utilisation * Acétate +

Benzoate -

Citrate -

Lactate -

Malate +

Acide mucique -

Oxalate -

Propionate + Pyruvate + Succinate + Tartrate +

15207

samines et similaires Il est également souhaité et voulu

d'inclure les recombinants génétiques inter et intra-spé-

cifiques produits par des techniques génétiques connues des snëcialistes de la technique, telles que par exemple des techniques de conjugaison, de transduction et de génie gé- nétique. La culture de Actinomadura yumaense peut se faire avec une grande variété de milieux de culture solides ou

liquides Les milieux qui sont utilisables pour la produc-

tion des antibiotiques LL-C 23024 a, e et iota comprennent une source d'azote assimilable telle que des protéines, un hydrolysat de protéine, des polypeptides, des acides aminés,

un siro D de macération de mais, etc, et des anions et ca-

tions minéraux tels que le potassium, sodium, ammonium, calcium, sulfate, carbonate, phosphate, chlorure, etc Des traces d'éléments tels que le bore, le molybdène, le cuivre, etc, sont apportées comme impuretés d'autres constituants des milieux L'aération dans les cuves et les flacons est assurée par un courant d'air stérile forcé dans le milieu ou à la surface du milieu de fermentation Une agitation supplémentaire dans les cuves est fournie par une turbine mécanique Un agent antimousse tel que de l'huile de lard

ou un agent antimousse de silicone peut être ajouté si né-

cessaire. L'Actinomadura yumaense est développé et maintenu

sur des cultures inclinées de gélose, par exemple de la gé-

lose de Bennett, du malt de levure gélose, ou le milieu ATCC N O 172 On préfère le milieu ATCC N O 172 La culture inclinée est inoculée avec une culture de Actinomadura yumaense et incubée à 28-370 C, de Dréférence vers 321 C, pendant environ 7 jours Ces cultures mères peuvent être maintenues Dar des transferts en série sur des cultures

inclinées de gélose fraîche ou un tampon de la gélose con-

tenant des mycelia provenant de la culture inclinée de gé-

lose bien développée peut être utilisé pour inoculer les

milieux liquides.

Des inoculations de Actinomadura yumaense en

15207

flacons à secousses sont préparées en inoculant 100 ml de milieu liquide stérile dans des flacons de 500 ml avec des raclures ou des eaux de lavage de spores provenant d'une culture inclinée de gélose de la culture Des exemples de milieux d'ensemencement appropriés sont donnés ci-dessous. Milieu A Extrait de boeuf 0,3 % Bact A tryptone 1 0,5 % Glucose 1,0 % Extrait de levure 0,5 % Eau quantité suffisante pour 100 Peptone, marque déposée de Difco Laboratories Detroit, Michigan. On ajuste le p H à 6,8 7, 2 avec une base diluée,

par exemple l'hydroxyde de sodium.

Milieu B Glucose 1,0 % Amidon 2,0 % Extrait de levure 0,5 % NZ-amine A 2 0,5 % Carbonate de calcium 0,1 % Eau quantité suffisante pour 100 % 2 produit de digestion de la caséine, marque déposée de Sheffield Chemical Co, Div Nat'l Dairy Products Corp. Norwich, N Y. On préfère le milieu B. On incube les flacons à une température de 25 à C, de préférence à 32 C, et on agite vigoureusement sur un appareil à secousses rotatif pendant de 1 à 4 jours On utilise alors cet inoculum d'ensemencement pour inoculer

une culture de fermentation, ou on peut congeler cette cul-

ture et la conserver pour fournir un inoculum pour des cul-

tures d'ensemencement ultérieures.

Les milieux suivants sont des exemples de milieux appropriés pour la fermentation de Actinomadura yumaense

pour produire les antibiotiques LL-C 23024 a, $ et iota.

Milieu C Glucose 1,5 % Glycérol 1,5 % Farine de soja 1,5 % Carbonate de calcium 0,1 % Chlorure de sodium 0,3 % Eau quantité suffisante pour 100 % 3 Peut être remplacée par une farine de graine de coton ou

des Produits solubles de viande avec un effet égal.

Milieu D Glucose 3,0 % Farine de soja 1,5 % Carbonate de calcium 0,1 % Chlorure de sodium 0,3 % Eau quantité suffisante pour 100 % Milieu E Amidon 1,0 % Mélasses 2,0 % Farine de soja 1,5 % Carbonate de calcium 0,1 % Eau quantité suffisante pour 100 X Milieu F Glucose 3,0 % Produits solubles de viande 2,5 % Chlorure de sodium 0,2 % Carbonate de calcium 0, 1 % Eau quantité suffisante pour 100 % Milieu G Glucose 3,0 % Farine de soja 0,5 % Sulfate d'ammonium 0,3 % Chlorure de sodium 0,2 % Carbonate de calcium 0,1 % Eau quantité suffisante pour 100 % Milieu H Glucose 3,0 % Sulfate d'ammonium 0,3 % Phos Dhate de potassium dibasique 0,1 % Carbonate de calcium 0,2 % Chlorure de sodium 0,1 % Eau Quantité suffisante Dour 100 On préfère le milieu D. La fermentation peut être effectuée dans 100 ml de milieu dans un flacon de 500 ml inoculé avec de 3 à IO % (volume/volume) d'une culture d'ensemencement préparée comme décrit ci-dessus et incubée à 25-350 C, de préférence vers

32 C, pendant de 24 à 72 heures avec aération Des échantil-

lons de la culture de fermentation peuvent être congelés et conservés pour une utilisation ultérieure comme inoculum

pour des cultures d'ensemencement.

En variante, la fermentation peut être effectuée dans de plus grandes cuves de fermentation équipées de moyens d'aération et d'agitation Chaque cuve est inoculée avec de 3 à 10 % (volume/volume) d'un inoculum préparé comme décrit ci-dessus L'aération est fournie à une vitesse de 0,5 à 2,0 litres d'air stérile par litre de bouillon par minute et le milieu de fermentation est agité par une roue

entraînée à 200-400 tours/minute La température est mainte-

nue à 25-350 C, de préférence à 32 C La fermentation est continuée jusqu'à ce que l'antibiotique s'accumule dans le milieu de fermentation, normalement après 100 à 150 heures,

puis on récolte l'antibiotique.

L'antibiotique peut être récolté et purifié selon

les procédés décrits dans le brevet US 4 278 663, voir ci-

dessus, ou selon le procédé suivant:

On mélange le bouillon de fermentation brut conte-

nant la totalité des cellules, préparé comme décrit ci-des-

sus, avec un égal volume d'un solvant organique non hydro-

carboné, immiscible à l'eau On préfère le chlorure de mé-

thylène ou l'acétate d'éthyle On sépare la phase organique

et on concentre sous vide jusqu'à obtention d'un sirop hui-

leux.

On dissout le sirop huileux dans le chlorure de méthylène et on verse sur une colonne de gel de silice,

d'alumine, de Sephadex LH-20 d (Pharmacia Fine Chemicals Div.

of Pharmacia, Inc, Piscataway, N J) ou de silicate de ma-

gnésium et d'aluminium Comme exemnles de solvants appro-

oriés pour le développement de la colonne, on citera l'éther diîthylique, l'acétate d'éthyle, un mélange 1:1 à 1:7 (vo- lume/volume) de chlorure d'éthylène et d'éther éthylique, l'acétone à 10-40 % dans le chlorure de méthylène, un alcool

inférieur à 2 à 10 % (on préfère le méthanol) dans le chlo-

rure de méthylène, l'acêtonitrile à 2 à 15 x dans le chlo-

rure de méthylène, ou le dioxanne à 2 à 15 % dans le chlo-

rure de méthylène On Dréfère le mélange chlorure de méthy-

lène/acétate d'éthvle 1:1 (volume/volume) On recueille les

fractions et on vérifie la présence d'une activité antibac-

tériénne par un dosage biologique contre un organisme sen-

sible, par exemple Bacillus subtilis On combine les frac-

tions actives et on concentre sous vide jusqu'à obtention d'un résidu On dissout ce résidu dans un solvant organique,

par exemple le t-butanol (préféré), le benzène ou le p-dio-

xanne et on lyophilise.

On dissout le solide lyophilisé dans un solvant organique approprié, par exemple le chlorure de méthylène,

l'hexane, le chlorure de méthylène/acétate d'éthyle, l'é-

ther diéthylique, l'hexane/acétate d'éthyle, l'hexane/chlo-

roforme ou l'hexane/éther On Dréfère l'éther diéthylique.

On agite cette solution avec de l'eau et on ajuste le p H à 1,5-4,0, de préférence vers 2,5 avec un acide minéral dilué quelconque On sépare la phase organique, on lave à l'eau pour éliminer tout excès d'acide, on sèche sur un agent desséchant approprié, on filtre et on concentre sous vide

jusqu'à obtention d'un résidu.

On dissout le résidu dans un solvant approprié

et on laisse la solution s'évaoorer lentement, de préféren-

ce vers 4 C Comme exemples de solvants an Dropriés, on ci-

tera le chlorure de méthylène, l'hexane, le chlorure de mé-

thylène/acétate d'éthyle, l'éther diéthylique, l'hexane/

acétate d'éthyle, l'hexane/chloroforme, ou l'hexane/éther.

On mréfère l'hexane/éther 5:2 (volume/volume) On recueille les cristaux résultants et on lave, de préférence vers 40 C avec tout hydrocarbure à point d'ébullition modéré tel que par exemple l'hexane ou l'heptane, et on sèche à l'air pour obtenir comme produit final l'antibiotique X-14868 A sous forme de l'acide libre. Si on désire obtenir le produit sous la forme d'un sel, on peut convertir l'acide libre par traitement avec le

cation approprié, de préférence sous la forme d'une base mi-

nérale diluée, selon les procédés bien connus des spécialis-

tes de la technique.

Les exemples suivants sont donnés à titre d'illus-

tration de l'invention Les milieux A, B, C, etc sont ceux

définis ci-dessus Sauf mention contraire, tous les procé-

dés sont effectués à la température ambiante (vers 22 C) et

à pression normale ( 101 k Pa).

Exemple 1.

On utilise des spores lavées provenant d'une cul-

ture inclinée sur gélose de Actinomadura yumaense NRRL 12515

pour inoculer un flacon de 500 ml contenant 100 ml d'un mi-

lieu stérile B On incube le flacon sur un appareil à se-

cousses rotatif à 28 C pendant 2 jours.

On transfère ensuite un inoculum à 5 % de cette culture dans 100 ml du milieu stérile C dans un flacon de 500 ml et on incube à 28 C pendant 5 jours sur un appareil

à secousses rotatif.

On vérifie chaque jour la présence d'une activité antibiotique par un dosage biologique contre Staphylococcus

aureus ATCC 6538 P Bacillus subtilis et Streptococcus fae-

calis, et on vérifie l'activité anthelmintique par un dosa-

ge biologique contre le nématode vivant à l'état libre (in-

dépendant) Caenorhabditis elegans.

Exem Dle 2.

On prépare plusieurs flacons de 500 ml, contenant chacun 100 ml d'un des milieux stériles suivants: Flacon 1: 100 ml du milieu C

Flacon 2: 100 ml du milieu C avec 1,5 % de farine de grai-

ne de coton remplaçant la farine de soja

Flacon 3: 100 ml du milieu C avec 1,5 % de produits solu-

bles de viande remplaçant la farine de soja Flacon 4: 100 ml de milieu D Flacon 5:100 ml du milieu E Flacon 6:100 ml du milieu F Flacon 7:100 ml du milieu G On inocule chacun de ces flacons avec un inoculum à 5 % de Actinomadura yumaense NRRL 12515 développé dans le

milieu B On incube alors les flacons sur un appareil à se-

cousses rotatif à 28 C pendant 4 à 6 jours.

On trouve que chaque culture a une activité anti-

biotique selon l'essai de l'exemple 1 et une activité anti-

coccidienne contre Eimeria tenella dans des cultures de tis-

su de rein de poussin.

Exemple 3.

* On utilise des cultures de fermentation congelées

de cellules de Actinomadura yumaense NRRL 12515 pour inocu-

ler un flacon de 500 ml contenant 100 ml de milieu stérile B On incube alors le flacon à 32 C pendant 4 jours sur un

appareil à secousses rotatif.

On transfère alors un inoculum à S e de cette cul-

ture dans 100 ml d'un milieu stérile H dans un flacon de 500 ml et on incube à 28 C pendant 5 jours sur un appareil

à secousses rotatif.

On confirme l'activité antibactérienne comme dans

l'exemple 1 et l'activité anticoccidienne comme dans l'exem-

ple 2.

On vérifie également la présence d'une activité antibiotique par chromatographie en couche mince sur des

plaques de gel de silice développées dans l'acétate d'éthy-

le/chloroforme 70:30 (volume/volume).

Exemple 4.

On inocule 100 ml de milieu stérile A dans un fla-

con de 500 ml avec des spores lavées provenant d'une culture inclinée sur gélose d'Actinomadura yumaense NRRL 12515 On incube le flacon à 32 C pendant 2 jours sur un appareil à

secousses rotatif.

On transfère alors un inoculum à 5 % de cette culture dans 100 ml de milieu stérile H dans un flacon de 500 ml et on incube sur un appareil à secousses rotatif à

32 C pendant 2 jours.

On transfère ensuite un inoculum à 5 % de cette culture dans un flacon de 500 ml contenant 100 ml du milieu stérile H frais et on incube à 28 C pendant 6 jours sur un

appareil à secousses rotatif.

On confirme l'activité antibactérienne comme dans

l'exemple 1.

Exemole 5.

On inocule deux flacons de 500 ml contenant cha-

cun 100 ml de milieu stérile A avec une culture d'ensemen-

cement congelée de Actinomadura yumaense NRRL 12515 et on incube à 32 C pendant 2 jours sur un appareil à secousses rotatif. On combine alors les contenus des deux flacons et

dans un flacon de 20 litres, on ajoute à 12 litres de mi-

lieu stérile A frais On incube cette culture pendant 2

jours à 28 C en aérant.

On transfère alors le contenu de ce flacon dans une cuve d'ensemencement de 300 litres contenant 288 litres de milieu stérile A-et on aère cette culture en agitant

pendant 25 heures à 32 C.

A la fin de la période d'incubation de 25 heures, on transfère les 300 litres de culture d'ensemencement dans

une cuve de fermentation de 1500 litres contenant 1200 li-

tres de milieu stérile C On incube cette culture en aérant

et en agitant pendant 115 heures à 28 C.

On vérifie l'activité antibiotique du bouillon de fermentation par chromatographie en couche mince sur des

plaques de gel de silice développées par l'acétate d'éthy-

le/chloroforme 70:30 (volume/volume) Ou bien, on soumet plusieurs plaques ainsi développées à un dosage biologique

contre Bacillus subtilis qui montre la présence d'une acti-

vité antibiotique.

Exemnle 6.

On prépare un milieu typique utilisé pour le dé-

veloppement d'un inoculum primaire, selon la formule sui-

vante: Extrait de boeuf 0,3 % Bacto -trvotone 0,5 % Glucose 1,0 % Extrait de levure 0,5 Bactoà gélose 0, 15 % Eau quantité suffisante pour 100 % On utilise des spores lavées ou raclées et des mycelia provenant d'une culture inclinée sur gélose de Actinomadura yumaense NRRL 12515 pour inoculer un flacon

de 500 ml contenant 100 ml du milieu stérilisé ci-dessus.

On place le flacon sur un appareil à secousses rotatif et

on agite vigoureusement pendant 48 heures à 32 C On uti-

lise l'inoculum du flacon résultant ( 100 ml) pour inoculer

un litre du même milieu stérile dans un flacon de 2 litres.

On aère cet inoculum avec de l'air stérile, pendant que le développement est continué pendant 48 heures à 28 C On utilise alors cette culture d'un litre Dour inoculer une cuve de fermentation de 30 litres contenant le même milieu stérile et on aère cette cuve avec de l'air stérile et on

incube à 28 C pendant 42 heures.

Exemple 7.

On prépare un milieu de fermentation selon la formule suivante: Dextrose 1,5 % Glycérol 1,5 % Farine de soja 1,5 % Carbonate de calcium 0,1 % Chlorure de sodium 0,3 % Eau quantité suffisante pour 100 %

On ajuste le p H à 7,0 avec de l'hydroxyde de so-

dium 6 N et on stérilise le milieu On utilise une portion de 30 litres de l'inoculum préparé tel que décrit dans l'exemple 1 pour inoculer 250 litres du milieu ci-dessus

15207

dans une cuve de fermentation de 300 litres On assure une aération stérile à la bouillie et on agite la bouillie par

une roue entraînée à 220 tours/minute On effectue la fer-

mentation à 320 C mendant 97 heures et on récolte la bouil-

lie.

Exemnle 8.

On prépare un milieu de fermentation selon la formule suivante Dextrose 3, 0 % Farine de soja 1,5 % Carbonate de calcium 0,1 %O Chlorure de sodium 0, 3 % Eau quantité suffisante pour 100 %

On ajuste le p H à 7,0 avec de l'hydroxyde de so-

dium 6 N et on stérilise le milieu On utilise une portion

de 300 litres de l'inoculum préparé comme décrit dans l'e-

xemole 1 Dour inoculer 3000 litres du milieu ci-dessus dans une cuve de fermentation On assure une aération stérile

dans la masse On agite la masse par une turbine fonction-

nant à 10 tours/minute On effectue la fermentation à 320 C

mendant 115 heures après quoi on recueille la bouillie.

Exemple 9.

1 On ajuste la bouillie de fermentation ( 100 1) à m H 4,0 en utilisant H Cl 6 N On agite alors la bouillie acide Dendant 1 à 2 heures avec un volume égal de chlorure de méthylène On filtre le mélange de la bouillie et de

chlorure de méthylène sur une terre de diatomée comme adju-

vant de filtration On soutire l'extrait au chlorure de mé-

thylène et on concentre sous vide jusqu'à environ 2 litres

d'antibiotiques partiellement purifiés.

2 Chromatographie sur gel de silice des antibio-

tiques partiellement purifiés.

On garnit une colonne de verre d'un diamètre de 7 cm d'une hauteur de 91 cm de gel de silice Woelm TSC On laisse le concentré brut (voir 1 cidessus) d'un volume de

2 litres environ suinter dans la colonne de gel de silice.

On développe la colonne d'abord avec 3 litres de chlorure

15207

de méthylène, puis avec du chlorure de méthylène/acétate

d'éthvle ( 1:1 en volume) pour obtenir un total de 126 frac-

tions, ayant chacune un volume de 80 ml On développe encore

en utilisant de l'acétate d'éthyle/éthanol ( 7:3) pour obte-

nir encore 87 fractions. On réunit les fractions 58 à 87, riches en C 23024 a

et on concentre sous vide jusqu'à un résidu pesant 90,4 g.

On dissout ce résidu dans un mélange de 600 ml d'éther di-

éthylique et de 600 ml d'hexane On filtre la suspension résultante pour obtenir un filtrat limpide On concentre le

filtrat limpide sous vide jusqu'à ce que des cristaux commen-

cent à se former On laisse cette suspension vieillir pendant une nuit On recueille le C 23024 a sur un entonnoir, on lave avec de l'éther froid et on sèche à l'air pour obtenir 33,1 g de C 23024 a cristallin On obtient encore 12,4 g de C 23024 a par réduction ultérieure du volume du lavage et du filtrat réunis. On réunit les fractions 177 à 203 provenant de l'élution avec de l'acétate d'éthyle/éthanol et enrichies en C 23024 l et on concentre sous vide pour obtenir 6,7 g de

C 23024 e partiellement purifié et on traite comme ci-dessus.

On réunit les fractions 204 à 213 provenant de l'élution avec de l'acétate d'éthyle/éthanol et enrichies en C 23024 iota et on concentre sous vide pour obtenir une pâte qu'on extrait de nouveau avec du méthanol On extrait l'extrait méthanolique avec du chlorure de méthylène chargé sur une colonne de gel de silice Woelm On lave la colonne avec du chlorure de méthylène et on élue avec du chlorure de méthylène/acétate d'éthyle ( 2:3) On vérifie les coupes

par chromatographie en couche mince et on réunit les frac-

tions actives, on traite sur charbon, on concentre et on

extrait plusieurs fois avec de l'heptane On refroidit l'ex-

trait à l'heptane final à O C pendant 48 heures et on sé-

pare les cristaux de la liqueur mère par filtration.

On dissout cette liqueur mère dans du chlorure de méthylène et on laisse suinter dans une colonne de verre garnie de gel de silice Woelm On élue alors successivement la colonne avec 2 litres de chlorure de méthylène, 8 litres de chlorure de méthylène/acétate d'éthyle ( 1:1) et 4 litres d'acétate d'éthyle/méthanol ( 9:1) On recueille l'éluat par fractions et on évalue leur composition antibiotique On réunit les fractions actives et on concentre sous vide pour

obtenir un résidu contenant du LL-C 23024 iota.

Exemple 10.

Autre nurification du C 23024 8 par chromatoqranhie sur gel

de silice.

On laisse du Senhade LH 20 gonfler dans un mé-

lange d'hexane/chlorure de méthylène/méthanol ( 10:5:1) On garnit une colonne de verre de 5 cm de diamètre avec le gel sur une hauteur de 86 cm On dissout la charge, 3 g de LL-C 23024 S purifié, dans 10 ml de chlorure de méthylène, 1 ml de méthanol et 10 ml d'hexane et on laisse suinter dans la colonne de gel On développe alors la colonne 3 avec un solvant de la même composition que celui utilisé pour transférer l'antibiotique sur la colonne On recueille les fractions au moyen d'un collecteur de fractions Les 23 premières fractions ont un volume de 17 ml chacune Les fractions 17 à 26 contiennent du C 23024 8, selon la chromatographie en couche mince On réunit ces fractions

et on concentre sous vide pour obtenir du LL-C 23024 D amor-

phe, pur, pesant 1269 mg.

Exem Dle 11.

Cristallisation du LL-C 23024 B sous la forme du sel de so-

dium. On dissout 2,4 g de LL-C 23024 8 purifié, préparé comme décrit dans les sections B et C, dans un mélange d'é-

ther diéthylique ( 500 ml), d'hexane ( 160 ml) et de chlorure de méthylène ( 25 ml) On transfère la solution résultante

dans une ampoule à décantation contenant 300 ml d'eau dis-

tillée On ajoute goutte à goutte H Cl dilué ( 1 N) jusqu'à

ce que le p H atteigne 2,0 à 2,5, après avoir agité et lais-

sé reposer On rejette la phase acide aqueuse et on lave successivement la phase organique, traitée à l'acide, avec 3 fois 400 ml d'eau On agite la couche organique lavée avec une cuillère à thé de Darco G-60 en poudre pendant 15

minutes et on filtre sur celite On place la couche orga-

nique décolorée sur 500 ml d'eau distillée et on ajoute goutte à goutte Na OH 5 N jusqu'à ce que le p H atteigne 11,0 à 11,5 après avoir agité et laissé reposer On rejette la phase aqueuse alcaline et on lave la couche organique restante avec deux fois 400 ml d'eau On sèche la couche organique lavée sur du sulfate de sodium et on concentre

sous vide jusqu'à un volume de 150 ml On laisse ce concen-

tré reposer sous une hotte pendant plusieurs heures On re-

cueille le LL-C 23024 8 cristallin sur un entonnoir, on lave avec de l Fhexane froid et on sèche à l'air pour obtenir 402 mg du sel cristallin de LL-C 23024 8 La composition

d'un échantillon est déterminée par microanalyse et carac-

téristiques spectrales.

Analyse pour C 46 H 77017 Na: Calculee: C 59,70; H 8,33; O 29,46; cendres 2,49 Trouvée: C 61,55; H 8,79; cendres 3,31; N O

Point de fusion (appareil Fisher-Johns) = 174 C.

Spectre de masse par désorption de champ = 924.

26 = + 3,2 (dans le méthanol).

Exemnle 12.

Purification du LL-C 23024 iota.

Sur un appareil pour chromatographie liquide de

haute performance Waters Prep 500 A, on adapte une cartou-

che de gel de silice sous une pression de 3790 k Pa On dis sout 5,0 g de la charge, le matériau brut de l'exemple 3, dans 50 ml d'heptane/acétate d'éthyle ( 45:55) et on injecte

dans la colonne de gel de silice On développe alors la co-

lonne avec le même solvant à un débit de 200 ml/minute en recueillant 40 fractions de 200 ml On réunit les fractions 21 à 32, on concentre jusqu'à obtention d'un résidu, on triture avec de l'hexane et on évapore pour obtenir du LL-C 23024 iota pur On répète 4 fois le procédé ci-dessus

et on recueille au total 280 mg de LL-C 23024 iota amorphe.

On dissout une portion de 90 mg de LL-C 23024 iota amorphe dans 10 ml d'éther diéthylique, mélangé avec 10 ml d'eau, et on ajuste à p H 2,5 avec de l'acide chlorhydrique 0,1 N On lave la couche éthérée avec de l'eau, on ajuste vers p H 11 avec de l'hydroxyde de sodium O,1 N, on sépare

et on lave de nouveau avec de l'eau On sèche la phase éthé-

rée sur du sulfate de sodium, on filtre, et on concentre jusqu'à obtention d'un résidu On laisse une solution de ce résidu dans l'éther/hexane s'évaporer lentement pour donner

un solide blanc amorphe.

Ce solide blanc amorphe a les propriétés suivan-

tes:

Analyse élémentaire: C 61,79; H 8,84; cendres 0,32.

a-726 = + 270 (C 0, 724, méthanol).

D +

Spectrométrie de masse par désorption de champ = (M+Na)+ -

m/e 953, soit une masse moléculaire calculée de 930.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1 Culture biologiquement pure de Actinomadura yumaense sp nov, ladite culture étant capable de produire les antibiotiques LL-C 23024 a, B et iota en des quantités récupérables par fermentation dans un milieu nutritif li-

quide contenant des sources assimilables de carbone, d'azo-

te et de sels minéraux.

2 Culture biologiquement pure selon la revendi-

cation 1, caractérisée en ce que Actinomadura yumaense sp.

nov est Actinomadura yumaense NRRL 12515.

3 Culture biologiquement pure du microorganisme Actinomadura yumaense sp nov selon la revendication 1 ou

2, caractérisée en ce que le microorganisme subit une muta-

tion spontanée de telle sorte que le microorganisme est gé-

nétiquement altéré, mais conserve encore la faculté de syn-

thétiser les antibiotiques -a, B et iota.

4 Culture biologiquement pure du microorganisme Actinomadura yumaense sp nov selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le microorganisme est soumis à

une action mutagène telle que le microorganisme est géné-

tiquement altéré, mais conserve encore la faculté de syn-

thétiser les antibiotiques LL-C 23024 a, B et iota.

Antibiotique LL-C 23024 B, caractérisé en ce que la forme substantiellement pure présente:

32 2

(a) un pouvoir rotatoire de lj 5 = + 320 + 2

( 0,495 %, méthanol) et de A 25 = + 46 + 2 ( 0,440 %, chlo-

roforme}; (b) une analyse élémentaire (%) d'environ C 61,55;

H 8,79;

(c) un point de fusion d'environ 171-173 C;

(d) une masse moléculaire calculée par spectro-

scopie de masse par désorption de champ de 902; (e) un spectre RMN de 13 C dans le chloroforme deutérié à 80 M Hz substantiellement tel que représenté sur la figure 2;

(f) un spectre d'absorption IR dans K Br substan-

tiellement tel que représenté sur la figure 1; et (g) un spectre RMN du proton dans le chloroforme deutérié à 20 MHZ substantiellement tel que représenté sur

la fiqure 3.

6 Sel d'addition avec un acide Dharmaceutiquement accentable de l'antibiotique LL-C 23024 B selon la revendica-

tion 5.

7 Antibiotique LL-C 23024 iota, caractérisé en ce que la forme substantiellement pure présente: (a) un pouvoir rotatoire de a 6 = + 270 (C: 0,724, méthanol); (b) une analyse élémentaire % d'environ: C 61,79;

H 8,84;

(c) une masse moléculaire calculée par spectro-

scopie de désorption de champ de 930; (d) un spectre RMN de 13 C dans le chloroforme deutérié à 80 M Hz substantiellement tel que représenté sur les figures 6, 7 et 8;

(e) un spectre d'absorption IR dans K Br substan-

tiellement tel que représenté sur la figure 4; et (f) un spectre RMN du proton dans le chloroforme deutérié à 20 M Hz substantiellement tel que représenté sur

la figure 5.

8 Sel d'addition avec un acide pharmaceutiquement

acceptable de l'antibiotique LL-C 23024 iota selon la reven-

dication 7.

9 Procédé pour la préparation des antibiotiques LL-C 23024 a, e et iota, caractérisé en ce qu'il consiste à

faire fermenter aérobiquement Actinomadura yumaense sp.

nov ou un de ses mutants dans un milieu liquide contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels

minéraux, jusqu'à ce qu'une activité antibiotique substan-

tielle soit conférée au bouillon de fermentation, puis à

recueillir l'antibiotique à partir de ce bouillon.

Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la température de la culture de fermentation est

maintenue à 25-35 C pendant une période de 24 à 150 heures.

11 Procédé selon la revendication 9 ou 10, ca-

ractérisé en ce que Actinomadura yumaense sp nov est

Actinomadura yamuense NRRL 12515.

12 Médicament pour lutter contre les infections de coccidiose chez les volailles, caractérisé en ce qu'il comprend un véhicule comestible et d'environ 0,000025 à 0,06 % en poids du composé LL-C 23024 a ou LL-C 23024 iota

ou d'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

13 Médicament selon la revendication 12, carac-

térisé en ce que le véhicule comestible est l'eau de bois-

son et contient de 2,5 à 120 npm de l'agent anticoccidien.

14 Procédé de lutte contre les nématodes présents dans un sol contenant des nématodes, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer sur le sol infesté de nématodes une quantité efficace pour tuer les nématodes d'un composé LL-C 23024 a, LL-C 23024 B ou des sels pharmaceutiquement acceptables de ces composés, des mélanges des composés ou des sels, ou des bouillons de fermentation ou encore des solides récoltés à partir des bouillies, à partir desquels

on obtient les antibiotiques nématocides.